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INTRODUÇÃO OBJETIVO Escolher a proporção de metanol:água mais adequada para ser utilizada como fase móvel na análise

. Separar e quantificar cafeína e teobromina em amostra de coca-cola. MATERIAIS - Refrigerante usado como amostra (Coca cola) - Água ultrapura - Metanol grau HPLC - Bécheres - Balão volumétrico 100,00 mL - Seringas - Microfiltros Equipamentos Cromatógrafo: SCL 10A VP, Schimadzu/Bomba: LC AT VP, Schimadzu. Coluna: C18 (fase reversa) – Macherey-nagel Detector: UV Visível (SPD-10AV) Válvula de Injeção: Rheodyne (20 μL). Agulha de injeção PROCEDIMENTO Preparo das soluções-padrão A partir de soluções-estoque 100 g/mL de teobromina e 100 g/mL de cafeína preparar 500 L as seguintes soluções-padrão: Padrão Cafeína 100 g/mL Teobromina 100 g/mL Água Deionizada 30 g/mL L L L 40 g/mL L L L 50 g/mL L L L Preparo da Amostra Transferir 50,00 mL de coca-cola, previamente degaseificada, para um balão volumétrico de 100,00mL. Adicionar 1 mL de cada uma das soluções de Carrez, agitar e deixar em repouso por 5 minutos. Completar o volume do balão com água ultrapura. Em seguida, centrifugar e filtrar a mistura utilizando o sistema seringa-microfiltro. Análise Cromatográfica - Ajustar a vazão da fase móvel para 0,6 mL/min.

mas com isso o tempo das análises aumentou.Com a fase móvel selecionada. fizemos uma nova tentativa onde foi usado 55% de metanol e 45% de água onde obtivemos um resultado satisfatório. resolveu-se diminuir o teor de metanol para aumentar a polaridade da solução.Para a otimização da fase móvel. RESULTADOS E DISCUSSÃO Preparo das soluções-padrão A partir de soluções-estoque 100 g/mL de teobromina e 100 g/mL de cafeína. injetar o padrão 30 g/mL.Ajustar o tempo de análise para 10 minutos. utilizando a proporção MeOH: . utilizando metanol:água como eluente (iniciar com 80 % de metanol).Ajustar o comprimento de onda do detector para 272 nm. com as seguintes quantidades: Padrão Cafeína 100 g/mL Teobromina 100 g/mL Água Deionizada 30 g/mL L L L 40 g/mL L L L 50 g/mL L L L Análise Cromatográfica Padrão 30 (80%) Padrão 30 (60%) Padrão 30 (55%) Padrão 40 (55%) Padrão 50 (55%) Coca Cola Comum Para a escolha da proporção da fase móvel foram testadas diferentes combinações. A primeira foi 80% de metanol e 20% de água. Por se tratar de uma coluna com fase reversa (C-18). . então foi realizado o mesmo processo em proporções diferentes com 60% de metanol e 40% de água. injetar as outras soluções-padrão e a amostra. a escolha da fase móvel foi a que tinha um sistema de solventes (metanol:água) com alta polaridade. .. . foram preparados 500 L das seguintes soluções-padrão. mas a separação ainda não foi eficiente. Por isso. houve uma boa separação e boa resolução. onde não separou bem os picos.

A solução Carrez II. Já a cafeína. T. garantindo assim a completa separação das substâncias analisadas. SKOOG. Estas soluções são utilizadas com objetivo de clariar amostras a serem analisadas. Construção da curva Concentração do padrão Área teobromina Área de cafeína 30 40 50 Solução de Carrez A solução de Carrez I: composta por acetato de zinco.C. NIEMAN. F. 5ª edição. A. Princípios da Análise Instrumental. A. TRUGO.H2O (55:45). (conforme a figura mostrada abaixo) o que a torna menos polar que a teobromina. nº 4. Quim. por possuir apenas dois grupos volumosos em sua estrutura (CH3). é a que sai primeiro da coluna. A teobromina é a que possui menor tempo de retenção. . ela é mais polar. possui três grupos volumosos (CH3). J.. Editora Bookman. 28. L. Vol. D. composta por hexacianoferrato de potássio.C. HOOLER. tendo maior afinidade pela fase estacionária. 2005. Nova. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MONTEIRO. M. 637-641. 2002. pois em relação a cafeína. Determinação de compostos bioativos em amostras comerciais de café torrado. logo. ficando assim mais tempo retida na coluna. que tem característica apolar.

17 de agosto de 2010. .DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM REFRIGERANTE À BASE DE COLA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ALUNOS RA Campinas.

Nesse trabalho. para isso será utilizada uma amostra obtida por LLE (extração líquido-líquido) fornecida por um segundo grupo e também uma amostra obtida por SPE (extração em fase sólida) preparada utilizando-se o refrigerante como amostra e fonte de cafeína. para solventes apolares. tendo em seu início trabalhos como o de Tswett. . que perceberam que com a diminuição do diâmetro das partículas da fase estacionária essa eficiência aumentava. [1] Na tentativa de se obter maior rendimento buscou-se diminuir esse tempo de eluição aplicando-se bomba de vácuo ou bombeamento de pressão. No final da década de 1960. onde as vazões eram muito baixas e os tempos de eluição eram longos. [1] O termo HPLC (do inglês High Performance Liquid Chromatography) designa esta técnica de cromatografia líquida a altas pressões e com o uso de fase estacionária com partículas de diâmetros de poucos micrômetros. da ordem de algumas horas. Esta técnica é muito útil devido à sua alta sensibilidade. Na operação do HPLC será usada a HPLC em fase reversa e detector espectrofotométrico por absorção de UV/Vis. Com a diminuição da partícula. foi usada uma fase estacionária que possuía diâmetro das partículas de 150 a 200 µm. Nesse experimento será estudada algumas técnicas de preparo de amostra que visam a extração e a préconcentração do analito. fez-se necessário utilizar pressões maiores para a eluição da fase móvel contendo a amostra. Um injetor de amostra e um detector [2]. mas os resultados não foram satisfatórios pois o aumento da vazão implicou em aumento dos pratos teóricos.Introdução A cromatografia líquida é atualmente uma das técnicas mais usadas de separação. entretanto a técnica básica para a produção de partículas menores ainda não era disponível. [1] A eficiência da separação era então um grande obstáculo para os cientistas. com o desenvolvimento dessa técnica. mesmo para amostras pouco voláteis (problema encontrado na cromatografia a gás). fácil adaptações para determinações quantitativas ou de espécies termicamente frágeis. Na HPLC usa-se uma coluna empacotada contendo a fase estacionária que freqüentemente é C18 como a fase apolar para solventes polares e sílica porosa como fase polar. onde foi usada colunas de vidro com diâmetros de 1 a 5 cm e comprimentos de 50 a 500 cm. pode-se produzir partículas de fase estacionária com diâmetros de 3 a 10µm.

e para a detecção.Metanol (MeOH) grau de pureza cromatográfico . Parte Experimental Reagentes e materiais: . antes da realização do mesmo.1 banho de ultrassom . bem como o emprego de cromatografia líquida em uma determinação quantitativa.2 balões volumétricos de 100 mL .1 bomba de vácuo .1 g de cafeína.3 balões volumétricos de 5 mL . .1 pipeta automática com volume variável de 100 a 1000 L .5 balões volumétricos de 10 mL . assim como a eficiência da extração. Para isso.1 pipeta volumétrica de 5 mL .1 sistema a vácuo para a extração em fase sólida . que visam a extração e a pré-concentração do analito. empregou-se a extração líquido-líquido (LLE) e também a extração em fase sólida (SPE).Água purificada em sistema Milli – Q (18.6 mm) . de comprimento de onda variável.2 MΩ). visou-se demonstrar ao aluno a possibilidade do uso de diferentes métodos para a preparação de amostra. em água purificada em sistema Milli-Q (18.Balança analítica Amostras de refrigerante a base de cola .1 pipeta automática com volume variável de 10 a 100 L .Padrão de cafeína .2 seringas de 1 mL . Para o preparo da solução estoque de cafeína de 1000 mg L-1 foi utilizado 0.3 cartuchos C18 (5.8 x 4.2 MΩ) Preparo das soluções: O preparo da fase móvel (MeOH/H2O 40:60 v/v) foi realizada pelo técnico responsável pelo experimento. que foi dissolvida em um balão volumétrico de 100 mL. Nesse experimento também estabeleceu-se alguns parâmetros de validação do método. e a determinação da concentração da cafeína presente em um refrigerante de cola empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa..1 proveta de 100 mL .Objetivos Nesse experimento.1 cromatógrafo a líquido com detector UV .1 proveta de 500 mL . a utilização de um detector espectrofotométrico por absorção no UV – Vis.

A etapa de extração líquido-líquido (preparação da amostra) foi feita por outro grupo. juntamente com água purificada em sistema Milli-Q (18. a amostra foi levada para análise no HPLC. As concentrações das soluções padrões foram iguais a 400. com bomba reciprocante adequada para análise por gradiente. Vazão: 1.0 mL min-1. Condições cromatográficas:         Cromatógrafo líquido modelo Shimadzu Prominence.6 mm x 250 mm x 5 m). Após a preparação. injetor automático e detector UV – visível com arranjo de diodos (UV-DAD). . Tempo de corrida: 8 minutos. e esse espectro foi previamente obtido pela monitora da prática.8 x 4. Cada solução padrão foi injetada apenas uma vez. 1200. à partir de uma solução padrão. Para o experimento.6 mm) conforme a figura abaixo. Procedimento: Para a construção da curva analítica. Preparo das amostras: Inicialmente transferiu-se 150 mL do refrigerante para um béquer de 250 mL. Para a preparação das soluções padrão de cafeína foram utilizados balões volumétricos de 10 mL. Temperatura: Ambiente. e para diluir os padrões foi utilizado fase móvel MeOH/H2O (40:60 v/v). e em seguida foi colocado em banho de ultrassom para degaseificação do refrigerante (aproximadamente por 20 minutos). Volume da alça de amostragem do injetor : 20 L. Após a degaseificação. 800. feito em duplicata para a amostra e foi feito um branco.2 MΩ). aferiu-se o volume do balão com água destilada.A solução de trabalho de cafeína foi preparada à partir da solução feita anteriormente em um balão volumétrico de 100 mL. para o ajuste do detector do cromatógrafo. Detecção: de acordo com o espectro UV. pipetou-se 5 mL do refrigerante e transferiu-se para um balão volumétrico de 50 mL. e com o auxílio de uma seringa injetou-se um volume equivalente a 3 vezes o volume da alça de amostragem de cada solução padrão no cromatógrafo. foi utilizada as soluções padrão de concentração 400 a 2000 g L-1. 1600 e 2000 g L-1. Fase Móvel: MeOH/H2O (40:60 v/v). foi necessário saber o comprimento de onda de máxima absorção. Fase Estacionária: C18 (4. Na extração em fase sólida (SPE) foi utilizado um cartucho C18 (5. utilizando 50 mL de água destilada na extração.

. Foram anotados os tempos de retenção e a área dos picos. tanto la extração líquido-líquido. A extração foi feita em quatro etapas fundamentais: condicionamento do cartucho (que é feito através da passagem de 5 mL de metanol. para a detecção dos picos. aferiu-se o balão com uma solução metanol:água (40:60 v/v). adição da amostra. quanto na extração em fase sólida (SPE). equivalente a 3 vezes o volume da alça de amostragem desta mistura deve ser injetado no cromatógrafo com auxílio de uma seringa. de todas as injeções. adicionou-se ao cartucho um volume de 3 mL da solução metanol:água (40:60 v/v). e uma alíquota de 200 L da amostra foi transferida para um balão de 10 mL e completada com solução metanol:água (40:60 v/v). durante o experimento. o cartucho de extração não seque. Assim. e o eluato contendo a cafeína foi recolhido em uma balão volumétrico de 5 mL.5 mL min-1). o cartucho deve ser lavado com 5 mL de água deionizada. Um volume. Em seguida. seguido de 5 mL de água deionizada a uma vazão aproximada de 2. A etapa de extração e pré-concentração foi feita passando-se os 50 mL da amostra pelo cartucho na vazão aproximada de 10 mL min-1. É importante que.Figura 1: Esquema de montagem do sistema de extração em fase sólida (SPE). Finalmente. lavagem e eluição do analito.

em que a fase móvel utilizada foi metanol e água. na proporção 40:60. visto que esse tem uma seletividade maior (por possuir menos moléculas que podem absorver a energia. dois comprimentos de onda que possuem um máximo de absorção em 206 nm e outro em 273 nm.03407 ---------------------------------------------------------- . 1600 e 2000 g/L. que foram separadas por HPLC em fase reversa.626 15. podendo ser interferentes). A curva analítica encontrada está na Figura 140000 120000 100000 Área do Pico 80000 60000 40000 20000 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 Concentração g/L Figura 2: Curva Analítica para as concentrações padrão de cafeína Regressão Linear: Y=A+B*X Parâmetro Valor Erro ----------------------------------------------------------A -8616. 800. foram preparadas soluçõespadrão de cafeína. de concentrações 400.6 20255. utilizamos o comprimento de onda mais alto. Assim. 1200.2681 ----------------------------------------------------------R SD N P ----------------------------------------------------------0.79287 5 0. 273 nm. ou seja. para determinarmos a cafeína.42805 B 56.90606 19312.Análise e Discussão dos Resultados Seleção do comprimento de onda: Vemos no espectro de absorção encontrado para a cafeína. Curva Analítica: No início do experimento. no UV-visível.

Assim. ressaltando que este valor deve ser o mais próximo possível de 1. e este deve ser definido por no mínimo 5 pontos. Normalmente. observamos a qualidade da curva obtida. foi obtida uma boa qualidade na curva analítica.90606 para r (visto na tabela no gráfico da curva analítica). essa resposta é corrigida para o valor obtido com o branco no instrumento. Vale lembrar que a ANVISA. vários padrões que contêm concentrações conhecidas do analito são introduzidos no instrumento. Quanto maior o ângulo de inclinação. Para observarmos a linearidade. r>0.6. É dada pela variação no sinal de resposta pela variação da unidade de concentração do analito (ou seja. a inclinação da curva analítica). Parâmetros: Linearidade: Por linearidade entendemos o quanto um gráfico da curva de calibração segue uma linha reta. e assim termos a relação matemática entre o sinal medido e a quantidade do analito (essa relação é determinada a partir dos sinais medidos). Como em nosso experimento obtivemos o valor de 0. da forma Y = AX + B. em que A = 56. por exemplo. Sensibilidade: Está relacionada com o grau que o método está livre de interferência de outras espécies contidas na matriz da amostra. devemos ver se a concentração é proporcional à área (ou seja. isso nos mostra se a curva é linear. se obedece a lei de beer). observamos que maior a sensibilidade (maior incremento da resposta do detector) refletindo em uma maior área ou altura do pico. Obtemos assim. Y = área do pico e X = concentração da amostra.90. ou seja.626. com os dados obtidos.99 e o INMETRO. recomenda r = 0. e os termos a. Para testar a linearidade. afim de medir os sinais para as quantidades conhecidas do analito. b são determinados através de uma regressão linear.A curva analítica anterior pode ser descrita por uma equação linear. a linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados que sejam diretamente proporcionais à quantidade do analito. Assim. B = -8616. a equação de reta da curva analítica. dentro de uma determinada faixa de aplicação do mesmo. um gráfico com a resposta do instrumento corrigida versus concentração do analito é feito. podemos observar que o método utilizado para o experimento é . pois assim a dispersão do conjunto de pontos experimentais e a incerteza dos coeficientes de regressão estimados são menores. ainda podemos usar do seguinte critério: a interseção com o eixo y da curva de calibração (após subtrair a resposta do branco para cada padrão) deve ser o mais próximo possível de zero. verificamos que dentro das expectativas. Também. para que se possa minimizar os erros. Assim. através do coeficiente de correlação r. Dessa forma.

sensível.626). pois foi obtido um bom coeficiente angular da curva analítica (56. e com pequenos incrementos de concentração. . obtiveram-se variações significativas em termos de área.

a medição torna-se menos precisa. e outras linhas são desenhadas paralelas no gráfico. e que a relação linear y = ax +b é válida. Dessa forma. quando ele decresce. deve-se construir uma curva analítica com medidas em replicatas. a precisão e a exatidão exigidas. há a formação de dímeros diminuindo a absorbância. O LOQ pode ser . para uma maior precisão. para 95% e 105% da linha da faixa linear. Visto que o detector tem algumas limitações em concentrações muito altas ou muito baixas. portanto. com as concentrações correspondentes no eixo x. Um gráfico é construído à partir do cálculo dos coeficientes de regressão (que deve ser realizado com bastante cuidado.626 LOD = 1125. uma maior concentração deve ser registrada para o LOQ.49 g/L Limite de Quantificação (LOQ): A determinação do LOQ represente um compromisso entre a concentração.626 LOD = 3. diminuindo possíveis erros que poderiam afetar os parâmetros quando é realizada apenas uma injeção. Limite de Detecção (LOD): Toda técnica analítica tem um limite de detecção. através dessas respostas relativas (eixo y). uma linha horizontal sobre toda a faixa linear. É dada do LOQ até o último ponto da curva. Obtém-se assim. O método é linear até o ponto onde a resposta relativa intercepta a linha de 95 ou 105%. verificação que pode ser feita baseando-se em relações geométricas do gráfico de regressão ou por dividir os dados do inal pelas suas respectivas concentrações. constrói-se o gráfico. É um sinal dez vezes maior que o ruído. É dado por: LOD = 3.Faixa Linear: O intervalo de quantidade de analito em que se pode construir uma curva analítica linear . é chamado de faixa linear. para que os pontos obtidos fossem mais representativos de uma concentração. resultando em respostas relativas).. 79287/56. verificando se todos os pontos utilizados estão dentro da faixa linear correspondente. 79287 e S = 56.3 x s/S s = estimativa do desvio padrão da resposta (que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco. E. que pode ser definido como a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de confiança. da equação de linha de regressão ou do coeficiente linear da equação) S = inclinação ou coeficiente angular da curva analítica Sendo s = 19312. Preferencialmente. o que pode ser estendido se forem testadas concentrações maiores.3 x 19312.

59 g/L .626 LOQ = 10 x 19312. 79287 e S = 56.determinado por: LOQ = 10 x s/S s = relação sinal – ruído ou a relação entre a estimativa do desvio padrão da resposta S = inclinação da curva analítica Sendo s = 19312.626 LOQ = 3410. 79287/56.

Verificamos que os valores obtidos para LOD e LOQ são muito altos. para evitar erros do tipo.2 1202. em um curto intervalo de tempo (no mesmo dia por exemplo). 26 Média 1590. Precisão intra-dia: É avaliada através do cálculo de desvio padrão relativo RSD = SD/CMD (x100).1 1796.5 1182. em que SD é o desvio padrão intra-dia e CMD é a concentração média determinada. como por exemplo.8 1900.20 RSD (%) Recuperação (%) Tabela 1: Resultados que foram obtidos nas análises das amostras de cafeína por SPE e LLE.5 291. Dessa forma. o que afetou a linearidade da curva e gerou um desvio padrão maior que o esperado. 49 1489.0 1761. picos maiores aumentam a relação sinal-ruído.8 1670. . Essa precisão intra-dia refere-se ao coeficiente de variação obtido por repetição do método com o mesmo analista. Tanto o LOD quanto o LOQ podem ser afetados pelas condições cromatográficas.5 1648.2 115. é estaticamente mais confiável calcular o LOD q o LOQ baseando-se nos parâmetros da curva analítica. utilizando o mesmo equipamento e os mesmos reagentes. Amostra spe1 spe2 sp3 lle1 (75mL) lle2 (75mL) lle3 (75mL) lle1 (25mL) lle2 (25mL) lle3 (25mL) Área do Pico 100190 84714 59447 91131 58327 77725 85955 93191 99015 Concentração (g/L) 1921. como problemas na coluna. e isso pode ser atribuído a erros.6 SD 363. problemas no preparo das soluções padrão.7 1789. resultando em LOD e LOQ mais baixos.2 1524.

5ª Edição.C. Harris. Skoog. Nieman. D. ou talvez ao erro do operador. cada amostra foi preparada por um operador (aluno) diferente. pela análise do valor de r (coeficiente de regressão). F. A. 2005.. “Análise Química Quantitativa”. Bibliografia 1.. Holler. T. 2002. percebeu-se que esta não obedecia muito bem a equação de uma reta. pois como se tratava de um laboratório de ensino. Rio de Janeiro. D. 6ªEdição. o que gerou discrepância. No caso das amostras.A. e isso pode ser atribuído ao fato de ter ocorrido erros no preparo das soluções-padrão.90606. 2. mas está de acordo com o valor estipulado pelo INMETRO. Editora Bookman. Essa perda na linearidade pode ser atribuída à coluna. “Princípios de Análise Instrumental”. Também.Conclusão Na análise da curva analítica. .. Editora LTC. que é 0. a reprodutibilidade não foi boa. J. observamos que este não está de acordo com o valor estipulado pela ANVISA.