6.

Biocapteurs
6.1 Principe dun biocapteur
Biocapteur = lment de reconnaissance molculaire + transducteur

analyte

signal

analyte

signal

transducteur lment de reconnaissance molculaire

transducteur lment de reconnaissance molculaire

Llment de reconnaissance molculaire ragit spcifiquement avec le bioanalyte dintrt. Le transducteur agit en tant que dtecteur, convertissant lvnement de reconnaissance molculaire en un signal facilement mesurable.
240

Llment de reconnaissance molculaire et le transducteur sont intgrs dans un seul dispositif (petit et portatif) permettant de doser directement lanalyte dintrt sans lajout dautres ractifs ou de pr-traitement de lchantillon.

(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

241

 Llment de reconnaissance molculaire: est immobilis /prs de la surface du transducteur par physisorption, chimisorption ou par pigeage dans une membrane inerte offre une spcificit et une sensibilit leves pour lanalyte, ainsi quune rponse rapide ex. enzymes, anticorps, ADN, cellules entires, micro-organismes Le transducteur: est le composant dun biocapteur qui dtecte les changements physiques se produisant dans llment de reconnaissance molculaire suite la liaison de lanalyte et les convertit en un signal de sortie qui peut tre amplifi, affich et sauvegard peut convertir le signal provenant dun vnement de reconnaissance molculaire soit directement ou par le biais dun mdiateur chimique (ex. glycomtre) Principe de fonctionnement dun biocapteur
(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

242

Modes de transduction: le type de reconnaissance molculaire dtermine le type de transducteur utilis ex. spectrophotomtrie, lectrochimie, calorimtrie et pizo-lectricit

243 (Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

Combinaisons diffrentes
lment biologique Transducteur lectrochimie - Enzyme - Micro-organisme - Tissue (plante ou animale) - Anticorps marqu avec enzyme - Enzyme - Micro-organisme - Tissue - Anticorps marqu avec enzyme potentiomtrie lectrodes rdox et slectives aux ions (ex. lectrode de verre, lectrodes slectives au CO2, NH3 et sulphide) Exemple

ampromtrie

Dtection de H2O2/O2, lectrodes aux enzymes

244

lment biologique - Enzyme -Bicouche lipidique

Transducteur lectrochimie Conductimtrie

Exemple lectrodes de Pt ou Au pour dterminer le changement de conductivit de la solution due la production dions

- Anticorps - Acide nuclique - Anticorps - Antigne - Enzyme - Acide nuclique

Optique fluorescence

Photodiodes, fibreoptiques, puces ADN BIAcore (avec surfaces dAu ou Ag)

rsonance de plasmons de surface (SPR)

245

lment biologique - Anticorps - Antigne - Enzyme - Acide nuclique - Enzyme - Micro-organisme - Cellule

Transducteur Acoustique

Exemple Dispositifs piezolectriques, microbalance cristal quartz

Calorimtrie

Thermisteur ou thermopile

B.M. Paddle, Biosensors for chemical and biological agents of defence interest , Biosensors & Bioelectronics 1996, 11, 1079-1113
246

6.2 Biocapteur base denzyme

Le 1er biocapteur (dvelopp par Clark et Lyons en 1962 pour la dtection du glucose) tait constitu de la glucose oxydase (GO) pige la surface dune lectrode de Pt par une membrane dialyse permettant la diffusion des substrats et produits /de la couche enzymatique. La conversion du D-glucose (S) en gluconolactone (P) et H2O2 est dtecte par lectrochimie:
lectrode auxiliaire lectrode de travail lectrode de rfrence

S + O2

P + H2O2

enzyme pige dans une membrane semi-permable

H2O2

2H+ + O2 + 2e-

Capteur ampromtrique

Eappliqu = +0.70 V vs. E.C.S.

247

 Lamplitude du courant mesur (i) dpend de quatre facteurs: cintique de transfert de masse qui dtermine les vitesses auxquelles les substrats peuvent tre fournis et les produits enlevs de la couche enzymatique cintique enzymatique qui dtermine la vitesse laquelle le H2O2 est gnr lintrieure de la couche enzymatique cintique de la raction lectrochimique qui dtermine la vitesse laquelle le H2O2 produit dans la raction enzymatique est converti en O2 efficacit de conversion, i.e. fraction de H2O2 oxyde Les ractions se produisent dans une mince couche la surface du transducteur; des concentrations stables des ractifs et des produits existent dans cette couche lorsquun signal constant est obtenu.
248

Glycomtre - biocapteur ampromtrique

Bandelette-test pour le glucose
lectrode de rfrence Ag/AgCl zone ractive contacte lectrique lectrode de travail/enzyme

Fe(CN)64e
-

FAD

C6H12O6 glucose

lectrode
Fe(CN)63-

glucose oxydase

FADH2

C6H10O6 gluconolactone 249

 Laccepteur physiologique (O2) est remplac par un mdiateur synthtique (1,1-dimthylferrocne ou Fe(CN)63-/4-) pouvant transporter les lectrons du centre rdox de lenzyme la surface de llectrode. Due lutilisation dun mdiateur artificiel, lanalyse devient insensible la fluctuation du taux doxygne (i.e. N2 vs. air) Lanalyse peut aussi tre effectue des potentiels plus bas (limination despces interfrentes).

Courbes dtalonnage enregistres pour le glucose avec le ferrocne comme mdiateur

(Daprs Mikkelsen & Cortn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

250

6.3 Microrseau base dADN

Un microrseau base dADN permet lanalyse en parallle de plusieurs gnes sur un seul dispositif. Des dizaines de milliers de ractions peuvent tre effectues simultanment sur une seule puce ADN. Cette nouvelle technologie exploite lappariement de deux oligonuclotides complmentaires. Avec un microrseau dADN, il est possible didentifier la squence dun gne et de dtecter des mutations gntiques.

(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

sonde molculaire

251

Fabrication de macro- ou microrseaux dADN

Une puce ADN contient un arrangement ordonn doligonuclotides immobiliss en forme de points sur un support solide miniaturis (gnralement du verre). Chaque point dune puce contient jusqu ~106 oligonuclotides identiques, mais la squence nuclotidique varie dun point lautre.

252

Dans un macrorseau, la taille des points est 300 m. Il y a 1,000 10,000 diffrents points par puce. Les macrorseaux sont fabriqus avec un dispositif piezolectrique programmable (cf. imprimante jet encre)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

tapes de fabrication dun macrorseau

253

 Modes dimmobilisation des oligonuclotides:

Couplage covalent dun oligonuclotide 1- Modification de la surface de verre avec un silane fonctionnalis
H3CO H3CO Si H3CO 95% acetone/ 5% eau O O Si O ou H3C H3C Si Cl H3C O Si H3C X

OH

OH

(ou X= NH2, SH, CHO,

)
O
254

2- Raction avec oligonuclotide amin, NH2-(CH2)6-O-(PO)2-oligo

1,4-phnylenediisothiocynate H2

255

CHO

CH=

- Attaque nuclophilique (-NH2, -SH, -OH) sur des poxydes

256

Couplage non-covalent (adsorption lectrostatique) groupements phosphate chargs ngativement de lADN Surface modifie avec un -amino propylsilane Surface modifie avec une couche de poly-L-lysine

257

 Dans un microrseau, la taille des points est de 20 50 m (ex. puce ADN dAffymetrix).

puce ADN dAffymetrix

(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

258

Fabrication dun microrseau par photolithographie

OH

OH

ClSi(CH3)2

-HCl
plaque de verre

H3C Si CH3 H3C Si CH3 O O

www.affymetrix.com

259

Principe dune puce ADN

(marqueur fluorescent)
(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 260

Lecteur de microrseauxmicroscope confocal fluorescence induite par laser

excitation: Vert (532 nm) Rouge (633 nm)

261

Squenage de lADN avec un microrseau

Un microrseau constititu de 44 = 128 points de tetranuclotides. Pour simplicit, seulement une chane est illustr par point.

(Daprs Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

Un microrseau aprs raction avec de lADN partiellement digr. Lhybridation avec les tetranuclotides du rseau est indique en rouge.
262

Marqueurs fluorescents: rhodamine et fluorescein ou Cy3 et Cy5 excitation: Vert (532 nm) Rouge (633 nm)

263

Microrseaux et les couleurs des points

264