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Universidad Nacional Mayor De San Marcos

( Universidad del Per ,decana de Amrica )

Facultad de Ciencias Biolgicas Escuela Acadmica Profesional de Microbiologa Y Parasitologa

2013

Medios de cultivos
Curso: Bacteriologa

Prof.: Jorge Len

Alumnos: Antonio Ricce Condori Mercy Hoyos Camones Jhoseline Ramrez Barbarn 10100032 10100086 10100118

Universidad Nacional Mayor de san Marcos

01/01/2013

[MEDIOS DE CULTIVOS] 2013

Contenido

INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 3 PROCEDIMIENTO ................................................................................................................................................. 4 CALDO SELENITO 4 TRIPTEINA SOYA AGAR.5 M ENTEROCOCCUS AGAR 6 AGAR XLD (XILOSA-LISINA-DEXOCICOLATO) 7 Bibliografa .......................................................................................................................................................... 9 Anexo .................................................................................................................................................................. 9

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[MEDIOS DE CULTIVOS] 2013

INTRODUCCIN
Los medios de cultivo son una mezcla de diversas sustancias que nos permiten obtener informacin de un cultivo microbiano, entre los diferentes tipos de medios de cultivo estn los slidos, semislidos y lquidos los cuales permitirn tener diferentes resultados tratando de emular el ecosistema de cada microorganismo. El conocimiento del crecimiento microbiano permiti el desarrollo de los medios de cultivo el cual nos permite conocer algunas caractersticas de los microorganismos, como sus requerimientos nutricionales, metabolismo, as como pruebas que confirmen aplicaciones de los microorganismos.

OBJETIVOS
- conocer los diferentes medios de cultivo, as como su criterio de empleo. - Conocer la composicin qumica de los medios de cultivo

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PROCEDIMIENTO

Para poder realizar medios de cultivos ptimos, primero debemos de conocer los componentes de cada uno de ellos, su preparacin adecuada y los cuidados que se deben tener para su almacenamiento.
Entre los medios de cultivo, veremos a los siguientes:

1. CALDO SELENITO:
Es un medio enriquecido para el aislamiento de Salmonella sp. A partir de materiales clnicos, especialmente heces. Este medio sirve para cultivar microorganismos en tubos de ensayo.

Fundamento:
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayora de la flora entrica excepto Salmonella sp. durante las primeras 8 12 horas de incubacin.

Frmula (en gramos por litro) Peptona Lactosa Fosfato de sodio Selenito de sodio 5.0 4.0 10.0 4.0

Instrucciones Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta su disolucin completa. Evite el calentamiento excesivo. No esterilizar en autoclave. Distribuir en tubos estriles un volumen no menor a 5ml. Se recomienda guardar en heladera si no se usa de inmediato

pH final : 7.0 0.2

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Limitaciones:
Se aconseja usar el medio el mismo da de la preparacin. No incubar el medio de cultivo sembrado por ms de 24 horas, debido a que el efecto inhibitorio del selenito disminuye luego de las primeras 6 12 horas de incubacin, y adems porque no es favorable para la mayora de las cepas de Salmonella, que pueden no recuperarse. La nica ventaja de incubar durante 48 horas es el incremento de la recuperacin de Salmonella pullorum

Comentarios:
La preparacin de este medio, nos indica que no debemos autoclavar, esto es porque algunos componentes pierden su capacidad de seleccin; por lo que si se desea tener un medio totalmente estril se le agrega en algn caso verde de Malaquita, que se encarga de eliminar agentes contaminantes.

2. TRIPTEINA SOYA AGAR:


Medio utilizado para propsitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fundamento:
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos, aminocidos libres, bases pricas y pirimdicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta tambin carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.

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Adicionado con 5- 10% sangre, se logra un medio enriquecido y adecuado para observar reacciones de hemlisis. Instrucciones Disolver 40 g de polvo deshidratado por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 118 121C. pH final : 7.3 0.2

Frmula (en gramos por litro) Triptena Peptona de soya Cloruro de sodio Agar 15.0 5.0 5.0 15.0

3. M ENTEROCOCCUS AGAR:
M agar enterococcus, tambin conocido como agar de Azida, se utiliza para el aislamiento y la enumeracin de enterococos en agua y otros materiales de filtracin por membrana o la tcnica verter placa. Se utiliza en mtodos estndar para la deteccin de estreptococos fecales y enterococos utilizando la filtracin de membrana. Fue desarrollado por Slanetz para la enumeracin de enterococos por la tcnica filtracin de membrana. Una modificacin de m agar enterococcus, es la adicin de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). Este medio modificado result ser un medio superior al de filtracin de membrana, para el recuento de enterococos. El aumento de la recuperacin de colonias se obtuvo por incubacin de las membranas inoculadas en la superficie del agar en lugar de en las almohadillas con medio lquido saturado.

Fundamento:
La peptona proporciona nitrgeno, minerales y aminocidos. El extracto de levadura es la fuente de carbono y la dextrosa como suministros de vitaminas. El fosfato dipotsico funciona como amortiguador para el medio.

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El azida de sodio es el agente selectivo para suprimir el crecimiento de Gram negativos. El agar es el agente de solidificacin. El cloruro de tetrazolio (TTC) es el colorante usado como un indicador del crecimiento bacteriano; TTC se reduce a la forma insoluble dentro de la clula bacteriana resultando en la produccin de colonias de color rojo. Frmula (en gramos por litro) Triptosa Extracto de levadura Dextrosa Fosfato dipotsico Acida sdica Agar 2,3,5 cloruro de tetrazolio 20 5 2 4 0.4 10 0.1 pH final : 7.2 0.2 a 25C Suspender 42 g del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar a fondo. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto para que se disuelva por completo. No esterilice en autoclave. Enfriar a 45 50C y se distribuye en placas Petri Instrucciones

4. AGAR XLD (XILOSA-LISINA-DEXOCICOLATO):


El Agar XLD (xilosa-lisina-dexocicolato) es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el aislamiento y la diferenciacin de patgenos entricos Gram negativos ( Salmonella y Shigella) de muestras clnicas y no clnicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella (el Agar XLD fue desarrollado por Taylor). Los patgenos son diferenciados no solo de los no patgenos fermentadores de lactosa, sino tambin de varios patgenos no fermentadores de la lactosa o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de grmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente txicos.

Fundamento: La degradacin de los carbohidratos presentes en el medio XLD genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es prcticamente fermentada por todas las enterobacterias con excepcin de los microorganismos pertenecientes al gnero Shigella.
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La lisina se incluye para aumentar la diferenciacin de los microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella, ya que sin la lisina estos microorganismos rpidamente fermentan la xilosa produciendo la acidificacin del medio y no se pueden diferenciar de otras especies no patgenas. Como la cantidad de este carbohidrato es limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen, comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacin del medio; este hecho se evidencia porque el rojo fenol nuevamente vira a un color rojo. En el caso de los coliformes lisina positiva, para prevenir la alcalizacin del medio por la utilizacin de la lisina, se incorpora en el medio un exceso de lactosa y sacarosa. El medio tambin tiene la capacidad de detectar la produccin de H 2S, a travs del sistema indicador tiosulfato de sodio y citrato frrico amonio. Cuando el microorganismo produce H 2S se observan colonias con el centro negro. Los microorganismos no patgenos productores de H 2S no descarboxilan la lisina; cuando estn presentes estos microorganismos la reaccin cida producida por la utilizacin de los carbohidratos previene en ennegrecimiento de las colonias. El desoxicolato de sodio es utilizado como un indicador de los microorganismos Gram positivos.

Frmula (en gramos por litro) Xilosa L-Lisina Lactosa Sacarosa Cloruro de Sodio Extracto de Levadura Rojo Fenol Desoxicolato de sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Frrico de Amonio Agar 3,75 5 7,5 7,5 5 3 0,08 2,5 6,8 0,8 15 pH final = 7.4 0.2

Instrucciones

Suspender 57 g de medio en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con agitacin suavemente hasta que el medio llegue a ebullicin. Evitar el sobrecalentamiento ya que puede provocar la precipitacin del medio. Este medio no se puede esterilizar por autoclave. Enfriar a una temperatura entre 45 50C en un bao de mara y verter en placas de Petri estriles

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Bibliografa
Martos, P. G. (2006). Microbiologa Clnica Prctica. Prats, G. (2006). Microbiologia Clinica. Tortora, G. (2007). Introduccion a la Microbiologia.

Anexo
La evolucin de los medios de cultivo Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

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CONDICIONES PARA EL MEJORFUNCIONAMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados 2- consistencia adecuada del medio 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases 4- condiciones adecuadas de humedad 5- Luz ambiental 6- pH 7- Temperatura 8- Esterilidad del medio

DE MEDIOS DE CULTIVO atendiendo a su estado fsico: lquidos semislidos slidos atendiendo a su utilidad prctica:

Medios para aislamientos primarios: para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Medios para identificacin: diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin). Algunos smbolos a tener en cuenta :

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