URI – CAMPUS DE ERECHIM

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS





Produção de lipases por
fermentação em estado sólido e fermentação submersa
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo



Thaís da Luz Fontoura Pinheiro


Dissertação de Mestrado submetida ao Programa
de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-
Campus de Erechim, como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, Área de concentração: Engenharia de
Alimentos, da Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões – URI - Campus de
Erechim.



ERECHIM, RS – BRASIL
MARÇO DE 2006

ii

























“Dedico esta conquista ao meu grande amor
Daniel, pela sua compreensão, incentivo e todas
as alegrias que sempre me deu”.



iii
AGRADECIMENTOS

A Deus pelo amparo constante.
Aos meus pais, Odete e Edina, pelo incentivo e amor demonstrados em
todos os momentos.
Às minhas irmãs, Angelita e Marta, e à madrinha Celi por todo o apoio que
me deram.
Às minhas orientadoras, Profª. Débora de Oliveira e Profª. Helen Treichel,
pela oportunidade de realizar este trabalho, pelo imenso aprendizado durante o
trabalho de pesquisa, pela paciência e rigor com os meus erros, pelo carinho e
compreensão, e também pelos conselhos dispensados em um período difícil da
minha vida.
Ao Prof. Marco Di Luccio por todas as contribuições a este trabalho e à
minha formação e por ter me ajudado a chegar até aqui.
À Profª. Francine Padilha e Prof. Rogério Cansian por toda a atenção
dispensada e por todo o conhecimento que me transmitiram.
À Profª. Denise Freire por ter cedido o fungo Penicillium verrucosum para o
desenvolvimento desta pesquisa.
Aos amigos da Central de Materiais por me auxiliarem sempre que
necessário.
Às colegas Nádia e Aniela pelo desenvolvimento de parte do trabalho e por
terem me ensinado muito sobre fermentação.
À minha querida Geciane, pelo carinho que me recebeu e por todo o
conhecimento que me transmitiu.
À inesquecível “Jô”, pelas palavras de incentivo e ombro amigo sempre
oferecido nas horas em que eu mais precisava.
À bolsista Natália, pela colaboração com este trabalho e pela
disponibilidade em me ajudar.
Ao Lindomar, por toda a contribuição técnica que deu à esta dissertação.
Às queridas colegas Patrícia e Stephani, pela amizade, companheirismo e
pelo apoio emocional e técnico concedido durante todo este período.
iv
À querida amiga Silvana, por ter contribuído enormemente com este
trabalho, compartilhando interesses, atividades, preocupações e alegrias.
Aos demais colegas e amigos do Curso de Mestrado em Engenharia de
Alimentos da URI-Campus de Erechim e do Laboratório de Biotecnologia de
Alimentos, pelos momentos de alegria e descontração, e pelas experiências
compartilhadas.
À grande amiga Potira, pela amizade e pelo auxílio prestado durante
momentos difíceis.
À URI-Campus de Erechim e ao Departamento de Engenharia de Alimentos
pelo apoio no desenvolvimento do projeto e por possibilitarem a minha formação.





















v
SUMÁRIO

RESUMO ...............................................................................................................xiii
ABSTRACT............................................................................................................xiv
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................4
2.1 Definição de lipases........................................................................................4
2.2 Fontes de lipases............................................................................................5
2.3 Vantagens e aplicações das lipases microbianas...........................................5
2.3.1 Indústria de alimentos...............................................................................7
2.3.2 Indústria oleoquímica................................................................................7
2.3.3 Indústria de detergentes...........................................................................8
2.3.4 Indústria farmacêutica..............................................................................8
2.3.5 Tratamento de efluentes..........................................................................9
2.4 Produção de lipases microbianas.................................................................10
2.5 Formas de produção de lipases....................................................................13
2.5.1 Fermentação em estado sólido..............................................................13
2.5.2 Fermentação submersa..........................................................................19
2.6 Caracterização de lipases.............................................................................22
2.7 Considerações finais.....................................................................................23
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................24
3.1 Materiais........................................................................................................24
3.1.1 Reagentes e meios de cultura.................................................................24
3.1.2 Equipamentos..........................................................................................24
3.2 Métodos.......................................................................................................25
3.2.1 Fermentação em Estado Sólido............................................................ 26
3.2.1.1 Microrganismo............................................................................... 26
3.2.1.2 Inóculo............................................................................................26
3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................27
3.2.1.4 Preparo das amostras....................................................................27
3.2.1.5 Métodos Analíticos.........................................................................28
vi
3.2.1.6 Estudo da produção de lipases......................................................31
3.2.1.7 Caracterização da lipase obtida por fermentação em estado
sólido..............................................................................................35
3.2.2 Fermentação Submersa.........................................................................36
3.2.2.1 Microrganismo................................................................................36
3.2.2.2 Inóculo............................................................................................36
3.2.2.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................37
3.2.2.4 Preparo das amostras....................................................................37
3.2.2.5 Métodos Analíticos.........................................................................37
3.2.2.6 Estudo da produção de lipases......................................................40
3.2.2.7 Caracterização das lipase obtida por fermentação
submersa........................................................................................43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO. ......... ............................................................44
4.1 Caracterização dos substratos e indutores..................................................44
4.2 Fermentação em Estado Sólido...................................................................45
4.2.1 Estudo do indutor........ ...........................................................................45
4.2.2 Estudo do inóculo ideal...........................................................................48
4.2.3 Avaliação da concentração de suplemento na produção de lipases por
fermentação em estado sólido............................................................... 49
4.2.4 Otimização da produção de lipase por fermentação em estado
sólido......................................................................................................51
4.2.5 Cinética de produção de lipase para a condição otimizada...................54
4.2.5.1 Avaliação dos parâmetros cinéticos.................................................56
4.2.6 Caracterização parcial da lipase produzida por fermentação em estado
sólido......................................................................................................57
4.2.6.1 Temperatura e pH ótimos...............................................................58
4.2.6.2 Temperatura de estabilidade..........................................................60
4.2.6.3 Influência do pH no estudo da estabilidade da lipase................... 63
4.2.7 Considerações finais............................................................................. 64
4.3 Fermentação Submersa...............................................................................65
4.3.1 Estudo do indutor....................................................................................65
vii
4.3.1.1 Produção de Biomassa...................................................................68
4.3.2 Otimização da produção de lipase por fermentação
submersa................................................................................................69
4.3.2.1 Meio Sintético.................................................................................69
4.3.2.2 Meio Industrial................................................................................76
4.3.3 Caracterização parcial da lipase obtida por fermentação
submersa................................................................................................84
4.3.3.1 Meio Sintético.................................................................................84
4.3.3.2 Meio Industrial................................................................................88
4.3.4 Considerações finais..............................................................................90
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES.......................................................................91
5.1 Conclusões..................................................................................................91
5.2 Sugestões para trabalhos futuros................................................................92
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................94
7 ANEXO I..........................................................................................................106
















viii
ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2.1. Principais aplicações da FES na indústria alimentícia.........................17

Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados..
.....................................................................................................................25
Tabela 3.2. Variáveis e níveis estudados no planejamento de experimentos 2
2

para otimização das condições de processo por FES.................................33
Tabela 3.3. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para temperatura e pH ótimos da enzima obtida por FES...........................36
Tabela 3.4. Variáveis e níveis estudados no planejamento experimental PB de 12
ensaios mais 3 pontos centrais para produção de lipases por FS em meio
sintético........................................................................................................41
Tabela 3.5. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para
o meio de cultura sintético por FS................................................................42
Tabela 3.6. Variáveis e níveis estudados no planejamento experimental PB de 12
ensaios mais 3 pontos centrais para produção de lipases por FS em meio
industrial.......................................................................................................42
Tabela 3.7. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
3
para
o meio de cultura industrial por FS...... ......................................................43
Tabela 3.8. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para
temperatura e pH ótimos da enzima obtida por FS.....................................43

Tabela 4.1. Caracterização dos substratos e indutores..........................................44
Tabela 4.2. Indutores estudados para produção de lipases por FES e suas
respectivas atividades enzimáticas..............................................................46
Tabela 4.3. Análise estatística (Teste de Tukey) dos melhores resultados
obtidos..........................................................................................................47
Tabela 4.4. Resultados do estudo cinético para a atividade lipásica em meio basal
e PDA...........................................................................................................48
ix
Tabela 4.5. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipásica) para produção de lipases por
FES..............................................................................................................51
Tabela 4.6. Análise de variância para a atividade lipásica por FES.......................52
Tabela 4.7. Parâmetros cinéticos para produção de lipase por FES utilizando
Penicillium verrucosum...............................................................................57
Tabela 4.8. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FES.........................................................................59
Tabela 4.9. Análise de variância para a atividade lipásica.....................................59
Tabela 4.10. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 25ºC...... ....................................................61
Tabela 4.11. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 35ºC............................................................61
Tabela 4.12. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 45ºC............................................................61
Tabela 4.13. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 55ºC............................................................62
Tabela 4.14. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 65ºC............................................................62
Tabela 4.15. Valores das atividades enzimáticas versus os valores de pH
estudados em FES.......................................................................................63
Tabela 4.16. Indutores estudados e suas respectivas atividades lipásicas em
FS.................................................................................................................65
Tabela 4.17. Teste de indutores para produção de lipases por FS
.....................................................................................................................67
Tabela 4.18. Produção de biomassa em função dos indutores utilizados em
FS.................................................................................................................68
Tabela 4.19. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3
pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio sintético.................................. 70
x

Tabela 4.20. Matriz do planejamento fatorial 2
2
(valores codificados e reais) com
as respostas da atividade de lipase no decorrer da FS utilizando meio
sintético........................................................................................................73
Tabela 4.21. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3
pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................77
Tabela 4.22. Matriz do planejamento fatorial 2
3
com as respostas de atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................80
Tabela 4.23. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FS em meio sintético...............................................85
Tabela 4.24. Análise de variância para a atividade lipásica por FS.......................86
Tabela 4.25. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FS em meio industrial.............................................88















xi
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Características do fungo Penicillium verrucosum.................................11

Figura 3.1. Béqueres utilizados para a FES...........................................................27
Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experiência idealizada de
fermentação.................................................................................................34

Figura 4.1. Atividade lipásica em 48 horas de fermentação para os diversos
indutores estudados por FES.......................................................................47
Figura 4.2. Cinética de produção de lipase em meio basal e PDA.........................49
Figura 4.3. Curvas cinéticas de atividade lipásica em função da concentração de
óleo de soja por FES....................................................................................50
Figura 4.4. Superfície de resposta e curva de contorno para atividade lipásica
obtida por FES.............................................................................................53
Figura 4.5 Cinética de produção de lipase, protease e crescimento celular
(glicosamina) por FES..................................................................................55
Figura 4.6. Evolução do pH e atividade proteásica ao longo da
FES..............................................................................................................56
Figura 4.7. Atividade lipásica obtida por FES em função da temperatura e
pH.................................................................................................................60
Figura 4.8. Gráfico normalizado da atividade lipásica em função do tempo e da
temperatura de exposição por FES.............................................................63
Figura 4.9. Atividade lipásica em função do tempo e do pH de extração da enzima
por FES........................................................................................................64
Figura 4.10. Atividade lipásica em 48 horas de fermentação para os diversos
indutores estudados em FS.........................................................................66
Figura 4.11. Perfil da atividade lipásica utilizando diferentes indutores por
FS.................................................................................................................67
Figura 4.12. Cinética de FS para produção de lipases utilizando meio sintético:
Planejamento experimental PB...................................................................71
xii
Figura 4.13. Gráfico de Pareto da produção de lipases por FS utilizando meio
sintético em função das variáveis independentes estudadas: Planejamento
experimental PB..........................................................................................72
Figura 4.14. Cinética de FS para produção de lipases utilizando meio sintético:
Planejamento fatorial 2
2
...............................................................................74
Figura 4.15. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
sintético em função das variáveis independentes estudadas em 96 horas de
fermentação: Planejamento fatorial 2
2
.........................................................74
Figura 4.16. Cinética de produção de lipase e crescimento celular (peso seco) na
melhor condição experimental utilizando meio sintético por
FS.................................................................................................................75
Figura 4.17. Perfil da FS para produção de lipases utilizando meio industrial:
Planejamento experimental PB....................................................................78
Figura 4.18. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
industrial: Planejamento experimental PB...................................................79
Figura 4.19. Perfil da FS para produção de lipases utilizando meio industrial:
Planejamento fatorial 2
3
...............................................................................81
Figura 4.20. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
industrial: Planejamento fatorial 2
3
...............................................................82
Figura 4.21. Cinética de produção de lipase e crescimento celular (peso seco) na
melhor condição experimental utilizando meio industrial por FS.................83
Figura 4.22. Superfície de resposta e curva de contorno para a atividade
enzimática em função da temperatura e pH por FS....................................87
Figura 4.23. Gráfico de Pareto para determinação da temperatura e pH ótimos da
atividade lipásica obtida por FS em meio industrial.....................................89


xiii
RESUMO

Produção de lipases por fermentação em estado sólido e fermentação submersa
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo
Thaís da Luz Fontoura Pinheiro
Março/2006

Orientadoras: Débora de Oliveira e Helen Treichel

O crescente interesse na produção de lipases está especialmente relacionado ao
grande potencial biotecnológico que estas enzimas apresentam. No entanto, os altos
custos de produção destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua utilização. A
aplicação de subprodutos agroindustriais como substrato na produção de lipases, além de
agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a reduzir em muito o preço
final da enzima. Neste trabalho investigou-se a produção de lipases por Penicillium
verrucosum por fermentação em estado sólido utilizando farelo de soja como substrato
sólido e por fermentação submersa fazendo uso de meios sintético e industrial. Avaliou-se
o efeito de algumas variáveis de processo e diferentes suplementações do meio sobre a
produção de lipases em escala de bancada, utilizando a técnica de planejamento de
experimentos e análise de superfície de resposta, visando obter condições que
maximizem a produção da enzima. Observou-se que o fungo Penicilllium verrucosum
apresentou um bom desempenho na produção da enzima por fermentação em estado
sólido, permitindo-se obter altos valores de atividade lipásica, 40 U/g em 48 horas de
fermentação e 52 U/g em 72 horas de fermentação nas condições operacionais
otimizadas (T= 27,5
o
C e U= 55%). A enzima bruta obtida por FES apresentou condições
ótimas de atividade a 30ºC em pH 7,0 e manteve-se estável a 35ºC em valores de pH
entre 6,0 e 7,0. A produção da enzima por fermentação submersa apresentou valores de
3,15U/mL em 96 horas de fermentação no meio sintético e de 2,22 U/mL em 72 horas de
fermentação no meio industrial. A enzima obtida por meio sintético apresentou as faixas
de temperatura e pH ótimos de 29ºC a 32ºC, 40ºC a 45ºC e 7,0 a 8,5 respectivamente; e
a lipase obtida por meio industrial apresentou a faixa de temperatura de 30ºC a 40ºC e pH
entre 5,0 e 9,0 como valores ótimos.

xiv

ABSTRACT

Lipase production by solid state fermentation and submerged fermentation
using Penicillium verrucosum

Thaís da Luz Fontoura Pinheiro
Março/2006

Advisors: Débora de Oliveira e Helen Treichel


The growing interest in lipase production is especially related to the great
biotechnogical potential that these enzymes present. However, the high production costs
of these biocatalysts many times restrict their use. The application of agro industrial by-
products as substrate in lipase production, besides joining value to low cost materials in
the market, can reduce the final price of the enzyme. In this work, lipase production was
investigated, using Penicillium verrucosum and solid state fermentation of soy bran as
substrate and by submerged fermentation using a synthetic and an industrial medium. The
effects of some process variables and different media supplementations on lipase
production were evaluated in laboratory scale, using the experimental design technique
and response surface analysis, in order to obtain the conditions that maximize the
production of the enzyme. The Penicilllium verrucosum presented a good performance in
the enzyme production by solid state fermentation, yielding high values of lipase activity,
40 U/g in 48 hours of fermentation and 52 U/g in 72 hours of fermentation in the optimized
operational conditions (T=27,5
o
C and U=55%). The crude enzymatic extract presented
optimum pH and temperature of 7.0 and 30ºC, respectively, and stayed stable at
temperature of 35ºC in pH values between 6.0 and 7.0. The enzyme production by
submerged fermentation presented lipase activity of 3.15 U/mL in 96 hours of fermentation
in the synthetic media and 2.22 U/mL in 72 hours of fermentation in the industrial media.
The enzymatic extract obtained using synthetic medium showed optimum temperature and
pH of 29ºC to 32ºC, 40ºC to 45ºC and 7,0 to 8,5, respectively; and the lipase obtained
using industrial medium presented the strip of temperature from 30ºC to 40ºC and pH
between 5,0 and 9,0 as optimum.
Capítulo 1– Introdução
1
1 INTRODUÇÃO

As lipases são enzimas pertencentes à família das hidrolases que têm
como função biológica primordial catalisar a hidrólise de triacilgliceróis insolúveis
para gerar ácidos graxos livres, mono e diacilgliceróis e glicerol. Além de sua
função natural, as lipases podem catalisar reações de esterificação,
interesterificação e transesterificação em meio não-aquoso (Houde et al., 2004;
Freire, 1996). Lipases microbianas são biocatalisadores de grande valor, devido
principalmente a características como: ação sob condições amenas, estabilidade
em solventes orgânicos, especificidade ao substrato e régio enâncio seletividade.
(Snellman et al., 2002).
Recentemente, as lipases assumiram um lugar de destaque no mercado
mundial das enzimas, evidenciado pelo aumento da quantidade de informação
reportada na literatura, o que reflete uma média de 1000 publicações por ano.
Depois das proteases e amilases, as lipases são consideradas como o terceiro
grande grupo em volume de vendas, movimentando bilhões de dólares. Essa
conquista se deve tanto pela sua versatilidade de aplicação quanto pela relativa
facilidade de produção em massa, tornando-as especialmente atrativas para
aplicações industriais (Hasan et al., 2006; Jaeger e Reetz, 1998; Freire, 1996).
O potencial de aplicações industriais que as lipases possuem abrange a
indústria de alimentos como aditivos (modificação de aromas), química fina
(síntese de ésteres), detergentes (hidrólise de gorduras), tratamento de efluentes
(decomposição e remoção de substâncias oleosas), couro (remoção de lipídios
das peles dos animais), farmacêutica e a área médica (remédios, digestivos e
enzimas para diagnósticos) (Burkert, 2002; Burkert et al., 2004). No entanto, os
altos custos de produção destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua
utilização (Freire, 1996).
A produção de lipases pode ser realizada por fermentação submersa (FS)
ou por fermentação em estado sólido (FES). O primeiro processo utiliza um meio
de cultura líquido, sendo este o mais utilizado e descrito em maior número de
trabalhos com maiores detalhes (Martins, 2001); já o segundo, baseia-se na
Capítulo 1– Introdução
2
utilização de substratos sólidos com baixas porcentagens de água em sua
composição (Alonso, 2001). Por estes substratos poderem oferecer suporte
nutricional e de crescimento ao microrganismo, a FES apresenta-se como um
processo mais vantajoso em relação à fermentação submersa, além de fornecer,
em geral, altos rendimentos e facilidade na recuperação dos produtos (Sharma et
al., 2001).
A utilização de subprodutos agroindustriais como substrato na produção de
lipases, além de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a
reduzir em muito o preço final da enzima, sendo que a aplicação da fermentação
em estado sólido em muitos casos diminui consideravelmente os custos do
processo, quando comparada à fermentação submersa (Castilho et al., 2000a).
Assim, estudos sobre a utilização de diferentes microrganismos,
suplementos e substratos para a produção de lipases em meio líquido e meio
sólido podem contribuir no sentido de encontrar combinações ideais para se obter
lipases com altos rendimentos, utilizando substratos e condições operacionais que
possibilitem a redução dos custos do processo de produção em escala industrial
(Vargas, 2004).
Com base nestes aspectos, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a
produção de lipases por fermentação submersa e fermentação em estado sólido
utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo. Como objetivos
específicos pode-se citar: avaliação de diferentes meios e suplementações
visando obter condições que maximizassem a produção da enzima e a
caracterização da enzima bruta. Investigou-se o efeito de algumas variáveis de
processo e diferentes suplementações em escala de bancada, utilizando a técnica
de planejamento de experimentos e análise de superfície de resposta. A
caracterização da enzima bruta proveniente da fermentação em estado sólido e
submersa foi realizada quanto ao pH ótimo e de estabilidade e a temperatura
ótima e de estabilidade, no intuito de conhecer algumas propriedades das lipases
obtidas.
Como forma de apresentação, o presente trabalho foi dividido em capítulos,
os quais contemplam uma revisão da literatura buscando inserir o trabalho
Capítulo 1– Introdução
3
desenvolvido, embasando-o teoricamente (Capítulo 2). O Capítulo 3 apresenta os
materiais e metodologias empregadas para o desenvolvimento de todas as etapas
do trabalho. No Capítulo 4 são apresentados e discutidos os resultados obtidos
para a produção de lipases por fermentação em estado sólido e fermentação
submersa utilizando Penicillium verrucosum e o Capítulo 5, como forma de
fechamento do trabalho, apresenta as conclusões e sugestões para a
continuidade do mesmo.



Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
4
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo será apresentada uma abordagem sobre lipases, dando
ênfase especial às formas de produção, foco principal deste trabalho,
contextualizando com dados e informações reportadas na literatura.


2.1 DEFINIÇÃO DE LIPASES

As lipases são enzimas classificadas como hidrolases e atuam sobre
ligações éster presentes em acilgliceróis, liberando ácidos graxos e glicerol,
constituindo uma classe especial de esterases

(Jaeger e Reetz, 1998). A
característica de atuação em uma interface entre a fase aquosa e não-aquosa as
distingue das esterases (Pandey et al., 2000).
Lipases catalisam reações de substratos insolúveis em água (Alvarez-
Macarie et al., 1999) e a hidrólise de acilgliceróis para ácidos graxos,
diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol (Mahadik et al., 2002). Sob certas
condições, elas também catalisam reações de esterificações, transesterificações
(acidólise, interesterificação, alcoólise), aminólise e tiotransesterificação em
solvente orgânico anidro, sistema bifásico e em solução micelar com alta
especificidade. O deslocamento do equilíbrio na reação, no sentido direto
(hidrólise) ou inverso (síntese), é controlado pela quantidade de água presente na
mistura reacional (Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).
As lipases geralmente não requerem cofatores, atuam em uma ampla faixa
de pH, são relativamente estáveis a altas temperaturas, apresentam
especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enâncio-seletividade
(Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).
Pesquisas relacionadas às lipases têm aumentado devido à gama de
possíveis aplicações práticas que possuem a nível industrial. Estas enzimas têm
sido utilizadas na hidrólise de gorduras, produção de ácidos graxos e aditivos de
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
5
alimentos, síntese de ésteres e peptídeos, resolução de misturas racêmicas ou
adição em detergentes (Maleata, 1996).


2.2 FONTES DE LIPASES

Tradicionalmente, as lipases eram obtidas do pâncreas de animais. A
descoberta foi feita por Claude Bernard, em 1856 e anos mais tarde, aumentou o
interesse pelas lipases microbianas devido às dificuldades de acesso ao material
de origem animal (Hasan et al., 2006).
As lipases são originárias de grande número de bactérias, fungos, plantas e
animais, tendo suas propriedades variáveis de acordo com sua procedência.
(Saxena et al., 2003). Particularmente, as enzimas microbianas são mais estáveis
que as extraídas de plantas e animais, tornando sua produção mais conveniente e
segura (Hasan et al., 2006).
As lipases provenientes de microrganismos constituem um grupo de
valiosas enzimas de aplicação biotecnológica, devido principalmente à
versatilidade de suas propriedades, no que se refere à atuação enzimática e
especificidade ao substrato, e facilidade de produção em massa, sendo um dos
grupos mais utilizados no segmento industrial (Hasan et al., 2006).


2.3 VANTAGENS E APLICAÇÕES DAS LIPASES MICROBIANAS

O uso de enzimas nas indústrias permite o desenvolvimento de processos
tecnológicos muito próximos aos eficientes processos executados pela natureza
(Hasan et al., 2006).
Em função da busca de novas fontes de enzimas, o interesse por
microrganismos tem crescido muito nos últimos anos. Existe um grande apelo
econômico pelas lipases microbianas, já que a maioria destas enzimas é
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
6
extracelular e, desta forma, os processos de produção e processamento das
enzimas, com suas etapas de purificação, têm custo diminuído (Alonso, 2001).
Nos últimos anos, devido a sua excelente capacidade régio enâncio seletiva
numa variedade de solventes orgânicos e substratos, lipases têm emergido como
um importante biocatalisador em aplicações biomédicas (Pandey et al., 1999).
Para sua utilização na indústria biomédica e farmacêutica, as lipases necessitam
de um alto grau de pureza com propriedades específicas, sendo então
indispensável o conhecimento de propriedades relacionadas ao substrato e
parâmetros do processo (pH, temperatura, etc.) (Benjamin e Pandey, 2000).
A versatilidade das lipases fazem com que estas possuam um vasto
potencial de aplicação em alimentos, detergentes, farmacêutica, couro, têxtil,
cosmética e indústria papeleira (Houde et al., 2004). Além disso, a utilização de
lipases pelas indústrias apresenta vantagens como: estabilidade a altas
temperaturas e amplas faixas de pH, facilidade de separação dos produtos e,
quando imobilizadas, podem ser submetidas às condições industriais típicas, com
reatores com temperaturas superiores a 70ºC por longos períodos de tempo
(Hasan et al., 2006).
As lipases têm sido investigadas extensivamente como alternativas de rotas
para novas biotransformações; centenas de sínteses bio-orgânicas usando lipases
têm sido descritas recentemente; a diversidade das aplicações industriais gerais e
propostas excede em muito as aplicações de outras hidrolases (Alonso, 2001).
Atualmente, as lipases são aplicadas em escala industrial, na produção de
alimentos, detergentes, cosmética e farmacêutica (Jaeger e Reetz, 1998) e
representam um mercado com grande potencial de crescimento (Alonso, 2001).
Apesar de existirem diversas lipases sendo produzidas em larga escala e
aplicadas comercialmente, a plena utilização industrial destas enzimas passa
necessariamente pela redução de custos de produção. Isso poderá ser alcançado
através da seleção de novos microrganismos produtores, de melhoramento
genético, de modificações no meio de cultura e de otimização das condições de
cultivo e dos sistemas de produção (Gutarra, 2003).
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
7
Nos itens a seguir serão apresentados alguns exemplos de aplicações
industriais das lipases.

2.3.1 INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
As lipases microbianas têm sido utilizadas para a obtenção de ácidos
graxos livres a partir da hidrólise seletiva de óleos e gorduras presentes em
diversos alimentos. Os ácidos graxos livres podem ou não sofrer modificações
químicas e, dependendo do tamanho da cadeia carbônica e do grau de
insaturação, conferem um peculiar sabor e aroma para os alimentos,
representando um importante papel nas propriedades físico-químicas,
organolépticas e nutricionais de diversos produtos (Jaeger e Reetz, 1998).
Na indústria de queijos elas são empregadas na alteração e intensificação
do sabor e em processos de aceleração da maturação. Também na indústria de
laticínios, as lipases são utilizadas para a obtenção de margarinas de baixo teor
calórico, entre outras (Alonso, 2001).
A literatura reporta a hidrólise do óleo de fígado de bacalhau para a
produção de ácidos graxos ômega 3 – insaturados, destinados às dietas de
grupos clínicos especiais (Pandey et al., 1999). O enriquecimento de óleos com
ácidos graxos poliinsaturados, como por exemplo, ácido linolênico, conferem a
estes atividades anti-carcinogênicas e anti-escleróticas, sendo chamados
atualmente de alimentos nutracêuticos (Martins, 2001).

2.3.2 INDÚSTRIA OLEOQUÍMICA
O uso de lipases para a hidrólise de gorduras em âmbito industrial
proporciona vantagens como a diminuição de gastos com energia e a minimização
da degradação térmica dos compostos, quando comparado às vias químicas
tradicionais. Estas são provavelmente as principais atrações que levam à
substituição das tecnologias químicas atuais pelas biológicas. Devido ao seu valor
nutritivo, a não degradação de ácidos graxos poliinsaturados pode ser importante
para a preservação de aditivos de alimentos tais como mono e diacilgliceróis,
sendo estes últimos, os componentes principais dos novos óleos para cozimento,
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
8
que têm a proposta de retardar o aumento de triglicerídios e colesterol no sangue
(Hasan et al., 2006).
O espaço para a aplicação de lipases na indústria oleoquímica é amplo. As
gorduras e os óleos são produzidos em grande escala pelo mundo gerando em
torno de 60 milhões de toneladas sendo que mais de 2 milhões de toneladas são
utilizadas em processos que consomem uma grande quantidade de energia tais
como hidrólise, glicerólise e alcoólise. Entretanto, apesar de sua superioridade
aparente, os métodos enzimáticos ainda não alcançaram um nível de exploração
comercial proporcional a seu potencial de aplicações (Hasan et al., 2006).

2.3.3 INDÚSTRIA DE DETERGENTES
O campo de aplicação das lipases mais importante comercialmente é a
indústria de detergentes. Aproximadamente 1000 toneladas de lipases são
adicionadas a 13 bilhões de toneladas de detergentes produzidos a cada ano,
competindo com os surfactantes normalmente empregados, pela maior eficiência
na remoção de manchas, em superfícies e em tecidos, pela menor temperatura
necessária à lavagem e pela biodegradabilidade (Martins, 2001).
Os desafios para a utilização de lipases em formulações de detergentes
consistem nas características que estas enzimas devem apresentar, como
estabilidade nas condições de lavagem, entre pH 10,0 e 11,0 das formulações e
em temperaturas de 30 a 60ºC; além disso, devem apresentar pouca ou nenhuma
especificidade pelo substrato, sendo capazes de atuar sobre diversos óleos, e por
fim, devem resistir aos componentes da formulação e à degradação causada por
enzimas proteolíticas também presentes (Martins, 2001).

2.3.4 INDÚSTRIA FARMACÊUTICA
Recentemente foi evidenciado o esforço da indústria farmacêutica em
produzir compostos opticamente puros, em detrimento da produção das misturas
racêmicas, que por sua vez levava a uma série de implicações, como a ocorrência
de vários efeitos colaterais indesejados. Isto porque a maioria dos fármacos
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
9
sintetizados possui um ou mais centros quirais, e ainda continua a ser
comercializada como uma mistura racêmica (Alonso, 2001).
Há interesse nos óleos de peixes de regiões frias (anchova e sardinha)
devido aos efeitos fisiológicos e terapêuticos (atuam no sistema cardíaco,
circulatório e imunológico e nos processos inflamatórios e carcinogênicos)
encontrados nos ácidos graxos de cadeia longa, presentes nesses óleos. A maior
parte da produção mundial dos ácidos EPA (eicosapentaenóico) e DHA
(docosahexaenóico) são hidrogenados para a produção de margarinas e outros
produtos, praticamente destruindo suas propriedades terapêuticas. Por isso é de
interesse industrial obter triglicerídeos homogêneos a partir desses ácidos, já que
os triglicerídeos são encontrados nos alimentos e no organismo humano. Portanto,
a síntese catalisada por lipases é desejável para produção de triglicerídeos a partir
desses ácidos com um alto grau de pureza (Burkert, 2002).

2.3.5 TRATAMENTO DE EFLUENTES
O tratamento de efluentes de diversas origens é uma nova área de
aplicação para as lipases. O derramamento de óleo em oceanos e rios e em
grandes áreas de terra tem sido uma constante nos dias atuais. O despejo do
rejeito da indústria de laticínios e indústria oleoquímica, principalmente nos leitos
fluviais, ocorre de forma criminosa no Brasil, seja pela falta de uma legislação
mais rígida ou pelo descaso das autoridades competentes. As lipases surgem
como uma excelente alternativa para o tratamento do rejeito industrial composto
por material graxo (Alonso,2001).
Cabe ressaltar que as aplicações das lipases citadas anteriormente são
apenas ilustrativas e estão em número bastante reduzido em relação às
possibilidades de utilização destas enzimas no futuro. A sua plena utilização
esbarra na redução dos custos dos processos de produção e purificação, na
busca por novas cepas produtoras, no melhoramento genético destas cepas, além
da mutagênese sítio dirigida, ou da modificação química das lipases afim de que
produzam maiores quantidades destas enzimas em tempos menores, com
características desejáveis (Martins, 2001).
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
10
2.4 PRODUÇÃO DE LIPASES MICROBIANAS

Microrganismos são muito versáteis, porém bastante sensíveis às
condições do ambiente ao qual estão sendo submetidos. Em um planejamento
experimental para produção de lipases, fatores que influenciam o processo como
composição do meio, pH, temperatura e aeração devem ser estritamente
controlados (Alonso, 2001; Marek e Bednarski, 1996).
As lipases microbianas em geral são extracelulares, sendo excretadas
através da membrana externa para o meio de cultura. A otimização das condições
de fermentação para lipases microbianas é de grande interesse, desde que as
condições de cultura não influenciem nas propriedades da enzima, bem como na
proporção de lipase extracelular e intracelular (Wooley e Peterson, 1994).
Uma grande variedade de microorganismos tem habilidade de produzir
lipases, sendo função de alguns parâmetros reacionais e apresentando diferentes
especificidades, massa molecular, sensibilidade à temperatura e pH (Burkert,
2002; Burkert et al., 2004). No entanto, do ponto de vista industrial, os fungos são
os preferidos como fontes de lipases, pois as enzimas produzidas por eles
geralmente são extracelulares, facilitando a sua extração do meio fermentado e
também por serem considerados microorganismos seguros para aplicação na
indústria de alimentos, bebidas e farmacêutica (Mahadik et al., 2002; Burkert,
2002; Burkert et al., 2004).
A literatura reporta que diversos gêneros de fungos filamentosos têm sido
estudados como fontes de lipases por exemplo, Rhizopus (Pastore et al., 2003),
Aspergillus (Mahadik et al., 2004), Rhizomucor (Cordova et al., 1998), Penicillium
(Jesus et al., 1999), Mucor (Abbas et al., 2002), entre outros.
Penicillium é considerado um gênero universal de fungos encontrados em
todo o planeta. A maioria das espécies é saprófita e geralmente ou
ocasionalmente encontrada no solo, vegetais podres, sementes e grãos. Há mais
de 20 anos têm-se estudado a taxonomia e classificação das espécies do gênero
Penicillium com base em dados morfológicos e químicos Penicillium verrucosum é
comumente encontrado em cereais estocados em regiões de clima temperado
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
11
(Jesus et al., 1999). Apresenta como características principais: colônia radialmente
sulcada, velutinosa, micélio branco, conidiogênese moderada de cor verde-
acinzentada. A Figura 2.1 apresenta algumas características do fungo Penicillium
verrucosum.

Figura 2.1. Características do fungo Penicillium verrucosum.

Na formulação de um meio fermentativo deve-se proporcionar nutrientes
necessários ao crescimento do microrganismo e produção de metabólitos e além
disso, este deve ser adequado para suprir energia para biossíntese e manutenção
celular (Smits et al., 1996).
Este deve ser composto basicamente por fonte de carbono, fonte de
nitrogênio (seja ela orgânica ou inorgânica), sais orgânicos, vitaminas e indutores,
quando necessários para a produção de lipase, visto que existem lipases
induzíveis e constitutivas. As lipases constitutivas são aquelas que são produzidas
independente do meio de cultura onde o microrganismo se encontra, já as lipases
induzíveis têm sua produção estimulada pela presença de algum indutor presente
no meio de cultivo (Alonso, 2001).
Foi demonstrado que a presença de substratos lipídicos (e seus
metabólitos, como ácidos graxos) pode estimular a produção de lipases, como em
Candida rugosa (Dalmau et al., 2000). Neste estudo, avaliou-se os efeitos de
diferentes fontes de carbono, testando substratos lipídicos e não-lipídicos.
Verificou-se que no segundo grupo de substratos, alguns dão suporte para o


Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
12
crescimento do microrganismo, porém pouca atividade lipásica é obtida. Foi ainda
realizada a combinação de dois tipos de substratos, o que não aumentou a
produção da enzima.
Na produção de lipase por Penicillium restrictum foi estudada a influência
da razão carbono/nitrogênio adicionado ao meio de cultivo, fazendo uso de óleo
de oliva, peptona e amido. Observou-se que pequenas variações nos níveis de
nutrientes exercem grande influência na quantidade de enzima obtida e que, o
meio basal, ao ser enriquecido diferentemente, pode proporcionar a produção de
enzimas variáveis (Gombert et al., 1999).
Como fonte de carbono podem ser utilizados carboidratos, lipídios ou
proteínas, sendo o lipídio normalmente utilizado como indutor. Comumente as
fontes de nitrogênio já presentes no meio de cultura contêm algumas, senão todas
as vitaminas necessárias para o metabolismo do microrganismo. Porém, existem
casos onde alguma vitamina ou uma suplementação é necessária para o
crescimento celular (Alonso, 2001; Becker et al.,1997).
Cada microrganismo apresenta um valor de pH ótimo para o crescimento e
que muitas vezes não é o mesmo para produção de lipases (Gao et al., 2000). É
possível que ocorram variações nos valores de pH durante o cultivo, os quais
podem ser influenciados tanto pelo microrganismo e pela composição do meio,
quanto pelos demais parâmetros da fermentação (Alonso, 2001).
Calor é produzido tanto pela atividade microbiana quanto pela agitação do
sistema; sendo que para se obter boas condições para o crescimento e produção
de enzimas, torna-se indispensável o controle da temperatura ideal (Alonso,
2001).
Microrganismos produtores de lipases apresentam uma ampla faixa de
temperatura de crescimento. Em geral, fungos e leveduras têm uma temperatura
ótima entre 22 e 30ºC (Toida et al., 1995).
Os processos fermentativos, em sua maioria, são aeróbicos e desta forma o
fornecimento de oxigênio se torna indispensável. A demanda de oxigênio em uma
fermentação seja ela a nível industrial ou laboratorial, é normalmente suprida pela
agitação e aeração do meio fermentativo. A produtividade de muitas fermentações
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
13
para produção de lipases ou outros metabólitos pode ser influenciada pela
disponibilidade do oxigênio, portanto, qualquer fator que possa interferir nesta
disponibilidade do oxigênio para as células microbianas deve ser considerado
(Alonso, 2001).
Pesquisas têm demonstrado que a agitação e aeração são parâmetros que
influenciam diretamente a produção de lipases. Elibol e Ozer (2000) verificaram
que a produtividade da enzima depende fortemente da agitação quando se utiliza
Rhizopus arrhizus. Neste caso, a aeração exerceu forte influência no crescimento
celular, o que também foi observado por Koutinas et al. (2003), que avaliou estes
parâmetros com Aspergillus awamori. Resultados semelhantes foram encontrados
para os cultivos realizados com Penicillium restrictum. Neste estudo a produção de
lipases mostrou-se positivamente influenciada pela variação da agitação e a
aeração não apresentou efeito sobre a produção da enzima (Freire et al., 1997).


2.5 FORMAS DE PRODUÇÃO DE LIPASES

2.5.1 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
O processo de fermentação em meio sólido é bastante característico e
utiliza substratos insolúveis com baixas porcentagens de água em sua
composição, os quais devem atuar tanto como suporte fisiológico quanto como
fonte de nutrientes na ausência de água livre (Alonso, 2001; Pandey, 1992;
Pandey, 2003). Na formulação do meio de fermentação várias fontes de carbono
(substrato principal) são utilizadas, entre elas cita-se (Alonso, 2001): Farelo de
trigo (Silva et al., 2000; Ellaiah et al., 2004), farelo de arroz (Ellaiah et al., 2004),
farelo de cevada (Dominguez et al., 2003), bagaço de cana-de-açúcar (Cordova et
al., 1998; Ellaiah et al., 2004), torta de côco (Benjamin e Pandey, 2001), torta de
soja (Vargas, 2004), torta de babaçu (Palma et al., 2000; Gombert et al., 1999;
Castilho et al., 2000), entre outros, além da incorporação opcional de alguma fonte
de carbono indutora para a produção de lipases (óleos, ácidos graxos,
detergentes). Em alguns casos, fontes de nitrogênio complementar são utilizadas:
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
14
licor de milho, extrato de levedura, uréia, sais de amônio e outros. Sais metálicos e
micro-elementos podem ser suplementados para suprir as necessidades do
microrganismo (Alonso, 2001).
No processo de fermentação em estado sólido deve-se levar em
consideração alguns aspectos importantes, como a seleção do microrganismo, a
escolha do substrato, a otimização dos parâmetros do processo, o isolamento e a
purificação do produto, dentre outros fatores (Pandey, 2003).
Com base na classificação teórica, o fato da umidade contida no meio de
fermentação ser muito baixa, somente permitiria o uso de um número limitado de
microrganismos, principalmente fungos e leveduras para fermentação em estado
sólido. Culturas de bactérias exigem alta atividade de água e, portanto, não seriam
adequadas à fermentação em estado sólido. No entanto, existem relatos que
demonstram que bactérias podem ser usadas nestes processos, quando bem
controladas e manipuladas (Pandey et al., 2000; Pandey, 2003).
Nos últimos anos, a técnica de fermentação em estado sólido tem recebido
uma maior atenção dos pesquisadores, tanto para produção de enzimas, quanto
para obtenção de substâncias de interesse da indústria de alimentos, pois tem
mostrado que pode ofertar maior produtividade ou produtos com melhores
características do que a fermentação submersa. Além disso, há a possibilidade de
utilização de substratos de baixo valor agregado, diminuindo assim o custo da
produção (Robinson e Nigam, 2003).
Desde 1986, há no Brasil uma série de pesquisas sendo desenvolvidas a
fim de agregar valor aos produtos e subprodutos da agricultura tropical,
principalmente pelo aumento da geração de resíduos agroindustriais na região. A
utilização dos resíduos da agroindústria brasileira, além de fornecer diferentes
alternativas de substratos para fermentação, também ajuda na diminuição dos
problemas de poluição (Pandey et al., 1999).
O processo seletivo dos substratos sólidos depende de vários fatores, entre
eles, o custo e viabilidade envolvendo assim a investigação de diferentes resíduos
agroindustriais. Estes, normalmente são ricos nutricionalmente, sendo que no
processo de fermentação em estado sólido eles fornecem não somente os
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
15
nutrientes para a cultura, mas também servem como suporte das células
microbianas (Couto e Sanromán, 2006).
Dentre os fatores importantes para o crescimento microbiano e atividade no
substrato, particularmente o tamanho das partículas (granulometria) e níveis de
umidade/atividade de água são pontos críticos. Geralmente pequenas partículas
de substrato fornecem uma grande superfície de contato com o microrganismo,
mas resulta num baixo crescimento. Contrariamente, grandes partículas fornecem
maior aeração, mas limitam a superfície de contato para uso microbiano. Portanto
o tamanho da partícula deverá ser selecionado de acordo com cada processo em
particular (Pandey et al., 1999).
Estudos demonstram que a umidade do meio de fermentação é um fator
determinante no sucesso deste processo, sendo que níveis elevados de umidade
causam diminuição da porosidade e dificultam a transferência de oxigênio. No
entanto, níveis baixos de umidade do meio diminuem a solubilidade do substrato
sólido e produzem um aumento do turgor da água (Mahadik et al., 2002).
Atualmente, há poucos modelos de biorreatores que operam em condições
de estado sólido disponíveis no mercado. Isto ocorre, principalmente devido aos
vários problemas encontrados no controle de diferentes parâmetros, sabendo-se
que é difícil o controle das condições ambientais em biorreatores, particularmente
temperatura e umidade (Couto e Sanromán, 2006).
O equipamento utilizado para este tipo de fermentação é composto por
câmaras de fermentação de volume definido, onde existe um controle da
temperatura e da porcentagem de umidade do meio. Em escala industrial de
produção, este meio é disposto em bandejas de alta área superficial e com uma
profundidade que varia de 1 a 10 centímetros. Em escala laboratorial são
utilizadas bandejas menores ou placas de Petri, que são acondicionadas nas
câmaras (Alonso, 2001).
O tempo e a temperatura de fermentação são bastante variáveis.
Dependendo do microrganismo em questão, o tempo costuma variar de 1 a 7 dias,
enquanto a temperatura pode variar de 20 a 40ºC (Alonso, 2001).
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
16
A fermentação em estado sólido apresenta como vantagens o baixo custo
das matérias primas empregadas no meio de cultivo, a simplicidade do meio de
fermentação utilizado, a menor probabilidade de contaminação do meio pela
menor quantidade de água presente e a possibilidade de obtenção da enzima
extracelular mais concentrada (Martins, 2001; Alonso, 2001). Outra questão
interessante á a alta produtividade obtida com esta técnica (Couto e Sanromán,
2006). Benjamin e Pandey (1995) e Castilho et al. (2000) compararam a
fermentação submersa e a fermentação em estado sólido como sistemas de
produção de lipases, constatando aumento da produção da enzima e de sua
estabilidade por meio do segundo sistema.
Apesar do processo de fermentação em estado sólido apresentar várias
vantagens, alguns problemas são apresentados durante a sua execução. A
dificuldade nas medidas dos parâmetros como aeração, pH, temperatura, umidade
e a baixa homogeneidade do meio são questões que dificultam a produção de
substâncias de interesse em grande escala (Martins, 2001; Couto e Sanromán,
2006). A automação deste processo é dificultada pelo equipamento em si e
apresenta um maior custo em mão de obra em escala industrial. Além desses
inconvenientes, existe a necessidade do pré-tratamento do substrato para a
eliminação de possíveis contaminantes que venham a interferir na produção de
lipase e no crescimento do microrganismo (Alonso, 2001).
A fermentação em estado sólido reproduz processos microbiológicos
naturais. No caso de aplicações industriais, estes processos naturais, se
monitorados, produzem o produto desejado (Couto e Sanromán, 2006). Assim,
vários produtos de valor agregado têm sido produzidos por essa técnica fazendo
uso de matérias primas provenientes da natureza (Pandey, 2000).
Esse tipo de fermentação tem mostrado também um enorme potencial
tecnológico no que diz respeito ao desenvolvimento de produtos que apresentam
componentes derivados de microrganismos como rações para animais, produtos
para a indústria alimentícia, química e farmacêutica. Estas aplicações envolvem a
biotransformação de produtos e resíduos agrícolas para enriquecimento
nutricional, produção de biomassa e formação de produtos com alto valor
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
17
agregado, como metabólitos secundários biologicamente ativos, incluindo
antibióticos, alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos, biopesticidas, micro-pesticidas
e bioerbicidas, biossufactantes, biocombustíveis, compostos aromáticos, etc.
(Pandey, 2003).
As principais aplicações do processo de fermentação em estado sólido na
indústria de alimentos estão apresentadas na Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Principais aplicações da FES na indústria alimentícia.
Aplicação Referências
Produção de flavors Medeiros et al., 2001; Larroche et al., 1999.

Produção de enzimas

Alfa-amilases

Lipases


Pectinases


Francis et al., 2003; Ramachandran et al., 2004.

Jesus et al., 1999; Vargas, 2004; Gombert et al.,
1999; Palma et al., 2000.

Castilho et al., 2000; Bai et al., 2004.

Produção de ácidos orgânicos

Ácido lático

Ácido cítrico


Naveena et al., 2005.

Prado et al., 2004.

Produção de goma xantana Stredansky e Conti, 1999.

Estudando a produção de lipases por fermentação em estado sólido, Palma
et al. (2000) utilizaram o fungo Penicillium restrictum e torta de babaçu como meio
basal. O meio foi enriquecido com peptona, tween 80 e óleo de oliva verificando-
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
18
se que a maior atividade lipásica (27,8 U/g em 25 horas de fermentação) foi obtida
quando se utilizou a peptona como suplemento.
Cordova et al. (1998) investigaram o uso de bagaço de cana de açúcar e
torta de oliva (resíduo da indústria de óleo de oliva) para a produção de lipases por
Rhizopus rhizopodiformis e Rhizomucor pusillus. As maiores atividades
enzimáticas obtidas foram de 79,6 U/g com R. rhizopodiformis e 20,2 U/g com R.
pusillus respectivamente, quando se utilizou uma mistura de 50:50 dos substratos
estudados.
A produção de lipases por Penicillium simplicissimum em meio sólido
usando torta de soja como substrato foi estudada por Vargas (2004). Foi
constatado que a maior produção da enzima (30 U/g em 80 horas de fermentação)
ocorreu sob as condições de 27,5ºC e 55% de umidade do meio e que a torta de
soja é rica em nutrientes e não necessita de adição de fontes suplementares de
carbono e nitrogênio para aumentar a produção de lipases.
Diferentes resíduos agroindustriais foram utilizados para a produção de
lipases por Aspergillus niger em uma pesquisa feita por Kamini et al. (1998). As
maiores atividades lipásicas obtidas foram de 363 U/g em 72 horas quando
utilizou-se torta de óleo de gengibre e de 303 U/g em 96 horas de fermentação
fazendo uso de farelo de trigo como substrato. Neste estudo, a adição de fontes
de nitrogênio e de indutores foi ineficaz para o aumento da produção da enzima.
Domínguez et al. (2003) investigaram a produção de lipases por Yarrowia
lipolytica por fermentação em estado sólido. Observou-se que o uso de materiais
orgânicos como suporte para a produção de lipases além de diminuir os custos de
produção da enzima proporciona maiores atividades lipásicas quando comparado
ao uso de suportes sintéticos. Concluiu-se que a utilização de nozes trituradas
como substrato gerou cerca de 69 U/g de atividade enzimática em 10 dias de
fermentação, superando os resultados obtidos com farelo de cevada
suplementado com óleo de girassol, milho e oliva.



Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
19
2.5.2 FERMENTAÇÃO SUBMERSA
A fermentação submersa, que tem como característica principal a utilização
de um meio fermentativo líquido com nutrientes solúveis, é o processo mais
utilizado para a produção de lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001).
Esse tipo de sistema de produção de lipases pode ser realizado em frascos
agitados (erlenmeyers, por exemplo), fermentadores de bancada ou
fermentadores em escala industrial. Os processos realizados em frascos agitados
apresentam dificuldades no controle de certos parâmetros, como por exemplo, a
aeração, que é uma variável determinante em alguns casos de produção de
lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001). Apesar disso, a fermentação submersa para
produção de lipases é comumente executada em agitadores de bancada (frascos
agitados) em escala laboratorial (Elibol e Ozer, 2000; Elibol e Ozer, 2002; Dalmau
et al., 1999; Ellaiah et al., 2004, Kanwar et al., 2002, Tan et al., 2003; Mahadik et
al., 2003; Ciafardini et al., 2006; Benjamin e Pandey, 1995; Asther et al., 2002).
Existem fermentadores que operam de forma contínua, semi-contínua ou
descontínua. No regime contínuo (Montesinos et al., 1996), há uma constância na
entrada de substrato conforme as necessidades do microrganismo e na saída do
meio fermentado.
Já os processos descontínuos podem ser realizados na forma de batelada,
isto é, quantidades únicas de substrato são fornecidas ao microrganismo no início
do cultivo, sendo este muito utilizado para produção de lipases (Shu et al., 2006;
Koutinas et al., 2003; Li et al., 2001; Li et al., 2004; Freire et al., 1997; Freire et al.,
1997; Freire et al.,1999). É um processo de baixo custo, porém, necessita de uma
maior vigilância operacional para assegurar a reprodutibilidade e constância das
propriedades do produto.
A batelada alimentada consiste em realimentar o processo durante sua
execução, visando aumentar a produção, permitindo a exploração de aspectos
cinéticos do processo (Martins, 2001).
A técnica de fermentação submersa possui relativa facilidade de cultivo em
grande escala, já que garante homogeneidade do meio e facilidade no controle
dos parâmetros do processo, principalmente se monitorados por sensores
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
20
adequados (Couto e Sanromán, 2006). No entanto, a maior probabilidade de
contaminação, pela maior quantidade de água, é um inconveniente deste
processo. Outra limitação é quando a enzima produzida é extracelular, sendo
obtida uma preparação mais diluída, inserindo uma etapa de concentração mais
trabalhosa na purificação (Alonso, 2001).
A questão da viabilidade econômica da fermentação submersa frente à
fermentação em estado sólido é outro problema encontrado na condução do
processo, já que os meios de fermentação normalmente apresentam um alto
custo.
Com a finalidade de estudarem a indução de diferentes fontes de carbono
na produção de lipases por Fusarium solani, Maia et al. (2001) utilizaram um meio
basal que consistia de 0,11% de MgSO
4
.7H
2
O, 0,015% de KH
2
PO
4
, 0,3% de
NaNO
3
, 0,015% de NaCl, 0,015% de ZnSO
4
e 0,001% de FeSO
4
, 0,5% de óleos
vegetais e 0,5% de trioleína como fonte de carbono. Dentre os indutores
estudados, o óleo de gergelim foi o que proporcionou maior produção de lipases
(0,88 U/mL) em 120 horas de fermentação a 28ºC e 120 rpm.
Dalmau et al. (2000), pesquisando a produção de lipases por Candida
rugosa, utilizaram um meio de cultura contendo por litro 15g de KH
2
PO
4
, 5,5g de
K
2
HPO
4
, 5g de (NH
4
)
2
SO
4
, 0,5g de MgSO
4
.7H
2
O, 0,1g de NaCl, 0,1g de CaCl
2
.
Foram testados como fonte de carbono na concentração de 2g/L: ácido palmítico,
ácido oléico, trioleína e Tween 80, sendo o ácido palmítico o melhor indutor para a
produção da enzima nas condições de 30ºC, 150 rpm em 48 horas de
fermentação, gerando cerca de 5,3 U/mL.
Freire et al. (1997) investigaram como fonte de carbono para produção de
lipases por Penicillium restrictum o óleo de oliva, a glicose e a lactose. Os
resultados demonstraram que o crescimento celular para o óleo de oliva e a
glicose foi semelhante, porém, a atividade enzimática foi cerca de 6 vezes superior
com o uso de óleo de oliva, indicando que a produção da enzima pode ser
regulada pela glicose. Na presença da lactose não houve crescimento celular e
ocorreu baixa produção da enzima, devido ao microrganismo não metabolizar este
açúcar. Peptonas de carne, soja e caseína a 2% foram investigadas como fonte de
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
21
nitrogênio e resultaram em um crescimento celular semelhante, no entanto, a
capacidade de produção da enzima alcançou melhores níveis com a peptona de
carne, obtendo um máximo de 13 U/mL de atividade enzimática. O microrganismo
em estudo foi incapaz de crescer na presença de nitrogênio inorgânico.
Em continuidade ao trabalho anterior, Freire et al. (1997a) verificaram o
efeito da temperatura e pH inicial do meio de cultura na produção de lipase
utilizando o mesmo microrganismo. As temperaturas estudadas foram 25ºC, 30ºC,
37ºC, e a faixa de pH variou de 5,5 a 8,0. Foi observado que a maior produção da
enzima foi de 14 U/mL em 80 horas de fermentação sob temperatura de 30ºC e
pH inicial de 5,5. A enzima foi caracterizada quanto à sua estabilidade e condições
ótimas de atuação. Através deste estudo foi possível concluir que o pH e a
temperatura ótima foram de 7,0 e 37ºC, respectivamente. A enzima foi estável na
faixa de 30ºC a 37ºC em pH 7,0.
A produção de lipases por Antrodia cinnamomea foi avaliada por Shu et al.
(2006). O meio basal composto por 3% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de
extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte, 0,1% de KH
2
PO
4
, 0,1% de
MgSO
4
.7H
2
O e 0,1% de vitamina B
1
foi suplementado por 0,01% de óleo de oliva
e protagonizou um aumento de 15 U/mL para 26 U/mL no 16º dia de fermentação
sob as condições de 28ºC e 150 rpm.
Um estudo comparativo de fermentação submersa e fermentação em
estado sólido utilizando Penicillium restrictum foi realizado por Castilho et al.
(2000). Verificou-se que para a fermentação submersa foi necessário um
investimento capital 78% maior que o valor investido para a fermentação em
estado sólido, indicando que o segundo processo é mais atrativo
economicamente. Observou-se que as principais vantagens da fermentação em
estado sólido é a possibilidade de uso de resíduos agroindustriais como substrato
e a produtividade que este processo apresenta, o que reduz consideravelmente os
custos de produção de enzimas.



Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
22
2.6 CARACTERIZAÇÃO DE LIPASES

Lipases de várias origens têm sido aplicadas em vários segmentos, como
na indústria farmacêutica e na clínica. Nesse sentido, a caracterização destas
enzimas é essencial tanto para o estabelecimento das condições de trabalho e
aplicações como para a determinação da temperatura e pH ótimos e de
estabilidade (Alonso, 2001).
Pastore et al. (2003) realizaram a caracterização bioquímica da lipase
produzida por Rhizopus sp., verificando que a enzima bruta apresentou condições
ótimas de atividade a 40ºC em valores de pH entre 6,0 e 6,5 e manteve 50% ou
mais de sua atividade quando aquecida por 60 minutos à temperaturas entre 40ºC
e 55ºC.
A lipase produzida por Antrodia cinnamomea apresentou atividade ótima
com pH 8,0 e 40ºC, e tanto a atividade quanto a estabilidade diminuíram
significativamente com valores de pH acima de 10. A estabilidade da atividade
enzimática foi testada na faixa de temperatura de 25ºC a 60ºC e apresentou-se
estável na faixa de 25ºC a 45ºC (Shu et al., 2006). Burkert (2002) e Burkert et al.
(2004) verificaram que a lipase produzida por Geotrichum candidum NRRL-Y552
apresentou condições ótimas de atividade a 37ºC e em pH 7,0 e observaram que
a estabilidade da lipase é maior em baixas temperaturas, como a de 30ºC, por
exemplo.
A lipase produzida por Aspergillus niger caracterizada por Kamini et al.
(1998) apresentou atividade ótima em pH 7,0 e 37ºC e mostrou-se estável em
valores de pH entre 4,0 e 10,0 e na faixa de temperatura de 40ºC a 50ºC, sendo
que esta também manteve sua estabilidade na presença de detergentes.
Kamini et al. (1998) ainda neste estudo, compararam a estabilidade térmica
da lipase produzida por fermentação submersa e por fermentação em estado
sólido, verificando que a primeira manteve 57% de atividade a 60ºC, enquanto a
segunda manteve 69% de atividade sob a mesma temperatura, mostrando que
Aspergillus niger possui habilidade em produzir a enzima com maior estabilidade
térmica por fermentação em estado sólido.
Capítulo 2– Revisão Bibliográfica
23
2.7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Como pôde ser observado através da revisão bibliográfica apresentada
neste capítulo, há um grande interesse na obtenção da enzima lipase devido ao
seu amplo potencial de aplicação industrial.
Verifica-se que, dependendo do microrganismo usado na fermentação, a
lipase obtida possui uma especificidade em particular. As inúmeras variáveis que
envolvem o processo de obtenção da enzima vão desde a composição do meio
(fonte de carbono, fonte de nitrogênio, sais e indutores) até as condições
operacionais como pH, temperatura, agitação, aeração e forma de condução do
processo fermentativo.
A busca pela redução dos custos de produção de lipases faz com que
aumente as investigações sobre substratos e formas de fermentação para que a
obtenção da enzima se torne mais viável economicamente. Atualmente, a
fermentação em estado sólido vem ganhando espaço e a atenção de
pesquisadores por apresentar vantagens econômicas perante à fermentação
submersa, porém é necessário um estudo mais aprofundado a fim de conhecer a
fisiologia do microrganismo e verificar sua melhor adaptação, para assim
determinar o processo fermentativo mais vantajoso.
Portanto, é de grande valia estudos sistemáticos como é o caso do uso da
metodologia do planejamento experimental, para a definição de variáveis
significativas como a concentração dos meios de cultura e as condições de
temperatura visando obter as condições ótimas de produção de lipase. A
caracterização da enzima também se torna interessante, pois possibilita um maior
conhecimento das propriedades da lipase obtida.
Capítulo 3– Material e Métodos
24
3 MATERIAL E MÉTODOS

Neste capítulo serão descritos os materiais, procedimentos experimentais e a
metodologia analítica usados para o desenvolvimento do estudo da produção de
lipases por Penicillium verrucosum durante a realização deste trabalho.


3.1 MATERIAIS

3.1.1 REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
Os nutrientes necessários para a formulação dos meios de cultivo e os
principais reagentes e produtos utilizados encontram-se listados na Tabela 3.1.

3.1.2 EQUIPAMENTOS
Os principais equipamentos utilizados neste estudo foram os seguintes:

• Câmara de fluxo laminar (Pachane);
• Germinadora para incubação (Tecnal TE-401);
• Bomba a vácuo (Marconi);
• Banho termostático (Tecnal TE-210);
• Estufa para secagem (Marconi);
• Balança analítica (Bel Engineering);
• Agitador orbital (Marconi MA-410);
• Potenciômetro (Gehaka);
• Espectrofotômetro (Agilent Tecnologies 8453);
• Dessecador (Kartell);
• Mixer manual (Black & Decker);
• Centrífuga (Hettich).



Capítulo 3– Material e Métodos
25
Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados.
Produtos Reagentes
Acetato de sódio (Synth) Fosfato de Sódio Monobásico (Synth)
Acetil Acetona (Vetec) Glicose (Synth)
Acetona (Quimex) Goma Arábica (Synth)
Ácido acético glacial (Quimex) Hidrolisado de Levedura (Prodeza, Mogi
Mirim-SP)
Ácido clorídrico (Quimex) Hidróxido de Potássio (Quimex)
Ácido tricloro-acético (Vetec) Hidróxido de Sódio (Nuclear)
Agar (Vetec) Meio PDA* (Acumedia)
Água de maceração de Milho (Corn
Products do Brasil)
Melaço (Usina Ester, Cosmópolis-SP)
Amido solúvel (Synth) Óleo de mamona (Delaware)
Azocaseína (Sigma) Óleo de milho (Salada)
Carbonato de Cálcio (Vetec) Óleo de oliva (Arisco)
Carbonato de Sódio (Synth) Óleo de soja (Soya)
Cloreto de Sódio (Proton) p-dimetilaminobenzaldeído (Vetec)
Etanol (Quimex) Peptona bacteriológica (Inlab)
Extrato de levedura (Vetec) Biftlato de Potássio (Nuclear)
Farelo de Soja (Olfar) Sulfato de Amônio (Vetec)
Fenolftaleína (Nuclear) Sulfato de Magnésio (Synth)
Fosfato de Potássio (Vetec) Tween 80 (Vetec)
Fosfato de Sódio Dibásico (Nuclear)
* Composição: após o preparo de 39g em 1L o meio contém: 4g/L de infusão de batata,
20g/L de glicose e 15g/L de ágar.


3.2 MÉTODOS

Nesta seção está apresentada a metodologia empregada para a produção de
lipases por Penicillium verrucosum. Primeiramente, será descrita a metodologia
empregada na execução dos experimentos por fermentação em estado sólido e,
numa segunda etapa, a metodologia empregada na fermentação submersa.
Capítulo 3– Material e Métodos
26
3.2.1 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

3.2.1.1 Microrganismo
O fungo Penicillium verrucosum empregado foi isolado previamente por
Freire (1996) em solo brasileiro. Este microorganismo foi pré-selecionado como
bom produtor de lipases através das metodologias de seleção em meio sólido e
líquido descritas na literatura (Freire, 1996). Este fungo tem sido
permanentemente estocado em glicerol, sílica e meio sólido recoberto com óleo
mineral sob refrigeração. A propagação de esporos para posterior fermentação foi
feita por um período de 7 dias a 27,5ºC.

3.2.1.2 Inóculo
Foram testados dois meios para a produção de inóculo. O primeiro
chamado de meio basal é constituído por: amido solúvel 2%; óleo de oliva 1%;
extrato de levedura 0,1%; MgSO
4
. 7H
2
O 0,025%; KH
2
PO
4
0,5%; CaCO
3
0,5% e
Agar 1,5%, (m/v). Todos os componentes do meio foram solubilizados e levados à
fervura para completa dissolução do amido. Após a fervura o meio basal foi
emulsificado com auxílio de um mixer manual e 100 mL de meio foram
transferidos para erlenmeyer de 500 mL. O segundo meio (Potato Dextrose Agar -
PDA) é constituído por PDA 3,9% (m/v) e água destilada. Após a solubilização
completa do componente, ocorre a transferência de 100 mL de meio para
erlenmeyer de 500 mL. Os dois meios foram autoclavados a 121ºC por 30
minutos.
Do tubo estoque, retirou-se uma alçada e transferiu-se para um tubo de
ensaio contendo 10 mL de solução de Tween 80. Após a homogeneização retirou-
se 0,30 mL e inoculou-se nos erlenmeyers já resfriados mantendo-se em câmara
de germinação a 27,5ºC por 7 dias (Vargas, 2004). O recolhimento de esporos foi
feito adicionando-se 10 mL de solução de Tween 80 (0,1% v/v) e pérolas de vidro
estéreis ao erlenmeyer. Retirou-se 1 mL da solução contendo esporos, este
volume foi transferido para um tubo de 9 mL de solução de Tween 80 sendo
estocados a 4ºC por, no máximo, 15 dias.
Capítulo 3– Material e Métodos
27
3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo
O substrato utilizado em todos os experimentos de fermentação em meio
sólido consistiu de farelo de soja obtido no moinho Olfar (Erechim- RS) o qual foi
peneirado (Tyler 35-60) e armazenado em freezer até o momento da sua
utilização.
A fermentação em meio sólido foi realizada em béqueres de polipropileno
de 500 mL tampados com manta acrílica de acordo com a Figura 3.1.
Em cada béquer eram colocados 10 g de farelo de soja e a adição de água
ao meio era realizada de acordo com a determinação prévia da umidade desejada
e por gotejamento manual com auxílio de pipeta volumétrica de forma que toda a
área do farelo fosse recoberta. Os béqueres eram autoclavados a 1,0 atm por 15
minutos e após o resfriamento, inoculava-se a suspensão de esporos previamente
diluída até concentração de esporos desejada (4 x 10
8
esporos/g).

Figura 3.1. Béqueres utilizados para a FES.

3.2.1.4 Preparo das amostras
Após maceração das amostras em câmara de fluxo, retirava-se de cada
frasco duas alíquotas de 0,5 g para posterior análise de umidade e pH. Ao
restante do material, o qual era pesado em erlenmeyers de 250 mL, eram
adicionados 45 mL de tampão fosfato de sódio 100mM pH 7,0 e se efetuava a
Capítulo 3– Material e Métodos
28
incubação em agitador orbital à temperatura de 37ºC e velocidade de agitação de
150 rpm por 30 minutos. Em seguida, era feita a extração da fração líquida por
prensagem manual em filtro de nylon e o sobrenadante era utilizado para a
dosagem de atividade lipásica e proteásica. A fração sólida retida no filtro era
utilizada para dosagem de glicosamina, que foi utilizada como medida indicativa
do crescimento microbiano.

3.2.1.5 Métodos Analíticos

Caracterização dos substratos e indutores
A caracterização do farelo de soja, do hidrolisado de levedura, do melaço e
da água de maceração de milho foi feita seguindo as Normas Analíticas do
Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985). As análises realizadas foram: umidade (diferença
de massa), lipídeos (Método Soxhlet e solvente a frio) e nitrogênio (método de
Kjeldahl).

Medida de atividade lipásica
Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipásica, óleo de
oliva (10% m/v) emulsionado por três minutos com goma arábica (5%p/v) em
tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulsão contidos em
erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 2mL da amostra. Após incubação por
15 minutos a 37ºC e 150 rpm, a reação foi interrompida e os ácidos graxos
extraídos pela adição de 20 mL de uma solução de acetona/etanol (1:1 v/v). Os
ácidos graxos eram, então, titulados com uma solução de NaOH (0,05 M) até pH
11.
Os brancos reacionais eram preparados colocando-se as amostras após a
incubação em agitador orbital e adicionando-se imediatamente acetona/etanol,
realizando-se após, a titulação. As dosagens de atividade foram feitas em
duplicata e a média aritmética dos valores encontrados foi utilizada para o cálculo
da atividade lipásica.
Capítulo 3– Material e Métodos
29
Uma unidade de atividade lipásica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1 mmol de ácido graxo por minuto nas condições descritas
acima que pode ser determinada através da equaçâo 3.1 (Leal, 2000).

( )
|
¹
|

\
|
×
(
¸
(

¸

×
|
¹
|

\
|
×
× × −
=
Au
As
m
Vd
Vc t
M Vb Va
A
1000
(3.1)


Onde:

A = atividade lipásica (U/g);
Va = volume da amostra titulada (mL);
Vb = volume do branco titulado (mL);
Vc = volume da amostra usada na reação (mL);
Vd = Volume do tampão usado para a extração (mL);
t = tempo de reação (minutos);
M = molaridade da solução de NaOH;
m = massa contida no erlenmeyer (g);
As = massa da amostra seca (g);
Au = massa da amostra úmida (g).

Medida de atividade proteásica
Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra
e 0,5 mL de solução de azocaseína
1
0,5% (m/v) preparada em tampão acetato 50
mM pH 5,0. Os tubos foram então incubados durante 15 minutos
2
a 37°C. Após o
período de incubação, a reação enzimática foi interrompida adicionando-se 0,5 mL

1
Detalhes sobre preparo desta solução ver Anexo 1
2
Tempo determinado após acompanhamento cinético da reação utilizando algumas amostras


Capítulo 3– Material e Métodos
30
de solução de ácido tricloro-acético (TCA) 10% (m/v), em banho de gelo. Os tubos
com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se então
1 mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1 mL de solução de hidróxido de
potássio 5 M. Fazia-se então a determinação da absorbância da solução por
espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) em 428 nm. O branco das reações era
preparado adicionando-se a amostra após a adição do TCA. O branco do aparelho
foi preparado substituindo-se o volume de amostra por tampão acetato 50 mM pH
5,0.
Uma unidade de atividade proteásica foi definida como a quantidade de
enzima que produz uma diferença unitária de absorbância por minuto de reação
entre o branco reacional e a amostra nas condições de ensaio, determinada
através da Equação 3.2 (Charney e Tomarelli, 1947).

( )
|
¹
|

\
|
×
(
(
¸
(

¸

×
|
|
¹
|

\
|
×
× − ×
=
Au
As
m
Vd
Va t
f Abs f Abs
A
b b a
(3.2)

Onde:

A = atividade proteásica (U/g);
Abs
a
= leitura de absorbância da amostra;
Abs
b
= leitura de absorbância do branco;
f = fator de diluição;
t = tempo de reação (minutos);
Va = volume de amostra (mL);
Vd = Volume do tampão usado para a extração (mL);
m = massa contida no erlenmeyer (g);
As = massa da amostra seca (g);
Au = massa amostra úmida (g).

Capítulo 3– Material e Métodos
31
Medida de crescimento celular
Como forma indireta de quantificar o crescimento celular, foi utilizada a
dosagem de glicosamina, segundo Aidoo et al. (1981). Adicionou-se 5 mL de uma
solução de ácido clorídrico 6 M a 0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em
banho de água fervente por duas horas. Em seguida, a amostra foi resfriada e
filtrada a vácuo. Do sobrenadante, transferia-se 1 mL para um balão de 25 mL,
adicionando-se uma gota de solução alcoólica de fenolftaleína 0,5% (p/v). Logo
após, a neutralização foi efetuada adicionando-se solução de hidróxido de sódio 3
N, até que a mistura atingisse a coloração rosa. Procedia-se então à titulação
reversa com uma solução de KHSO
4
1%, até que a coloração rosa
desaparecesse. O volume do balão foi então completado com água destilada.
Após a etapa de extração descrita acima, tomava-se 1 mL da solução e
adicionava-se à mesma 1 mL de solução de acetil acetona
3
em Na
2
CO
3
0,5 N,
colocando a mistura em banho de água fervente por 20 minutos. Após o
resfriamento das amostras, adicionava-se 6 mL de etanol, em seguida, 1 mL de
reagente de Erlich
4
. Os tubos foram então incubados a 65º C por 10 minutos, e a
absorbância lida em espectofotômetro (Agilent Tecnologies) a 530 nm. O branco
foi preparado adicionando-se água no lugar da amostra.

3.2.1.6 Estudo da Produção de Lipases

Uso de diferentes indutores
O tempo e a temperatura de fermentação na etapa da escolha dos
indutores foram definidos em 48 horas e 27,5ºC, respectivamente, segundo
resultados obtidos em estudo com Penicillium simplicissimum (Vargas, 2004). Os
experimentos foram realizados em duplicata para a definição do melhor
suplemento em função da atividade lipásica obtida.
Os meios de cultivos foram suplementados com os diferentes indutores,
numa concentração de 1% (p/v), sendo eles: óleo de oliva extra-virgem (Arisco);

3,4
Detalhes sobre preparo desta solução ver Anexo 1


Capítulo 3– Material e Métodos
32
óleo de milho (Salada); óleo de soja (Soya); óleo de mamona (Delaware); melaço
(Usina Ester, Cosmópolis-SP); hidrolisado de levedura (Prodex lac
®
- Prodeza-
Mogi Mirim-SP); água de maceração de milho (Corn Products do Brasil) e glicose
(Nuclear). Utilizou-se farelo puro de soja com duas granulometrias: tyler 16-42 e
tyler 35-60 para verificação da real necessidade de indutores e a influência da
granulometria na produção da enzima e avaliou-se também o efeito do meio de
crescimento, utilizando-se inóculo proveniente do meio basal e do meio PDA.
Para a fermentação em estado sólido misturou-se o indutor em água
deionizada e homogeneizou-se com mixer por 2 minutos. O volume da mistura a
ser adicionado no farelo de soja foi determinado de acordo com a umidade final
desejada de 55% (Vargas, 2004), descontando-se 2,5 mL adicionados no
momento da inoculação com a suspensão de esporos e a umidade presente no
farelo.
A adição da mistura (água e indutor) ao farelo foi feita por gotejamento
manual com auxílio de pipeta volumétrica de forma que toda a área do farelo fosse
recoberta. Os béqueres foram então tampados com manta acrílica e papel
alumínio e autoclavados a 1,0 atm por 15 minutos. Após o resfriamento dos
béqueres, inoculou-se a suspensão de esporos previamente diluída até
concentração de esporos desejada (4x10
8
esporos/g). A concentração de esporos
da suspensão de estoque foi determinada por contagem em câmara de Neubauer
após diluição adequada (10
-3
).

Os béqueres contendo os meios de cultivo foram incubados em câmara de
germinação à temperatura de 27,5ºC por 48 horas com injeção de ar umidificado,
de forma a manter a umidade da câmara em 99%. Ao final do tempo de
fermentação, as amostras foram retiradas para posterior análise.

Otimização das condições de processo na produção de lipases
A técnica de planejamento de experimentos é uma ferramenta estatística
que permite determinar as variáveis que exercem maior influência no desempenho
de um determinado processo, assim como avaliar possíveis inter-relações entre
variáveis de um processo. Além disso, essa ferramenta também permite otimizar o
Capítulo 3– Material e Métodos
33
sistema em estudo, com o objetivo de maximizar ou minimizar uma resposta. A
principal vantagem da utilização desta ferramenta é a redução do número de
experimentos e a conseqüente redução de custos (Barros et al., 1996).
Para que as condições de produção de lipases pelo fungo Penicillium
verrucosum fossem otimizadas, utilizou-se a técnica de planejamento fatorial de
experimentos e análise de superfície de resposta.
Um planejamento fatorial completo 2
2
com dois pontos axiais para cada
variável independente e um ponto central repetido três vezes foi realizado. O
tempo de fermentação foi fixado em 48 horas. A metodologia de superfície de
resposta foi utilizada para determinar a influência das variáveis estudadas e
otimizar as condições de cultivo para a produção de lipases por fermentação em
estado sólido.
As variáveis e níveis estudados encontram-se na Tabela 3.2 e foram
determinadas com base na experiência prévia do grupo (Capra et al; 2003) e
trabalhos disponíveis na literatura (Vargas, 2004).

Tabela 3.2. Variáveis e níveis estudados no planejamento de experimentos 2
2

para otimização das condições de processo.
Nível Temperatura (ºC) Umidade (%)
-1,41 15 30
-1 18,6 37,3
0* 27,5 55
+1 36,4 72,7
+1,41 40 80
* Ponto Central

Ao final dos experimentos, os resultados obtidos foram analisados usando-
se o programa Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.,2001).

Cinéticas de fermentação
Para realização do estudo cinético, avaliou-se o efeito da concentração de
substrato, utilizando-se a condição otimizada da etapa anterior (sem adição de
Capítulo 3– Material e Métodos
34
suplemento) e com adição de 0,5% e 2,0% de óleo de soja. O tempo de
fermentação foi de 156 horas, avaliando-se a atividade lipásica a cada 12 horas.

Avaliação de parâmetros cinéticos
Com o intuito de avaliar a evolução dos valores de crescimento celular e
dos valores do produto (atividade lipásica) formado em função do tempo,
determinou-se os parâmetros cinéticos ou parâmetros de transformação. A Figura
3.2 demonstra algumas curvas de ajuste que permitem calcular os parâmetros
desejados.
Foram construídas curvas de Atividade Lipásica x Tempo e Concentração
de Glicosamina x Tempo de onde se retirou os valores para os cálculos utilizando
as equações 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 e 3.9 (Borzani et al., 2001).


Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experiência idealizada de
fermentação.

r
X
= dX/dt (3.3) r
P
= dP/dt (3.7)
µ
X
= (1/X)*dX/dt (3.4) µ
P
= (1/X)*r
P
(3.8)
P
X
= (Xf – Xo)/tf (3.5) P
P
= (Pf – Po)/tf (3.9)
Y
X/P
= µ
X

P
(3.6)

Capítulo 3– Material e Métodos
35
Onde:
r
X
: velocidade instantânea de produção de biomassa;
r
P
: velocidade instantânea de formação de produto;
µ
X
: velocidade específica de formação de biomassa num determinado tempo;
µ
P
: velocidade específica de formação de produto num determinado tempo;
P
X
: Produtividade em biomassa;
P
P
: Produtividade em produto;
Y
X/P
: Fator de conversão de biomassa em produto;
tf: Tempo de fermentação em que se deseja conhecer a produtividade.
A velocidade instantânea e o fator de conversão (biomassa/produto) foram
obtidos na fase exponencial de crescimento (t=48h); já os demais parâmetros
foram determinados no tempo desejado.

3.2.1.7 Caracterização da lipase obtida por fermentação em estado sólido

Temperatura e pH ótimos
Na determinação dos valores ótimos de temperatura e pH para a atividade
lipásica, foi realizado um planejamento fatorial completo 2
2
. Preparou-se a
emulsão utilizada como substrato para medida de atividade lipásica com diferentes
valores de pH de tampão fosfato de sódio e as amostras foram incubadas a
variadas temperaturas por 15 minutos e 150 rpm. As faixas de pH e temperatura
estudadas estão relacionadas na Tabela 3.3. Os experimentos foram realizados
em duplicata.

Temperatura de estabilidade
A fim de determinar a temperatura de estabilidade do extrato enzimático
obtido por fermentação em estado sólido, este foi submetido à diferentes
temperaturas no banho termostático, sendo estas: 25ºC, 35ºC, 45ºC, 55ºC, 65ºC.
As dosagens de atividade lipásica nos tempos 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24
horas após incubação foram realizadas conforme descrito anteriormente. Os
experimentos foram realizados em duplicata.
Capítulo 3– Material e Métodos
36
Tabela 3.3. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para
temperatura e pH ótimos.
Nível Temperatura (ºC) pH
-1,41 29,95 4,88
-1 32 5,5
0* 37 7,0
+1 42 8,5
+1,41 44,05 9,11
* Ponto Central

pH de estabilidade
Para determinação do pH de estabilidade, a enzima foi extraída com
tampão fosfato de sódio 100 mM formulados com os seguintes valores de pH: 5,5;
6,0; 6,5; 7,0 e 7,5. O extrato enzimático foi incubado a 50ºC e a determinação da
atividade lipásica foi realizada conforme descrito anteriormente, nos tempos 0, 15
e 30 minutos, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas após incubação. Os experimentos foram
realizados em duplicata.

3.2.2 FERMENTAÇÃO SUBMERSA

3.2.2.1 Microrganismo
A descrição do microrganismo e a metodologia usada para a manutenção
do mesmo foi apresentada no item 3.2.1.1.


3.2.2.2 Inóculo
O meio para a produção de inóculo foi defno estudo por FES e era
constituído por PDA 3,9% (m/v) e água destilada e a metodologia empregada foi
descrita no item 3.2.1.2.



Capítulo 3– Material e Métodos
37
3.2.2.3 Preparo dos meios de cultivo
Para a condução do processo por fermentação submersa, para fins de
comparação, utilizou-se um meio sintético e outro industrial. O primeiro era
composto por peptona bacteriológica, extrato de levedura, cloreto de sódio e óleo
de oliva. O segundo consistiu de água de maceração de milho (AMM), hidrolisado
de levedura (Prodex Lac®), cloreto de sódio e óleo de oliva.
A fermentação em meio submerso foi realizada em erlenmeyers de 250 mL
tampados com algodão envolvido por gaze. Os meio de cultivo eram esterilizados
a 1,0 atm por 15 minutos e após seu resfriamento eram inoculados com a
suspensão de esporos com concentração de 2x10
6
esporos/mL.

3.2.2.4 Preparo das amostras
Após o período de fermentação, as amostras eram filtradas em filtros
whatman 44 e o sobrenadante era utilizado para dosagem de atividade lipásica e
proteásica. A fração sólida retida no filtro era usada para avaliar o crescimento
celular por massa seco.

3.2.2.5 Métodos Analíticos

Caracterização dos substratos e indutores
A caracterização dos substratos e indutores foi realizada conforme item
descrito para fermentação em estado sólido.

Medida de atividade lipásica
Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipásica, óleo de
oliva (10% m/v) emulsionado por três minutos com goma arábica (5%p/v) em
tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulsão contidos em
erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 2mL da amostra. Após incubação por
15 minutos a 37ºC e 150 rpm, a reação foi interrompida e os ácidos graxos
extraídos pela adição de 20 mL de uma solução de acetona/etanol (1:1 v/v). Os
Capítulo 3– Material e Métodos
38
ácidos graxos eram, então, titulados com uma solução de NaOH (0,05 M) até pH
11.
Os brancos reacionais eram preparados colocando-se as amostras após a
incubação em agitador orbital e adicionando-se imediatamente acetona/etanol,
fazendo-se após, a titulação. As dosagens de atividade foram feitas em duplicata e
a média aritmética dos valores encontrados foi utilizada para o cálculo da atividade
lipásica.
Uma unidade de atividade lipásica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1 mmol de ácido graxo por minuto nas condições descritas
acima, e pode ser determinada através da equação 3.10 (Leal, 2000).


( )
Vc t
M Vb Va
A
×
× × −
=
1000
(3.10)


Onde:
A = atividade lipásica (U/mL);
Va = volume da amostra titulada (mL);
Vb = volume do branco titulado (mL);
Vc = volume da amostra usada na reação (mL);
t = tempo de reação (minutos);
M = molaridade da solução de NaOH.

Medida de atividade proteásica
Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra
e 0,5 mL de solução de azocaseína
5
0,5% (p/v) preparada em tampão acetato 50
mM pH 5,0. Os tubos foram então incubados durante 15 minutos
6
a 37°C. Após o
período de incubação, a reação enzimática foi interrompida adicionando-se 0,5 mL
de solução de ácido tricloro-acético (TCA) 10% (p/v), em banho de gelo. Os tubos

5
Detalhes sobre preparo desta solução ver Anexo I
6
Tempo determinado após acompanhamento cinético da reação utilizando algumas amostras
Capítulo 3– Material e Métodos
39
com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se então
1mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1mL de solução de hidróxido de
potássio 5M. Fazia-se então a determinação da absorbância da solução por
espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) em 428nm. O branco das reações era
preparado adicionando-se a amostra após a adição do TCA. O branco do aparelho
foi preparado substituindo-se o volume de amostra por tampão acetato 50mM pH
5,0.
Uma unidade de atividade proteásica foi definida como a quantidade de
enzima que produz uma diferença unitária de absorbância por minuto de reação
entre o branco reacional e a amostra nas condições de ensaio, determinada
através da Equação 3.11 (Charney e Tomarelli, 1947).

( )
Va t
f Abs f Abs
A
b b a a
×
× − ×
=
(3.11)

Onde:
A = atividade proteásica (U/mL);
Abs
a
= leitura de absorbância da amostra;
Abs
b
= leitura de absorbância do branco;
f = fator de diluição;
t = tempo de reação (minutos);
Va = volume de amostra (mL).

Medida do crescimento celular
O crescimento microbiano por fermentação submersa foi quantificado pelo
peso seco das amostras. Um volume conhecido da amostra era filtrado em papel
Whatman nº44 previamente dessecado em estufa a 105ºC por 4 horas. Após a
filtração, os filtros eram incubados na mesma estufa e pesados periodicamente até
a obtenção do peso constante. A biomassa foi determinada pela equação 3.12.

Capítulo 3– Material e Métodos
40
( )
a
a
V
F F
B
1000 × −
=
(3.12)

Onde:
B = Biomassa (mg/mL);
F
a
= Filtro com amostra após dessecação (mg);
F = Filtro dessecado (mg);
V
a
= Volume da amostra filtrada (mL).

3.2.2.6 Estudo da Produção de Lipases

Uso de diferentes indutores
O tempo e a temperatura de fermentação na etapa da escolha dos
indutores foram definidos em 48 horas e 27,5ºC, respectivamente, segundo
resultados obtidos em estudo com Penicillium simplicissimum (Vargas, 2004). Os
experimentos foram realizados em duplicata para a definição do melhor
suplemento em função da atividade lipásica obtida.
Os meios de cultivos foram suplementados com os diferentes indutores,
numa concentração de 1% (m/v), sendo eles: óleo de oliva extra-virgem (Arisco);
óleo de milho (Salada); óleo de soja (Soya); óleo de mamona (Delaware); melaço
(Usina Ester, Cosmópolis-SP); hidrolisado de levedura (Prodex lac
®
- Prodeza-
Mogi Mirim-SP), água de maceração de milho (Corn Products do Brasil) e glicose
(Nuclear).

Para a avaliação do melhor indutor para a produção de lipases utilizou-se o
meio sintético suplementado com os diferentes indutores já descritos, sendo que
os indutores lipídicos substituíram o óleo de oliva, o qual faz parte da composição
do meio.
Os erlenmeyers contendo o meio suplementado foram então tampados com
algodão, gaze e papel alumínio e levados à autoclave a 1,0atm por 15 minutos.
Após o resfriamento destes, inoculou-se a suspensão de esporos previamente
diluída até concentração de esporos desejada (2x10
6
esporos/g). A concentração
Capítulo 3– Material e Métodos
41
de esporos da suspensão de estoque foi determinada por contagem em câmara
de Neubauer (200 mm) após diluição adequada (10
-3
).

A incubação dos meio foi feita em agitador orbital à temperatura de 27,5ºC
por 48 horas a 150rpm. Ao final do tempo de fermentação, as amostras foram
retiradas para posterior análise.

Otimização das condições de processo na produção de lipases
Assim como foi feito no estudo de otimização de produção de lipases por
fermentação em estado sólido, para que as condições de produção de lipases por
fermentação submersa fossem otimizadas, utilizou-se a técnica de planejamento
fatorial de experimentos e análise de superfície de resposta.
Na primeira etapa do estudo de otimização da produção de lipases aplicou-
se no meio sintético a técnica de planejamento de experimentos utilizando-se uma
matriz do tipo Plackett-Burman (PB) de 12 ensaios mais 3 pontos centrais, para
que os principais efeitos das variáveis em estudo pudessem ser avaliados. A
Tabela 3.4 apresenta a faixa de valores estudados neste planejamento. Após
análise dos resultados aplicou-se um planejamento fatorial completo 2
2
para este
meio, cuja faixa de valores está apresentada na Tabela 3.5.

Tabela 3.4. Variáveis e níveis estudados no planejamento experimental PB de 12
ensaios mais 3 pontos centrais para produção de lipases por FS em meio
sintético.
Nível
Temperatura
(ºC)
Inóculo
(%m/v)
Peptona
(%m/v)
Extrato de
levedura
(%m/v)
Cloreto de
sódio
(%m/v)
Óleo de
oliva
(%m/v)
-1 28 2,5 2 0,5 0,5 1
0* 32 7,5 5 1,75 1,75 1,5
+1 36 12,5 8 3 3 2
*Ponto Central

De forma similar à primeira etapa do estudo de otimização da produção de
lipases utilizando um meio sintético, aplicou-se para o meio industrial uma matriz
Capítulo 3– Material e Métodos
42
do tipo Plackett-Burman (PB) de 12 ensaios mais 3 pontos centrais, sendo que a
faixa de valores estudados neste planejamento está descrita na Tabela 3.6. Após
análise dos resultados aplicou-se um planejamento fatorial completo 2
3
para o
meio industrial, cuja faixa de valores está apresentada na Tabela 3.7.

Tabela 3.5. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para
o meio de cultura sintético por FS.
Nível Temperatura (ºC) Peptona (%m/v)
-1 20 4
0* 28 8
+1 36 12
* Ponto Central

Tabela 3.6. Variáveis e níveis estudados no planejamento experimental PB de 12
ensaios mais 3 pontos centrais para produção de lipases por FS em meio
industrial.
Nível
Temperatura
(ºC)
Inóculo
(%m/v)
Água de
Maceração
de Milho
(%m/v)
Hidrolisado de
Levedura
(%m/v)
Cloreto de
sódio
(%m/v)
Óleo de
oliva
(%m/v)
-1 28 2,5 2 0,5 0,5 1
0* 32 7,5 5 1,75 1,75 1,5
+1 36 12,5 8 3 3 2
* Ponto Central

Cinéticas de fermentação
Para realização dos estudo cinéticos, avaliou-se o efeito das concentrações
dos substratos nos tempos de 48, 72 e 96 horas. As melhores condições
encontradas para os meios sintético e industrial foram avaliadas em até 108 horas,
dosando-se a atividade lipásica a cada 12 horas.

Capítulo 3– Material e Métodos
43
Tabela 3.7. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
3
para
o meio de cultura industrial por FS.
Nível Temperatura (ºC) Água de Maceração
de Milho (%p/v)
Hidrolisado de
Levedura
(%p/v)
-1 20 4 2
0* 28 8 4
+1 36 12 6
* Ponto Central

3.2.2.7 Caracterização da lipase obtida por fermentação submersa

Nesta etapa, a lipase obtida por FS foi parcialmente caracterizada em
termos de temperatura e pH ótimos, conforme metodologia descrita a seguir.

Temperatura e pH ótimos
Na determinação dos valores ótimos de temperatura e pH para a atividade
lipásica, foi realizado um planejamento fatorial completo 2
2
tanto para o extrato
enzimático bruto obtido em meio sintético, quanto para o extrato obtido em meio
industrial. Adicionou-se tampão fosfato de sódio com diferentes valores de pH à
emulsão utilizada como substrato para medida de atividade lipásica e as amostras
foram incubadas à diferentes temperaturas por 15 minutos e 150rpm. As faixas de
pH e temperatura estudadas estão relacionadas na Tabela 3.8. Os experimentos
foram feitos em duplicata.

Tabela 3.8. Variáveis e níveis estudados no planejamento fatorial completo 2
2
para
temperatura e pH ótimos da enzima obtida por FS.
Nível Temperatura (ºC) pH
-1,41 29,95 4,88
-1 32 5,5
0* 37 7,0
+1 42 8,5
+1,41 44,05 9,11
* Ponto Central
Capítulo 4– Resultados e Discussão
44
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste capítulo serão apresentados e discutidos todos os resultados obtidos
ao longo dos processos de produção e de caracterização parcial da(s) lipase(s) de
Penicillium restrictum obtidos por fermentação em estado sólido e fermentação
submersa. Primeiramente será apresentada a caracterização dos substratos e
indutores utilizados no desenvolvimento deste trabalho.


4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS E INDUTORES

A Tabela 4.1 apresenta os resultados da caracterização dos substratos e
dos indutores utilizados neste trabalho.

Tabela 4.1. Caracterização dos substratos e indutores.
Amostra Gordura (%) Umidade (%) Proteína (%)
Farelo de Soja 2,4 12,8 35,8
Melaço de cana 0,7 39,0 2,2
Água de maceração de milho 0,6 59,0 19,3
Hidrolisado de levedura 1,2 9,6 39,8
Extrato de levedura 0 5,4 8,9
Cloreto de sódio 0 5,9 0
Óleo de soja 100 0 0
Óleo de milho 100 0 0
Óleo de mamona 100 0 0
Óleo de oliva 100 0 0
Peptona bacteriológica 0 5,6 12,5

Através da caracterização pode-se considerar que o farelo de soja é um
meio rico em nutrientes e, portanto, pode constituir-se em um substrato adequado
à fermentação em estado sólido. De fato, ao se comparar a composição deste
meio com tortas provenientes da agroindústria, observa-se que o teor de
Capítulo 4– Resultados e Discussão
45
nitrogênio (proporcional ao teor de proteína) do farelo de soja é maior do que o
teor de nitrogênio de tortas como a de babaçu (Gombert et al., 1999; Palma et al.,
2000; Leal et al., 2003, Castilho et al., 2000), de coco, de arroz, farelo de trigo (Ul-
Haq et al., 2002) e torta de oliva (Cordova et al., 1998), porém menor que o teor
de nitrogênio obtido em torta de soja por Vargas (2004). Ainda assim, optou-se por
se realizar um estudo sistemático da suplementação do farelo de soja com outros
componentes de baixo custo, a fim de se verificar as necessidades nutricionais do
microrganismo para maximizar a produção de lipase.
Alguns desses suplementos também foram caracterizados para verificação
do teor de nitrogênio, umidade e gordura, sendo que a umidade obtida foi levada
em consideração nos ajustes de umidade dos meios durante os experimentos
realizados por fermentação em estado sólido. O hidrolisado de levedura e a água
de maceração de milho, ao contrário do melaço de cana, apresentam alto teor de
nitrogênio, pois a diferença entre os valores obtidos pode ser amenizada pelo alto
teor de umidade da água de maceração de milho, sendo considerados, então,
bons suplementos para incrementar o teor deste componente no meio, podendo
ser também utilizados como substratos para fermentação submersa. Já os óleos
foram considerados fontes suplementares de carbono no meio pois os mesmos
somente contêm lipídeos.


4.2 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO


Neste item serão apresentados e discutidos os resultados referentes à
produção de lipases por Penicillium verrucosum em fermentação em estado
sólido.

4.2.1 ESTUDO DO INDUTOR
O teste de indutores para produção de lipases foi realizado em 48 horas de
fermentação, tempo fixado com base em estudos anteriores com P.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
46
simplicissimum (Vargas, 2004). Os resultados estão apresentados na Tabela 4.2 e
podem ser melhor visualizados através da Figura 4.1.

Tabela 4.2. Indutores estudados para produção de lipases por FES e suas
respectivas atividades enzimáticas.
Indutor Atividade Lipásica (U/g)
Desvio Padrão ( ± ±± ± )
Controle (farelo – tyler 16-42) com inóculo em meio
basal
43,3 ± 2,2
Controle + Óleo de Soja (1% m/v) 16,7 ± 7,9
Controle + Óleo de Oliva (1% m/v) 10,0 ± 2,0
Controle + Óleo de Milho (1% m/v) 11,5 ± 0,6
Controle + Glicose (1% m/v) 3,2 ± 0,6
Controle + Óleo de Mamona (1% m/v) 6,5 ± 1,1
Farelo (tyler 35-60) 20,6 ± 2,9
Controle + Melaço (1% m/v) 23,3 ± 0,2
Farelo (tyler 35-60) com inóculo em PDA 52,2 ± 9,1
Farelo (tyler 16-42) com inóculo em PDA 46,5 ± 7,2
Controle + Hidrolisado de levedura (1% m/v) 24,0 ± 2,9
Controle + Água de maceração de milho (1% m/v) 7,0 ± 0,4


Através da análise estatística (Teste Tukey), observou-se que não existe
diferença significativa entre as amostras de farelo puro (controle, Farelo – tyler 35-
60 com inóculo em PDA e Farelo – tyler 16-42 com inóculo em PDA). Para a real
verificação, fez-se uma nova análise estatística entre as três melhores amostras. A
Tabela 4.3 apresenta os resultados da segunda análise estatística.




Capítulo 4– Resultados e Discussão
47
0
10
20
30
40
50
60
C tyler
16-42
OS OO OM Gli OM F tyler
35-60
Mel F tyler
35-60
PDA
F tyler
16-42
PDA
Hid AMM
Indutor
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)

Figura 4.1. Atividade lipásica em 48 horas de fermentação para os diversos
indutores estudados por FES.

Tabela 4.3. Análise estatística (Teste de Tukey) dos melhores resultados obtidos.
Indutor Atividade Lipásica (U/g)
Desvio Padrão ( ± ±± ± )
Controle (farelo – tyler 16-42) 43,3 ± 2,28
a

Farelo (tyler 35-60) com inóculo em PDA 52,2 ± 9,14
a

Farelo (tyler 16-42) com inóculo em PDA 46,5 ± 7,24
a

Obs: Letras iguais correspondem à amostras sem diferença significativa a nível de 5%.

Observa-se que a adição de diferentes indutores, na concentração de 1%
(m/v), não tem efeito na produção de lipases pelo fungo Penicillium verrucosum,
sendo que se constatou que o farelo puro obteve as maiores atividades lipásicas,
independente da granulometria do mesmo. Através da análise estatística concluiu-
se que não existe diferença significativa a nível de 5% entre as três melhores
amostras na produção de lipase e optou-se por adotar o farelo de soja com tyler
16-42 como substrato para os estudos posteriores.
Nesta etapa foi possível se obter uma atividade lipásica de
aproximadamente 40 U/g de farelo seco em 48 horas de fermentação, sendo este
valor maior que o encontrado por Gombert et al. (1999) que avaliaram a produção
Capítulo 4– Resultados e Discussão
48
de lipase por Penicillium restrictum utilizando torta de óleo de babaçu como
substrato obtendo a atividade máxima de 6 U/g de torta em 24 horas de
fermentação.

4.2.2 ESTUDO DO INÓCULO IDEAL
Apesar de não haver diferença significativa a nível de 5% entre o controle e
o farelo de soja com inóculo em PDA, realizou-se um estudo cinético com tempo
de fermentação de 48 horas para definição do inóculo ideal, levando-se em
consideração, além da atividade lipásica, a facilidade de obtenção do meio e a
homogeneidade de crescimento celular. Os inóculos estudados foram
provenientes de dois meios diferentes – meio basal e meio PDA - utilizando farelo
de soja com granulometria tyler 16-42 para ambos. A Tabela 4.4 apresenta os
resultados do estudo cinético e estes podem ser melhor observados na Figura 4.2.

Tabela 4.4. Resultados do estudo cinético para a atividade lipásica em meio basal
e PDA.
Tempo
(horas)
Atividade Lipásica (U/g)
Desvio Padrão ( ± ±± ± )
Controle
Atividade Lipásica (U/g)
Desvio Padrão ( ± ±± ± )
PDA
12 0 ± 2,68 0 ± 0,34
24 4,9 ± 2,70 3,2 ± 0,70
36 10,2 ± 1,06 9,0 ± 0,01
48 25,0 ± 0,05 35,0 ± 0,06
72 39,9 ± 11,54 16,6 ± 5,14
96 15,8 ± 1,19 19,4 ± 0,37
120 25,5 ± 3,31 15,6 ± 3,61
144 19,4 ± 8,90 11,9 ± 0,74
168 16,1 ± 5,32 32,3 ± 8,96

Capítulo 4– Resultados e Discussão
49
Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
CONTROLE
PDA

Figura 4.2. Cinética de produção de lipase em meio basal e PDA.


De acordo com a Figura 4.2, pode-se observar que o inóculo oriundo do
meio PDA apresentou uma atividade lipásica superior para um tempo de 48 horas,
tempo este em estudo. Devido, então, a esta maior atividade lipásica bem como à
facilidade de preparo do meio e à homogeneidade de crescimento das células,
definiu-se que o inóculo proveniente do meio PDA seria o ideal para as
fermentações.


4.2.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SUPLEMENTO NA PRODUÇÃO
DE LIPASES POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
Em estudo anterior, avaliou-se a produção de lipases utilizando-se uma
concentração de suplemento fixada em 1% m/v. Com o intuito de estudar o
comportamento da atividade lipásica em diferentes concentrações de suplemento,
variou-se a adição de óleo de soja em 0,5% e 2,0% m/v, faixa inferior e superior à
estudada. A escolha deste suplemento baseia-se em Pastore et al. (2003), que diz
que os substratos naturais de lipases são os triacilgliceróis, apresentando maior
afinidade por ácidos graxos de cadeia longa, e também no fato do substrato já
Capítulo 4– Resultados e Discussão
50
conter óleo de soja e este, dentre os óleos estudados, ter mostrado o melhor
resultado.
A Figura 4.3 apresenta as curvas cinéticas obtidas de atividade lipásica
para as variáveis estudadas. Observa-se que a atividade lipásica obtida
apresentou um pico de atividade máxima de cerca de 52 U/g, em torno de 72
horas de fermentação para a amostra controle. Observa-se, também, que ocorre
diminuição da atividade lipásica quando o meio é suplementado, confirmando o
estudo anterior.

Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0
10
20
30
40
50
60
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
CONTROLE
0,5 %
2,00 %

Figura 4.3. Curvas cinéticas de atividade lipásica em função da concentração de
óleo de soja por FES.

Geralmente os lipídios promovem um aumento da produção de lipases
(Gombert et al., 1999; Domínguez et al., 2003; Mahadik et al., 2002), entretanto,
neste estudo as fontes lipídicas parecem ter exercido um efeito inibitório na
produção da enzima. Uma situação semelhante foi observada por Vargas (2004)
que avaliou a produção de lipase por Penicillium simplicissimum e verificou que a
adição de diferentes óleos à torta de soja usada como substrato provocou uma
diminuição da produção de lipases, dando indicativos de ocorrência de inibição por
excesso de substrato.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
51
4.2.4 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE LIPASE POR FERMENTAÇÃO EM
ESTADO SÓLIDO

Nesta etapa, avaliou-se o efeito da temperatura e da umidade na produção
de lipase por fermentação em estado sólido. Foi utilizado um planejamento fatorial
completo com pontos axiais para verificação dos efeitos de primeira e segunda
ordem bem como as interações entre as variáveis.
A Tabela 4.5 apresenta a matriz do planejamento com os valores reais,
codificados e as respostas para a atividade lipásica. É interessante observar que
as condições se basearam em estudo anterior realizado por Vargas (2004), que
utilizou Penicillium simplicissimum e torta de soja como substrato.

Tabela 4.5. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipásica) para produção de lipases por FES.
Ensaio Temperatura
(ºC)
Umidade
(%)
Atividade Lipásica (U/g)
Desvio Padrão ( ± ±± ± )
1 -1 (18,6) -1 (37,3) 2,4 ± 0,30
2 +1 (36,4) -1 (37,3) 5,3 ± 1,30
3 -1 (18,6) +1 (72,7) 7,7 ± 1,12
4 +1 (36,4) +1 (72,7) 18,3 ± 1,99
5 -1,41 (15) 0 (55) 4,4 ± 0,34
6 +1,41 (40) 0 (55) 4,0 ± 2,27
7 0 (27,5) -1,41 (30) 4,9 ± 2,28
8 0 (27,5) +1,41 (80) 29,2 ± 1,51
9* 0 (27,5) 0 (55) 36,5
10* 0 (27,5) 0 (55) 37,7
11* 0 (27,5) 0 (55) 48,2
* Ponto central

Verifica-se que o ensaio que apresentou uma maior atividade enzimática
em 48 horas de fermentação corresponde ao ponto central (T= 27,5ºC e U=55%),
Capítulo 4– Resultados e Discussão
52
seguido da condição experimental 7 (T=27,5ºC e U=80%). A mínima atividade
lipásica obtida no planejamento foi encontrada na condição experimental 1
(T=18,6ºC e U=37,3%). Observa-se neste estudo que o microrganismo tende a
produzir mais lipase, dentro da faixa de estudo das variáveis, de condições
intermediárias a condições superiores de umidade. Os valores máximos de
atividade enzimática obtidos nos pontos centrais caracterizaram que a mesma foi
otimizada em função da temperatura e umidade dentro da faixa estudada.
A Equação 4.1 apresenta o modelo codificado otimizado para a produção
da enzima em função da temperatura e da umidade, o qual foi validado pela
análise de variância apresentada na Tabela 4.6. Verifica-se que o coeficiente de
correlação obtido (0,90) e o teste F (4,3 vezes maior que o valor tabelado)
validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construção da
superfície de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.4.

Atividade lipásica (U/g)= 40,8 – 20,5.Temperatura
2
– 13,06.Umidade
2
(4.1)

Tabela 4.6. Análise de variância para a atividade lipásica por FES.
Fonte de Variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média
Quadrática
F calculado
Regressão 2672,78 2 1336,39 19,34
Resíduo 552,77 8 69,10
Falta de ajuste 470,27 6
Erro puro 82,50 2
Total 3225,55 10
Coeficiente de correlação: R=0,90 , F
0,95;2;8
=4,46
Capítulo 4– Resultados e Discussão
53

15 27,5 40
Temperatura (
o
C)
30
55
80
U
m
i
d
a
d
e

(
%
)

Figura 4.4. Superfície de resposta e curva de contorno para atividade lipásica
obtida por FES.

A atividade lipásica máxima obtida para 48 horas de fermentação para o
fungo Penicillium verrucosum foi de, aproximadamente, 40,8 U/g de farelo seco,
valor este maior se comparado com Vargas (2004) que utilizou Penicillium
simplicissimum e torta de soja como substrato e obteve 12,5 U/g de torta seca
para 48 horas de fermentação e cerca de 30 U/g para 80 horas de fermentação.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
54
Verifica-se que a atividade obtida é superior à encontrada por Gutarra
(2003), que utilizou torta de babaçu suplementada com 3,3% de óleo de oliva e
obteve, aproximadamente, 6 U/g em 48 horas e 18,5 U/g em 72 horas de
fermentação com Penicillium verrucosum. Gombert et al. (1999) utilizaram torta
de babaçu enriquecida com 2% de óleo de oliva e estudaram a produção da
enzima por Penicillium restrictum encontrando 30,3 U/g em 24 horas de
fermentação.
A produção de lipases verificada neste estudo superou também os valores
relatados por Cordova et al. (1998) que avaliaram a produção de lipases por
Rhizomucor pusillus fazendo uso de bagaço de cana de açúcar e torta de óleo de
oliva como substratos, obtendo uma produção enzimática máxima de 20,24 U/g
em 25 horas de fermentação.
Observa-se que em temperaturas superiores e inferiores à do ponto central
há uma queda na produção da enzima, já para uma umidade muito superior (80%)
à do ponto central (55%) e mantendo-se a temperatura de 27,5°C, verifica-se que
a atividade lipásica apresenta valores satisfatórios. Isto pode ocorrer devido ao
fato de que os fungos produtores de lipases, em geral, são mesófilos,
apresentando temperatura ótima entre 20º e 30ºC (Toida et al., 1995); e a
umidade em níveis muito baixos, prejudica o transporte de nutrientes e toxinas
através da membrana e pode causar a perda das propriedades funcionais de
enzimas da cadeia metabólica celular (Gervais e Molin, 2003).

4.2.5 CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE LIPASE PARA A CONDIÇÃO OTIMIZADA
A melhor condição para a produção da lipase por fermentação em estado
sólido, determinada através da metodologia de análise da superfície de resposta,
foi a condição experimental correspondente ao ponto central do planejamento
experimental (T=27,5°C e U=55%). Nesta condição foi então avaliado o
comportamento cinético da fermentação. A cinética de crescimento celular,
produção de lipases e atividade proteásica, para a condição otimizada encontram-
se na Figura 4.5.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
55
Observa-se na curva de atividade lipásica uma queda de produção a partir
de 72 horas de fermentação, o que pode ser explicado pelo aumento da atividade
proteásica, onde o pico máximo de produção ocorreu em 132 horas de
fermentação com valor de 0,69 U/g, valor este semelhante ao obtido por Vargas
(2004) e menor que o obtido por Gutarra (2003).
Nesta etapa, observou-se que o crescimento máximo microbiano se deu em
156 horas de fermentação, sendo este de 76,9 mg/g, o que caracteriza um alto
crescimento. Vargas (2004) obteve em 48 horas de fermentação com o fungo
Penicillium simplicissimum uma concentração de glicosamina de 7,2 mg/g. Neste
estudo, em 48 horas de fermentação, a concentração obtida foi de 33,1 mg/g,
podendo-se concluir então que o meio de cultivo utilizado é bom para o
crescimento celular.

Tempo (horas)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)
C
o
n
c
.

d
e

G
l
i
c
o
s
a
m
i
n
a

(
m
g
/
g
)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
r
o
t
e
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
ATIV. LIPÁSICA
GLICOSAMINA
ATIV. PROTEÁSICA

Figura 4.5. Cinética de produção de lipase, protease e crescimento celular
(glicosamina) por FES.

A queda da atividade lipásica a partir de 72 horas de fermentação pode ter
ocorrido também pela sua desativação com aumento do pH do meio pela ação da
protease, fato este que pode ser observado na Figura 4.6.

Capítulo 4– Resultados e Discussão
56
Tempo (horas)
p
H
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
r
o
t
e
á
s
i
c
a

(
U
/
g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
5.2
5.6
6.0
6.4
6.8
7.2
7.6
8.0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156
pH
Ativ. Proteásica

Figura 4.6. Evolução do pH e atividade proteásica ao longo da FES.

Observa-se na Figura 4.6 que o pH apresenta o mesmo comportamento
que a atividade proteásica, ou seja, à medida que a atividade proteásica aumenta,
há um aumento também no pH, ainda que bem pequeno. O aumento de atividade
proteásica e pH ao longo do tempo de fermentação foi observado por Freire et al.
(1997a), Palma et al. (2000), Vargas (2004) e Gombert et al. (1999). Os
pesquisadores citados anteriormente sugerem que este efeito esteja
possivelmente relacionado à proteólise, que gera aminoácidos, cuja desaminação
libera amônia para o meio.

4.2.5.1 Avaliação dos parâmetros cinéticos
Com base nas curvas cinéticas obtidas no estudo anterior, determinou-se
alguns parâmetros cinéticos com o intuito de avaliar a eficiência do processo de
produção de lipase usando-se como microrganismo o fungo Penicillium
verrucosum.
Na Figura 4.6 pôde-se visualizar as curvas de crescimento celular e
atividade lipásica e atividade proteásica referentes à condição otimizada no
planejamento experimental (T=27,5°C e U=55%; crescimento celular em meio
PDA, farelo de soja tyler 16-42 como substrato).
Capítulo 4– Resultados e Discussão
57
Através da figura apresentada anteriormente, calculou-se na fase
exponencial a velocidade instantânea de produção de biomassa (r
X
), velocidade
instantânea de formação de produto (r
P
) e o fator de conversão de biomassa em
produto (Y
X/P
). Obteve-se também em 48 horas de fermentação as velocidades
específicas de formação de biomassa (µ
X
) e de formação de produto (µ
P
), bem
como a produtividade em biomassa (P
X
) e a produtividade em produto (P
P
). Os
valores desses parâmetros cinéticos encontram-se na Tabela 4.7.

Tabela 4.7. Parâmetros cinéticos para produção de lipase por FES utilizando
Penicillium verrucosum.
Parâmetro r
X
(U/g.h) r
P
(U/g.h) Y
X/P
µ
X
(h
-1
)
µ
P

(h
-1
)
P
X

(mg/g.h)
P
P
(U/g.h)
Fase
exponencial
1,019 1,636 0,63 - - - -
48 h de
fermentação

-

-

-

0,026

0,041

0,48

0,80

A produtividade em produto foi determinada em 72 horas de fermentação,
onde encontrou-se 0,74 U/g.h. Comparando-se com outros trabalhos realizados
verifica-se que este valor supera a produtividade em produto obtida por Gutarra
(2003), que obteve 0,26 U/g.h. em 72 horas de fermentação, e também por
Castilho et al. (2000) que avaliaram a produtividade da enzima produzida em 24
horas de fermentação por Penicillium restrictum utilizando torta de babaçu e óleo
de oliva como substratos, obtendo 0,24 U/g.h.

4.2.6 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LIPASE PRODUZIDA POR
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
Após a extração da enzima produzida por fermentação em estado sólido na
condição otimizada, procedeu-se a sua caracterização parcial.



Capítulo 4– Resultados e Discussão
58
4.2.6.1 Temperatura e pH ótimos
A determinação dos valores de temperatura e pH ótimos foi feita através da
realização de um planejamento fatorial 2
2
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos
centrais, e a matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipásica obtidos estão apresentados na Tabela 4.8. Observando-se os
resultados de atividade enzimática obtidos verifica-se que o valor máximo
encontra-se no ensaio 6, o qual corresponde a um pH de 7,0 e temperatura de
44ºC.
Em relação ao pH ótimo, Kamini et al. (1998) caracterizaram a lipase de
Aspergillus niger e encontraram um valor de 7,0. Um resultado similar foi obtido
por Benjamin e Pandey (2001), os quais relataram que uma das três formas
distintas de lipases produzidas por Candida rugosa apresentou atividade ótima em
pH 7,0 e temperatura de 40ºC. Esta mesma temperatura foi encontrada como
ótima por Pastore et al. (2003) que estudaram a caracterização de lipase
produzida por Rhizopus sp. e determinaram um pH ótimo entre 6,0 e 6,5. A
caracterização parcial da lipase produzida por Yarrowia lipolytica foi executada por
Martins (2001) que determinou a temperatura ótima de 45ºC e pH ótimo de 9,0
para a enzima. A mesma temperatura foi reportada como ótima por Shu et al.
(2006) em um estudo de caracterização de lipase proveniente de Antrodia
cinnamomea, sendo que o pH ótimo encontrado foi de 8,0.
A Tabela 4.9 apresenta a análise de variância para a atividade enzimática
obtida nos níveis estudados. Verifica-se que o coeficiente de correlação e o F
calculado permitiram a validação do modelo codificado apresentado na equação
4.2, o qual possibilitou a construção da superfície de resposta e curva de contorno
apresentada na Figura 4.7.

Atividade lipásica (U/mL)= 1,38 + 0,431. pH – 0,520. pH
2
(4.2)


Capítulo 4– Resultados e Discussão
59
Tabela 4.8. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FES.
Ensaio pH Temperatura (ºC) Atividade Lipásica
(U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32) 0
2 -1 (5,5) 1 (42) 0,17
3 1 (8,5) -1 (32) 1,19
4 1 (8,5) 1 (42) 0
5 0 (7,0) -1,41 (30) 1,50
6 0 (7,0) 1,41 (44) 2,25
7 -1,41 (4,88) 0 (37) 0
8 1,41 (9,11) 0 (37) 1,72
9 0 (7,0) 0 (37) 1,14
10 0 (7,0) 0 (37) 1,23
11 0 (7,0) 0 (37) 1,76


Tabela 4.9. Análise de variância para a atividade lipásica.
Fontes de
Variação
Soma dos
Quadrados
Graus de
Liberdade
Quadrados
Médios
F calculado
Regressão 3,12 2 1,56 3,49
Resíduos 3,57 8 0,45
Falta de ajuste 3,35 6
Erro Puro 0,22 2
Total 6,70 10
Resíduos = Falta de ajuste + Erro Puro
F
0,90;2;8
= 3,11
Coeficiente de correlação: R = 0,90
Capítulo 4– Resultados e Discussão
60



Figura 4.7. Atividade lipásica obtida por FES em função da temperatura e pH.

4.2.6.2 Temperatura de estabilidade
Os resultados obtidos de atividade lipásica no extrato concentrado em
função do tempo de incubação em diferentes temperaturas estão apresentados
nas Tabelas 4.10, 4.11, 4.12, 4.13 e 4.14, e podem ser melhor visualizados na
Figura 4.8.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
61
Tabela 4.10. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 25ºC.
Tempo (h) Atividade lipásica (U/mL) A/A
0

0 1,84 1
0,5 2,72 1,48
1 3,45 1,87
2 2,55 1,39
4 1,50 0,81
6 0,64 0,34


Tabela 4.11. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 35ºC.
Tempo (h) Atividade lipásica (U/mL) A/A
0

0 1,24 1
0,5 3,08 2,48
1 1,48 1,19
2 1,91 1,54
4 3,32 2,68
6 0 0


Tabela 4.12. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 45ºC.
Tempo (h) Atividade lipásica (U/mL) A/A
0

0 3,56 1
0,5 1,56 0,44
1 2,7 0,76
2 3,72 1,04
4 0,74 0,20


Capítulo 4– Resultados e Discussão
62
Tabela 4.13. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 55ºC.
Tempo (h) Atividade lipásica (U/mL) A/A
0

0 2,29 1
0,5 2,32 1,01
1 1,32 0,57
2 0,85 0,37
4 0,71 0,31
6 0 0

Tabela 4.14. Acompanhamento da atividade lipásica no extrato concentrado obtido
por FES sob a temperatura de 65ºC.
Tempo (h) Atividade lipásica (U/mL) A/A
0

0 2,32 1
0,5 2,96 1,27
1 3,5 1,51
2 2,64 1,14
4 0,18 0,08
6 0 0

Através dos resultados encontrados para a temperatura de estabilidade
para a lipase produzida por fermentação em estado sólido pelo fungo Penicillium
verrucosum observou-se que a temperatura de maior estabilidade, dentro da faixa
estudada, é a de 35ºC.
Maia et al. (2001) obtiveram a temperatura de 35ºC como a de maior
estabilidade para a lipase produzida por Fusarium solani. Kamini et al. (1998)
verificaram que a lipase de Aspergillus niger apresentava estabilidade quando
submetida a temperaturas de até 40ºC. Um estudo realizado por Burkert (2002)
mostrou que a lipase de Geotrichum candidum NRRL-Y552 diminui sua
estabilidade à medida em que se aumenta a temperatura, concluindo que a
enzima é mais estável a baixas temperaturas como a de 30ºC.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
63

Figura 4.8. Gráfico normalizado da atividade lipásica em função do tempo e da
temperatura de exposição por FES.

4.2.6.3 Influência do pH no estudo da estabilidade da lipase
A estabilidade da lipase foi analisada extraindo-a em diferentes valores de
pH (5,5 – 7,5) em tampão fosfato de sódio 100mM a 35ºC. Os resultados estão
apresentados na Tabela 4.15 e graficados na Figura 4.9.

Tabela 4.15. Valores das atividades enzimáticas versus os valores de pH
estudados em FES.
Tempo (h) pH = 5,5 pH = 6,0 pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5
0 4,02 5,82 3,11 1,24 3,97
0,5 1,91 3,6 2,06 3,08 3,6
4 1,8 3,22 2,88 3,32 1,72
6 0 2,45 2,81 1,91 1,04
8 1,61 1,01 1,48 0
12 0 0 0

0 0,5 1 2 4 6
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A
/
A
0
25ºC
35ºC
45ºC
55ºC
65ºC
Capítulo 4– Resultados e Discussão
64

Figura 4.9. Atividade lipásica em função do tempo e do pH de extração da enzima
por FES.

A análise dos resultados demonstra que a lipase de Penicillium verrucosum
apresenta uma maior estabilidade em pH 6,0 e 7,0. Pastore et al. (2003)
verificaram que a lipase de Rhizopus sp. mostrou-se mais estável na faixa de
valores de pH entre 5,6 e 8,0. A lipase de Aspergillus niger apresentou uma faixa
de maior estabilidade entre 5,0 e 8,5 (Kamini et al., 1998) e 6,5 e 7,5 em tampão
tris-HCl para lipase de Candida rugosa (Benjamin e Pandey, 2001). Freire et al.
(1997a) encontraram para a lipase de Penicillium restrictum uma maior
estabilidade no intervalo de pH 7,0 até 8,0.

4.2.7 CONSIDERAÇÕES FINAIS: Produção de lipases por fermentação em
estado sólido por Penicillium verrucosum
A fermentação em estado sólido mostrou ser um processo bastante eficaz para
a produção de lipases e, neste estudo, promoveu resultados superiores aos
encontrados na literatura. O fungo Penicillium verrucosum apresentou uma boa
adaptação ao farelo de soja utilizado como substrato, confirmando o enorme
0 0,5 4 6 8 12
Tempo (h)
0,0
1,0
1,8
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
pH=5,5
pH=6,0
pH=6,5
pH=7,0
pH=7,5
Capítulo 4– Resultados e Discussão
65
potencial que os resíduos agroindustrais possuem como meios de cultura
nutritivos para a produção de lipases.


4.3 FERMENTAÇÃO SUBMERSA

Neste item serão apresentados e discutidos os resultados referentes à
produção de lipases por Penicillium verrucosum por fermentação submersa.

4.3.1 ESTUDO DO INDUTOR
Os resultados do teste de indutores para produção de lipases por
fermentação submersa estão apresentados na Tabela 4.16 e podem ser melhor
visualizados através da Figura 4.10. Cabe salientar que, bem como no estudo por
fermentação em estado sólido, estes resultados foram obtidos após 48 horas de
fermentação.

Tabela 4.16. Indutores estudados e suas respectivas atividades lipásicas em FS.
Indutor Atividade Lipásica (U/mL)
± Desvio Padrão
Controle (Peptona, extrato de levedura, NaCl
e água)
0,54 ± 0,05
Glicose 0,08
Água de maceração de milho 0 ± 0,5
Hidrolisado de levedura 0 ± 0,11
Melaço de cana 0 ± 0,11
Óleo de soja 1,12 ± 0,29
Óleo de milho 0,37 ± 0,05
Óleo de mamona 0 ± 0,05
Óleo de oliva 1,41 ± 0,23

Capítulo 4– Resultados e Discussão
66
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
C Gli AMM Hid Mel OS OMi OMa OO
Indutor
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)

Figura 4.10. Atividade lipásica em 48 horas de fermentação para os diversos
indutores estudados em FS.

Verificou-se que a maior atividade enzimática foi obtida quando o meio
recebeu como suplemento o óleo de oliva, enquanto a glicose proporcionou um
decréscimo na atividade lipásica. O uso de óleo de mamona e rejeitos
agroindustriais, tais como água de maceração de milho, melaço e hidrolisado de
levedura não colaborou para o aumento da produção da enzima, parecendo ter
efeito inibitório.
De acordo com Burkert (2002), os óleos de oliva e soja possuem
composições semelhantes entre si, apresentando cerca de 15% de ácidos graxos
saturados e 85% de ácidos graxos insaturados, o que explicaria o comportamento
semelhante na produção de lipase com a utilização destes dois óleos.
Maliszewska e Mastalerz (1992) reportaram que ácidos graxos saturados
inibiram a produção de lipases por Penicillium citrinum, enquanto os ácidos graxos
insaturados aumentaram a produção da enzima.
Com o intuito de definir um indutor para maximizar a produção de lipases,
realizou-se a cinética enzimática dos três indutores que apresentaram as melhores
atividades, tendo seu resultado em exposição na Tabela 4.17. Por meio da Figura
4.11 pode ser observado o perfil da atividade enzimática para os diferentes
ensaios após 24, 48, 72 e 96 horas de fermentação.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
67
Tabela 4.17. Teste de indutores para produção de lipases por FS.
Indutor Atividade
Lipásica (U/mL)
24 h
Atividade
Lipásica (U/mL)
48 h
Atividade
Lipásica (U/mL)
72 h
Atividade
Lipásica (U/mL)
96 h
Controle 0 0,60 0 0
Óleo de soja 0 1,12 0 0,04
Óleo de oliva 0 1,52 1,88 0,52


24 48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Controle
Óleo Soja
Óleo Oliva

Figura 4.11. Perfil da atividade lipásica utilizando diferentes indutores por FS.

Como pode-se verificar, o óleo de oliva usado como suplemento provoca
um efeito indutor na produção de lipases por fermentação submersa utilizando P.
verrucosum. Um estudo realizado por Freire et al. (1997) para definir a melhor
fonte de carbono para a produção de lipases por Penicillium restrictum concluiu
que o óleo de oliva aumentou a produção da enzima em 6 vezes em relação às
atividades antes obtidas.


Capítulo 4– Resultados e Discussão
68
4.3.1.1 Produção de biomassa
Os resultados da produção de biomassa (ou de crescimento celular) obtidos
pelo experimento que avaliou o uso de diferentes indutores para produção de
lipases em 48 horas de fermentação estão representados na Tabela 4.18. Por
meio da análise desta tabela é possível verificar que a produção máxima de
biomassa foi obtida com a utilização de óleo de oliva como agente indutor,
correspondendo à máxima atividade lipásica apresentada no mesmo experimento.
Um resultado semelhante foi obtido por Freire et al. (1997) que avaliaram os
efeitos da concentração de biomassa na produção de lipases por Penicillium
restrictum. Neste estudo, a maior produção de células e de lipase ocorreu quando
se utilizou óleo de oliva como fonte de carbono, gerando uma concentração de
14,2 mg/mL e de 13 U/mL, respectivamente. D’Annibale et al. (2006) verificaram
que tanto a atividade lipásica quanto a produção de biomassa por Candida
cylindracea NRRL Y-17506 aumentaram com a adição de óleo de oliva ao meio
basal.

Tabela 4.18. Produção de biomassa em função dos indutores utilizados em FS.
Indutores Biomassa (mg/mL) ± DP
Controle (Peptona, extrato de levedura, NaCl e
água)
0,10 ± 0,03
Glicose 0,11 ± 0,02
Água de maceração de milho 1,00 ± 1,12
Hidrolisado de levedura 0,36 ± 0,32
Melaço de cana 0,16 ± 0,08
Óleo de soja 0,82 ± 0,44
Óleo de milho 1,02 ± 0,09
Óleo de mamona 0,23 ± 0,06
Óleo de oliva 1,11 ± 0,06

No entanto, a mesma situação de correspondência não pode ser verificada
com o uso de óleo de soja e de milho, onde se obteve resultados de 1,12 U/mL e
Capítulo 4– Resultados e Discussão
69
0,82 mg/mL e 0,37 U/mL e 1,02 mg/mL, respectivamente. Maia et al. (2001)
estudaram a produção de lipases e crescimento celular por Fusarium solani. A
maior produção da enzima teve como fonte suplementar o óleo de gergelim,
apresentando 0,88 U/mL de atividade lipásica em 120 horas de fermentação.
Entretanto, o mesmo suplemento gerou o menor crescimento celular em
comparação com outras fontes de carbono testadas no experimento, sendo este
de 6,8 mg/mL. Freire et al. (1997) constataram que a glicose usada como
suplemento para a produção de lipases por Penicillium restrictum proporciona uma
alta produção de biomassa, porém, reprime a síntese da enzima.
Portanto, não é possível, com base nos resultados obtidos neste trabalho,
relacionar os resultados da produção de biomassa com as atividades lipásicas
obtidas nos experimentos.

4.3.2 ESTUDO DA PRODUÇÃO DE LIPASES POR FERMENTAÇÃO
SUBMERSA
Com o intuito de definir um meio de produção de lipases que viesse de
encontro à fisiologia do fungo estudado, trabalhou-se com dois meios diferentes:
meio sintético e meio industrial.

4.3.2.1 Meio sintético

Plackett-Burman: Estudo da variação de temperatura, volume de
inóculo, concentração de peptona, extrato de levedura, cloreto de sódio e
óleo de oliva na produção de lipases
Neste procedimento as variáveis independentes estudadas foram:
temperatura, volume de inóculo, concentração de peptona, extrato de levedura,
cloreto de sódio e óleo de oliva, escolhido como indutor na etapa anterior do
trabalho para a produção da enzima. A resposta avaliada foi a atividade lipásica
no decorrer da fermentação.
A Tabela 4.19 apresenta a matriz do planejamento com os valores reais,
codificados e as respostas para a atividade lipásica. Em uma análise preliminar,
Capítulo 4– Resultados e Discussão
70
pode-se notar que as maiores atividades lipásicas foram obtidas em 72 e 96 horas
de fermentação.

Tabela 4.19. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3
pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio sintético.

Ensaio
Temp.
(ºC)
Inóculo
(%m/v)
Peptona
(%m/v)
Extrato
lev.
(%m/v)
Cloreto
sódio
(%m/v)
Óleo
oliva
(%m/v)
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
48h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
72h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
96h
1 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 1,77 ± 1 0 1,53 ± 0,5
2 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) -1 (0,5) -1 (1) 0 0 0
3 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) -1 (1) 1,38 ± 0,05 1,41 ± 0,59 2,64 ± 0,1
4 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0,48 ± 0,1 0,34 ± 0,48 0,23 ± 0,1
5 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0 1,26 ± 0,59 0
6 1 (36) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 0 0,69 ± 0,2
7 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 1,2 ± 0,2 1,34 ± 1,6 2,72 ± 0,2
8 -1 (28) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0,82 ± 0,1 3,48 ± 0,4 2,79 ± 0,05
9 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) 1 (2) 2,12 ± 0,6 2,99 ± 0,3 2,83 ± 0,3
10 36 (1) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 0 0 ± 0,2
11 -1 (28) 1 (12,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2) 0,75 ± 0,1 2,26 ± 1,4 0
12 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0 0,49 ± 0,1 0,84
13* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,18 ± 0,1 0,53 ± 0,1 1,3 ± 0,5
14* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,11 ± 0,05 0,49 ± 0,1 1,22 ± 0,3
15* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 1,22 0,34 ± 0,05 1,15 ± 0,1
*Ponto Central

Através da Figura 4.12 pode ser observado o perfil da atividade enzimática
para os diferentes ensaios realizados neste planejamento. Analisando as
respostas obtidas verifica-se que em 8 dos 15 ensaios ocorreu aumento da
atividade lipásica em 96 horas de fermentação, tempo no qual os resultados foram
analisados estatisticamente. Verifica-se ainda que os ensaios que apresentaram
Capítulo 4– Resultados e Discussão
71
maior atividade da enzima tiveram como temperatura de fermentação 28ºC.
Estudos feitos por Ellaiah et al. (2004) e Maia et al. (2001) para a produção de
lipases por Aspergillus niger e Fusarium solani constataram que 28ºC foi a
temperatura ideal para a produção de enzima por estes microrganismos.


Figura 4.12. Cinética de FS para produção de lipases utilizando meio sintético:
Planejamento experimental PB.

Para uma análise mais consistente dos resultados do primeiro
planejamento, os dados obtidos em 96 horas de fermentação foram tabulados e
analisados utilizando o pacote Statistica®, módulo de Planejamento de
Experimentos (“Experimental Design”). Um planejamento do tipo Plackett-Burman
permite apenas a avaliação dos efeitos principais e estes são melhor visualizados
através do Gráfico de Pareto (Figura 4.13), que apresenta a magnitude dos efeitos
absolutos das variáveis manipuladas sobre as variáveis de resposta.
Observou-se que, com 95% de confiança, a temperatura apresentou um
efeito negativo sobre a produção de lipases enquanto a peptona mostrou
influenciar positivamente. As demais variáveis em estudo não foram significativas.

Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Ensaio 14
Ensaio 15
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Capítulo 4– Resultados e Discussão
72
Figura 4.13 Gráfico de Pareto da produção de lipases por FS utilizando meio
sintético em função das variáveis independentes estudadas: Planejamento
experimental PB.

Planejamento fatorial 2
2
: Estudo da variação de temperatura e da
concentração de peptona

A partir dos resultados obtidos no planejamento do tipo Plackett-Burman
selecionou-se a temperatura e concentração de peptona como variáveis a serem
estudadas em um planejamento fatorial 2
2
visando a otimização da produção de
lipase por este meio de cultura. Optou-se por fixar a concentração de inóculo no
nível 0 (7,5% m/v). Quanto às concentrações de extrato de levedura, de cloreto de
sódio e de óleo de oliva foram fixadas no nível –1 (0,5%, 0,5% e 1% m/v,
respectivamente), já que não apresentaram influência nesta etapa do estudo de
produção de lipases. Este resultado é economicamente muito interessante quando
se projeta um processo em escala industrial, diminuindo o custo do meio de cultivo
na produção da enzima desejada ou outro bioproduto (Burkert, 2002). A matriz do
planejamento experimental realizado, com os níveis codificados e reais, bem como
as respostas de atividade enzimática obtidas encontram-se na Tabela 4.20.


-,61299
-1,00014
1,322768
1,673048
3,194001
-4,31858
p=,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Óleo
Inóculo
Extrato de Levedura
NaCl
Peptona
Temperatura
Capítulo 4– Resultados e Discussão
73
Tabela 4.20. Matriz do planejamento fatorial 2
2
(valores codificados e reais) com
as respostas da atividade de lipase no decorrer da FS utilizando meio sintético.
Ensaio Temperatura
(ºC)
Peptona
(%m/v)
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
48h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
72h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
96h
1 -1(20) -1 (4) 0 1,76 3,22
2 1(36) -1(4) 0 0,23 0
3 -1(20) 1 (12) 0 1,98 3,03
4 1(36) 1(12) 0 0,82 0
5* 0 (28) 0 (8) 0,61 0 0,15
6* 0 (28) 0 (8) 0,53 0 0,37
7* 0 (28) 0 (8) 2,38 0 0,15
* Ponto Central

A produção de lipase foi observada através do acompanhamento da
atividade enzimática ao longo do tempo de fermentação como mostrado na Figura
4.14. Em 96 horas de fermentação pôde ser verificado que os ensaios
experimentais 1 e 3 alcançaram o máximo de atividade enzimática de 3,22 U/mL e
3,03 U/mL, respectivamente.
Para definir em quais condições seria realizado o estudo cinético, construiu-
se um gráfico de Pareto (Figura 4.15) para avaliar os principais efeitos e
interações das variáveis estudadas em 96 horas de fermentação. Observou-se
que, com 95% de confiança, a temperatura mostrou influenciar negativamente na
produção da enzima, enquanto a peptona demonstrou não aumentar a produção
de lipases neste estudo.
Para a avaliação da cinética de fermentação decidiu-se utilizar as mesmas
condições usadas no ensaio 1 deste experimento, já que neste fez-se o uso do
menor nível de peptona (4% m/v). A intenção de diminuir os custos da produção
de lipases justifica esta escolha.

Capítulo 4– Resultados e Discussão
74
Figura 4.14. Cinética de FS para produção de lipases utilizando meio sintético:
Planejamento fatorial 2
2
.


Figura 4.15. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
sintético em função das variáveis independentes estudadas em 96 horas de
fermentação: Planejamento fatorial 2
2
.

-,747931
,747931
-24,603
p=,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Peptona(L)
TxP(L)
(1)Temperatura(L)
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Capítulo 4– Resultados e Discussão
75
Cinética de produção de lipases na condição maximizada utilizando
meio sintético
A melhor condição para a produção da lipases por fermentação submersa
utilizando meio sintético foi a condição experimental do ensaio 1 do planejamento
fatorial 2
2
(20ºC, 7,5% m/v de inóculo, 4% m/v de peptona, 0,5% m/v de extrato de
levedura, 0,5% m/v de NaCl e 1% m/v de óleo de oliva). Nesta condição foi então
avaliado o comportamento cinético da fermentação. A cinética de crescimento
celular e a produção de lipase se encontra na Figura 4.16.
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Tempo (h)
0,00
0,25
0,97
1,30
3,15
A
t
i
v
i
d
a
d
e

L
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
2,38
2,97
3,88
6,52
7,93
8,88
B
i
o
m
a
s
s
a

(
m
g
/
m
L
)
Atividade Lipásica
Biomassa

Figura 4.16. Cinética de produção de lipase e crescimento celular (peso seco) na
melhor condição experimental utilizando meio sintético por FS.

Observa-se que na curva de atividade lipásica há 2 picos de produção da
enzima, sendo o maior em 96 horas. Burkert (2002) realizou um teste de cinética
de produção de lipases em frascos agitados por Geotrichum candidum NRRL Y-
552, encontrando o pico de atividade enzimática de 11,51 U/mL em 48 horas de
fermentação. Em 96 horas praticamente não havia mais a presença de lipases no
meio fermentativo que era constituído por 5% m/v de peptona, 0,1% m/v de
NaNO
3
, 0,1% m/v de MgSO
4
e 1% m/v de óleo de soja.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
76
O valor máximo de atividade lipásica obtido neste experimento foi de
3,15U/mL, sendo este maior que o valor encontrado por Puthli et al. (2006), que
avaliaram a produção de lipases por Candida rugosa obtendo um máximo de
atividade de 1,84U/mL em 66 horas de fermentação. No entanto, é menor que a
atividade lipásica de 12,55U/mL em 72 horas de fermentação obtida por Benjamin
e Pandey (1996) utilizando Candida rugosa.
Nesta etapa, observou-se que o crescimento celular máximo, assim como a
maior atividade lipásica, se deu em 96 horas de fermentação, sendo este de
8,88mg/mL o que caracteriza um bom crescimento. A produção de biomassa
deste estudo supera os valores encontrados por Maia et al. (2001) que, em estudo
da produção da enzima por Fusarium solani, obtiveram 6,8mg/mL em 120 horas
de fermentação e por Puthli et al. (2006) que encontraram um valor máximo de
5,87mg/mL em 72 horas de fermentação por Candida rugosa.
A determinação da atividade proteásica foi realizada nesta condição
experimental maximizada utilizando meio sintético por fermentação submersa,
porém não foi apresentada por ter sido desprezível.
O fato da quantidade de protease presente no meio ser muito pequena, não
é comum em estudos de produção de lipases por fermentação submersa. Neste
caso, é provável que o tipo de protease contida no meio tenha sofrido hidrólise de
outras proteases, diminuindo assim a quantidade de protease total no meio
fermentativo (Burkert, 2002).

4.3.2.2 Meio industrial

Plackett-Burman: Estudo da variação de temperatura, volume de
inóculo, concentração de água de maceração de milho, hidrolisado de
levedura, cloreto de sódio e óleo de oliva na produção de lipases
Nesta primeira etapa aplicou-se o mesmo planejamento de experimentos
utilizado no meio sintético para que pudessem ser avaliados os efeitos principais
de cada variável na resposta atividade lipásica. Foi analisada a variação da
Capítulo 4– Resultados e Discussão
77
temperatura, volume de inóculo, concentração de água de maceração de milho,
hidrolisado de levedura, cloreto de sódio e óleo de oliva na produção de lipases.
A Tabela 4.21 apresenta os valores codificados, reais e as respostas para a
atividade lipásica obtidas neste planejamento. A Figura 4.17 apresenta o
acompanhamento da atividade enzimática ao longo das 48, 72 e 96 horas de
fermentação.

Tabela 4.21. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3
pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio industrial.
Ensaio Temp.
(ºC)
Inóculo
(%) m/v
AMM**
(%) m/v
Prodex
Lac***
(%) m/v
Cloreto
sódio
(%) m/v
Óleo
oliva
(%)
m/v
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
48h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
72h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
96h
1 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0,69 ± 0,2 0,23 ± 0,1 0,73 ± 0,7
2 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) -1 (0,5) -1 (1) 0,34 ± 0,2 0 0,65 ± 0,4
3 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) -1 (1) 0,76 ± 0,1 0,19 ± 0,2 0 ± 0,4
4 1 (36) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0 0,84 ± 0,3 0,31 ± 0,2
5 1 (36) 1 (12,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0 0 0 ± 0,7
6 1 (36) 1 (12,5) 1 (8) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0,07 ± 0,1 0 0 ± 0,6
7 -1 (28) 1 (12,5) 1 (8) 3 (1) -1 (0,5) 1 (2) 0 0 0 ± 0,3
8 -1 (28) -1 (2,5) 1 (8) 3 (1) 1 (3) -1 (1) 0,34 ± 0,1 1,38 ± 0,6 0 ± 0,6
9 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) 3 (1) 1 (3) 1 (2) 0,49 ± 0,2 0 0 ± 0,4
10 36 (1) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) 1 (3) 1 (2) 0 ± 0,2 0,15 0,27 ± 0,1
11 -1 (28) 1 (12,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2) 0 0 0,92 ± 0,1
12 -1 (28) -1 (2,5) -1 (2) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (1) 0,61 ± 0,43 0 0,34 ± 0,05
13* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,19 ± 0,05 0,11 ± 0,1
14* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,23 0,23 ± 0,3
15* 0 (32) 0 (7,5) 0 (5) 0 (1,75) 0 (1,75) 0 (1,5) 0 0,19 ± 0,05 0,34 ± 0,1
*Ponto Central; ** AMM= Água de maceração de milho; ***Prodex Lac= Hidrolisado de levedura.

Capítulo 4– Resultados e Discussão
78

Figura 4.17. Perfil da FS para produção de lipases utilizando meio industrial:
Planejamento experimental PB.

Verifica-se pela Tabela 4.21 que a maior atividade enzimática foi obtida em
72 horas de fermentação no ensaio 8 (1,38 U/mL). Esta condição tem como
características os menores níveis de temperatura, volume de inóculo e
concentração de óleo de oliva e os maiores níveis de água de maceração de
milho, Prodex Lac e cloreto de sódio.
Analogamente à análise do primeiro planejamento aplicado ao meio
sintético, realizou-se a avaliação dos resultados obtidos neste planejamento
utilizando o pacote Statistica
®
. O gráfico de Pareto, representado pela Figura 4.18,
mostra a análise estatística dos efeitos das variáveis sobre a atividade lipásica,
onde pode-se observar que todas as variáveis estudadas foram estatisticamente
significativas a 5% de significância.
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
Ensaio 12
Ensaio 13
Ensaio 14
Ensaio 15
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Capítulo 4– Resultados e Discussão
79
Figura 4.18. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
industrial: Planejamento experimental PB.

Pela análise da Figura 4.18, verifica-se que as variáveis água de
maceração de milho, hidrolisado de levedura e cloreto de sódio apresentam
efeitos significativos positivos, o que indica que um deslocamento dos níveis de
concentração das mesmas para valores superiores acarretaria num aumento dos
valores de atividade enzimática. As concentrações do inóculo e de óleo e a
variação da temperatura mostram exercer um efeito negativo na produção de
lipases.

Planejamento fatorial 2
3
: Estudo da variação de temperatura,
concentração de água de maceração de milho e hidrolisado de levedura

Após análise dos resultados obtidos, propôs-se um planejamento
experimental fatorial 2
3
para avaliar a variação de temperatura e concentrações de
água de maceração de milho e hidrolisado de levedura na produção de lipases. A
concentração do inóculo foi fixada no mesmo valor do ponto central do
planejamento Plackett-Burman, bem como o efetuado quando do estudo de
produção de lipase por fermentação submersa utilizando meio sintético. Já a
concentração de óleo de oliva, que apresentou um efeito negativo, teve seu valor
-4,375
8,125
-10,125
20,625
-30,125
31,125
p=,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Temperatura
NaCl
Óleo
Prodex
Inóculo
AMM
Capítulo 4– Resultados e Discussão
80
fixado no mínimo e, contrariamente, o cloreto de sódio foi fixado no nível +1 por ter
apresentado em efeito positivo na produção da enzima.
A Tabela 4.22 apresenta os valores reais e codificados deste planejamento,
e as respostas para a atividade enzimática, na qual verifica-se que ocorreu um
aumento dos valores quando comparada com o do tipo Plackett-Burman antes
estudado, sendo que o máximo obtido foi de 2,63 U/mL em 72 horas de
fermentação no ensaio de número 5. Este caso pode ser melhor visualizado por
meio da Figura 4.19.

Tabela 4.22. Matriz do planejamento fatorial 2
3
com as respostas de atividade
lipásica no decorrer da FS utilizando meio industrial.
Ensaio Temperatura
(ºC)
AMM
(%m/v)
Prodex
Lac
(%m/v)
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
48h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
72h
Ativ.
Lipásica
(U/mL)
± DP
96h
1 -1 (20) -1 (4) -1 (2) 0 0,31 0,47
2 1 (36) -1 (4) -1 (2) 0,13 0 0,98
3 -1 (20) 1 (12) -1 (2) 0,35 0 0
4 1 (36) 1 (12) -1 (2) 0 0 0,78
5 -1 (20) -1 (4) 1 (6) 0,08 2,63 0
6 1 (36) -1 (4) 1 (6) 0 0 0,27
7 -1 (20) 1 (12) 1 (6) 1,23 0,03 0
8 1 (36) 1 (12) 1 (6) 0 0 0,64
9* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,47 0,9
10* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,47 1,5
11* 0 (28) 0 (8) 0 (4) 0 0,39 1,2
* Ponto Central

Os níveis de concentração de água de maceração de milho e de Prodex
Lac foram deslocados para valores superiores, conforme indicou a análise das
respostas do planejamento Plackett-Burman, considerando que os efeitos dos dois
Capítulo 4– Resultados e Discussão
81
substratos foram positivos e significativos com 95% de confiança. Mesmo com
concentrações maiores de água de maceração de milho e Prodex Lac o meio
ainda é muito mais econômico se comparado ao sintético.

Figura 4.19. Perfil da FS para produção de lipases utilizando meio industrial:
Planejamento fatorial 2
3
.

Construiu-se um gráfico de Pareto (Figura 4.20) para avaliar os principais
efeitos e interações das variáveis estudadas na produção de lipases. Observou-se
que, com 95% de confiança, o Prodex Lac apresentou efeito positivo sobre a
atividade lipásica. No entanto, a temperatura e a água de maceração de milho
apresentaram efeitos negativos. É importante salientar que as interações entre a
água de maceração de milho e o Prodex Lac tiveram efeitos negativos, e o fato do
efeito de um substrato industrial isolado ser positivo e a interação entre eles ser
negativa ocorre devido à composição destes substratos. Nenhum deles pode ser
considerado como fonte de nitrogênio, carbono ou outros sais minerais ou
vitaminas, pois estes substratos possuem uma composição bastante complexa,
que contêm diversos nutrientes, que individualmente pode causar efeito positivo,
porém a interação entre eles pode ocasionar um excesso em alguns destes
48 72 96
Tempo (h)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Ensaio 11
Capítulo 4– Resultados e Discussão
82
nutrientes importantes para a fermentação e causar uma inibição indesejada
(Treichel, 2004).
Para a realização do estudo cinético de fermentação submersa optou-se
por utilizar as mesmas condições do ensaio 5 deste planejamento, que foi o que
apresentou maior atividade lipásica.


Figura 4.20. Gráfico de Pareto para produção de lipases por FS utilizando meio
industrial: Planejamento fatorial 2
3
.

Cinética de produção de lipases na melhor condição experimental
utilizando meio industrial por fermentação submersa
Ao utilizar um meio industrial, a melhor condição encontrada para a
produção da lipases por fermentação submersa foi a determinada para o ensaio 5
do planejamento fatorial 2
3
(20ºC, 7,5% mm/v de inóculo, 4% m/v de água de
maceração de milho, 6% m/v de Prodex Lac, 3% m/v de NaCl e 1% m/v de óleo de
oliva). Esta condição foi então realizada novamente para acompanhamento
cinético.
A Figura 4.21 apresenta a cinética de crescimento celular e a produção de
lipases para a melhor condição encontrada para o meio industrial. A atividade
lipásica desta vez apresentou um pico de atividade máxima de cerca de 2,22 U/mL
-17,5292
17,98844
-17,9884
22,27505
-22,275
-22,7343
p=,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
AMMxProdex(L)
Prodex(L)
TxProdex (L)
TxAMM (L)
AMM(L)
Temperatura(L)
Capítulo 4– Resultados e Discussão
83
em 72 horas de fermentação. Este valor é comparável aos obtidos por
fermentação submersa utilizando Aspergillus niger como microrganismo produtor
de lipases (Mahadik et al., 2004), mas bem inferior do que os obtidos por Freire et
al. (1997 e 1997a).

Figura 4.21. Cinética de produção de lipase e crescimento celular (peso seco) na
melhor condição experimental utilizando meio industrial por FS.

Neste gráfico pode-se notar com clareza a associação do crescimento com
a produção de lipase, conforme observado por Elibol e Ozer (2000) em estudo
avaliativo da produção de lipases por Rhizopus arrhizus por fermentação
submersa. Os autores verificaram que há uma relação entre o crescimento
microbiano e produção da enzima, sendo que obtiveram uma atividade lipásica e
produção de biomassa máxima de aproximadamente 21U/mL e 8,5mg/mL
respectivamente, em 48 horas de fermentação.
O incremento da biomassa iniciou em aproximadamente 36 horas de
fermentação, estendendo-se até 72 horas. O meio de cultura industrial utilizado
neste trabalho mostrou ser razoável para o crescimento celular, apresentando
uma concentração celular máxima de 26,33mg/mL, superando os valores de
concentração de biomassa obtidos em estudos de produção de lipases realizados
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
Tempo (h)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
A
t
i
v
i
d
a
d
e

l
i
p
á
s
i
c
a

(
U
/
m
L
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
B
i
o
m
a
s
s
a

(
m
g
/
m
L
)
Atividade lipásica
Biomassa
Capítulo 4– Resultados e Discussão
84
por Maia et al. (2001), Freire et al. (1997 e 1997a), Mahadik et al. (2004), Puthli et
al. (2006), Elibol e Ozer (2000) e Benjamin e Pandey (1996) , com diferentes
microrganismos.
A determinação da atividade proteásica foi realizada nesta condição, e
como ocorreu no estudo cinético realizado na melhor condição experimental
utilizando meio sintético, não foi apresentada por ter sido desprezível.

4.3.3 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LIPASE OBTIDA POR
FERMENTAÇÃO SUBMERSA
Após a obtenção do extrato enzimático por fermentação submersa,
procedeu-se a sua caracterização parcial em função da temperatura e pH ótimos.

4.3.3.1 Meio Sintético
A determinação dos valores de temperatura e pH ótimo da enzima obtida
por fermentação submersa utilizando um meio sintético foi realizada através da
execução de um planejamento fatorial 2
2
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos
centrais, e a matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipásica obtidos estão apresentados na Tabela 4.23.
Analisando-se as respostas obtidas na Tabela 4.23, verifica-se que as
maiores atividades lipásicas foram de 4,02U/mL e 4,37U/mL correspondendo aos
ensaios 4 e 5, respectivamente. A condição de 30ºC de temperatura e pH 7,0 foi a
que promoveu a maior atividade lipásica (4,37U/mL).
Resultados semelhantes aos encontrados neste planejamento foram
obtidos por Tan et al. (2003) que analisaram a produção de lipases por
fermentação submersa por Candida sp, determinando 28ºC e 7,0 como
temperatura e pH ótimos, respectivamente.
A literatura reporta que o pH neutro é geralmente definido como ótimo para
a atividade lipásica, com pode ser verificado nos trabalhos de Tan et al. (2003),
Abbas et al. (2002), Burkert (2002), Kamini et al. (1998), Fadiloglu e Soylemez
(1997), Freire et al. (1997a) e Benjamin e Pandey (2001).

Capítulo 4– Resultados e Discussão
85
Tabela 4.23. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de
lipase por FS em meio sintético.
Ensaio pH Temperatura (ºC) Atividade Lipásica
(U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32)
0,69
2 -1 (5,5) 1 (42)
1,92
3 1 (8,5) -1 (32)
3,91
4 1 (8,5) 1 (42)
4,02
5 0 (7,0) -1,41 (30)
4,37
6 0 (7,0) 1,41 (44)
3,95
7 -1,41 (4,88) 0 (37)
2,11
8 1,41 (9,11) 0 (37)
2,34
9 0 (7,0) 0 (37)
2,72
10 0 (7,0) 0 (37)
2,42
11 0 (7,0) 0 (37)
2,53

A Tabela 4.24 apresenta a análise de variância para a atividade enzimática
obtida nos níveis estudados. Verifica-se que o coeficiente de correlação e o F
calculado permitiram a validação do modelo codificado, apresentado na equação
4.3.

Atividade lipásica (U/mL)= 2,55 + 0,66.Temperatura
2
+ 0,70.pH – 0,30. pH
2
(4.3)

Tabela 4.24. Análise de variância para a atividade lipásica por FS.
Fontes
de Variação
Soma dos
Quadrados
Graus de
Liberdade
Quadrados
Médios
F calculado
Regressão 8,02 3 2,67 4,05
Resíduos 4,62 7 0,66
Falta de ajuste 4,58 5
Erro Puro 0,05 2
Total 12,64 10
Resíduos = Falta de ajuste + Erro Puro
F0,90;3;7 = 3,11
Coeficiente de correlação: R = 0,80
Capítulo 4– Resultados e Discussão
86

Este modelo possibilitou a construção da superfície de resposta e curva de
contorno apresentada na Figura 4.22.





Figura 4.22. Superfície de resposta e curva de contorno para a atividade
enzimática em função da temperatura e pH por FS.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
87

Analisando-se esta figura nota-se que um aumento da temperatura e um
aumento dos valores de pH ocasionaria um incremento na atividade lipásica.
Verifica-se também que as faixas de temperatura de 29ºC a 32ºC e 40ºC a 45ºC e,
valores de pH entre 7,0 e 8,5 representam as condições ótimas de atividade
lipásica.

4.3.3.2 Meio industrial
Um planejamento fatorial 2
2
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos
centrais foi realizado com a finalidade de determinar os valores de temperatura e
pH ótimos da enzima obtida por fermentação submersa utilizando um meio
industrial. A matriz do planejamento experimental bem como os resultados de
atividade lipásica obtidos estão apresentados na Tabela 4.25.
Observando-se os resultados obtidos neste planejamento, verifica-se que
os ensaios 1, 8 e dos pontos centrais foram os que apresentaram as maiores
atividades lipásicas.
A temperatura de 37ºC e o pH 7,0 são as condições referentes aos pontos
centrais e, as mesmas foram definidas como ótimas para as lipases obtidas por
Fadiloglu e Soylemez (1997) que utilizaram Candida rugosa como microrganismo
produtor da enzima e por Burkert (2002), que caracterizou a lipase proveniente de
Geotrichum candidum NRRL-Y552. Igualmente para a lipase de Penicillium
restrictum foi encontrada uma temperatura ótima de 37ºC e pH 7,0 (Freire et
al.,1997a).






Capítulo 4– Resultados e Discussão
88
Tabela 4.25. Matriz do planejamento experimental completo para avaliação da
temperatura e pH ótimos (valores codificados e reais) com as respostas da
atividade de lipase por FS em meio industrial.
Ensaio pH Temperatura (ºC) Atividade
Lipásica (U/mL)
1 -1 (5,5) -1 (32) 1,76
2 -1 (5,5) 1 (42) 0,4
3 1 (8,5) -1 (32) 0
4 1 (8,5) 1 (42) 0
5 0 (7,0) -1,41 (30) 0
6 0 (7,0) 1,41 (44) 0,96
7 -1,41 (4,88) 0 (37) 0,4
8 1,41 (9,11) 0 (37) 1,6
9 0 (7,0) 0 (37) 1,6
10 0 (7,0) 0 (37) 1,92
11 0 (7,0) 0 (37) 1,76

A análise estatística dos resultados de atividade lipásica permitiu somente a
obtenção dos efeitos de primeira e segunda ordem da temperatura e pH sobre
esta resposta, uma vez que não foi possível se obter um modelo estatisticamente
significativo. Os efeitos foram expressos na forma de Gráfico de Pareto
apresentado na Figura 4.23.
Capítulo 4– Resultados e Discussão
89

Figura 4.23. Gráfico de Pareto para determinação da temperatura e pH ótimos da
atividade lipásica obtida por FS em meio industrial.

Observou-se que, com 90% de confiança, a temperatura apresentou a
maior influência na atividade da lipase, seguida pelo pH. As duas variáveis
apresentaram efeitos negativos na atividade lipásica, enquanto a interação entre
elas mostrou influenciar positivamente na resposta.
Em uma avaliação global pode-se notar que a temperatura ótima para a
atividade lipásica encontra-se na faixa de 30ºC a 40ºC, como se verifica conforme
evidenciaram também os resultados obtidos por Abbas et al. (2002), Kolossvary
(1996), Burkert (2002), Kamini et al. (1998), Fadiloglu e Soylemez (1997), Freire et
al. (1997b) e Benjamin e Pandey (2001).
A análise dos efeitos mostra que os valores do pH devem ser diminuídos
para que ocorra um incremento da atividade lipásica. Comparando com os valores
de pH estudados para a definição de pH ótimo observa-se que estes estão de
acordo com os dados da literatura para outras lipases que apresentam valores de
pH ótimo na faixa de 5,0 a 9,0 reportados, por exemplo, nos trabalhos de Mahadik
et al. (2002), Martins (2001), Kolossvary (1996), Abbas et al. (2002), Shu et al.
(2006), Tan et al. (2003), Burkert (2002), Freire et al. (1997), Kamini et al. (1998),
Benjamin e Pandey (2001), Pastore et al. (2003) e Fadiloglu e Soylemez (1997).
-,014163
-1,03569
4,25
-6,38185
-10,2509
p=,1
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Temperatura (L)
pH (L)
TxpH (L)
pH(Q)
Temperatura(Q)
Capítulo 4– Resultados e Discussão
90
4.3.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS: Produção de lipases por fermentação
submersa por Penicillium verrucosum
Neste estudo a produção de lipases por fermentação submersa apresentou
resultados razoáveis.
Cabe ressaltar que o cultivo de fungos, tais como Penicillium, apresenta
problemas inerentemente clássicos. O crescimento celular elevado dificulta a
transferência de massa e influencia na produção de biomassa e da enzima e a
maioria dos trabalhos da literatura não apresenta uma discussão sobre a
dificuldade de se trabalhar com fungos e a falta de reprodutibilidade nos
resultados.
O meio sintético foi mais eficiente na produção lipásica perante o meio
industrial, porém, eleva o custo de produção, principalmente quando há interesse
em produzir a enzima em escala industrial. O meio de fermentação composto por
resíduos provenientes da agroindústria mostrou sofrer interações entre seus
componentes, o que pode ter interferido negativamente na produção da enzima.

Capítulo 5– Conclusões e Sugestões
91
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES


5.1 CONCLUSÕES

A utilização de fermentação em estado sólido na produção de lipase
utilizando como substrato farelo de soja apresentou resultados satisfatórios. O
fungo Penicillium verrucosum apresentou um bom desempenho na produção da
enzima, permitindo obter valores de atividade lipásica de 40U/g em 48 horas de
fermentação e 52U/g em 72 horas de fermentação nas condições operacionais
otimizadas (T=27,5°C, U=55%). Além disso, obteve-se baixa atividade proteásica,
quando comparado a outros microrganismos e meios reportados na literatura, o
que torna vantajosa a utilização deste sistema para a produção de lipases.
O farelo de soja demonstrou ter um grande potencial nutricional,
possibilitando o bom desenvolvimento do microrganismo tanto em termos de
crescimento quanto em produção de lipase, uma vez que os resultados obtidos
neste trabalho mostraram não haver a necessidade de utilização de fontes
suplementares, o que pode levar a uma considerável economia com matérias-
primas no processo industrial.
A caracterização parcial da lipase bruta produzida por FES apresentou
condições ótimas de atividade a 44ºC em pH 7,0 e manteve sua estabilidade a
35ºC em valores de pH entre 6,0 e 7,0.
A produção de lipases por fermentação submersa apresentou menores
atividades do que as encontradas na literatura. Procurando definir um meio
fermentativo que pudesse vir a diminuir os custos da produção da enzima, testou-
se um meio sintético e outro industrial. Os valores de atividade lipásica obtidos
foram de 3,15U/mL em 96 horas para o meio sintético e 2,22U/mL em 72 horas
para o meio industrial, sendo que este último mostrou ser razoável para o
crescimento celular, gerando uma concentração de células de 26,33mg/mL.
Apesar da atividade lipásica do meio industrial ser menor que a
apresentada pelo meio sintético, há que se levar em consideração o baixo custo
Capítulo 5– Conclusões e Sugestões
92
do primeiro, sendo que, mesmo que haja a necessidade de aumentar as
concentrações dos substratos, este ainda é muito mais econômico do que o
segundo, podendo tornar esta forma de condução do processo economicamente
mais viável.
A enzima contida no extrato bruto proveniente do meio sintético apresentou
as faixas de temperatura ótimas de 29ºC a 32ºC e de 40ºC a 45ºC e pH ótimo
entre a faixa de valores 7,0 e 8,5. A lipase obtida a partir de meio industrial
apresentou 30ºC a 40ºC de temperatura e pH entre 5,0 e 9,0 como faixa de
valores de temperatura e pH ótimos, respectivamente. Possivelmente os
resultados obtidos para estes extratos refletem a caracterização resultante de
diferentes formas de lipases existentes em ambos os meios fermentativos.


5.2 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Com base nos resultados e conclusões obtidos neste estudo sugere-se como
trabalhos futuros:
• Avaliação da estabilidade do extrato bruto enzimático produzido por
FES e FS em relação ao armazenamento à baixas temperaturas;
• Definição das condições ótimas para extração da lipase obtida por
FES;
• Avaliação da atividade de esterificação dos extratos enzimáticos
obtidos, visando sua aplicação em reações de interesse na área de
alimentos (esterificação, alcoólise, acidólise e transesterificação);
• Realização de estudos de concentração, purificação, imobilização e
caracterização das frações enzimáticas obtidas;
• Avaliação da atividade (hidrolítica e de esterificação) dos extratos
enzimáticos (brutos, liofilizados, concentrados, purificados e
imobilizados) em fluidos pressurizados, buscando confrontar com
Capítulo 5– Conclusões e Sugestões
93
resultados já disponíveis para lipases comerciais, visando propor
novas aplicações para as lipases obtidas;
• Utilização das técnicas de dosagem do crescimento microbiano por
FES, com utilização de métodos respirométricos, para uma avaliação
mais precisa do crescimento e verificação da associação da produção
da enzima com o crescimento microbiano;
• Realização de estudos por fermentação em estado sólido e submersa
com outros tipos e configurações de biorreator utilizando resíduos
agroindustriais como substrato e P. verrucosum ou outros
microrganismos para a produção de lipases.
• Estudos de aplicação da enzima como catalisador de reações
(hidrólise e esterificação) de interesse para as indústrias.
Capítulo 6– Referências Bibliográficas
94
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Capítulo 7– Anexos I
106
7 ANEXO I


Procedimentos para o preparo de algumas soluções


1. Solução de azocaseína 0,5%

Pesar 0,5 g de azocaseína, adicionar 20 mL de água destilada, acrescentar
solução de hidróxido de sódio 40% até chegar a pH 12,0. Adicionar ácido acético
até chegar ao pH 5,0, completar o volume para 100 mL com tampão acetato de
sódio 50 mM pH 5,0.
Obs: Estocar sob refrigeração por, no máximo, 30 dias.

2. Solução de acetil acetona em Na
2
CO
3
0,5 N

Misturar 1 mL de acetil acetona em 50 mL de solução de Na
2
CO
3
0,5 N.
Obs: Esta solução não pode ser estocada, deve ser preparada na hora do
ensaio.

3. Reagente de Erlich

Dissolver 2,67 g de DAB (p-dimetilaminobenzaldeído) em um volume
pequeno (em torno de 30 mL) de etanol/ácido clorídrico 1:1. Após a dissolução,
completar o volume para 100 mL com água destilada.

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