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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ˜ ESPANA

11 N.◦ de publicaci´ on: 51
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k ES 2 052 044 kInt. Cl. : A61K 31/365
C07D 307/58

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kN´ umero de solicitud europea: 89402004.9 kFecha de presentaci´ on : 12.07.89 kN´ umero de publicaci´ on de la solicitud: 0 363 230 kFecha de publicaci´ on de la solicitud: 11.04.90

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

T3

54 T´ ıtulo: Utilizaci´ on de acetogeninas en terap´ eutica, en cuanto a sustancias antiparasitarias.

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30 Prioridad: 18.07.88 FR 8809674

73 Titular/es:

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Laboratoires Debat Soci´ et´ e Anonyme 60 rue de Monceau F-75008 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´ on BOPI:

01.07.94

72 Inventor/es: Cave, Andr´ e;

Hocquemiller, Reynald y Laprevote, Olivier

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.07.94

74 Agente: Vilaseca Bequet, Jorge

Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´ on en el Bolet´ ın europeo de patentes, de la menci´ on de concesi´ on de la patente europea, cualquier persona podr´ a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´ on deber´ a formularse por escrito y estar motivada; s´ olo se considerar´ a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de on de Patentes Europeas). oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´
Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

. (1984). 35 Asimismo se conoce la “desacetiluvaricina” que es una acetogenina de f´ ormula II [donde Z1 = Z4 = aginas 644 . Annona y Asiminia.3153. extra´ ıdos de “Rollinia papillonella” y presentados como poseedores de una actividad citot´ oxica. (1984). p´ llinona” que es un componente de f´ ormula II [donde Z1 = H1 Z2 = Z3 = OH. Uveria. 25 (N◦ 30). aginas 652 . Nad. Las acetogeninas descritas a continuaci´ on. J.2016. (1982)... 10 Arte anterior Se sabe que anteriormente ya se han descrito las propiedades citot´ oxicas y antitumorales de lactonas de ´cido graso. Org. son productos principalmente extra´ ıdos de plantas pertenecientes a la familia de las anon´ aceas. extra´ ıda de Uvaria OCOCH3] descrita por JOLAD y al.Z1 representa una funci´ on oxo. 48 (N◦ 4).. la relaci´ on C1 . (1984). y en el ciclo lactona.657. aginas 3199 . p´ reois´ omeros de f´ ormula II (llamados “rollinina” e “isorollinina”) [en la que Z1 = H y Z2 = Z3 = Z4 = OH]. se conocen dos esteDe DABRAH y al. se conoce una acetogenina de f´ ormula II [en la que Z1 = Z4 =H1 Z2 = OH y Z3 = aginas 3151 . especialmente del g´ enero Rollinia... p´ accuminata y denominada “uvaricina”.2 052 044 DESCRIPCION Campo del invento 5 El presente invento trata de la nueva utilizaci´ on terap´ eutica de los compuestos pertenecientes a la familia de las acetogeninas como sustancias antiparasitarias. p´ 40 aginas 2013 . Tetrahedron Letters. Phytochemistry. p´ acetogeninas extra´ ıdas de Annona cherimolia cuya f´ ormula es la siguiente: 45 50 55 60 2 . 47 (N◦ 4). H y Z2 = Z3 = OH] descrita por JOLAD y al. Prod. se conoce asimismo la “roDe DABRAH y al.C35 est´ a totalmente saturada]. (1985).. 23 (N◦ 9). J..3202. se conocen Tambi´ en de CORTES y al. Prod. Nat. J. 47.645. conteniendo en su mol´ a ecula un grupo bis (tetrahidrofuranilo) y que responden a la siguiente f´ ormula: 15 20 25 30 En particular. Chem.

OH). y por otra parte. y W=1´ o 2. 30 25 r = 1.A .18. m = 9 .4. se sabe que la patente americana US .5 . y como agentes parasiticidas [ver columna 4 l´ ıneas 49 . (H. de las acetogeninas cuya f´ ormula es la siguiente: 15 20 en la que la combinaci´ on (A1 A2) se ha elegido entre las combinaciones (H.oxo . (H. 5 10 Finalmente. OAc) y (= O).10 (donde se describen ensayos sobre nematodos en suspensi´ on en un medio acuoso)].metilo .dihidrofuranilo) [producto denominado “dihidrocherimolina”].2 052 044 en la que Z5 es un resto de 3 .51 (donde se hace menci´ on de veh´ ıculos inertes farmac´ euticamente aceptables). columna 5. 35 A3 representa un grupo elegido entre: 40 45 50 55 60 3 . no sea superior a 6. columnas 9 . que destacan por sus propiedades antimicrobianas con respecto a las bacterias G y las Candida.4 721 727 propone la utilizaci´ on en agricultura como agentes pesticidas por una parte y en terap´ eutica especialmente veterinaria.(2 .5 . con la condici´ on de que el n´ umero total de sustitutivos oxi en los grupos A1 y A2.15. l´ ıneas 23 .25 (donde se se˜ nala el tratamiento de los par´ asitos internos del animal) y ejemplos 3 . H). n = 10 .2.

y 4 . denominada “asicimina” y cuya f´ ormula se desarrolla de la siguiente forma: 5 10 15 20 25 Por la FR .A . inclu´ ıdos o no como productos en la f´ ormula general (ver la f´ ormula IV) de la mencionada US . Chem. PETIT y al. utilizable en el tratamiento del c´ ancer.lacontas que responden a la f´ ormula 45 50 55 60 en la que R representa H ´ o OH.A .2 052 044 El componente pesticida preferido seg´ un la citada US . p´ evidencia por medio de an´ alisis espectral RMN.4 721 727. que la mencionada rolliniastatina 1 es efectivamente un diastereois´ omero de la asimicina cuya f´ ormula V se detalla a continuaci´ on. 65 (N◦ 6).. Ver para ello el cuadro 2 p´ agina 1434 del mencionado art´ ıculo que compara los espectros RMN de la rolliniastatina 1 y de la asimicina. Can.. que es un diastereois´ omero cuya f´ ormula V se describe m´ as arriba y que act´ ua como sustancia antitumoral o antineopl´ asico. como nuevas sustancias antiparasitarias.1435. (1987).4 721 727 es (una mezcla de estereois´ omeros) extra´ ıda de la corteza y de granos de Asimina triloba. se preconiza una nueva utilizaci´ on de los componentes acetogeninos. aginas 1433 . Objeto del invento De acuerdo con un primer aspecto del invento.2 617 843 se conoce la utilizaci´ on de la rolliniastatina 1. pone en El art´ ıculo de G.A . 30 35 40 M´ as concretamente. se preconiza la utilizaci´ on de una sustancia elegida entre el conjunto constitu´ ıdo por (i) las (tetrahidrofuranilo) . J. seg´ un el invento.R.

Heidelberg. y . los is´ omeros geom´ etricos de constituci´ on.2.3 furanilo) . El reactivo de KEDDE es una soluci´ on al 2% (p/v) de a ´cido 3. seg´ un el invento. se preconizan como nuevos productos industriales las (tetrahidrofuranilo) . STAHL “Thin . De acuerdo con un segundo aspecto del invento. Por “estereois´ omeros” (o “diastereois´ omeros”) se entienden aqu´ ı los is´ omeros ´ opticos resultantes de la presencia de varios ´ atomos de carbono asim´ etricos. que es una especie del g´ enero Rollinia o una especie parecida perteneciente a la familia de las anon´ aceas.los diastereois´ omeros de f´ ormula I que son trihidr´ oxilos (R = M) en posiciones 3.dihidroxitridecilo] . 10 Seg´ un un tercer aspecto del invento. 12 trihidroxitridecilo] .(13 . por un lado.1. Estos componentes tetrahidr´ oxilos son nuevos. A tal efecto.12 .G.1.5 .2.oxo ..tetrahidrofurano. El procedimiento de preparaci´ on preconizado para obtener unos componentes acetogeninos de f´ ormula I incluye la extracci´ on de una planta. Berlin.5 . pueden prepararse seg´ un las modalidades operatorias conocidas de hecho por la aplicaci´ on de mecanismos cl´ asicos de reacci´ on o de extracci´ on. En revancha. como ingrediente activo.5 . para la preparaci´ on de un medicamento antiparasitario destinado a la utilizaci´ on en terap´ eutica humana y veterinaria.tetrahidrofuranilo)] ..metilo . 1969. y que responden a la nomenclatura sistem´ atica de 2 .. al menos uno de los mencionados componentes acetogeninos como medicamento antiparasitario.2 . sustancias extra´ ıdas de plantas pertenecientes a la familia de las anon´ aceas.lactonas que no han sido todav´ ıa descritas en el arte anterior.Layer Chromatography”. especialmente aqu´ ellos que comportan un sustitutivo OH que pueda ser de configuraci´ on R o S.dihidro . un disolvente apropiado para retener las fracciones que dan una reacci´ on positiva con el reactivo de KEDDE.tetrahidrofuranilo] . previamente triturada y secada con las siguientes 5 55 60 . seg´ un el invento. Para obtener unos componentes de f´ ormula I donde R = H u OH. los componentes preferidos en el plano farmacol´ ogico en consideraci´ on a sus propiedades antiparasitarias son los productos tetrahidr´ oxilos (R = OH) de f´ ormula I.2 . resultantes de las respectivas configuraciones (especialmente E o Z) de los sustitutivos de cada ciclo.furanilo) . Springer .los diastereois´ omeros de f´ ormula I que son tetrahidr´ oxilos (R = OH) en posiciones 3. con por lo menos. 15 y 24 seg´ un la numeraci´ on de los ´ atomos de carbono propuestos en el primer art´ ıculo mencionado de JOLAD y al.hidroxiundecilo) 2 .(1 . como sustancias antiparasitarias. Se introducen algunas gotas de este reactivo en la muestra a ensayar que se ha puesto previamente en soluci´ on con algunas gotas de KOH al 6% p/v en etanol.metilo . 30 35 40 45 50 Los componentes acetogeninos.[13 .2 . Seg´ un el invento. 5 Dichas (tetrahidrofuranilo) . para proceder a continuaci´ on al aislamiento de dichas fracciones. 15 y 24 seg´ un la mencionada numeraci´ on de JOLAD y al. 15 Descripci´ on detallada del invento Las acetogeninas que se utilizan. y por otro. bilharziosis y leptospirosis cuando R es H.oxo . ver la publicaci´ on de K. delata la presencia en la muestra a ensayar de una mol´ ecula con un resto y .5 . son componentes elegidos entre el conjunto constituido por 20 25 .2 052 044 (ii) sus estereois´ omeros ´ opticos y geom´ etricos. y que responden a la nomenclatura sistem´ atica de 2 .5 .intenso.[5 . se preconiza un procedimiento de extracci´ on que se realiza partiendo de una planta de una de las especies pertenecientes al g´ enero Rollinia o de otra especie parecida de la familia de las anon´ aceas. La aparici´ on de una coloraci´ on de rosa a violeta .hidroxiundecilo) . KREBBS y al.3 .(5 . con respecto (A) a las parasitosis cuando R es OH. “Spray Reagents” en la obra de E.dihidro . New York.dinitrobenz´ oico en etanol.Verlag. y (B) a las leishmaniosis. los componentes trihidr´ oxilos tienen una f´ ormula cuyo desarrollo es conocido (ver f´ ormula V detallada m´ as arriba) y son probablemente los diastereois´ omeros de la rolliniastatina 1 y de la asicimina. se preconiza un compuesto terap´ eutico conteniendo.[5 .5. seg´ un el invento.(5 .lact´ onico.(1 . 11.lactonas son por lo general.tetrahidrofurano.

los ´ esteres (como los acetatos de alquilo inferior en C1 . los hidro1◦ ) extracci´ carburos alif´ aticos saturados. donde R = H u OH.2 052 044 operaciones: on por medio de un disolvente elegido entre el conjunto formado por los ´ eteres. los hidrocarburos arom´ aticos halogenados.dicloroetano. 1. los hidrocarburos alic´ ıclicos (tales como el ciclopentano y el ciclohexano). los hidrocarburos alic´ ıclicos.1. los hidrocarburos alif´ aticos halogenados. para 5◦ ) evaporaci´ obtener un res´ ıduo sustancialmente desprovisto de dicho disolvente. hexano. los hidrocarburos alif´ aticos halogenados (en particular el tetracloruro de carbono.C7 (como la acetona. con disolventes de polaridad creciente. En este procedimiento. se utilizar´ an las hojas o los granos de Rollinia o de una especie perteneciente a la familia de las anon´ aceas. Vereins Prov. los hidrocarburos alif´ aticos (tales como el pentano. y m´ as concretamente en Per´ u y Ecuador. el tetrahidrofurano. las acetonas en C3 C7. la metilpropilcetona).5 . 15 on del disolvente de extracci´ on contenido en el concentrado lavado de esta forma. La variedad preferida. por ejemplo el acetato de etilo) y sus mezclas. MAAS y registrada bajo el N◦ 5972 del cat´ Sistem´ atica de la Universidad del Estado de Utrecht. (1934)]. los hidrocarburos arom´ aticos (tales como el benceno. las hojas. 2◦ ) separaci´ 10 5 on bajo presi´ on reducida del medio l´ ıquido de extracci´ on as´ ı obtenido. la metiletilcetona. 60 ◦ La extracci´ on de la fase 1a ¯ ) se realiza a una temperatura entre 10 C y la temperatura de reflujo del on medio de extracci´ on. especialmente a una temperatura dentro de la gama de 15◦C a 35◦C. los granos o por la cumbre florida) o por la planta entera. 47.propanol e isopropanol).C4. las mezclas agua . seg´ un el invento. 3◦ ) concentraci´ ı obtenido con un a ´cido mineral dilu´ ıdo 0. aproximadamente 105 Pa). el tetrahidrofurano. dicha extracci´ 6 . n . los alcoholes en C1 . los hidrocarburos arom´ aticos halogenados (tales como el clorobenceno. los alcoholes en C1 . los hidrocarburos arom´ aticos. 12 (N◦ 1). el etanol. Preferentemente. m . los tallos.dicloroetano y 1. Pa´ ıses Bajos. o incluso las mezclas de los mencionados disolventes. el acetato de etilo y (sobretodo) el ´ eter de petr´ oleo.toluenos). la especie Rollinia ruboides.2 . Los disolventes preferidos son el cloroformo.C5 (en especial el metanol.metanol y agua . tolueno y los o .e. 136 (1905)]. Consta de especies que crecen especialmente en Am´ erica del Sur. la especie Rollinia papilionella y la especie Rollinia sylvatica. Brandeburg. dietileter y diisopropileter). 187. el metanol. las cetonas en C3 . El g´ enero Rollinia es muy conocido. en columna de s´ ılice. es decir la especie Rollinia ulei [especialmente descrita por DIELS. bajo presi´ on puede realizarse bajo presi´ on atmosf´ erica (p. on del medio de extracci´ on para separar el insoluble y recoger el medio l´ ıquido de extracci´ on. cloroformo.5 M y a continuaci´ on con 4◦ ) lavado del concentrado as´ agua destilada. la madera. la corteza. ıa del res´ ıduo as´ ı obtenido. las partes preferidas de la planta est´ an principalmente constitu´ ıdas por las hojas y los granos. el diometilformamida. Acta Horti Berg.C5. Asimismo.dicloroetileno). Verh..2 . pertenece a la especie Rollinia ulei y se denomina en adelante la variedad Rollinia ulei (MAAS 5972) o Rollinia sp MAAS (5972). la especie Rollinia microcarpa [especialmente descrita por FRIES. Las especies similares que incluyen particularmente a las Asimina triloba. Bot. Para obtener unos componentes de f´ ormula I anteriormente mencionados. 25 30 35 40 45 50 55 De entre los disolventes de extracci´ on utilizables para la realizaci´ on de la fase 1a ¯ ). diclorometano. heptano y ´ eter de petr´ oleo). previamente trituradas y secadas. 1. Uvaria accuminata. etanol. Annona cherimolia y Annona densicoma. Ha sido descrita por el Profesor alogo del herbolario que posee el Instituto de Bot´ anica P.1 .M.y p . 6◦ ) chromatograf´ para recoger s´ olo las fracciones de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE. 20 on de las mencionadas fracciones de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE y separaci´ on 7◦ ) purificaci´ de los componentes de f´ ormula I. el diclorometano.etanol. los ´ esteres y sus mezclas. la materia prima vegetal triturada y secada est´ a constitu´ ıda por una parte de la planta (las ra´ ıces. se pueden citar los ´ eteres (especialmente el dimetileter.J. el dimetilformamide. los diclorobencenos y el bromobenceno).

b) acetato de etilo puro.flash” (en ingl´ es: “flash chromatography”). como m´ la fase 3¯ ).5 . Estas se realizan ventajosamente por “cronomatograf´ ıa . la purificaci´ on de la fase 7a ¯ ) incluye una cromatograf´ separaci´ on sobre placa de s´ ılice. Org. por ejemplo un s´ ılice cuyas part´ ıculas tengan una media de di´ ametro inferior o igual a 80 µm. De forma ventajosa se utilizar´ a un volumen de disolvente de extracci´ on de 1 litro por una cantidad de 90 a 180 g de materia prima vegetal previamente triturada y secada.1 de volumen del concentrado volumen de disolvente de extracci´ on utilizado en la fase 1a ¯ ).1. ıa . on reducida. posteriormente.15 de volumen de concentrado a partir de 1 un 0. o d3) una mezcla de los disolventes d1 y d2 en proporciones variables. la fase 6a ¯ ) consta de una serie de separaciones sucesivas.. Preferentemente dicha conLa concentraci´ on prevista en la fase 3a ¯ ) se realiza bajo presi´ centraci´ on se realizar´ a de modo que se obtenga de 0.07 a 0. y mejor a´ a partir de 1 volumen de disolvente de extracci´ on utilizado en la fase 1a a asimismo un ¯ ). es decir por cromatograf´ ıa sobre aginas 2923 columna y bajo presi´ on.aluego. a De forma ventajosa. El lavado de la fase 4a ´cido mineral dilu´ ıdo y luego con agua destilada. 7 60 . Preferentemente. seg´ un t´ ecnica descrita por W. (1978). p´ 2925. H2SO4 o HNO3. Generalmente se realiza por gravedad. la columna aqu´ ı utilizada se cubrir´ a con s´ ılice de baja granulometr´ ıa. STILL y al. Brevemente. Se utilizar´ evaporador rotativo que opere bajo presi´ on reducida al ba˜ no maria a una temperatura de 40 a 70◦ C. El a ´cido ¯ ) se consigue con un a mineral dilu´ ıdo puede ser HCl. para la fase 7a ¯ ): 45 50 55 d1) una mezcla de tolueno/isopropanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla tolueno/isopropanol (88/12) v/v] que puedan contener en un momento dado una baja cantidad [inferior o igual al 5% en volumen con relaci´ on al volumen de dicha mezcla] de dietilamina. las cromatograf´ ıas de las fases 6a ¯ ) y 7¯ ) se llevan a cabo sucesivamente con los siguientes pasos: 10 15 20 25 30 35 40 para la fase 6a ¯ ): a) mezcla de hexano/acetato de etilo en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla hexano/acetato de etilo (60/40) v/v]. 5 on cl´ asica que tiene por objeto separar lo insoluble y recoger La separaci´ on de la fase 2a ¯) es una filtraci´ el extracto l´ ıquido o medio l´ ıquido de extracci´ on.2 052 044 reducida. J. 43.5N y mejor a´ un 1 volumen de a ´cido HCl 1N por 4 volumenes del concentrado obtenido en la ınimo 1 volumen de agua destilada por 4 volumenes del concentrado obtenido en fase 3a ¯ ).. La evaporaci´ on de la fase 5a ua ventajosamente bajo presi´ on reducida de modo que se elimine ¯ ) se efect´ practicamente todo el disolvente de extracci´ on contenido en el concentrado lavado resultante de la fase 4a ¯ ). La cromatograf´ ıa de la fase 6a ¯ ) se realiza con disolventes de polaridad creciente al objeto de retener las fracciones aisladas de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE. c) una mezcla de acetato de etilo/metanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla acetato de etilo/metanol (98/2) v/v]. Chem.flash y posteriormente una Con preferencia. de acuerdo con las calidades dadas anteriormente. d2) una mezcla de cloroformo/acetona/etanol en la que las cantidades respectivamente de los tres componentes se encuentren en proporciones variables. Se utilizar´ a ventajosamente dos veces 1 volumen de ´ acido HCl 0.C.

25 bars cuando se trate de una mezcla tolueno/isopropanol.1. El mejor modo de llevar a cabo este procedimiento de extracci´ on consiste en someter las hojas trituradas y secadas de Rollinia sp MAAS (5972) a las siguientes operaciones: on con eter de petr´ oleo a una temperatura comprendida entre 10◦C y la temperatura de 1◦ ) extracci´ reflujo del medio de extracci´ on (p. se pueden utilizar en el momento de llevar a cabo la fase 6a ¯ ). o d3) una mezcla de los disolventes d1 y d2 en proporciones variables o componentes an´ alogos. Seg´ un el invento. al menos un componente elegido 8 .18 y 0.15 3◦ ) concentraci´ del volumen del concentrado a partir de 1 volumen de eter de petr´ oleo utilizado en la fase 1a ¯ ). d1.5 . la temperatura de ebullici´ on del disolvente de extracci´ on). c) una mezcla de acetato de etilo/metanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla acetato de etilo/metanol (98/2) v/v]. cuando se efect´ ua la cromatograf´ ıa . debiendo contener dichos disolventes sucesivamente. a raz´ on de por lo 4◦ ) lavado del concentrado as´ menos dos veces 1 volumen de ´ acido HC1 0.5N y luego de al menos una vez 1 volumen de agua destilada por 4 volumenes de concentrado obtenido en la fase 3a ¯ ). 2◦ ) filtraci´ on de dicho extracto eteropetr´ olico bajo presi´ on reducida para obtener de 0.07 a 0. mediante asociaci´ on con un excipiente fisiol´ ogicamente aceptable. por un lado.22 bars cuando no comporte la mezcla de tolueno/isopropanol. b) acetato de etilo puro. a raz´ on de 1 litro de eter de petr´ oleo por 90 a 180 g de materia vegetal triturada y secada. y por otro entre 0. 55 60 a Practicamente. o con unos disolventes an´ alogos. 20 ı obtenido con el a ´cido HCl dilu´ ıdo. las fases 1a ¯ ) y 2¯) pueden realizarse sucesivamente con un aparato del tipo Soxhlet. 25 30 35 a) una mezcla de hexano/acetato de etilo en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla hexano/acetato de etilo (60/40) v/v]. de modo que no se retengan m´ as que las fracciones aisladas de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE. se recomienda que la presi´ on de gas en la columna de elecci´ on est´ e comprendida entre 0. conteniendo 40 45 50 d1) una mezcla de tolueno/isopropanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables [conviene realizar la mezcla tolueno/isopropanol (88/12) v/v] que puedan contener en un momento dado una baja cantidad [inferior o igual al 5% en volumen con relaci´ on al volumen de dicha mezcla] de dietilamina.flash de las fases 6a ¯ ) y 7¯ ). luego con agua.e. on de dichas fracciones aisladas de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE por cronoma7◦ ) purificaci´ tograf´ ıa bajo presi´ on sobre columna de s´ ılice de baja granulometr´ ıa. entonces se utilizar´ a en la fase 7a ¯ 5 a Por otra parte. d2 o d3. uno o varios disolventes ) un disolvente d1. d2) una mezcla de cloroformo/acetona/etanol en la que las cantidades respectivamente de los tres componentes se encuentren en proporciones variables.2 052 044 Como variante.2 y 0. ıa bajo presi´ on del res´ ıduo de evaporaci´ on as´ ı obtenido con unos disolventes de polaridad 6◦ ) cromatograf´ creciente sobre columna de s´ ılice de granulometr´ ıa inferior o igual a 80 µm. on del concentrado as´ ı lavado bajo presi´ on reducida de modo que elimine practicamente 5◦ ) evaporaci´ todo el eter de petr´ oleo contenido en dicho concentrado lavado. se preconiza una composici´ on terap´ eutica tanto humana como veterinaria. que refuerza. procediendo posteriormente a la separaci´ on por cromatolog´ ıa sobre una delgada capa de s´ ılice para aislar al menos uno de los componentes de f´ ormula I donde R = H u OH. 10 15 on para separar lo insoluble y recoger el extracto eteropetr´ olico obtenido de tal forma. d2 o d3 con menos polaridad.

(87. La fracci´ on A aislada por medio de la mencionada mezcla de acetato de etilo/metanol (0. el marc se seca durante dos meses en cuba ventilada.(1 . en 190 g de s´ ılice (Kieselgel Merck 9385).30 por CCM sobre placa de s´ ılice. A 9 . Dicha fracci´ on (0.hidroxiundecilo) .1 g por 1 kg de materia prima vegetal previamente triturada y secada. (87. Bien entendido que el conjunto de dichos elementos no es limitativo y se da meramente a t´ ıtulo informativo.5/10/2.25 por CCM sobre placa de s´ ılice. aislante: tolueno/isopropanol/dietilamina. (N◦ de C´ 40 La fracci´ on B obtenida de la separaci´ on del extracto eteropetr´ olico siguiendo las modalidades operatorias descritas anteriormente en el ejemplo 1.5 . Esta primera fracci´ on se cromatograf´ ıa de nuevo bajo presi´ on sobre columna de s´ ılice (95 g) utilizando el disolvente tolueno/isopropanol (88/12) v/v. luego con acetato de etilo puro y m´ as tarde por la mezcla de acetato de etilo/metanol (98/2) v/v.(5 . El rendimiento es de 0. 8 g del extracto eteropetr´ olico.2.2 052 044 entre el conjunto que contienen los componentes de f´ ormula I y sus estereois´ omeros ´ opticos y geom´ etricos. utilizando como aislante la mezcla de tolueno/isopropanol/acetona (75/6/19) v/v. lavada 2 veces en 50 ml de ´ acido clorh´ ıdrico 1N. y especialmente para los mam´ ıferos.tetrahidrofurano 15 odigo: OL 261087) (N◦ de C´ 260 g de hojas de Rollinia sp MAAS (5972) reducidas en polvo y secadas se extraen por 2 litros de eter de petr´ oleo en un aparato de tipo Soxhlet. disolvente tolueno/isopropanol/dietilamina. La evaporaci´ on del eter de petr´ oleo deja un res´ ıduo de 11. 10 5 Ejemplo 1 Obtenci´ on de 2 .22 .5/10/2.2 .5. en soluci´ on con la mezcla hexano/acetato de etilo (60/40) v/v se cromatograf´ ıan bajo presi´ on.metilo .2 . Ejemplos 2 y 3 20 25 30 35 Obtenci´ on de dos is´ omeros del producto del ejemplo I odigo: OL 291087 y OL 301087). La fracci´ on 3 est´ a constitu´ ıda por 155 mg del componente OL 291087 puro [Rf. 0.tetrahidrofuranilo] . constitu´ ıda por 200 mg del componente OL 261087 puro [Rf 0. OL 171187 y OL 181187) (N◦ de C´ 55 60 Tras la extracci´ on por eter de petr´ oleo de 260 g de hojas de Rollinia ulei (MAAS 5972) de acuerdo con las modalidades descritas en el ejemplo 1.[13 . El aislamiento se lleva a cabo mediante la mezcla hexano/acetato de etilo (60/40) v/v.oxo . El rendimiento global es de 1.1. Por supuesto.5 g) reacciona muy positivamente al reactivo de KEDDE.5) v/v]. 1 vez por 50 ml de agua destilada y secada en sulfato de sodio anh´ ıdrido.5 .5) v/v].trihidroxitridecilo] . el ingrediente activo interviene siguiendo una cantidad farmac´ euticamente eficaz.furanilo) .. Otras ventajas y caracter´ ısticas del invento se comprender´ an mejor leyendo los siguientes ejemplos de preparaci´ on y los resultados farmacol´ ogicos. Se recoge la segunda fracci´ on aislada as´ ı obtenida.5) v/v]. 0. en tal composici´ on que conviene tanto en terap´ eutica humana y veterinaria.3 g (rendimiento: 4. produce una reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE. Se obtienen 2 fracciones A y B que reaccionan positivamente al reactivo de KEDDE.dihidro . La soluci´ on eteropetr´ olica se concentra bajo presi´ on reducida hasta 200 ml. Se obtienen varias fracciones y recoge las fracciones 3 y 5.8 g) se cromatograf´ ıa de nuevo bajo presi´ on sobre columna de s´ ılice (95 g). aislante: tolueno/isopropanol/dietilamina.8 g por 1 kg de materia prima vegetal triturada y secada inicialmente.0. Ejemplos 4 a 6 Obtenci´ on de tres otros is´ omeros del producto del ejemplo I odigo: OL 161187. (87. El rendimiento es de 0. 45 50 La fracci´ on 5 est´ a constitu´ ıda por 95 mg del componente OL 301087 puro [Rf. Este producto se distingue debilmente por CCM del componente OL 291087. 12 .3 .5/10/2.[5 .5 g por 1 kg de materia prima vegetal triturada y secada inicialmente.23 por CCM sobre placa de s´ ılice.4%).

luego.8 g (OL 171187.2.5/10/2.5 litros de diclorometano en un aparato del tipo Soxhlet.8 g (OL 181187.3 por CCM sobre placa de s´ ılice. El concentrado as´ ı obtenido se lava 3 veces con 200 ml de a ´cido HCl 1N. tras la debida filtraci´ on.5 .15 g (OL 181187. Estudio de citotoxicidad y citoestasis 45 50 55 60 Raiz ensayada: Se toman como base c´ elulas epiteliales KB provenientes de un carcinoma oral epidermoide humano. Los rendimientos obtenidos por 1 kg de materia prima vegetal previamente triturada y secada son los siguientes: 0. La segunda fracci´ on recogida est´ a constitu´ ıda por 78 mg del componente OL 301187 puro [RF 0. Ej. 2 veces con 200 ml de agua destilada. 1. es decir los componentes OL 161187 (40 mg) OL 171187 (405 mg) y respectivamente OL 181187 (219 mg).(1 . 11 y 13. (87.15 por CCM sobre placa de s´ ılice empleando como aislante la mezcla tolueno/isopropanol /dietilamina (87.5) v/v. La fracci´ on 11 (1.5/12. Las respectivas Rf son 0. y luego se seca con sulfato de sodio anh´ ıdrido.22 0.tetrahidrofurano 30 35 40 odigo: OL 051187) (N◦ de C´ La fracci´ on 10 obtenida en el momento de la cromatograf´ ıa del extracto de diclorometilico siguiendo las modalidades operatorias descritas en los ejemplos 4 . promastigote seg´ un protocolo operatorio descrito a continuaci´ on. obtenida en el momento de la cromatograf´ ıa del extracto de dicloromet´ ılico siguiendo las modalidades operatorias descritas en los ejemplos 4 .tetrahidrofuranilo] .oxo .[13 .1.5/10/2.5 g) se somete a una nueva cromatograf´ ıa bajo presi´ on en columna de s´ ılice (112 g).5) v/v). Ejemplo 7 Obtenci´ on de otro is´ omero del producto del ejemplo I 25 5 10 15 20 odigo: OL 301187) (N◦ de C´ La fracci´ on 13.3 .metilo .2 . El polvo vegetal de tal modo alcalinizado se extrae entonces con 2.hidroxiundecilo) . Entre las 16 fracciones obtenidas.(5 . se somete a una nueva cromatograf´ ıa bajo presi´ on en columna de s´ ılice (112 g). aislante: tolueno/isopropanol /dietilamina.[5 .dihidro .5/10/2. (87.6. aislante: tolueno/isopropanol /dietilamina. La actividad antiparasitaria ha sido determinada in vitro sobre Leishmania donovani. Ejemplo 8 Obtenci´ on de 2 .5) v/v.6. Ej.25 por CCM sobre placa de s´ ılice. El res´ ıduo (8.2 .5 . Esta cromatograf´ ıa permite obtener sucesivamente tres componentes puros.furanilo) .5/12. 5) y 0. utilizando la mezcla tolueno/isopropanol (90/10) v/v. se somete a una nueva cromatograf´ ıa bajo presi´ on en columna de s´ ılice (112 g) utilizando como aislante la mezcla de tolueno/isopropanol (87. El aislamiento se realiza por medio de dicha mezcla de cloroformo/acetona/etanol (95/4/1) v/v.12 . El rendimiento global es de aproximadamente 0. tres presentan reacciones muy positivas al reactivo de KEDDE. el mencionado clorometano se evapora bajo presi´ on reducida por medio de un evaporador rotativo. Ej. es decir: las fracciones 10. 6). Estudio farmacologico A continuaci´ on se resumen los resultados de ensayos llevados a cabo con los componentes de acuerdo con el invento. El concentrado lavado as´ ı obtenido se desembaraza de una parte de sus pigmentos mediante agitaci´ on en presencia de carb´ on vegetal.5 g) se pone en soluci´ on en la mezcla de cloroformo/acetona/etanol (95/4. El rendimiento global es de aproximadamente 0. La soluci´ on dicloromet´ ılica se concentra bajo presi´ on reducida en un evaporador rotativo hasta conseguir ocupar un volumen de 1 litro. 10 . utilizando como aislante la mezcla tolueno/isopropanol (87. La toxicidad se ha evaluado por la medida de citotoxicidad y de citoestasis con respecto a c´ elulas KB siguiendo una t´ ecnica habitual.1) v/v y se cronomatograf´ ıa bajo presi´ on en 190 g de s´ ılice (Kielselgel Merck 9385).3 g de OL 301187 por 1 kg de materia prima vegetal previamente triturada y secada. La segunda fracci´ on recogida est´ a constitu´ ıda por 76 mg del componente OL 051187 puro (Rf 0.2 052 044 continuaci´ on se tritura durante dos horas con 30 ml de amon´ ıaco semidilu´ ıdo. 4).3 g de OL 301187 por 1 kg de materia prima vegetal previamente triturada y secada.5) v/v.5) v/v].20 y 0.dihidroxitridecilo] .

364. “Determination of aginas 109 . 40 Estudio antiparasitario Raiz ensayada: Se toma como base una raiz de Lieshmania donovani LRC L52 (de la colecci´ on OMS).Leishmania: El cultivo se realiza en caja de 24 c´ upulas que contienen 500 µl cada una del medio.hidroxietilo . Analytical Biochemistry.. y luego se coloca en estufa a CO2 a 26◦C durante 3 o 11 .piperazina N’ .000 promastigotes por c´ upula. and Med. 20..etanosulf´ onico) 90% en volumen 10% en volumen 10 15 2 ml por 100 ml del medio Medida del efecto citoest´ atico: El cultivo se realiza en caja de 12 c´ upulas que contienen 2 ml cada una del medio. El producto a ensayar se pone en soluci´ on en dimetilsulf´ oxido (DMSO) y se diluye con el medio de cultivo. El medio se ´4 cultiva con 500. EAGLE “Propagation in a fluid medium of a human epidermoid carcinoma strain aginas 362 . Proc. 10. 40 y 50 µm por ml de medio.2 .J. El valor obtenido se compara con un testigo desprovisto de producto (densidad o ´ptica de 100%). 89. (1965) y comercializadas por la KB (21811)”. 5 Medio de cultivo: El medio de cultivo utilizado ten´ ıa la siguiente composici´ on medio de cultivo 199 medio SVF tampon HEPES (´ acido N . la dosis citot´ oxica corresponde a la dosis letal para el 100% de las c´ elulas (completa desaparici´ on de la capa celular). 159. 30. 35 20 25 30 Resultados: Los resultados obtenidos se consignan en el siguiente cuadro I. La soluci´ on as´ ı obtenida se a˜ nade al medio de cultivo para obtener concentraciones del producto a ensayar de 5. Soc. Despu´ es de fijar las El medio cultivado y as´ ı tratado se coloca en un tubo a 37◦ C durante 3 d´ c´ elulas por el m´ etodo llamado al cristal violeta [seg´ un t´ ecnica de R. 45 Medio de cultivo: El medio de cultivo utilizado ten´ ıa la siguiente composici´ on: 50 - 55 60 medio EAGLE modificado DUBBELCO medio RPMI 1640 conteniendo 25% milimoles de tampon HEPES suero de ternero fetal inactivado al calor penicilina a 5 UI/ml kanamicina 45% en volumen 45% en volumen 10% en volumen 5 µ g/ml 5 µ g/ml Medida del efecto anti . p´ Sociedad llamada EUROBIO.2 052 044 obtenidas seg´ un H. Exp. GILLIER y al. ıas. Las c´ elulas se a˜ naden al mismo tiempo que la soluci´ on o producto a ensayar. Biol. Medida del efecto citot´ oxico: En las anteriores condiciones. La medida cell number in monolayer cultures”.2 . (1986)]. p´ de la actividad citost´ atica se realiza por lectura de la densidad ´ optica a 590 nm.113.

0 3. La medida de la actividad se realiza contando las c´ elulas en el hemocit´ ometro. comparando el n´ umero resultante con un testigo desprovisto de producto (100% de c´ elulas.2 052 044 horas.2 >20 10 (100%) (c) 10 (87%) (d) 20 (79%) 20 (98%) 10 (97%) (e) 10 (71%) (f) 10 (96%) (g) 20 (11%) 40 ∗∗∗ ∗∗ estad´ ısticamente muy significativo estad´ ısticamente significativo 45 (a) con respecto a las c´ elulas KB (b) en µg/ml (c) DI = 5 µg/ml por inhibici´ on del 83% 50 (d) DI = 5 µg/ml por inhibici´ on del 40% (e) DI = 5 µg/ml por inhibici´ on del 95% y 55 DI = 20 µg/ml por inhibici´ on del 100% (f) DI = 20 µg/ml por inhibici´ on del 93% (g) DI = 20 µg/ml por inhibici´ on del 99% 60 12 . Ej. Ej.50) y las dosis de inhibici´ on m´ aximas medidas (Dimax). Ej. Ej. Cuadro I Producto 25 20 N◦ C´ odigo Citotoxicidad (a) (b) Citoestasis (a) (b) 20∗∗∗ 20∗∗ 20∗∗ 20∗∗ 20∗∗ 20∗∗ 20∗∗∗ 20∗∗ DI . equivale al 0% de inhibici´ on de crecimiento). Ej. Ej.2 10. 10 5 Resultados: Los resultados obtenidos se consignan igualmente en el siguiente cuadro I.0 7. 15 Con las acetogeninas del invento. Las cajas cultivadas y tratadas por el producto se dejan en la estufa durante 3 o ´4 d´ ıas. se han obtenido buenos resultados en el tratamiento de parasitosis. El producto a ensayar se a˜ nade en soluci´ on al DMSO a concentraciones variables bajo un volumen de 25 µl por c´ upula.0 7. Notas 1 2 3 4 5 6 7 8 OL OL OL OL OL OL OL OL 261087 291087 301087 161187 171187 181187 301187 051187 40 40 40 40 40 50 40 40 2.0 5. especialmente de bilharziosis en el hombre y de leptospirosis en el perro. en el que figuran las dosis de inhibici´ on a 50% (DI .50 (b) Dimax (I%) (b) 30 35 Ej. Cada manipulaci´ on se realiza dos veces.5 6. Ej.

y (ii) sus estereois´ omeros ´ opticos y geom´ etricos. debiendo contener dichos disolventes sucesivamente a) una mezcla de hexano/acetato de etilo en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables.15 3◦) concentraci´ del volumen delconcentrado a partir de 1 volumen de eter de petr´ oleo utilizado en la fase 1a ¯ ).5N y luego de al menos una vez 1 volumen de agua destilada por 4 volumenes de concentrado obtenido en la fase 3a ¯ ).lactonas respondiendo a la siguiente f´ ormula: 10 15 20 25 en la que R representa H u OH. luego con agua. c) una mezcla de acetato de etilo/metanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables o de disolventes an´ alogos. Procedimiento de preparaci´ on de una acetogenina elegida por el conjunto constitu´ ıdo por 5 (i) las (tetrahidrofuranilo) . on para separar lo insoluble y recoger el extracto eteropetr´ olico obtenido de tal forma. conteniendo como aislante 13 50 55 60 . 2◦) filtraci´ on de dicho extracto eteropetr´ olico bajo presi´ on reducida para obtener de 0.1. on de dichas fracciones aisladas de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE por cronoma7◦) purificaci´ tograf´ ıa bajo presi´ on sobre columna de s´ ılice de baja granulometr´ ıa. ıa bajo presi´ on del res´ ıduo de evaporaci´ on as´ ı obtenido con unos disolventes de polaridad 6◦) cromatograf´ creciente sobre columna de s´ ılice de granulometr´ ıa inferior o igual a 80 µm.5 . 35 40 45 on del concentrado as´ ı lavado bajo presi´ on reducida de modo que elimine practicamente 5◦) evaporaci´ todo el eter de petr´ oleo contenido en dicho concentrado lavado.07 a 0.2 052 044 REIVINDICACIONES 1. 30 yu ´til en terap´ eutica humana y veterinaria como medio antiparasitario. de modo que no se retengan m´ as que las fracciones aisladas de reacci´ on positiva al reactivo de KEDDE. a raz´ on de por lo 4◦) lavado del concentrado as´ menos dos veces 1 volumen de ´ acido HCl 0. b) acetato de etilo puro. la caracter´ ıstica de dicho procedimiento consiste en someter las hojas trituradas y secadas de la variedad Rollinia ulei (MAAS 5972) a las siguientes operaciones: on con eter de petr´ oleo a una temperatura comprendida entre 10◦C y la temperatura de 1◦) extracci´ reflujo del medio de efracci´ on del disolvente de extracci´ on a raz´ on de 1 litro de eter de petr´ oleo por 90 a 180 g de materia vegetal triturada y secada. ı obtenido con el a ´cido HCl dilu´ ıdo.

5/10/2. pudiendo contener en un momento dado una baja cantidad de dietilamina inferior o igual al 5% en volumen con relaci´ on al volumen de dicha mezcla. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1. de 10 de octubre.5) v/v. las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992. caracterizado por el hecho de que se utiliza un disolvente tolueno/isopropanol /dietilamina (87. 60 14 . se utiliza una mezcla de tolueno/isopropanol (88/12) v/v. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´ e o no inclu´ ıda en la mencionada reserva. 5. que puede contener adem´ as una cantidad de dietilamina inferior o igual al 5% en volumen con relaci´ on al volumen de dicha mezcla de tolueno/isopropanol.2 052 044 d1) una mezcla de tolueno/isopropanol en la que las respectivas cantidades de los dos componentes se encuentren en proporciones variables.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986. procediendo posteriormente a la separaci´ on por cromatolog´ ıa sobre una delgada capa de s´ ılice para aislar al menos uno de los componentes de f´ ormula I donde R = H u OH. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1. 2. 15 5 10 3. caracterizado por el hecho de que en la fase a). o de un aislante an´ alogo. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1. 167. se utiliza una mezcla de hexano/ acetato de etilo (60/40) v/v. caracterizado por el hecho de que en la fase d1). 20 25 30 35 40 45 50 55 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 4. o d3) una mezcla de los disolventes d1 y d2 en proporciones variables. no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ ımicos y farmac´ euticos como tales. se utiliza una mezcla de acetato de etilo/metanol (98/2) v/v. relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 4. caracterizado por el hecho de que en la fase c). d2) una mezcla de cloroformo/acetona/etanol en la que las cantidades respectivamente de los tres componentes se encuentren en proporciones variables.