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VII Congreso Nacional de Ciencia de los Alimentos y III Foro de Ciencia y Tecnologia de Alimentos

Guanajuato, Gto.
331
Comparación de dos Métodos de Extracción de Antocianinas en Ficus carica Variedad
Misión

Aguilera Ortíz Miguel
1
, Alanis Guzmán María Guadalupe
2
y Reza Vargas María del Carmen
1

1
Facultad de Ciencias Químicas-UJED.
2
Facultad de Ciencias Biológicas-UANL. Av. Artículo
123 s/n, Fracc. Filadelfia. Gómez Palacio, Dgo. Tel. 01 (871) 715 88 10. Fax 01 (871) 715 29
64 e-mail: maotsetung@mixmail.com.

Resumen
Soluciones de metanol acidificado y acetona fueron usadas para extraer antocianinas de piel
de higo congelada, en un proceso no continuo. El tipo de método y tamaño de muestra
fueron factores significativos en el proceso de extracción, donde el metanol acidificado fue
más eficiente que la acetona en la extracción producida. Un escaneo espectrofotométrico a
diferentes longitudes de onda (región visible) fue determinado en los extractos. Los valores
de absorbancia observados fueron más altos a 520 nm. Una solución de metanol:agua:ácido
fórmico (70:28:2) es recomendada para la extracción de antocianinas a tamaños de muestra
menores a 1 g; sin embargo, a tamaños de muestra mayores a 2 g una solución de acetona
es recomendada. También fueron obtenidos extractos metanólicos de pi el es l i ofi l i zadas
observando val ores más al tos de absorbanci a en muestras l i ofi l i zadas no
resuspendi das en agua que en muestras l i ofi l i zadas y resuspendi das en agua.
Además un escanéo de pH fue realizado, encontrando que las antocianinas son
dependientes del pH, encontrándose rojas a pH = 2 y azules a pH = 8.
Palabras clave: antocianinas, extracción, solvente, absorbancia.
Abstract
Solutions of acidificated methanol and acetone were used to extrac anthocyanins from frozen
fig skin, in a no continuos process. The kind of method and size of sample were significative
factors in process of extraction, where acidificated methanol was more efficient than acetone
in yield extraction. A spectrophotometric screening to different wavelengths (visible range)
was determined in the extracts. Values of absorbance were taller at 520 nm. A solution of
methanol: water: formic acid (70:28:2) is recommended for extraction of anthocyanins to size
of samples less than 1 g; however, a size of samples majorities than 2 g a solution of acetone
is recommended. Also, extracts methanolics were obtained from frozen fig skin liofilized
showing values higher of absorbance in liofilized samples no dissolved in water than liofilized
samples and dissolved in water. In addition, a screening of pH was realized, finding that
anthocyanins are dependents of pH; they are red to pH = 2 and blue to pH = 8.
Key words: anthocyanins, extraction, solvent, absorbance.


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Introducción
Hay una fuente importante de colorantes naturales presentes en frutas rojas tales como
cerezas, ciruelas, fresas, frambuesas, zarzamoras, uvas, pasas rojas y negras (Jackson et
al, 1978; Frankel et al, 1995; Lepidot et al, 1999). Restricciones en el uso de colorantes
sintéticos en alimentos ha conducido al interés en el uso potencial de antocianinas como un
colorante alimenticio en bebidas, jarabes, jugos de frutas, gelatinas, mermeladas, helados,
dulces de pasta y yogures, tan bien como en pasta dental, farmacéuticos, cosméticos y
productos similares (Clydesdale y Francis, 1976; Durante, 1995). Pigmentos presentes en
pieles de higo negro pueden ser industrialmente extraídos usando dos procesos de
extracción junto con ácido fórmico. La producción de éste pigmento bajo estos métodos de
extracción no es solamente para recuperar la mayor cantidad posible pero también para
obtener un ingrediente valuado comercialmente alto. Wilkinson et al comenzó a extraer
antocianinas en 1977 usando metanol con pequeñas cantidades de HCl (Nollet, 1996). La
acidificación con ácidos fuertes como el HCl sirve para mantener un pH bajo. Este puede, sin
embargo, alterar la forma nativa del complejo de pigmentos rompiendo asociaciones con
metales, copigmentos y proteínas (Moore et al, 1982). Para obtener antocianinas lo más
naturalmente posible el uso de solventes neutros (por ejemplo, 60% metanol, etilenglicol, n-
butanol, acetona) y ácidos orgánicos débiles (ácido fórmico, ácido acético) han sido
recomendados (Hendry, 1992). Kalt y MacDonald (2002), describieron un proceso para la
recuperación de antocianinas de arándano con un sistema solvente de MeOH:H
2
O:ácido
fórmico (70:28:2) (Agilent Technologies, 2002). García-Viguera et al (1998a), usaron un
método para la extracción de antocianinas con acetona y al final del proceso acidificaban el
extracto con agua acidificada (ácido fórmico al 3%). El presente trabajo fue conducido para
desarrollar un método para extraer antocianinas de pieles de higo congelado usando
soluciones de metanol y acetona como solventes, para evaluar cuál de los dos pudiera ser
elegido como método de extracción. Los valores de absorbancia observadas fueron tomadas
como parámetros de referencia en cada proceso para decidir su elección.

Materiales y Métodos
Los higos Ficus carica var. Misión fueron adquiridos directamente de la planta procesadora
de higo, ubicada en Álvaro Obregón, Mpio. de Lerdo, Dgo. Los higos fueron cosechados en
un estado de maduración industrial. Los lotes de higos frescos fueron almacenados en un


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cuarto frío de 0-5ºC conforme llegaban de la planta procesadora. Posteriormente, se separó
la piel y la pulpa del tejido manualmente con un cuchillo. Una vez separadas las pieles, se
almacenaron en un congelador a -20ºC aproximadamente en bolsas de plástico hasta el
momento de ser analizadas. Una vez congel adas l as pi el es de hi go, se l i ofi l i zaron
usando un l i ofi l i zador Labconco Freezone.
Extracción de antocianinas. Un proceso no-continuo de extracción fue empleado durante
todo el experimento. Previamente se determinó el % de humedad y el % de sólidos de la piel
de higo congelada, por el método tradicional de la estufa de desecación. Esto con el objetivo
de establecer un tamaño de muestra determinado en base a los sólidos de la piel. Se llevó a
cabo la extracción de las antocianinas, probando soluciones de metanol acidificado y
soluciones de acetona. Para poder correr la extracción con metanol acidificado, se
manejaron cinco tamaños de muestra (en base al % sólidos= 20% ) que fueron 40, 80, 120,
160 y 200 mg, respectivamente. El método se basó en obtener un extracto metanólico
(metanol:agua:ácido fórmico) a partir de la piel de higo congelada, donde posteriormente se
hizo un escaneo a diferentes longitudes de onda en un espectrofotómetro en la región visible
(510, 515, 520, 535, 546 y 550 nm, respectivamente). Cada tamaño de muestra fue
previamente molida (molino para especies) para homogenizar la muestra. Enseguida, la piel
de higo congelada y homogenizada se colocó en un frasco de vidrio conteniendo éste 10 mL
de una solución fría de metanol acidificado (MeOH:H
2
O:ácido fórmico; 70:28:2). La mezcla
se colocó en una licuadora (Osterizer) y se molió por espacio de 10 min a una velocidad de
4. Después de la molienda, la mezcla obtenida se filtró a vacío. Finalmente, el filtrado se dejó
reposar por 1 hora en la oscuridad. Pasado este tiempo, se hizo un escanéo a diferentes
longitudes de onda en un espectrofotómetro y por último se tomaron las lecturas de
absorbancia para cada longitud de onda. Adicionalmente, se usaron otros tamaños de
muestra, aumentando el porcentaje de sólidos en base a un gramo de muestra congelada,
de 2 a 20%, respectivamente. Por lo tanto, los tamaños de muestras empleados fueron 400,
800, 1200, 1600 y 2000 mg, respectivamente. Para la extracción con acetona, se manejaron
tres tamaños de muestra: 2, 4, y 6 g, respectivamente. El método se basó en obtener un
extracto acetónico (concentrándolo a vacío y resuspendiéndolo en agua acidificada) a partir
de la piel de higo congelada. Cada tamaño de muestra (previamente homogenizada) se
colocó en un vaso de precipitado conteniendo 15 mL de una solución de acetona.
Enseguida, se dejó reposar esta mezcla por 5 min a temperatura ambiente, una vez obtenido
el extracto acetónico, se flitró a vacío. Estos filtrados se concentraron en una estufa a vacío a


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35ºC por 6 horas aproximadamente. Después, se resuspendieron los extractos con 5 mL de
una solución de agua acidificada (3% de ácido fórmico). Finalmente, se hizo un escanéo a
diferentes longitudes de onda en un espectrofotómetro y por último se tomaron las lecturas
de absorbancia para cada longitud de onda. Después de lo anterior se utilizaron los extractos
metanólicos para llevar a cabo un screening de pH y color (titulando con ácido y base),
usando piel de higo congelada y liofilizada.

Resultados y Discusión
Soluciones de metanol acidificado fueron efectivas en la extracción de antocianinas de piel
de higo congelada a tamaños de muestra menores de 1 g, como se puede observar en el
Cuadro 1., donde la tendencia observada fue que el valor de la absorbancia aumentó
conforme se pasó de una onda de longitud pequeña a una más grande, sin embargo al llegar
a 520 nm aquí se registraron los valores más altos y a partir de este valor nuevamente
descendió el valor de la absorbancia. De la misma manera pasó con el tamaño de muestra,
sin embargo, al pasar de un tamaño de muestra cuatro (160 mg) a un tamaño de muestra
cinco (200 mg) descendió el valor de la absorbancia.

Cuadro 1. Valores Promedios de Absorbancia de Extractos Metanólicos Acidificados a
Diferentes Longitudes de Onda (Región Visible) y con Diferentes Tamaños de Muestra.

Longitud de Onda, λ Tamaño
de
muestra,
mg

510

515

520

535

546

550
40 0.740 0.763 0.778 0.776 0.682 0.633
80 0.842 0.861 0.877 0.860 0.782 0.738
120 0.819 0.848 0.872 0.848 0.726 0.656
160 1.365 1.424 1.470 1.447 1.240 1.117
200 1.140 0.973 1.013 0.996 0.824 0.724

Con lo anterior, confirmamos que a mayor tamaño de muestra se extraen mejor las
antocianinas y que la mejor lectura se da en 520 nm en la región visible, usando el método
del metanol acidificado. El pigmento extraído como una función del tamaño de muestra y de


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la longitud de onda es mostrado en la Fig. 1. Cuando se usó un tamaño mayor en base a los
sólidos (de 2 a 20%) se pudo observar un comportamiento similar que al inicio. Lógicamente,
la concentración obtenida aumentó significativamente. Como vemos en Cuadro 2, el
comportamiento fue similar al del primer experimento.

Figura 1. Espectro de Absorción de Extractos Metanólicos Acidificados de Antocianinas en la
Región Visible a Diferentes Tamaños de Muestra.

Cuadro 2. Valores Promedios de Absorbancia de Extractos Metanólicos Acidificados a
Diferentes Longitudes de Onda (Región Visible) y con Diferentes Tamaños de Muestra.
Longitud de Onda, λ Tamaño
de
muestra,
mg

510

515

520

535

546

550
400 1.765 1.832 1.888 1.861 1.614 1.469
800 3.066 3.111 3.134 3.068 2.762 2.515
1200 3.683 3.735 3.740 3.714 3.443 3.185
1600 3.835 3.824 3.834 3.820 3.809 3.760
2000 3.873 3.868 3.821 3.856 3.829 3.821

También podemos comentar que el valor de la absorbancia aumentaba conforme
pasábamos de una onda de longitud pequeña a una más grande, sin embargo al llegar a 520
nm aquí se registraban los valores más altos y a partir de este valor nuevamente descendía
el valor de la absorbancia. De la misma manera pasó con el tamaño de muestra. Sin
0
0.5
1
1.5
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
i
510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm

40 mg
80 mg
120 mg
160 mg
200 mg


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embargo, algunos valores obtenidos no mantuvieron este comportamiento. Como
previamente comentamos, el comportamiento de los datos para los tamaños de muestras
cuatro y cinco no mostraron la misma tendencia de aumentar conforme aumentaba la
longitud de onda; en consecuencia, en este experimento el dato más alto (absorbancia) se
observó en una longitud de onda más baja y en un tamaño de muestra más grande, en
comparación con el primer experimento realizado. El pigmento extraído como una función
del tamaño de muestra y de la longitud de onda es mostrado en la Fig. 2.

Figura 2. Espectro de Absorción de Extractos Metanólicos Acidificados de
Antocianinas en la Región Visible a Diferentes Tamaños de Muestra.

A tamaños de muestras menores de 1 g, extractos acetónicos de antocianinas no fueron
obtenidos, sin embargo, a tamaños de muestra superiores a 2 g, soluciones de acetona son
recomendadas. Posteriormente, se realizó otra corrida experimental usando 2, 4 y 6 g como
tamaños de muestra. Una vez obtenido el extracto acetónico, se filtró dicho extracto.
Finalmente, se estabilizó la temperatura y se consiguió concentrar los extractos. Se realizó la
resuspensión en agua acidificada (3% ácido fórmico. Los resultados obtenidos del escanéo a
diferentes longitudes de onda se dan en el Cuadro 3.

0
1
2
3
4
A
B
S
O
R
B
A
N
C
C
I
A

510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm
400 mg
800 mg
1200 mg
1600 mg
2000 mg


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Cuadro 3. Valores Promedio de Absorbancia de Extractos Acetónicos a Diferentes
Longitudes de Onda (Región Visible) y con Diferentes Tamaños de Muestra.
Longitud de Onda, λ Tamaño
de
muestra,
g

510

515

520

535

546

550
2 3.779 3.782 3.792 3.673 3.319 2.992
4 3.856 3.861 3.847 3.839 3.802 3.807
6 3.867 3.844 3.877 3.859 3.846 3.807

Los valores de absorbancia obtenidos de esta corrida experimental son diferentes y
ligeramente más altos que por el método de metanol acidificado. El pigmento extraído como
una función del tamaño de muestra y de la longitud de onda es mostrado en la Fig. 3.

Figura 3. Espectro de Absorción de Extractos Acetónicos de Antocianinas en la
Región Visible a Diferentes Tamaños de Muestra.

Referente a las muestras liofilizadas resuspendidas en agua y no resuspendidas en agua,
podemos observar que se obtiene un valor de absorbancia más alto en muestra liofilizada no
resuspendida con agua que en muestra liofilizada y resuspendida en agua. Por otro lado, los
extractos metanólicos, al ser titulados con el HCl 0.1 N su color rojo débil se intensifica a un
rojo más fuerte con forme desciende el valor del pH; de acuerdo con Nollet (1996), reporta
que en medios fuertemente ácidos (a valores por debajo de 2) las antocianinas existen en su
forma coloreada roja como cationes de flavilium. Los extractos metanólicos obtenidos de piel
de higo congelada y liofilizada, al ser titulados con el NaOH 0.1 N su color rojo débil decrece
y cambia de rojo a azul oscuro con forme aumenta el valor del pH; según Nollet (1996),
0
1
2
3
4
A
B
S
O
R
B
A
C
I
A

510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm
2 g
4 g
6 g


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comenta que a valores de pH débilmente ácidos, neutros y básicos, el carbinol y las formas
de la base quinonoidal dominan al cation flavilium, tanto que el color decrece y cambia de
rojo a azul.
Conclusiones
El método de metanol acidificado fue mejor con respecto al de acetona, usando un tamaño
de muestra menor a 1 g. El método de soluciones de acetona fue mejor comparado con el de
metanol acidificado, usando un tamaño mayor de 2 g. De acuerdo al tamaño de muestra, el
método de metanol acidificado es más sensible, menos complicado y con menos tiempos de
espera que el de la acetona. Sin embargo, aunque ligeramente, en cuanto a cantidad de
extracción, el de la acetona es recomendado. Las mejores absorciones de antocianinas a
partir de piel de higo congelada se observaron a 520 nm en la región visible del espectro de
absorción. Con respecto a las pieles liofilizadas, se observan valores más altos de
absorbancia en muestras liofilizadas no resuspendidas en agua que en muestras liofilizadas
y resuspendidas en agua. Las antocianinas se comportan dependientes del pH,
encontrándose rojas a pH = 2 y azules a pH = 8.

Bibliografía
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