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CALIDAD DE METODOS ANALITICOS

Julia Vinagre

INTRODUCCION
Los mtodos analticos que se apliquen para producir datos de composicin qumica de alimentos deben ser apropiados, utilizar tcnicas analticas exactas y ser realizados por analistas entrenados. La seleccin de un mtodo analtico debe ser realizada por el consejero cientfico del programa de base de datos, pero esta responsabilidad debe ser compartida con el analista. Si se considera que el principal objetivo de la base de datos de composicin de alimentos es nutricional, es evidente que el mtodo de anlisis seleccionado para un nutriente debe reflejar lo ms fielmente posible el valor nutritivo del alimento. En esta eleccin de un mtodo particular, se debe conocer, en primer lugar la qumica del nutriente, la naturaleza del sustrato alimenticio a ser analizado, el efecto del procesamiento y la preparacin sobre la matriz del alimento y en el nutriente, y el rango esperado de concentracin del nutriente. El segundo requisito es comprender las implicancias nutricionales del nutriente, lo cual incluye su rol, su distribucin en los alimentos y su importancia relativa en alimentos individuales en el suministro dietario total del nutriente. El proceso analtico se puede considerar dividido en 3 etapas: i)operaciones previas (muestreo, acondicionamiento, disolucin, separaciones, reacciones analticas y otras); ii) Medicin y traduccin de la seal analtica mediante el uso de instrumentos y; iii) toma y tratamiento de datos. La calidad de los resultados depende de la calidad de las diferentes etapas del proceso analtico. En la eleccin de un mtodo se debe focalizar la atencin en los principios analticos involucrados, ms bien que en el grado de sofisticacin del instrumento. Muchas veces un mtodo con uso de instrumentos modernos puede producir valores menos confiables que el mtodo tradicional que pretende reemplazar y es preferible desarrollar programas que aseguren la calidad de los datos obtenidos. Suele suceder tambin que las legislaciones de alimentos se basen en un mtodo estandarizado oficial que puede no ser el ms adecuado desde el punto de vista nutricional y, por tal motivo, se deben tomar decisiones individuales en cada caso.

CRITERIOS PARA LA ELECCION DE UN METODO


Basndose en las consideraciones de Egan, la eleccin de mtodos debe considerar: a. Dar preferencia a mtodos cuya calidad y confianza se ha establecido en estudios colaborativos, o similares en varios laboratorios (ISO / REMCO, 1993) b. Preferir mtodos documentados o adoptados por organizaciones internacionales reconocidas. c. Preferir mtodos de anlisis que se aplican en forma uniforme a varios tipos de alimentos sobre aquellos que se aplican a alimentos especficos. Entre los atributos a considerar en la calidad de un mtodo se deben mencionar aquellas caractersticas que son bsicas: confiabilidad, aplicabilidad, especifidad, exactitud, precisin, detectabilidad y sensibilidad.

Confiabilidad
Es un trmino general cualitativo que expresa el grado de cumplimiento satisfactorio de un mtodo analtico en trminos de sus variados atributos tcnicos (aplicabilidad, exactitud, precisin, sensibilidad y detectabilidad), siendo por lo tanto, un concepto compuesto. El objetivo del anlisis es determinar cul de estos atributos es importante y cul puede estar comprometido. Ejemplo: si se desea analizar un componente mayor no se requiere un bajo lmite de deteccin.

Aplicabilidad
En la aplicabilidad de un mtodo se debe considerar que est libre de interferencias producidas por otros materiales presentes en la muestra alimenticia, asimismo influye el rango en que se va a usar el mtodo.

Especificidad o selectividad
Es la habilidad de un mtodo para responder exclusivamente a la sustancia que se desea analizar. Sin embargo, en algunas ocasiones se aceptan mtodos con una pobre especificidad cuando el propsito del anlisis es captar compuestos similares dentro de un grupo (Ejemplo: grasa total, cenizas) La especificidad se refiere a la propiedad del mtodo de producir una seal medible debida slo a la presencia del analito, libre de interferencia de otros componentes en la matriz de la muestra.

Exactitud
Es la cercana del valor analtico al "valor verdadero" de concentracin del compuesto de inters en el material bajo examen. Es la concordancia entre la mejor estimacin de una cantidad y su valor real. La inexactitud es la diferencia numrica entre el valor promedio de un conjunto de repeticiones y el valor verdadero. En la prctica la cercana a un estndar de algn tipo se toma como medida de exactitud. Matemticamente se expresa: Desviacin:

Desviacin relativa:

Recuperacin:

X = valor promedio = valor verdadero De todas ellas, sin lugar a dudas, la ms utilizada es la recuperacin. Si bien el valor verdadero de la concentracin no se conoce sino que slo puede estimarse, es posible preparar una muestra por un procedimiento ms exacto que el evaluado (por pesada, dilucin en peso, etc.) y utilizarla como referencia. La exactitud o mejor dicho la inexactitud debe ser tan pequea como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia, o sea, la recuperacin debe acercarse al 100%. En el anlisis de macrocomponentes, en general se requiere que el valor medido no difiera significativamente del aceptado como referencia. Para determinarlo, se utiliza un ensayo t de Student, efectuando varias determinaciones de la muestra de concentracin conocida y calculando el t experimental (tob) que se compara con tablas t para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido, generalmente p=0,05.

Si el tob es menor que el valor tabulado el mtodo tiene la exactitud requerida para ese mbito de confianza. Si el tob resulta mayor que el valor tabulado, el mtodo tiene un error sistemtico, del signo resultante, para ese mbito de confianza.

Precisin
En trminos reales ms bien se debe considerar la imprecisin que corresponde, aproximadamente, al trmino dispersin y variabilidad analtica. La imprecisin se determina haciendo ensayos repetitivos de una misma muestra analtica. o de cada. conjunto de muestras analticas y luego se calcula la desviacin estndar, siendo muy importante en este caso la homogeneidad del sustrato. La precisin tiene la desventaja que requiere que los valores se distribuyan normalmente, que enfatiza los valores extremos de una serie de mediciones y que en muchos mtodos aumenta la desviacin estndar cuando aumenta la concentracin. Para evaluar datos de un amplio rango de concentracin es ms til calcular la desviacin estndar relativa (RSD) o bien el coeficiente de variacin por ciento (CV%). La precisin est relacionada con la disposicin de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples alcuotas de una muestra homognea.

La precisin se expresa matemticamente por "S" o ms comnmente por RSD o CV.

Los estimadores desviacin estndar y desviacin estndar relativa permiten evaluar la incertidumbre en. la estimacin de la medida (error aleatorio, correspodiente a la dispersin de datos alrededor. de la.media). La precisin de un mtodo analtico debe estudiarse sobre: a. El sistema, evaluando la dispersin de al menos 6 inyecciones del estndar por ejemplo en tcnica HPLC b. El mtodo, evaluando la dispersin de varias preparaciones de la muestra final homognea. La evaluacin corresponde a todo el procedimiento, desde la preparacin de la muestra hasta la medicin del analito por parte del instrumento. La imprecisin causada por las diluciones es un factor que con frecuencia se olvida. La precisin se puede medir en condiciones repetitivas (mismo analista, mismo da, mismo instrumento) y en condiciones reproducibles (diferente analista, diferente da, diferente instrumento). En muchos casos debe indicarse el lmite o intervalo de confianza de la medida el cual corresponde al rango en el cual puede definirse la probabilidad de capturar el parmetro con la probabilidad indicada. Cuando el nmero de muestras es pequeo (menos de 30), las medidas independientes y la distribucin normal se calculan de acuerdo a la distribucin t de Student:

Student tabulado para n mediciones con v=n-l grados de libertad y para varios niveles a de significancia (el ms aplicado es p=0,05 correspondiente a un intervalo de confianza del 95%).

Detectabilidad
Es la cantidad mnima de una sustancia (definida en trmino de cantidad absoluta o concentracin) que proporciona una respuesta medible para un mtodo descrito.

Sensibilidad
Es la pendiente de la curva respuesta -concentracin, o el cambio de respuesta por unidad de concentracin. Si la pendiente es empinada el mtodo tiene alta sensibilidad y si la pendiente es poco empinada, el mtodo posee una baja sensibilidad. En estudios de composicin de nutrientes

el anlisis de elementos trazas requiere alta sensibilidad, lo que en la prctica se puede lograr mediante amplificacin electrnica o por concentracin qumica del analito. En la Grfico 1 se resumen los atributos a considerar en la calidad.

VALIDACION DE METODOS
An los mtodos bien establecidos necesitan ser validados por los analistas usando el personal, reactivos y equipos del laboratorio cuyo mtodo se quiere validar. La validacin puede hacerse analizando un conjunto de muestras que han sido analizadas por otro mtodo o por otro laboratorio. El analista debe familiarizarse con un mtodo y asegurarse que ha alcanzado el grado deseado de recuperacin y precisin despus de haber analizado un conjunto de blanco y muestras analticas sintticas o fortificadas. Grfico 1 Respuesta en funcin de la concentracin del analito Atributos de los mtodos

Si un mtodo particular sobre un alimento, o realizado en otro laboratorio, ha dado un cumplimiento adecuado est indicando que el mtodo es adecuado, pero esto no significa que se pueda asumir que si el mtodo se ha realizado satisfactoriamente con un alimento determinado opere exactamente igual con un alimento diferente sino muy por el contrario, se debe asumir la posicin opuesta hasta comprobarlo. As por ejemplo, alimentos procesados y formulados, especialmente si contienen emulsificantes, pueden constituirse en un problema especial cuando se analiza, con un mtodo de anlisis desarrollando para un alimento primario.

La validacin consiste, en esencia, en confirmar y documentar que los resultados emanados de la aplicacin de un mtodo de anlisis son confiables. Evidentemente todo nuevo mtodo analtico debe validarse para demostrar su idoneidad, pero generalmente existen metodologas antiguas aplicadas durante mucho tiempo y entonces tiene poco sentido validar como si fuera una metodologa desconocida. Se habla entonces de una validacin retrospectiva, donde se pueden combinar los nuevos criterios de validacin con toda la experiencia ya adquirida. En cambio, se conoce como validacin prospectiva a la que se realiza frente a un producto nuevo. En muchos casos un mtodo analtico es desarrollado y validado por un grupo de trabajo y aplicado por otro grupo y para asegurar que este ltimo sea a su vez capaz de entregar resultados confiables, es conveniente realizar una transferencia de validacin. Si se trata, por ejemplo, de un mtodo cromatogrfico consiste en la comparacin de resultados de las pruebas de adecuacin y anlisis en paralelo, al menos dos muestras homogneas de concentraciones conocidas, dentro del rango de aceptacin del producto o dentro del rango de aplicacin de la metodologa. En un ensayo de validacin deben considerarse los siguientes parmetros:

selectividad linealidad precisin exactitud sensibilidad robustez

La selectividad, precisin, exactitud y sensibilidad, fueron descritas con anterioridad y en lo que respecta a la linealidad de un mtodo analtico se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin de analito y su respuesta. Este paso de la validacin es necesario si se va a trabajar con un solo estndar en las determinaciones de rutina, aunque pueden aceptarse mtodos no lineales, si se opera con estndares mltiples cada vez. Adems, conjuntamente se determina el rango lineal, es decir, el intervalo comprendido entre la concentracin mnima y mxima de analito para el cual el mtodo ha sido probado y dentro del cual se puede efectuar el dosaje por interpolacin en una curva estndar. Para su determinacin se prepara una serie de mnimo cinco diluciones de un estndar comprendiendo los mbitos estimados de trabajo con un exceso de al menos 50% sobre el lmite superior y un defecto de 50% debajo del lmite inferior. Estas soluciones se inyectan, al menos por duplicado, y se determina la curva de regresin Y = bX+a sobre los puntos individuales sin promedios por el mtodo de los cuadrados mnimos y se grafica para su documentacin. En muchos casos es interesante comparar los resultados de la recta de regresin obtenida sobre el analito puro, con la correspondiente a analito + matriz (en el Grfico 2, se seala para HPLC el efecto de la matriz). Grfico 2 Rectas de regresin del analito y analito ms matriz para HPLC

La no correspondencia de las rectas indica problemas por efecto de la matriz y est relacionada con la exactitud del mtodo en cuestin. Estos efectos de matriz pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza en aditivos y multiplicativos. Los aditivos se refieren a un desplazamiento positivo del cero en presencia de la matriz y los multiplicativos a un cambio de la pendiente. Independiente de la apariencia de la recta, resulta conveniente evaluar los estimadores de regresin en un intervalo de confianza dado (por ejemplo p=0,05):

- Del coeficiente de regresin lineal (r). Se determina para evaluar el ajuste al modelo lineal propuesto, Y=bX+a. - De la pendiente (b). Se determina como parmetro indicativo de la sensibilidad del mtodo, para evaluar la correlacin de diferentes mtodos. El lmite de confianza para el estimador de la pendiente (b) se calcula en funcin de su varianza Sb. - De la ordenada al origen (a). Se determina para evaluar la proporcionalidad de la funcin analtica, es decir, que la recta pase por el origen y que cualquier desviacin pueda adjudicarse nicamente a un error aleatorio. El lmite de confianza del estimador de la ordenada al origen (a) se calcula en funcin de su varianza Sa.
El mejor indicador del modelo lineal, en reemplazo de r es el clculo del valor tr con n-2 grados de libertad el cual se compara con el valor t tabulado para el nivel de confianza requerido. La hiptesis nula es "no existe correlacin entre X e Y", si el valor observado de tr es mayor que t tabla se rechaza la hiptesis y existe correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada.

BIBLIOGRAFIA