INTI – Mendoza

Curso práctico Microbiología de Aguas - 2013

Investigación de coliformes totales, coliformes termotolerantes y Escherichia coli.
Método de tubos múltiples Número Más Probable ISO 9308:2 SMWW

1.Principio El método se basa en la inoculación de porciones de muestras en una serie de tubos con medio de cultivo líquido que contienen lactosa. Luego de incubarlos por 24h (48h) a 35-37° , los tubos que presentan turbidez y producción de gas se subcultivan en un medios líquidos confirmatorios, incubando a 35-37°C 48h para coliformes totales (BL BG) y a 44° C 24h para coliformes termotolerantes (EC) . Para confirmar E coli, se subcultivan los tubos positivos para coliformes termotolerantes para evidenciar la producción de indol. Se calcula el Número Más Probable (NMP) de coliformes totales, coliformes termotolerantes (fecales) y presuntivo E coli por 100ml de muestras, utilizando tablas estadísticas considerando tubos. 2- Material y equipo • • • • • • • • Tubos de ensayo de 16x 160 mm Gradillas Pipetas estériles de 10 y 1 mL o micropipetas Estufa o baño de incubación (35 o37° C y 44-44.5° C) Medios de cultivos prueba presuntiva: Caldo Lauril Triptosa Sulfato ( contiene lactosa) Medio de cultivo prueba confirmatoria para coliformes totales: Caldo Bilis Verde Brillante Lactosa (BGBL o BRILA) Medio de cultivo prueba confirmatoria coliformes termotolerantes Caldo EC Medio de cultivo prueba confirmatoria E coli Agua de Triptona

Número Más Probable- Coliformes y E. coli en aguas

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Prueba Presuntiva Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos con Caldo LTS. por ejemplo.2013 Se incuba porciones de muestra en Caldo Lauril Sulfato luego de incubarse a 35-37° C durante 24(48h). Prueba presuntiva Curso práctico Microbiología de Aguas . su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44-44.1 -.INTI – Mendoza 3.Estimación del NMP para cada grupo según tablas NMP 3. La primera serie con 10 ml medio con doble concentración y las otras llevan el medio con simple concentración.5 ° C durante 24h.Coliformes y E.Producción de indol La especie Escherichia coli se diferencia de otros coliformes termotolerantes por su capacidad de producción de indol 4.Procedimiento Se realizará en las siguientes etapas: 1.Para coliformes termotolerantes: se evidencian ciertas características que diferencian los coliformes termotolerantes de otras Enterobacteriaceae como.Confirmación . Número Más Probable. . 3. los tubos que presentan gas y turbidez se consideran positivos y pasan a la etapa confirmatoria 2. coli en aguas Página 2 de 9 . por ejemplo. su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas y desarrollarse en presencia de sales biliares a 35-37° C durante 24h (48h).Para Coliformes totales: se evidencian ciertas características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como.

2013 Sembrar tubos de Caldo LTS En 1° serie de tubos doble concentración se vierte 10 ml de muestra sin diluir. se vierte 1 mL de la -1 dilución 10 de la muestra. tubos simple concentración. coli en aguas Página 3 de 9 . En 3° serie. Incubar las tres series a 35 o 37 ± 1ºC. se vierte 1 mL de la muestra sin diluir. Los tubos llevan campana de Durham para observar la producción de gas.Coliformes y E. En 2° serie. tubos simple concentración. haciendo lecturas a las 24 (48 horas) Número Más Probable.INTI – Mendoza Curso práctico Microbiología de Aguas .

Coliformes y E.2 Confirmación para coliformes totales La confirmación es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentación de la lactosa a 35 o 37° C Se utilizan únicamente los tubos positivos (fermentación y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva. con ansa en anillo. Incubar todos los tubos inoculados a 37° C durante 18-24 h Número Más Probable.2013 3.INTI – Mendoza Lectura de la Prueba Presuntiva La reacción es positiva cuando se evidencia la fermentación de la lactosa. Curso práctico Microbiología de Aguas . El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a la temperatura de incubación. En condiciones estériles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS). Seleccionar los tubos positivos fermentación + gas y desechar los otros. coli en aguas Página 4 de 9 . Y se inocula en un tubo con Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva.

1 ml -1 (10 ) + - Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales /100ml de muestra= 3-3. El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a 35 o 37° C (en presencia de sales biliares) Curso práctico Microbiología de Aguas .5° C Se utilizan únicamente los tubos positivos (fermentación y gas) en Caldo LTS seleccionados en la prueba presuntiva.INTI – Mendoza La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares.++ 2 1 Tubos 1ml ++ . Medio LTS Caldo Bilis Verde Brilante Combinación Tubos 10 ml +++ . con ansa en anillo.+ 0 Tubos 0.Coliformes y E. En condiciones estériles y se toma la muestra del tubo positivo (LTS).2013 Anotar la combinación de tubos confirmados para Coliformes Totales Ej.Confirmación para coliformes termotolerantes La confirmación es positiva cuando se comprueba el crecimiento en presencia de sales biliares y la fermentación de la lactosa a 44 o 44. Número Más Probable. coli en aguas Página 5 de 9 .

2013 Y se inocula en un tubo con Caldo EC Esto se repite con todos los tubos positivos de la prueba presuntiva.-+ 1 Tubos 1ml ++ .+ 1 Tubos 0.5° C durante 18-24 h La turbidez indica crecimiento en presencia de sales biliares.5 ºC (presencia de sales biliares) Anotar la combinación de tubos confirmados para Coliformes termotolerantes Ej. Número Más Probable. Incubar todos los tubos inoculados a 44.1 ml -1 (10 ) + 0 Calcular por Tabla el NMP de coliformes totales / 100ml de muestra Todos los tubos confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos coliformes termotolerantes en cada dilución se utilizan para el aislamiento de Escherichia coli en agar EMB o Levine y comprobación bioquímica de la producción de indol. El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a 44. coli en aguas Página 6 de 9 . Medio LTS EC Combinación Tubos 10 ml +++ .INTI – Mendoza Curso práctico Microbiología de Aguas .Coliformes y E.

4 Escherichia coli Para la investigación de E.C.2013 3.5ºC) en el medio E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos (crecimiento y formación de gas en caldo E. Siembra en agua triptona (TW) a partir de los tubos positivos de EC Incubar en estufa o en baño maria a 44-44.Coliformes y E.INTI – Mendoza Curso práctico Microbiología de Aguas .C.5 ºC durante 24h Simultáneamente se siembra en agar Levine (EMB) para aislamiento de las colonias y observar la morfología y coloración típica de Escherichia coli Incubar a 44. a 44. coli en aguas Página 7 de 9 .5 ºC con las placas invertidas durante 24 h Observar el brillo metálico de las colonias de Escherichia coli en agar EMB Número Más Probable.

INTI – Mendoza Curso práctico Microbiología de Aguas .partes de la colonia. El brillo metálico verdoso con luz reflejada nunca la presentan las especies de estos generos Realizar la prueba de indol en los tubos de agua triptona (TW) Añadir 0. Con luz reflejada. coli en aguas Página 8 de 9 . que ocupan las 3/4.Coliformes y E. planas o ligeramente cóncavas. 3 gotas) del reactivo de Kovacs a cada tubo. coli sobre agar EMB o Levine: 2-3 mm de diámetro.5 mL (aprox. Número Más Probable. este brillo metálico no se manifiesta. a veces. Otras colonias se descartan como pertenecientes a Escherichia col: incoloras o trasparentes (como las producidas por Proteus y Salmonella) rosas o marrones con centro azul oscuro ( como las producidas por Klebsiella y Enterobacter). centros azul oscuros o casi negros. se observa un brillo metálico verdoso.2013 Características de las colonias de E.

La reacción negativa muestra anillo amarillento. coli en aguas Página 9 de 9 .+ 0 Tubos 0. coli por mililitro de muestra. Anotar la combinación de tubos confirmados para Escherichia coli Ej.INTI – Mendoza La reacción positiva se manifiesta por la formación de un anillo rojo en la superficie del medio.Coliformes y E. se hace la lectura en la tabla del NMP para obtener el número de E.1 ml -1 (10 ) + - 0 Calcular por Tabla el NMP de Escherichia coli / 100ml de muestra Número Más Probable. Escherichia coli al desaminar e hidrolizar el triptófano del medio. produce indol que se pone de manifiesto al añadir el reactivo de Kovacs Curso práctico Microbiología de Aguas .-+ + + 1 Tubos 1ml ++ .2013 Con aquellos casos en que se comprueba la presencia de Escherichia coli por la producción de indol y el crecimiento característico sobre agar EMB. Medio LTS EC Agar EMB Indol Combinación Tubos 10 ml +++ .

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