Makalah Imunokimia

ELISA (Enzim Linked Imuno-Assay)

Disusun oleh : Anggita Setya Damayanti 115130100111025 Rini Nuraini 115130100111026 Hammam Shardi Mirrah 115130100111034 Navilla Y.Afanin M 115130100111035 Oktalavia Dwi Noer R 115130100111036 Ummu Syahidah R 115130100111040 Dyah Ayu Nur Rohma 115130100111045 Dinta Ardeli Mandasari 115130101111026 Wachidatun Nisa’ 115130101111030 Sri Retno Dewi Andriani 115130101111036 Septian Vidya Pangastuti 115130101111041 Virginia Anugrah Yutasari 115130101111049

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang Penyakit mulut dan kuku (PMK), atau sering disebut Foot and Mouth Disease (FMD), adalah salah satu penyakit menular pada hewan dan sangat ditakuti oleh hampir semua negara di dunia, terutama negara-negara pengekspor ternak dan produk ternak. Indonesia pertama kali tertular PMK pada tahun 1887 di daerah Malang, Jawa Timur. Pada umumnya PMK menyerang hewan berkuku genap, seperti sapi, kerbau, kambing, domba, babi, gajah, jerapah, dan menjangan. Penyebab PMK adalah virus yang sangat kecil, berdiameter ±20 milimikron, terbentuk dari asam inti ribo yang diselubungi protein. Virus ini sangat labil, antigenisitasnya cepat, dan mudah berubah. Hewan yang terserang penyakit PMK dengan menunjukkan gejala klinis akan dengan mudah didiagnosa dengan melihat gejalan klinisnya, namun untuk PMK subklinis, harus dilakukan serological test untuk dapat menentukan diagnosa. Tes netralisasi virus diketahui sebagai metode standar untuk mendeteksi antobodi FMDV (Foot and Mouth Disease Virus). Tetapi, prosedur laboratorisnya memakan waktu 2-3 hari, sehingga tes ini tidak sesuai untuk pengawasan hewan dalam jumlah besar. Metode lain dalam OIE manual adalah liqiud phase blocking (LPB) ELISA. Kekurangannya, pertama, dibutuhkan training dan pengalaman untuk menghasilkan hasil yang akurat. Kedua, reaksi positif palsu dapat terjadi sebanyak 4% pada hewan sehat yang tidak divaksin dan 18% pada hewan stress. Seperti yang telah diketahui, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) adalah tes yang menggunakan antibodi dan perubabahan warna untuk mengidentifikasi substansi. ELISA dikenal sebagai uji biokimia bertipe analisis “wet-lab” yang menggunakan solid phase dari Enzyme Immunoassay (EIA) untuk mendeteksi antigen pada sampel liquid atau sampel basah. Antigen dari sampel akan diikatkan ke permukaan well, kemudian antibodi yang spesifik ditambahankan sehingga dapat mengikat antigen. Antibodi tersebut diberi enzim dan langkah terakhir, substansi berisi substrat enzim ditambahkan. Reaksi subsequent akan memproduksi sinyal yang dapat dideteksi, umumnya perubahan warna pada substrat. Untuk itulah, tes deteksi PMK yang berasal dari pengembangan ELISA yang akan dibahas pada berikut ini dipilih dan diharapkan dapat menjadi rujukan untuk deteksi cepat PMK/FMD.

1.2 Tujuan • • Mengetahui prinsip kerja dari ELISA Mengetahui metode pengembangan dari ELISA untuk menyempurnakan metode pengujian PMK 1.3 Manfaat • Dengan mengetahui prinsip kerja dari ELISA diharapkan selanjutkan dapat menciptakan metode pengembangan ELISA untuk menyempurnakan metodemetode sebelumnya. . • Memberikan rujukan untuk mendeteksi PMK dengan metode yang telah dikembangkan dari ELISA.

.

dan kambing. ada tujuh tipe virus PMK.BAB II ISI 1. Metode dan Bahan 2. Pengantar Penyakit mulut dan kuku (PMK) adalah penyakit yang sangat menular pada hewan berkuku seperti sapi. Penyakit mulut dan kuku disebabkan oleh virus genus Aphtovirus dari famili Picornaviridae. 2. sinar UV. Hewan yang terinfeksi PMK klinis dapat terdeteksi secara langsung. . 2. Sel Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen) untuk propagasi bikulovirus rekombinan ditumbuhkan pada medium Grace (Invitrogen) yang diperkaya dengan 10% serum bovine fetal heat-inactivated dan larutan antibiotic-antimikolitik. virus berdiameter 10 – 20 milimikron dan terbentuk dari Ribonucleic acid (RNA) serta diselubungi oleh protein.1 Sel dan Virus Sel yang digunakan adalah Sel IBRS-2 ditumbuhkan pada medium esensial alpha minimum (MEM) yang diperkaya dengan 10% serum bovine fetal heat-inactivated dan larutan antibiotic-antimikolitik. C. tetapi hewan yang terinfeksi PMK subklinis harus dilakukan uji serologis terlebih dahulu. tidak tahan pH asam dan basa. O. Adapun uji lain yaitu liquid phase blocking (LPB) ELISA tetapi uji ini memiliki kelemahan yaitu membutuhkan pengalaman dan dapat menimbulkan hasil positif palsu. Adanya penyakit ini dapat menyebabkan kerugian ekonomi karena penurunan produksi susu serta kendala penjualan hewan hidup dan produk hewan. Sifat-sifat virusnya yaitu sangat labil. namun uji ini membutuhkan waktu yang lama dan fasilitas yang memadai. panas. Uji yang dapat digunakan adalah uji netralisasi virus untuk mendeteksi antibodi terhadap virus. Tetapi hal ini memiliki resiko sehingga dikembangkan protein rekombinan yang berasal dari virus PMK P1 dan 3C yang diekspresikan dalam sel insekta. Virus ini single strand. babi. 3. domba. Penyebaran virus PMK di berbagai negara menyebabkan ELISA berbasis protein rekombinan dikembangkan sebagai pengganti LPB ELISA untuk mendeteksi antibodi virus PMK serotip Asia 1. Penggunaan virus PMK inaktif membutuhkan antigen yang diproduksi di dalam laboratorium. yakni A. Oleh karena itu perlu ditingkatkan solid phase competitive (SPC) ELISA terutama untuk virus PMK serotipe O. antigenisitasnya cepat dan mudah berubah. Asia¸ South African Teritorry (SAT) 1.

3CF. 5_-GAA GGG ATC CAT GGG AGC CGG GCA ATC AGT CCG-3_. Sedangkan untuk gen 3C menggunakan P10 promoter XhoI and Sphl). (Untuk gen P1 menggunakan polyhedrin promotor BamH1 dan Spel untuk disisipkan pada kloning pada pFastBacdual. P1R. Setelah itu menggunakan DNA primer. diikuti dengan transfeksi dari DNA recombinan bacmid kedalam sell sf9 dan kemudian disimpan pada suhu 4oC sampai digunakan . .2. DNA komplementer untuk P1 dan RNA 3 C dihasilkan menggunakan AccuPower RT oremix. 5_-TAG GAC TAG TTA CAA AGT CTG TTT CTC AGG TGC-3_. and 3CR.2. • PCR amplifikasi dari gen P1 dengan menggunakan siklus thermal dengan tahap : Denaturasi 95oC selama 2 menit 30 detik Dilanjutkan dengan tahapan suhu 55oC selama 30 detik dan 72oC selama 2 menit 30 detik. Hasil yang didapat akhirnya Rekombinan baculovirus yang mengandung gen P1 dan 3C dihasilkan . 5_-AAC AGC ATG CTA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC-3_ . Dari rekombinan pFastBac/P1/3C tersebut menggenerasi dari Recombinan DNA baculovirus menjadi baculovirus shuttle vector (bacmid) dan diperbanyak dalam DH10Bac Eschericia coli (Invitrogen) menggunakan bac-to-bac sistem ekpresi baculovirus. . Dan terakhir ekstensi pada suhu 72oC selama 5 menit • Untuk PCR amplifikasi gen 3C sama dengan gen p1 hanya saja pada tahap elongasi menggunaan waktu 1 menit dengan suhu 72oC. P1F. Gen diamplifikasi dari cDNA menggunakan nPfu DNA polimerase. 5_-GAT TCT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C-3_. Generation of recombinant baculovirus containing the P1 Viral RNA diekstrak dari FMD yang terinfeksi dan sel IBRS-2 menggunakan ekstraksi RN mini kit. Masing-masing amplifikasi dari P1 dan 3C dikloningkan secara terpisah pada kloning apFastBacDual vector.

1/Ind/63/72) dicampur dengan Freund (Daejeon. Goat anti rabbit dikonjugasi dengan alkalin phosphatase (KPL). kemudian anti VPI kelinci dtambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC.3. Kemudian colorimetric reaction dikembangkan dengan menambahkan satu component solution of 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitro blue tetrazolium (KPL) 2. Sampel protein dipisahkan menggunakan NUPAGENovex Bis-Tris gels dengan Xsel SureLockmini-selInvitrogen. Ditambahkan 1:1000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC . Sera ini diperoleh dari Peptron Inc .4 Sera dan antibody monoklonal Disiapkan serum kelinci terhadap VP1 peptidewas dari inokulasi kelinci subkutan dengan hemocyanin limpet lubang kunci (KLH) digabungkan urutan peptida AY304994. Protein ditransfer dari gel ke nitrocelular membran selama 1 jam.2. Sel dibekukan dan thawing 3 kali dan diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 10. Sel yang terinfeksi dicampur dengan aseton dingin dan methanol kemudian diperiksa dengan peptide serum antiVPI kelinci. Expression of recombinant proteins Sf9 ditumbuhkan pada termos(suhu rendah) yang diinfeksi dengan reombinan baculovirus pada multiplicity of infection (MOI) dan dipanen untuk menentukan ekspresi optimal untuk maksimal rekombinan protein.000xg selama 30 enit. Anti VPI peptide serum dicampurkan dengan 1:100 pada phosphate buffered saline (PBS) selama 1 jam pada suhu 37 oC. Bovine sera yang tertutup di LPB ELISA digunakan untuk perbandingan awal sensitivitas relatif dan crossreactivity dari rP13C ELISA relatif terhadap LPB ELISA. Setelah dicuci dengan PBS . Imunofluoroescence assay (IFA) digunakan untuk menkonfirmasi ekspresi dari rekombinan protein. Kemudian diperiksa dengan fluorescence mikroskop untuk western blot analisis. Supernatan (rP13C) digunakan untuk diagnosa antigen pada penelitian. Dicuci dengan TBST . Ini berdasarkan pada untuk menyelesaikan adjuvan pada awalnya dan kemudian didapatkan adjuvant lengkap pada tiga penguat. antibodi sekunder . sintetik Asia (139TGPTRRGDLALQRVSNRLP157. FITC dikonjugasi dengan anti-rabbit antibodi dan dicairkan lagi dengan PBS 1:100 dan diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37oC. Korea). Sel Sf9 tumbuh pada wadah yang tterinfeksi dengan rekombinan baculovirus pada 5 MOI.

Caprine sera (n = 4) dikumpulkan dari empat kambing pada 40 hari setelah pengambilan intradermal di leher dengan strain Mongolia (As1/MOG/05) pada 20 hari pasca imunisasi tunggal dengan trivalen Vaksin (O. dilakukan pemurnikan MAB 70-17 (2g/ml) didalam 0. Bovine divaksinasi dengan dua dosis trivalen (O. Prancis) dalam volume akhir 3 ml. Inggris). Mab dipilih (1A31) dimurnikan menggunakan ImunoPure dengan pemurnian Kit IgG (Pierce. Paris. USA) dan diberi label menggunakan perodixase pelabelan kit (Roche Diagnostics. Swiss) sesuai dengan instruksi pabrik. sehingga penambahan ini berfungsi untuk mempertahankan pH .05 M Carbonat buffer pada pH 9. Korea). A. Basel.6 yang diinkubasi semalaman pada suhu 4 ̊ c.adalah kontrol yang kuat-positif dan moderat-positif sera sapi untuk serotipe Asia 1 (Shamir strain). 138EESSRRGDLAALARRVNNRLP158.760) dari hewan yang tidak memiliki riwayat paparan PMK virus diperoleh dari sapi (n = 640). dan serum sapi yang kuat-positif serotipe O.5. Buffer adalah zat yang dapat mempertahankan pH ketika ditambah sedikit asam/basa atau ketika diencerkan. Recombinant protein-based ELISA (rP13C ELISA) MaxiSorp ELISA plates yang telah dilapisi. A. Sebuah antibodi monoklonal (Mab) digunakan sebagai antibodi capture (70-17) diproduksi dengan metode fusi sel seperti yang dijelaskan sebelumnya (OEM et al. semua subjek tidak menunjukkan gejala FMD seluruh eksperimental periode. A. 2. Divaksinasi bovine serum (n = 68) yang diperoleh di lapangan selama 2000 PMK wabah di Republik Korea. dan C. yang disintesis di Peptron Inc dan menerima injeksi intravena sebagai booster akhir 3 hari sebelum fusi sel dengan sel myeloma SP2 / O. 2007). dan Asia 1) dari Merial (Surrey. berdasarkan pada urutan As1/MOG/05. Mereka berdarah pada 14 hari posting imunisasi pertama dan pada 13 dan 20 hari posting kedua imunisasi. Buffer memiliki dua macam yaitu asam lemah dan garamnya atau basa lemah dan garamnya. IL. babi (n = 560) dan kambing (n = 560) di peternakan dalam negeri yang telah didiagnosa sebagai negatif oleh nonstruktural protein (NSP) ELISA (Jenobiotech. dan Asia) vaksin.. Untuk mendapatkan Mab. IFA dan tes netralisasi virus.Sel hibridoma disaring oleh peptida ELISA. digunakan detektor antibodi untuk bersaing dengan antibodi serum. Dua babi 60-hari-tua diimunisasi dua kali intramuskular dengan protein rP13C di amixturewith IMS1313 adjuvant (Seppic. Tikus (BALB / c) diimunisasi empat kali dengan peptida KLP-terkonjugasi yang sesuai ke VP1 epitop. Gangwon. Akhirnya. Sera (n = 1.

Selanjutnya reaksi ditambahkan “Stop-reaction” berupa 50 чl yang mengandung 1.05% Diencerkan 1:8 berisi PBST mengandung 5% skim susu pada suhu 37 oC selama 1 jam Dicuci kembali dan dilakukan pengenceran 1”10 dan diinkubasi suhu 37 oC selama 1 jam . reaksi colorimetric dapat diketahui setelah 15 menit dengan menambahkan 0.05 M citrate phosphate buffer dengan pH 5 yang mengandung 0.1 чl/mg MAB konjugat ditambahkan horseradish peroxidase kedalam plate selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37c ̊ selama 1 jam. Larutan PBS berfungsi sebagai larutan penyangga dalam berbagai eksperimen untuk mempertahankan pH protein.6 mg/ml Ophenylenediamine didalam 0.05 % dan diinkubasi dengan 50 чl atau rP13C dengan pengenceran 1:18 dimana dalam pengenceran itu berisi PBST yang mengandung 5 % skim susu pada suhu 37̊ c selama 1 jam. Nilai Optical Density dapat dihitung dengan rumus: Hasil standardisasi dihitung dengan melihat nilai OD pengenceran serum positif tertinggi dibandingkan dengan nilai OD pengenceran serum negatif terendah. PI (%)= 100 x {1-(OD test serum / OD control)} Berikut adalah skema pengerjaan Recombinant protein-based ELISA (rP13C ELISA) MaxiSorp ELISA plate dimurnikan dengan MAB yang mengandung 0. Setelah pencucian dengan PBST 50 чl didalam terkandung 0.6 dan diinkubasi semalaman pada suhu 4oC Dicuci 3 kali dengan larutan PBS 0.015 % hydrogen peroxide. Pencucian bertujuan untuk melepaskan ikatan non spesifik sehingga didapatkan ikatan spesifik yang dikendaki saja yang ada didalam plate. selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dengan perbandingan 1:10 dan diinkubasi kembali pada suhu 37̊ c selama 1 jam.05 M carbonat buffer pada pH 9.larutan. Setelah plate dicuci total 5 kali pencucian.25 M sulpuric acid. Optical density dapat dibaca pada panjang gelombang 492 nm. Plate kemudian dicuci 3 kali menggunakan larutan PBS 0. Setelah itu dicuci kembai.

Sel-sel IBRS-2 tumbuh dengan baik pada 96 well micropipette yang telah diinfeksi dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 selama 48 jam sebelumnya dicampur dengan aceton dan methanol dalam keadaan dingin.6 mg/ml O-phenylenediamine didalam 0.6 Others test (tes lain) IFA digunakan untuk menguji rekasi spesifik antara MAB (IA31) untuk FMDV Asia 1. Lalu tambahkan konjugat berupa anti-rabbit-antibodies (KPL) yang telah diencerkan dengan perbandingan 1:100 dngan PBS dan diinkubasi pada suhu 37o c selama 1 jam. Fungsi pencucian adalah untuk membuang ikatan non spesifik yang tidak dikendaki sehingga yang tersisa dalam late adalah ikatan spesifik yang dikehendak. yang akan berikatan dengan antibody atau dengan reseptor spesifik pada permukaan limfosit T Posisi epitope dengan antibody harus berdekatan dan sesuai yang merupakan ikatan non kovalen. Sel-sel tersebut yang telah di treatmen menggunakan 1A31 dimana epitope akan selalu berada pada bagian VP1 diinkubasi pada suhu 37o c selama 1 jam.- Setelah pencucian 5 kali baru ditambah 0. Setelah pencucian dalakukan pembacaan menggunakan fluorescence microscope. Immunofluorescence assay adalah teknik dimana antibodi berlabel dengan molekul fluorescent (fluorescein atau rhodamine atau salah satu dari banyak zat warna fluorescent lainnya) digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dalam atau pada suatu sel atau jaringan oleh fluoresensi yang dipancarkan oleh antibodi terikat.05 M - Ditambahkan “stop reaction” berupa 1.25 M sulpuric acid Pembacaan hasil juga dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 429 nm 2. Cara kerja Sel IBRS-2 tumbuh baik pada 96 well micropipette yang telah diinfeksi dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 selama 48 jam Dicampur dengan aceton dan methanol dalam keadaan dingin Ditreatmen dengan menggunakan 1A31 yang memiliki epitope pada bagian VP1 . Epitop adalah Suatu tempattempat tertentu dari suatu imunogen yang sifatnya aktif. Jumlah epitop pada satu molekul antigen berbeda dengan jumlah epitop pada antigen yang lain. Setelah itu dicuci dengan larutan PBS.

1 Ekspresi protein rekombinan pada sel serangga Rekombinasi baculovirus yang mengandung gen P1 dan 3C dibawah 2 promoter yang berbeda dihasilkan melalui transfeksi sebuah rekombinasi DNA bacmid ke dalam sel serangga. . positive jika nilainya lebih dari sama dengan 45. Intrepentasi hasil Uji netralisasi virus dinyatakan sebagai berikut: - negative jika nilainya kurang dari sama dengan 11. 3. maupun untuk membantu / melengkapi diagnosis penyakit. Hasil 3. Expresi Titer dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran akhir serum di mana 50% dari well yang telah dilapisi. dubius jika nilainya antara 16 sampai 32 maka uji harus diulang. Titer dinyatakan sebagai angka kebalikan tertinggi dari pengenceran akhir yang masih dapat menunjukkan reaksi hasil uji postitif dengan nilai OD sebesar 50%. mempelajari penyebaran penyakit. rP13C yang diekspresikan di sel serangga dengan rekombinasi baculovirus dapat diidentifikasi menggunakan IFA dengan peningkatan serum kelinci yang melawan peptida FMDV VP1. Namun nilainya tidak selalu tepat 50% akan tetapi jika nilainya sudah menunjukkan 45% maka dianggap hasil positif . Uji ini berfungsi untuk mengetahui adanya penyakit di suatu daerah. Analisa Western blot memperlihatkan adanya serum yang melawan peptide VP1.- Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam Dicuci dengan larutan PBS Ditambahkan konjugat berupa anti-rabbit-antibodies (KLP) yang telah diencerkan 1:10 dengan PBS - Diinkubasi pada suhu 37 oC delama 1 jam Dicuci kembali Dilakukan pembacaan menggunakan fluorescence microscope Uji netralisasi Virus dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 menggunakan cell IBRS 2. Untuk mengetahui apakah reaktivitas diperoleh dari precursor P1 atau subunit VP1 membelah oleh 3C.

Secara kontras. 2 ekor babi diimunisasi sebanyak 2 kali dengan protein rP13C dengan jarak 2 minggu. Diperoleh data yang menunjukkan bahwa sera yang didapat dari seekor babi . (B) Profil rP13C pada sel sf9. protein rP13C dikoleksi setiap hari setelah sel serangga terinfeksi oleh rekombinan baculovirus dan kemudian dianalisis menggunakan Western blot. Sebagai protein control. Gambar 1. Pita VP1 mulai diobservasi 4 hari pascainfeksi hingga hari terakhir pengujian (hari ke 7 pascainfeksi). Protein rekombinan dikoleksi setiap hari setelah infeksi rekombinan baculovirus dan Western blot memperlihatkan anti-VP1 serum pda kelinci mendeteksi pita VP1 yang diperoleh dari precursor P1 melalui pembelahan 3C protease.2 Imunogenitas protein rekombianan pada babi Untuk mengetahui apakah protein rP13C dapat menimbulkan neutralizing antibodies pada hewan yang peka. dengan peningkatan serum kelinci melawan FMDV VP1. C adalah control positif. Nomor 1-7 mengindikasi hari pertama pascainfeksi (dpi) hingga 7 hari pascainfeksi. indikasi tersebut memperlihatkan bahwa reaksi fluorescence sebagian berasal dari protein VP1 melalui pembelahan oleh 3C protease seperti yang diharapkan. pita VP1 tidak secara nyata terlihat pada sel serangga yang terinfeksi recombinan baculovirus yang hanya mengandung P1. Sel yang diperiksa mengandung serum kelinci untuk melawan peptide FMDV. 3. inaktif antigen FMDV pada kit ELISA juga memprlihatkan pita VP1 yang sama. (A) Hasil Immunofluorescence assay untuk ekspresi rP13C pada sel sf9. Untuk menguji profil time course expression.Pita yang terlihat secara jelas berhubungan dengan adanya VP1.

. hal ini mengindikasikan bahwa penggunaan Mab kemungkinan sebagai detektor antibodi untuk berkompetisi dengan serum antibodi. Sera dari babi lain (#71) menunjukkan bahwa titer virus neutralization adalah 16 pada hari ke 13 pasca imunisasi kedua kemudian pada hari ke 20 pascaimunisasi juga mengalami penurunan. Hasil mengindikasikan bahwa protein rP13C mempertahankan neutralizing epitopes.3 Produksi dan karakterisasi Mab Neutralizing Mab diproduksi dari tikus yang diimunisasi dengan peptide FMDV VP1 yang berbasis pada As1/MOG/05. LPB ELISA juga menujukkan pola yang sama yang berhubungan dengan titer dari semua sera babi. Hal ini ditunjukkan dengan reaksi positif untuk strain Mongolian menggunakan IFA. yaitu supernatant dari kultur hibridoma menunjukkan titer virus neutralization adalah 128 untuk semua strain Mongolian dan Cambodian.(#51) memperlihatkan titer virus neutralization adalah 45 pada 13 hari pasca imunisasi kedua dan turun menjadi 22 pada hari ke 20 pasca imunisasi kedua. 3. Antibodi yang dipilih yaitu 1A31 adalah sebuah isotype IgG1 dan mengandung kappa light chains. Untuk mengetahui apakah Mab juga dapat berikatan dengan strain lain dari FMDV serotype Asia 1. IFA menggunakan Cambodian stain (CAM 9/80) dan menghasilkan hasil reaksi positif seperti strain Mongolian. Mab memiliki aktivitas FMDV neutralizing.

rP13C ELISA menunjukkan lebih dari 99% spesifisitas untuk setiap spesies sera secara keseluruhan. 3.5 kali lipat dan 2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA dan uji netralisasi virus. Pembacaan hasil dari rP13C ELISA rP13C ELISA dibaca menggunakan rP13C dan neutralizing Mab (1A31). 3. The rP13C ELISA dan LPB ELISA menunjukkan endpoint titer yang setara 1. Ketiga alat uji dibandingkan untuk caprine sera yang dikumpulkan pada 40 hari setelah injeksi oleh As1/MOG/05 FMDV vaksinasi single dengan vaksin trivalen (Gambar 4).5 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus untuk serum (# 4). Dengan tingkat cut-off. lebih dari setengah dari total sera yang diuji termasuk dalam PI 10. naif sera (n = 1760) yang berasal dari babi. kekhususan akhir menjadi 99. ditunjukkan pada Gambar. Sel IBRS-2 diinfeksi dengan strain Mongolian (A) dan strain Cambodian (B) dari FMDV Asia 1 dan diuji dengan Mab 1A31 yang spesifik untuk FMDV VP1.4. Immunofluorescence assay dari 1A31 untuk FMDV serotype Asia 1. dengan menghitung nilai rata-rata ditambah tiga kali standar deviasi. Selain itu. Cut-off tingkat PI ditentukan pada 50% untuk mengamankan kekhususan tinggi terlepas dari spesies. Untuk menentukan tingkat cut-off PI untuk rP13C ELISA. Untuk dua lainnya caprine sera (# 2 dan # 3).7%. peroksidase-conjugated Mab dan pengenceran serum. titik akhir titer oleh rP13C ELISA adalah 1. sapi dan kambing domestik diperiksa oleh rP13C ELISA (Tabel 2). Sebuah standarisasi awal dari semua komponen dilakukan untuk menentukan konsentrasi optimal rP13C terdiri dari antigen. Evaluasi rP13C ELISA dibandingkan dengan LPB ELISA dan uji virus netralisasi. Titik akhir titer rP13C ELISA dan LPB ELISA yang setara untuk satu caprine serum (# 1) dan sekitar 3 kali lipat lebih tinggi dibandingkan oleh Uji netralisasi virus atas dasar tingkat cut-off setiap assay ini. .Gambar 2.

rP13C ELISA setara . rP13C ELISA mencetak serum positif lemah sebagai positif dan cut-off serum sebagai negatif. Validasi rP13C ELISA Untuk uji musiman rP13C ELISA bisa menggantikan LPB ELISA untuk surveilans serologi di lapangan. sera dari dua ekor babi diimunisasi dengan rekombinan protein (rP13C) yang bekerja (Tabel 1). Titik akhir titer oleh rP13C ELISA setara dengan LPB ELISA dan lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus untuk sera babi (# 71) yang dikumpulkan pada 13 dan 20 hari pasca imunisasi kedua. rP13C ELISA memberikan titer endpoint 4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA untuk Asia 1 serum yang positif kuat (C ++) yang berasal dari ternak terinfeksi strain Israel FMDV. 68 sapi sera dikumpulkan pasca vaksinasi selama 2000 wabah PMK di Korea. Tiga sera lainnya. PI 50. rP13C ELISA dievaluasi untuk tahap FAO XVIII referensi sera internasional yang terdiri dari tingkat cut-off kuat. Sebagai tes awal untuk spektrum yang luas dari reaktivitas ini. Selain itu. Untuk menguji reaktif silang kontrol serum positif serotipe lain yang diterima.Untuk menguji kecocokan rP13C ELISA pada PMK di masing-masing spesies. rP13C ELISA juga mengakibatkan endpoint titer 2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA. hanya satu serum yang juga negative oleh LPB ELISA. menunjukkan bahwa secara keseluruhan. perlu dibuktikan apakah rP13C ELISA juga bisa mendeteksi antibodi terhadap jenis lain FMDV Asia 1. dan lemah (Tabel 4). Karena protein rP13C dan 1A31 Mab diproduksi pada dasar urutan Mongolia strain. Untuk satu babi serum (# 51) dikumpulkan pada 13 hari pasca imunisasi kedua. sera kontrol positif digunakan dalam LPB ELISA kit.5. yang menunjukkan kurang reaktivitas silang untuk serotipe A dan C sera. titik akhir titer oleh rP13C ELISA 8 kali lipat dan 4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan uji virus netralisasi dan LPB ELISA. dibagikan sekitar tingkat cut-off. Untuk serum (# 51) yang dikumpulkan pada 20 hari pasca imunisasi kedua. Untuk Asia 1 moderate-serum positif (C +). bagaimanapun. Dari empat negative sera oleh rP13C ELISA. mencapai puncak pada 13 hari pasca imunisasi kedua dan menurun pada 20 dpi. akhir titik titer oleh rP13C ELISA adalah sekitar 6 kali lipat dan 3 kali lipat lebih tinggi daripada yang di uji dengan uji netralisasi virus dan LPB ELISA. 3. Sementara rP13C ELISA mencetak empat sera sebagai negatif. Tiga uji serologis menunjukkan pola titer yang sama. Selama rP13C ELISA bereaksi dengan serotipe O serum pada tingkat sebanding dengan LPB ELISA. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3. LPB ELISA hanya mencetak dua sera sebagai negatif. LPB ELISA mencetak cut-off serum sebagai positif.

Pembahasan Dalam studi percobaan ini digunakan sel serangga untuk membuat protein rekombinan dari virus Penyakit Mulut dan Kuku (FMDV) untuk mendeteksi antibodi FMDV serotype Asia 1. dengan identifikasi dari VP1 yang tidak muncul ketika P1 saja yang diekspresikan. 4. Beberapa penelitian melaporkan bahwa prekursor P1 dan gen protease 3C atau 3CD dalam famili virus Picornaviridae dapat membuat partikel mirip virus dengan menggunakan bakteri E. Walaupun tidak dikonfirmasi secara langsung menggunakan mikroskop electron namun hasil dari ekspresi dan pembelahan P1 dan 3C protease dapat membentuk partikel sebagai serotipe O yang diinginkan untuk percobaan ini. meskipun pada praktiknya titer netralisasi virus rP13C ini rendah sehingga perlu pemurnian lebih lanjut untuk menilai imunogenitas dari vaksin protein rekombinan ini.dengan LPB ELISA dalam mendeteksi antibodi terhadap FMDV Asia 1 yang divaksinasi sera sapi. Berdasarkan hasil tersebut. rP13C dihasilkan dalam sel serangga sehingga bisa menimbulkan antibodi pada babi. Baculovirus. Jenis vaksin virus FMD yang dilemahkan yakni Mab (1A31) digunakan sebagai detektor diagnostik dalam penelitian ini dihasilkan oleh imunisasi yang VP1 peptida sesuai dengan loop GH yang dikenal imunologis penting karena berisi situs reseptor sel. perlu untuk mengatasi keterbatasan antigen yang dibutuhkan yakni memasukkan sel epitop B kemudian membangun partikel mirip virus P1 dan gen 3C yang sesuai dengan pembentukan alami dari FMDV sendiri. Sebuah penelitian sebelumnya mengenali situs antigenik kelanjutan Mab I (residu 144-159) yang digunakan untuk fase padat ELISA untuk mendeteksi antibodi serotipe O dari virus FMD. Penggunaan Mab di . coli. Oleh karena itu. dan vaksin vektor virus. Namun dalam percobaan tersebut vaksin yang digunakan pada hewan coba gagal bereaksi dengan VP-1 peptida. Ekspresi dan pembelahan P1 prekursor dengan 3C protease dikonfirmasi menggunakan analisis Western blot . upaya untuk menghasilkan partikel virus FMD yang dibuat menggunakan vektor baculovirus yang berisi baik P1 dan gen 3C dalam sel serangga untuk menggantikan virus FMD yang aktif untuk mendeteksi antibodi terhadap serotipe Asia 1. Dihasilkan protein rP13C yang memiliki sturktur yang sama dengan virus FMD yang kemudian bersaing dengan antibodi FMD yang berupa vaksin atau infeksi virus FMD sendiri. Sebelumnya terdapat metode menggunakan VP-1 peptida (virus capsid Protein) berbasis ELISA dalam mengukur respon serologis untuk FMDV serotipe protein sturktural O.

Tetapi sejak rP13C ELISA dilakukan dalam pemblokiran Format ELISA. Penelitian yang lebih luas perlu dilakukan untuk virus FMD jenis lainnya di masa depan untuk memastikan bahwa 1A31 Mab dapat mengikat spektrum yang luas dari strain Asia 1. uji netralisasi virus untuk sera dikumpulkan dari kambing yang ditantang dengan FMDV Asia 1 post-vaksinasi mungkin telah disebabkan oleh strain (As 1 / MOG/05) yang homolog dengannya dari rP13C dan Mab berasal. sejak rP13C ELISA merupakan sandwich ELISA dengan 70-17 Mab yang dilapisi untuk menangkap protein rP13C. dan beberapa negara dianggap memiliki endemik PMK. untuk semua babi sera dimana nilai-nilai titer berbatasan tingkat cut-off masing-masing tes. Meskipun kontrol serum positive berasal dari strain FMDV homolog terhadap antigen tertutup di LPB ELISA kit. dapat digunakan untuk menguji serum dengan cara yang sama terlepas dari spesies hewan. titik akhir titer oleh rP13C ELISA lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA. Karena sebagian besar variasi FMDV menyebabkan perubahan kodon dan fenotipe virus baru. Hal ini karena homolog imunogen dan rP13C ELISA menunjukkan pola titer sama dengan virus uji netralisasi dan LPB ELISA. tertutup dalam LPB ELISA kit. Karena wilayah Timur Tengah berada pada risiko tinggi untuk PMK melalui perdagangan ruminansia hidup dari Asia dan Afrika. Namun. diketahui bahwa epitop pada permukaan antigen dikenali langsung oleh Mab competitor atau diblokir oleh sterik hindrance atau perubahan konformasi yang diinduksi oleh antibodi yang mengikat epitop lain. . The 1A31 Mab digunakan dalam rP13C ELISA bisa menetralisir strain Kamboja FMDV Asia 1 ke tingkat yang sama seperti strain Senin-golian. rP13C ELISA menghasilkan titik akhir titer lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus dan LPB ELISA untuk sera yang berasal dari babi yang diimunisasi dengan protein rP13C. Oleh karena itu.ELISA ini juga menjamin kontrol kualitas yang konsisten dibandingkan dengan serum poliklonal yang meminimalkan jumlah variasi. yang berasal dari sapi yang terinfeksi dengan strain Israel FMDV Asia 1. itu tidak diperlukan untuk memurnikan rP13C untuk menghapus protein lain yang berasal dari sel-sel serangga. itu perlu untuk menguji serum yang berasal dari strain FMDV memiliki origi terkontaminasi di daerah ini. Hasil ini menunjukkan rP13C ELISA memiliki potensi untuk menggantikan LPB ELISA dan uji netralisasi virus untuk FMDV Asia 1 surveilans serologi di negara-negara Asia Tenggara yang endemis PMK. yang digunakan untuk menilai rP13C ELISA dalam kaitannya dengan LPB ELISA. kontrol tambahan serum positif. Maka perlu untuk memastikan bahwa 1A31 Mab juga mengikat strain virus FMD Asia 1.

karena ada sedikit lebih tinggi reaktivitas silang untuk serotipe A oleh LPB ELISA. rP13C. A. dan Asia 1. Sebagai kesimpulan. rP13C ELISA dapat digunakan sebagai sebuah metode yang sederhana dan dapat diandalkan untuk menggantikan LPB ELISA atau tes netralisasi virus. Hal ini mungkin menjelaskan mengapa LPB ELISA mencetak lebih sera sebagai positif dibandingkan dengan rP13C ELISA. A. Hasil bahwa rP13C ELISA mencetak cut-off serum sebagai negatif sedangkan LPB ELISA mencetak gol itu sebagai batas positif tidak mendevaluasi utilitas dari rP13C ELISA. Penyebaran virus yang baru PMK di seluruh benua Asia menunjukkan kebutuhan terus untuk surveilans aktif dan pengembangan bulu-ther program pengendalian daerah . Kemudian dilakukan rP13C ELISA dibandingkan dengan LPB ELISA untuk bovine serum divaksinasi dengan vaksin trivalen (O. Lemahnya serum positif telah disarankan untuk digunakan dalam mewakili standar minimum untuk mendeteksi antibodi dalam tes yang diterapkan untuk serosurveillance berbasis kawanan. Tes serologis untuk mendeteksi antibodi terhadap FMDV protein struktural juga dapat berguna untuk menilai status vaksinasi. ELISA berbasis protein rekombinan dapat digunakan sebagai alternatif untuk LPB ELISA atau tes netralisasi virus untuk mendeteksi antibodi terhadap serotipe FMDV Asia 1. dan Asia 1) di lapangan.rP13C ELISA mencetak serum positif lemah dengan benar. protein antigen rekombinan. yang merupakan keuntungan dari rP13C ELISA atas yang lain tes serologi saat ini yang memerlukan FMDV aktif sebagai antigen diagnostik. serta status infeksi FMDV. Kebanyakan dari semua. Dengan vaksin trivalen. antibodi akan diajukan terhadap serotipe O. kedua tes yang setara dalam mendeteksi antibodi untuk FMDV protein struktural di divaksinasi sera sapi. bisa EAS-ily diproduksi di laboratorium umum tanpa batasan. Hasilnya.

sehingga untuk menunjang metode-metode tersebut. Penyebaran dari FMD virus baru-baru ini di Asia menunjukkan bahwa dibutuhkan pengawasan berkelanjutan dan perkembangan lebih lanjut dari regional control programs. Adanya rP13C ELISA dapat bermanfaat untuk tujuan ini. dikembangkan protein rekombinan yang diperoleh dari FMDV P1 presecutor dan gen 3C protease yang digunakan sebagai alternatif sebagai antigen virus yang dinonaktifkan untuk LPB ELISA atau virus neutralization test untuk mendeteksi antibodi dari FMDV serotype Asia 1. .BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan Uji serologis yang telah menjadi standar untuk uji PMK atau FMD masih memiliki beberapa kelemahan.

. A Recombinant Protein-Based ELISA For Detecting Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Serotype Asia 1. Hyang-Sim Lee. Journal of Virological Methods 159 (2009) 112–118. 2009. Kwang-Nyeong Lee.DAFTAR PUSTAKA Joon Ko. Chang-Hee Kweon. Hoo-Don Joo. Su-Mi Kim. Eun-Jeong Heo. Byung-Sik Chang. Young. Seung-Min Hong. Jong-Hyeon Park. Hye-Young Jeoung.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful