06/12/2011

Anlisis microbiolgico de alimentos Microorganismos marcadores

En realidad
La mayora de los alimentos contienen microorganismos. No es posible el anlisis de todos los patgenos y de todos los alterantes.
Marcela Martnez M.Sc.

Mara Marcela Martnez Miranda Magister en Microbiologa Departamento de Ingeniera Universidad de Caldas

Porqu buscar microorganismos marcadores?

1. La deteccin de patgenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa. 2. La investigacin de patgenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo. 3. Calidad microbiolgica en trminos de microorganismos marcadores.
Marcela Martnez M.Sc.

Microorganismos marcadores
Son organismos (o grupos) que advierten:
manejo inadecuado presencia de microorganismos patgenos

Su deteccin en el laboratorio es ms sencilla, rpida y/o econmica.

Marcela Martnez M.Sc.

Microorganismos marcadores
ndices
Microorganismos cuya presencia en cantidades o niveles por encima de ciertos lmites numricos indica la posible presencia de patgenos ecolgicamente relacionados.

Caractersticas de un buen ndice de contaminacin en alimentos

1. Origen especfico 2. Tcnicas de laboratorio fiables y rpidas 3. Resistencia a condiciones ambientales y al procesado tanto o ms que los patgenos a los cuales representa.

Indicadores

Microorganismos cuya presencia en cantidades determinadas indica un tratamiento o procesado de inocuidad inadecuado.

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

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Un tratamiento de inocuidad insuficiente cumpliendo de ese modo una funcin de indicador

La presencia posible de patgenos entricos, es decir, una funcin de ndice para microorganismos de importancia para la salud pblica, como por ejemplo las shigelas, que se pudieran haber originado en la zona donde fueron tratados los camarones.

Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso:
Aerobios Mesfilos Psicrfilos y psicrotrficos Termfilos o termodricos Mohos y levaduras

Un microorganismo marcador dado puede funcionar a la vez como ndice y como indicador. Por ejemplo, la presencia de cantidades importantes de E. coli en los camarones precocinados congelados indica:

Coliformes totales

Indicadores de contaminacin fecal:

Coliformes fecales E. coli Enterococos Anaerobios sulfito-reductores
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Otros microorganismos indicadores

Estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus aureus) Recuento de Anaerobios Mesfilos Recuento de Anaerobios Esporulados Recuento de Virus entricos
Marcela Martnez M.Sc.

Mtodos de anlisis microbiolgico

Mtodo: cualitativo
PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g o mL de muestra.
Salmonella sp. Vibrio cholerae Listeria monocytogenes

Mtodo: cuantitativo
Tubos mltiples: NMP/g o mL de muestra Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporacin b. Por superficie
Marcela Martnez M.Sc.

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso

Aerobios mesfilos Psicrfilos y termfilos Mohos y levaduras Coliformes totales
Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de aerobios mesfilos (RAM)

Se desarrollan en presencia de aire a temperaturas medias (25-40C). Dan lugar a la formacin de colonias visibles despus de 72 horas a 3O C ( 48 horas a 37C) sobre un agar de recuento, incubado en condiciones de aerobiosis. Indican: la calidad sanitaria de un alimento. las condiciones de manipulacin. las condiciones higinicas de la materia prima. Marcela Martnez M.Sc.

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Aplicacin del RAM

Alimentos frescos, refrigerados y congelados. Materias primas e insumos. Alimentos listos para consumir.
Marcela Martnez M.Sc.

El RAM NO es til para:

Alimentos fermentados. Col acida, queso y otros derivados lcteos. Alimentos esterilizados (Recuento Microscpico Directo). Alimentos deshidratados y congelados (Recuento Microscpico Directo). Alimentos refrigerados (Recuento de psicrotrficas).
Marcela Martnez M.Sc.

Existen dos mtodos clsicos para el recuento de aerobios mesfilos

RAM por el mtodo de siembra a profundidad

Profundidad 10 -1 (48 h)

10 -2 A (48 h)

10 -2 B (48 h)

10 -3 A (48 h)

10 -3 B (48 h)

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Un RAM elevado indica:

En alimentos estables Materias primas muy contaminadas. Tratamiento no satisfactorio. En alimentos perecederos Materias primas muy contaminadas. Tratamiento no satisfactorio. Almacenamiento en condiciones de temperatura inadecuadas.
Marcela Martnez M.Sc.

Un RAM elevado puede significar:

1. Excesiva contaminacin de la materia prima. 2. Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin. 3. La posibilidad de que existan patgenos, pues stos son mesfilos. 4. La inmediata alteracin del producto.
Marcela Martnez M.Sc.

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Psicrotrficos
Por definicin son organismos que producen crecimiento visible a 7o C 1o C dentro de 7 a 10 das, independiente de su temperatura de crecimiento ptima. Los organismos mayormente asociados con alimentos refrigerados y que causan dao son psicrotrficos y no psicroflicos
Marcela Martnez M.Sc.

Psicrotrficos
Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram positivos y gram negativos; aerbos; anaerobios y anaerobios facultativos.
Aeromonas Bacillus Clostridium Lactobacillus Escherichia Listeria Serratia, ect. Hongos y levaduras
Marcela Martnez M.Sc.

Psicotrficos patgenos
Patgenos
Aeromonas hydrophila Bacillus cereus (algunas cepas) Clostridium botulinum type E, ByF Listeria monocytogenes Vibrio cholerae Yersinia enterocoltica Escherichia coli (algunas cepas)
Marcela Martnez M.Sc.

Psicrotrficos Mtodos de deteccin

Cultivo durante 10 das a 7oC para siembra en profundidad. Cultivo durante 7-8 das a 7o C para siembra en superficie Cultivo durante16 hr a 17O C seguido de 3 das a 7oC

Marcela Martnez M.Sc.

Termodricos
Organismos que pueden tolerar calor y por consiguiente tienen la capacidad de sobrevivir pausterizacin. Son capaces de sobrevivir el calentamiento de un alimento a temperaturas de 60 a 80OC.
Marcela Martnez M.Sc.

Termodricos
Gnero Actinomycetes Alcaligenes Arthrobacter Bacillus Clostridium Coryneform Lactobacillus Microbacterium Micrococcus Pseudomonas Alimento asociado Leche Leche Leche Leche/huevos Leche Huevos Leche/carne/jugos Leche Leche/huevos Huevos

Streptococcus/ Leche/carne/huevo Marcela Martnez M.Sc. Enterococcus

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Coliformes
Bacilos Gram negativos No esporulados Aerobios o anaerobios facultativos Fermentan la lactosa a 35C con produccin de cido y gas Viven en el ambiente y en animales de sangra caliente Los coliformes totales incluyen los fecales
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Son algunas especies que pertenecen a los gneros: Gnero

Escherichia Klebsiella Enterobacter

Fuente
Heces (humanas y animales) Heces, ambiente Heces, ambiente

Citrobacter

Ambiente
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Coliformes como indicadores de contaminacin fecal

Se encuentran en el intestino del hombre y de animales, pero tambin en otros ambientes como: suelo, plantas, cscara de huevo, etc. Son tiles como indicadores de contaminacin fecal por:
Su frecuencia en heces Su fcil deteccin en el laboratorio Sus caractersticas semejantes a algunos miembros patgenos de la familia Enterobacteriaceae
Marcela Martnez M.Sc.

Aplicacin del uso de Coliformes como indicadores

1. Deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los alimentos. 2. Evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto. 3. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo. 4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes reas del procesamiento de alimentos.
Marcela Martnez M.Sc.

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Pruebas de determinacin de Coliformes

1. Investigacin y recuento en medio lquido Se usa el Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) Investigacin y recuento en medio slido Se utiliza el medio selectivo agar biliado rojo-violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA)
Marcela Martnez M.Sc.

Pruebas para deteccin y recuento de Coliformes

1. Prueba presuntiva
Caldo Lauril Triptosa (CLT). Caldo Mc. Conkey. Caldo lactosado bilis verde brillante.

2.

2. Prueba confirmativa:
Medio EC. Medio bilis lactosa (BLVB)
Marcela Martnez M.Sc.

Investigacin y recuento en medio slido

Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 h a 35 C UFC/g (o/mL) de muestra.

Coliformes fecales (CF)

Origen intestinal Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae Bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados. Fermentadores de lactosa a 44.5 C con produccin de gas. Principalmente Escherichia coli (90%)

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Determinacin de CF

Escherichia coli (coliformes termotolerantes)

Capacidad para producir indol a partir de triptfano Produccin de la enzima glucuronidasa. Es el ndice de contaminacin fecal ms adecuado. Hay grandes cantidades de Escherichia coli en las heces humanas y animales.
Marcela Martnez M.Sc.

Su determinacin se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del mtodo de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubacin 44.5 C. Marcela a Martnez M.Sc.

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Determinacin de E. coli
Mtodos basados en:
Produccin de cido y gas a partir de la lactosa. Produccin de la enzima glucuronidasa.

Recuento de Enterobacterias
Familia Enterobacteriaceae Lactosa + y lactosa Se usan como grupo indicador en lugar del grupo de coliformes totales. Son de origen fecal y no fecal.
Marcela Martnez M.Sc.

Los procedimientos incluyen:

Filtracin con una membrana que despus se incuba en medios selectivos a 4445 C. nmero ms probable
Marcela Martnez M.Sc.

Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias como indicadoras en lugar de los coliformes 1. Los coliformes son un grupo mal definido taxonmicamente. 2. Los coliformes solo tienen en cuenta las enterobacterias lactosa positiva. 3. Las Enterobacterias son mas resistentes que los coliformes.
Marcela Martnez M.Sc.

Qu indica niveles altos de Enterobacteiras en alimentos procesados?

Tratamiento inadecuado y/o contaminacin posterior al tratamiento; ms frecuentemente a partir de materias primas, equipos sucios o manejo no higinico Multiplicacin microbiana que pudiera haber permitido el crecimiento de toda la serie de microorganismos patgenos y toxignicos.
Marcela Martnez M.Sc.

Mtodos para el recuento de Enterobacterias

Mtodo de recuento
Recuento en placa Recuento en medio lquido
Confirmacin con prueba de oxidasa

Estreptococos fecales Enterococcus

Se encuentran en las heces de los humanos y animales de sangre caliente. Animales de produccin: vaca, cerdo, oveja, caballo, gallina y pato. Son importantes en situaciones donde se sabe que hay contaminacin fecal y no se detectan coliformes.

Mtodo de ausencia presencia

VRBG Agar

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

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Uso de Enterococcus como indicadores en alimentos

Aunque se encuentran en cantidades menores que E. coli, son mas resistentes. Se consideran indicadores en alimentos procesados, como lcteos y crnicos, en los cuales E. coli no puede sobrevivir.
Marcela Martnez M.Sc.

Especies de Enterococcus
Grupo
Grupo 1

Especies
Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus durans Streptococcus bovis

Hbitat
estn normalmente presentes en las heces de humanos y animales

Grupo 2

Streptococcus equinus Enterococcus avium

no se encuentran comnmente en las heces humanas

Marcela Martnez M.Sc.

Clostridium sulfito reductores

Bacterias Grampositivas, esporuladas, anerobias, reductoras de sulfitos. Se utilizan como indicadores de contaminacin fecal antigua. Clostridium perfringens es de origen fecal y tambin se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza.
Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de esporas de Clostridium sulfito reductores

Se pesan 10g o ml y se homogenizan con 90ml de peptona 0.1% Se realizan diluciones seriadas en 9ml peptona 0.1%

Marcela Martnez M.Sc.

Choque trmico para formacin de esporas

Siembra en fondo en agar SPS

Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 minutos para hacer luego el choque trmico y activar las esporas. Marcela Martnez M.Sc. Para finalizar el choque trmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.

Se siembra 1ml en fondo de la dilucin que ha sido sometida a choque trmico Marcela Martnez M.Sc. y se agrega el medio SPS caliente.

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Incubacin en anaerobiosis
Se llevan a incubar las cajas en cmara de anaerobiosis por 72 horas a 37 C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosfrico.

Mohos y levaduras
Unicelulares hongos filamentosos

Marcela Martnez M.Sc.

Crecen ms lentamente que las bacterias en los alimentos no cidos que conservan humedad. Las levaduras crecen mas rpidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mohos son aerobios estrictos.
Marcela Martnez M.Sc.

Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentacin).

Mohos y levaduras en alimentos

Importantes en alimentos cidos y en los de baja actividad de agua:
Frutas frescas Jugos Vegetales Quesos Cereales Alimentos salazonados Encurtidos Alimentos congelados y deshidratados Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de mohos y levaduras

Se desarrollan en condiciones de aerobiosis. A temperaturas que varan entre 20 y 30C. Crecen ms lentamente que las bacterias. Los medios de cultivo deben favorecer su desarrollo pero no el de las bacterias.
Marcela Martnez M.Sc.

Medios de cultivo para mohos

Agar de Sabouraud Agar papa dextrosa Agar extracto de malta Agar Czapek-Dox Agar Micosel o micobitico BHI + antibiticos BHI
Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de mohos y levaduras

Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC 100 UFC Se reportan indistintamente mohos y levaduras

Marcela Martnez M.Sc.

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La misin de la vida es descubrir la vocacin y luego entregarse a ella con todo el corazn
Marcela Martnez M.Sc.

Buda

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