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Fabricación de solución de Cloruro Férrico.

Para los interesados que no tengan experiencia de química y, para deslindar responsabilidades del riesgo que significa manipulear sustancias altamente corrosivas, recuerdo que se deberá utilizar guantes de látex y realizar el proceso en un lugar con extracción forzada del aire ambiente o en su defecto realizar las reacciones por ejemplo en una parrilla con tiraje natural. Y siempre sin presencia de niños que por sus inesperados movimientos pueden causar serios desastres y quemaduras. Además deberán proveerse por lo menos de los siguientes elementos: -Vaso de precipitados de 400 ml -Vidrio de reloj de 12 cm de diámetro -Varilla de vidrio maciza de 8-10 mm de diámetro -Probeta graduada de 100 ml -Probeta graduada de 10 ml -Plancha eléctrica calefactora de 100-150° C -Balanza que detecte +/- 1 g -CLH de d =1.19 (ácido clorhídrico o muriático concentrado) -NO3H de d =1.42 (ácido nítrico concentrado) -H2O2 10 volúmenes (agua oxigenada de 10 volúmenes) -Alambre común no galvanizado (tipo para enfardar). También se puede utilizar clavos comunes de los más pequeños. O virutas de algún taller mecánico; pero con la condición que no este mezclado con virutas de otros metales y además habrá que secarla y desengrasarla, porque dicha viruta esta impregnada con aceite soluble utilizado en la máquina herramienta. Procedimiento. - Obtención de la solución concentrada de Cloruro Férrico. Pesar 10 g de alambre. Si no se dispone de balanza, hay varias opciones para solucionar este problema: 1- Hacer pesar un rollo de alambre, medir su longitud y calcular cuántos centímetros o metros se necesitan para obtener 10 g. 2- Hacer pesar por ejemplo 1 Kg de clavos, contar los clavos y calcular por regla de tres simple cuántos clavos se necesitan para obtener 10 g. 3- Recurrir a algún joyero o algún farmacéutico conocido que seguramente disponen de balanza de precisión. Colocar el alambre en un vaso de precipitados de 400 ml. Agregar 50 ml de agua común, medidos con la probeta de 100 ml, y 50 ml de ácido clorhídrico concentrado, medidos con la misma probeta. Colocar el vaso sobre una plancha caliente a unos 100 °C. Si el ataque es muy violento con tendencia a desbordar el vaso, retirar de la plancha caliente y si el ataque es muy lento, calentar para acelerar la reacción. Esperar que el alambre se disuelva totalmente, verificando con la varilla de vidrio que no haya trozos sin disolver. Una vez disuelto todo el hierro, agregar 10 ml de agua oxigenada medidos con la probeta de 10 ml. Agitar con la varilla de vidrio hasta que la solución cambie de color verdoso a color marrón oscuro. Si no cambia a color marrón, agregar 2-3 o más ml de agua oxigenada hasta que se produzca el cambio de color. Esta solución contiene: 43 % de cloruro férrico (Cl3Fe.6H2O). 2- Preparación de la solución final. En una botella de 1 litro con tapón de plástico (puede ser una botella de sidra), agregar agua hasta aproximadamente la mitad de su volumen.

para separarlos de los ácidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extracción o sustancias como CTAB (cetil trimethyammonium) que colabora en la precipitación del ADN. se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas. método del plato de agarosa. Finalmente agregar agua hasta completar el litro. Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las proteínas del ADN como fenol y cloroformo. es necesario degradarla empleando métodos físicos o químicos. que evite la acción de enzimas degradativas del ácido nucleico. método del mini-gel) o por fluorometria.A continuación agregar 150 ml de ácido nítrico concentrado. La inhibición de nucleasas es un factor crítico. medidos con la probeta de 100 ml. Agregar 75 ml de la solución concentrada de cloruro férrico obtenida según 1-. libre de proteínas.0-9. la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. Esta solución es la solución final que se utiliza directamente para el ataque del cobre de las plaquetas INTRODUCCIÓN La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular. Para bacterias y células desprovistas de pared. Tapar e invertir para mezclar. Colocar el tapón e invertir la botella 1-2 veces para mezclar. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugación. medidos con la probeta de 100 ml. Los métodos físicos son los más empleados.(método de saram wrap. aquí se trabajara específicamente con la extracción de AND vegetal. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción. Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría (absorbancia a una longitud de onda de 260nm). especialmente la congelación y la maceración. esta se alcanza empleando buffer1 con pHs poco óptimos para acción de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato). El pH durante el proceso de extracción debe ser óptimo. carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. o la observación directa con fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro de etidio. Colocar el tapón e invertir 1-2 veces para mezclar. OBJETIVO . Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos. Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos. El ADN libre de proteínas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer2 . para destruir las membranas celulares. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en el buffer. La mayoría de los procedimientos de extracción de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0.

iIsopropanol. • Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra • Agitar • Centrifugar a 5000 rpm /10min en frió a 4°C • Descartar sobrenadante • Resuspender sólido agregando 500?l del buffer2 por cada 70mg de la muestra. etanol 70% PROCEDIMIENTO • Pesar 70mg del tejido. alcohol Isoamilico. (50?g/ml ADN absorbancia de 1) Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido se realiza la siguiente relación: . baño agua (60ºC).HCl (pH 8. tubos de ensayo con tapa. • Leer espectrofotómetro a 260nm. llevarlo a mortero y macerar. espectrofotómetro.0) • 5mM EDTA • 350mM Sorbitol • 0.1% Cetiltrimetilamonio. Buffer 1: • 50mM Tris-HCl (pH8. balanza analítica. • Incubar a 60 °C por 15 minutos • Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una proporción 24:1 • Centrifugar a 5000rpm/10mit • Transferir la fase acuosa a otro tubo • Agregar 2 volúmenes de isopropanol frió -20 °C (para precipitar el ADN) • Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol) • Lavar con Etanol 70% • Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol) • Resuspender el precipitado en 300?l de Tris-Edta. mortero. agitar suavemente. bisturí. REACTIVOS Y MATERIALES Material del que se extrae el DNA (se recomienda utilizar material fresco). tubos eppendorf. pipetas de 5 ml.Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza. (CTAB) Otros reactivos Cloroformo. micropipetas y puntas.1% Mercaptoetanol • 10% polyetilienglicol Buffer 2: • 50 mM Tris.0) • 5 mM EDTA • 350 mM Sorbitol • 0.1% Mercaptoetanol • 1% Sodio Sarkosyl • 710 mM NaCl • 0. centrífuga refrigerada.

rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido. 4. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inocúlela en un tubo falcón de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. En la presente práctica utilizaremos el método de lisis alcalina para la preparación de DNA plasmídico. 10 mM EDTA. PROCEDIMIENTO 1. pH 7.5). Invierta el tubo unas 6 a 8 veces. 6. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. Adicione 200 ul de solución de lisis (0.ADN/Proteina =260nm/280nm Un valor menor de 1. solventes orgánicos. se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase logarítmica del crecimiento. Mezcle hasta que el precipitado quede totalmente disuelto. . OBJETIVO Obtener DNA plasmídico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos. en medio líquido. 1 mM EDTA. agite e incube a 37 °C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA. Centrifugue 1. Muchos de los plásmidos comúnmente utilizados. Precipite los ácidos nucleicos utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos. incluyendo tratamiento con detergentes iónicos y no iónicos. 7. 25 mM Tris-Cl. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solución 5M de acetato de potasio pH 4. los plásmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en medio líquido que contienen el antibiótico apropiado) que han sido inoculados con una colonia bacteriana. 5. 3. pH 8). Esta solución neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis precipitando simultáneamente el DNA genómico y el SDS. álcali o calor. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Las bacterias se recuperan por centrifugación y son lisadas por uno de varios métodos.8. utilice un vortex si es necesario. Resuspenda el precipitado de células bacterianas en 100 ul de tampón GTE (50 mM Glucosa. teniendo especial cuidado en no remover el precipitado blanco. Adicione 10ul de solución de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 °C). Disuelva el precipitado en 400 ul de tampón TE (10 mM Tris-Cl. tomada de un plato de agar. Retire el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf. debido a su facilidad de implementación. 1% SDS). Ponga el cultivo en agitación a 250 RPM y 37oC toda la noche. 2.8 indica contaminación por proteínas. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto.2 M NaOH. MINIPREPARACION DE DNA PLASMÍDICO INTRODUCCIÓN Por lo general.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por 1 minuto.

adicione 100 ?l de acetato de amonio 7.5 M y 1 ml de etanol. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el etanol se haya eliminado). Observe que la fase orgánica de FCI se localiza en la parte baja del tubo eppendorf. Para cuantificar el DNA realice una dilución 1/200 y lea la absorbancia a 260nm . sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la fase orgánica de FCI y transfiérala a un tubo limpio de 1. Para precipitar el DNA del plasmado. cuidadosamente.5 ml. Extraiga las proteínas de la solución que contiene el DNA del plasmido utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico).8. 11. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA del plásmido. Agite vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm por cinco minutes a temperatura ambiente. 9. 10. Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de Tampón TE. incube a -20°C por 15 minutos. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura ambiente.