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Licenciatura

em Bioqumica | 2012/2013 Laboratrio de Bio>sica e Bioqumica

Crystal Structures Explain Func9onal Dierences in the Two Ac9n Depolymeriza9on Factos of the Bisha K. Singh, et al. Malaria Parasite
Laboratrio de Bio>sica e Bioqumica 2012/2013 | Licenciatura em Bioqumica

Professoras responsveis: Dra. Maria Rosrio Dra. Maria Stretch

Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho

Objec&vos

Licenciatura em Bioqumica | 2012/2013 Laboratrio de Bio>sica e Bioqumica

Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Comparar e iden9car as diferenas estruturais das duas isoformas de ADF presentes nos Plasmodium Perceber os diferentes comportamentos das duas isoformas Perceber de que modo essas diferenas esto relacionadas com a malria

Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho

Introduo

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Muitas vezes associada ao mosquito Anopheles, mas na verdade um pequeno parasita protozorio (Gnero Plasmodium) Apresenta pequenos lamentos de ac9na localizados entre a membrana plasm9ca e a membrana interna do complexo paras9co. U9liza estes lamentos como motor para mo9lidade e invaso celular.

Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho

Introduo

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Ac9n-depolymeriza9on factors (ADFs) pertencem famlia das ADF/Colina que regulam a dinmica dos lamentos de ac9na. Ligam-se aos lamentos de F-ac9na, quebrando as interaes monmero- monmero. Ligam-se G-ac9na, desestabilizando a troca de nucle9dos ADP por ATP.

ADF do Plasmodium falsiparum. Pormenor das hlices (vermelho). Estrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e manipulao em Chimera.

Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho

Introduo

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Os protozorios possuem apenas uma ADF. O Plasmodium possui duas isoformas: ADF1 e ADF2 A ADF1 apenas se liga G-ac9na A ADF2 liga-se F-ac9na e G-ac9na
ADF do Plasmodium falsiparum. Pormenor da super>cie da protena. Estrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e manipulao em Chimera.

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Introduo PfADF1

Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Laboratrio de Bio>sica e Bioqumica

Monomrica 14 kDa 127 resduos de aminocidos 4 -helixes 6 -strands 10 -turns


ADF do Plasmodium falsiparum. Pormenor das hlices (vermelho) e das folhas (amarelo). Vdeo ob9do a par9r do cheiro PDB 1XF1 e manipulao em Chimera.

Vdeo ADF1_Pf

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Introduo PbADF2

Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Laboratrio de Bio>sica e Bioqumica

Dimrica 17 kDa (monmero) 148 resduos de aminocidos 4 -helixes 6 -strands 10 -turns


ADF do Plasmodium berghei. Pormenor das hlices (vermelho) e das folhas (amarelo). Vdeo ob9do a par9r do cheiro PDB 1XFA e manipulao em Chimera.

Vdeo ADF2_Pb

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Procedimento

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Amplicao das sequncias codicantes para a PfADF1 e PbADF2 por PCR

Enzimas de Restrio BamHI e XhoI

Digesto com as respec9vas enzimas

gDNA

gDNA Amplicado

Sequenciao para vericar

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Procedimento
Clonagem do Gene

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E. Coli; 36h; 291K; 800mL de meio AI

(GST)-PfADF1

Cultura

E. Coli; 12h; 291K; Expresso induzida por 0,6mM de -D-1-9ogalactopiranosdio de isopropil (GST)-PfADF2 Cultura

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Procedimento
(GST)-PfADF1

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Centrifugar (4000g; 277K; t=40min)

Tampo de Lise

Sonicao
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Procedimento
(GST)-PbADF2

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Centrifugar (15300g; 277K; t=15min)

Tampo de Lise

Sonicao
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Procedimento
(GST)-PfADF1

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

(GST)-PbADF2

Cromatograa de Anidade

Dilise durante a noite

Cromatograa de Anidade

Dilise durante a noite

Remoo do vetor GST (4,5g/mL Potease C3; 24-36h; 277K) Super>cie da ADF1 com destaque para as foras de Coulomb,
(vermelho) -10; (azul) +10. Manipulao em Chimera.

Remoo do vetor GST (3,5g/mL Potease C3; 6-8h; 277K)

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Procedimento
PfADF1 e PbADF2

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Coluna cromatogrca HiLoad 16/60 Superdix 75pg (GE Healthcare)


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Procedimento
(GST)-PfADF1

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

(GST)-PbADF2
Para determinar o folding e a estrutura secundria foi feita Espectroscopia de Dicrosmo Circular com radiao de sincrotro.

Avaliao do estado oligomrico e monodisperso da protena por ltrao em gel

Coluna cromatogrca 10/300 Superdix 75pg (GE Healthcare) Imagem demonstra9va de um Sincrotro.

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Procedimento
Cristalizao

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Mtodo da gota sentada Difuso de vapor

PfADF1 e PbADF2

Cristal da PfADF1

T=277K; ADF1 (pH 7,8); ADF2 (pH5,2) Cristal da PbADF2


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Procedimento
Obteno da G-Ac9na
G Tampo

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Ac9na d as humana plaquetas s lioliz ada

Dilise durante a noite

ADP G-Ac9na

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Procedimento
ac9na ADPG-

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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

Avaliar a interao da ac9na com as ADFs


PfADF1 o u PbAD F2

Incubar; t=30min; Tsala

Na9ve PAGE | Electroforese em gel de poliacrilamida a 7,5%; P=5W; t=60min; T=277K SDS-PAGE|Sistema tampo NuPAGE MES; Colorao com prata

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Procedimento
Cosedimentao
c9na a - P T A 4M

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ADFs (difere n

1mM M gC

tes concent

l2 e 0,15 M KCl

raes)

Incubar; t=2 a 3 h; Tsala

Ac9na polimerizada Centrifugao

SDS-Page
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Procedimento

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Estudo cin9co da polimerizao da ac9na


4M ADPG-Ac9na + Tampo de polimerizao

360nm

407nm

PfADF1 e PbADF2

Monitorizao da Fluorescncia; t=15min

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Procedimento

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Ensaio de Despolimerizao da Ac9na pelas ADFs


TRITC-marcado 2,88M ADPG-Ac9na 1mM MgCl2 0,15M KCl

Polimerizao; t=30min; Tsala PfADF1 e PbADF2 Observao ao LSM

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Resultados

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Alinhamento das Sequncias da PfADF1 e PbADF2 GPLGSMISGIRVNDNCVTEFNNMKIRKTCGWIIFVIQNC. GPLGSMVSGVNVSDECIYEFNRLKVKHLNKYIIYKIENLE EIIIHSKGA.S.T.....TLTELVQSIDKNNEIQCAYVVF KIVVDVLEHDMELTSLDNIIMRIKNNLK..N.TECRYIIA DAV.........SKIHFFMYARESSNSRDRMTYASSKQAI DMPIPTPEGVLRDRIYFIFWSPGLSKPKEKMLYAASKESL LKKIEGV.NVLTSVI..E..SAQDVADLK....! VRKINGIFKSL.E.ITCDINEFEEELKAIILNT!
-Hlices Folhas HOMOLOGIA: 25,6198%
Sequncia, emparelhamento e homologia ob9dos por Chimera
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Resultados

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ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera.

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Resultados

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N-Terminal

F-loop C-Terminal
ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera.
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ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento); pormenor das Cys 24 e 34. Estrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 com manipulao em Chimera.
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N-Terminal

ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor do N-terminal de ambas as estruturas.
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ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da hlice #3.

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-Hlice 4

ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da hlice #4 e das sequncias antecedentes N-Terminal. Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho

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ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro 2XFA com manipulao em Chimera. Destacada a Leu-96 e a Pro-94.

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ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da ligao a um lamento de F-ac9na.
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Introduo | Procedimento (Estrutura | Ensaios Bioqumicos) | Resultados

ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da ligao a um lamento de F-ac9na.
Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho