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CITOQUIMICA

APLICADA A LA HEMATOLOGIA

Bqca. Ivan Mara Victoria Hematologa Clnica 2012

La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales pesados, sustancias orgnicas molculas de depsito y otras sustancias.

MORFOLOGA <-----> BIOQUMICA


Son un complemento de las tinciones hematolgicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias

inorgnicas. As se mejora la diferenciacin celular. Tambin sirven para el diagnstico

CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS 70-80%

CITOMORFOLOGIA.

CITOQUIMICA.

90-95%

INMUNOFENOTIPO MAS MICROSC. ELECTRN. CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

99-100%

MUESTRAS UTILIZADAS
EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA PUNCION DE MDULA SEA PUNCION DE GANGLIOS LCR

TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:
Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se

pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales.


Atendiendo al momento en el que empezaron a ser

utilizadas para el Dx hematolgico, se dividen en tradicionales y especiales.

TINCIONES VITALES Y NO VITALES

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES


Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las

estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos (azul de metileno). coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante (Sudn III)

Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las

Colorantes neutros: neutros son sales de un cido y de una base

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por

Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas.


Una coloracin es panptica cuando se utilizan

sucesivamente sustancias colorantes neutras. (MayGrnwald-Giemsa)


Y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias

colorantes neutras juntas (azul de metileno, eosina, Wright)

Las reacciones citoqumicas pueden tambin clasificarse segn el mecanismo qumico involucrado 1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mnimo pero no un mximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccin contina y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores errneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rpidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

CLASIFICACION DE LAS TCNICAS CITOQUMICAS


CITOQUMICA CLSICA

CITOQUMICA ELCTRNICA

CITOQUMICA FLUORESCENTE

INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUMICA AUTOMATIZADA

Citoqumica Clsica: Se fundamenta en reacciones coloreadas

que pueden observarse e interpretarse con el microscopio ptico comn. de elevada sensibilidad

Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica,
se fijan sobre distintas estructuras de las clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores

Inmunocitoqumica no fluorescente:Se basa en la marcacin Fisicocitoqumca electrofortica Permite reconocer

de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.

determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos, mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoqumica automatizada:

CITOQUIMICA ELECTRONICA:

CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

INMUNES

NO INMUNES

INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE
Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante despus se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta concentracin de protena como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los anticuerpos. La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de hidrgeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio tico.

CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

Definicin de reaccin citoqumica


Es la reaccin que por el mtodo de uno o mas reactivos qumicos: aplicados a la clula en condiciones definidas; determina la formacin de productos coloreados; insolubles; no difusibles; que permiten el reconocimiento microscpico; de sustancias o grupos qumicos definidos; en su real ubicacin citolgica; para lo cual no deben destruir a la clula, y si lo hacen deben reemplazar a la sustancia identificada en su topografa

Las finalidades primordiales de la citoqumica son:


El reconocimiento y diagnostico celular El estudio de la fisiologa y la fisiopatologa celulares El Dx de la patologa

ESTANDARIZACION DE METODOS EN CITOQUIMICA


Preparacin estricta de los reactivos Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos Realizacin, la fijacin y conservacin adecuada de los preparados y

reactivos
Determinacin de tiempos exactos para cada uno de los pasos dem de temperatura (especial para enzimas) Tiempo y condiciones de la inmersin para la lectura Dimetros y conservacin idneos de los elementos sobre los cuales

se lleva a cabo la determinacin

Tres pasos fundamentales:


Fijacin: preservar las estructuras y reactividad funcional de las

clulas.

Incubacin en el medio de reaccin: como consecuencia se generan

productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de

reaccin .

Las reacciones deben tener 3 caractersticas:

sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

Pueden ser reconocibles.


SUSTANCIAS RECONOCIBLES: 1-DNA Y RNA. 2-PROTEINAS. 3-HEMOGLOBINA. 4-HIDRATOS DE CARBONO. 5-LIPIDOS. 6-FOSFOLIPIDOS. 7-METALES ENZIMAS RECONOCIBLES 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO) 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL) 3-FOSFATASA ACIDA (FAC) 4-ESTERASAS (EST) 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR) 6-DEHIDROGENASAS (DH)

CITOQUIMICA CLASICA
reconocimiento por:
principios no enzimticos Hidratos de carbonos: PAS Fe hemosidernico: PERLS Lpidos: Red Ol/Sudan Black Hemoglobina fetal: elucin acida MPO FAL FAL ESTEARASAS CATALASAS ENZIMAS HIDROLITICAS principios enzimticos

TINCIONES CLASICAS
1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

TINCIN DE PAS (Peryodic Schiff Acid)


Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la accin del cido perydico, potente agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso.

-C-C-

ALDEHIDOS

PURPURA

ACIDO PERYODICO

SCHIFF

RESULTADOS: clulas (+) con patrn difuso fucsia


intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie
Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie mieloide Basfilos: (+) con patrn lacunar o () hasta un 50% Serie eritroide normal: negativa Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un

patrn difuso mas granular o bloques

Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el

que un 30% es (+) en corona de grnulos

NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES

MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES

LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)

LMA6 en MO PAS (+)

TINCION DE PERLS
Se basa en la liberacin de los iones frricos de su

unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico.
Por esta reaccin se detecta el Fe

hemosidernico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad en la acumulacin de Fe en las mitocondrias (azul de Prusia)

HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parmetros:

n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofgico. Bsicamente se presentas 3 patrones: 1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con sobrecarga frrica. 2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o ausente: es el patrn caracterstico de la anemia ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance frrico negativo. 3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

Hemocromatosis (cortes histolgicos de hgado)

HEMOGLOBINA FETAL
Test de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos. Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.

Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguneo Rh(-).

SUDAN BLACK / RED OIL


Ambas se utilizan para la deteccin de lpidos, en el caso del Sudan Black este tie los fosfolpidos y esteroles de membrana de los grnulos.
Es un colorante lipofilo que se une de forma irreversible a

un componente granular indefinido en los granulocitos, en los eosinofilos y en algunos monocitos.

El producto de la reaccin es negro y granular

Tie tanto los grnulos azurfilos inespecficos como los especficos de los neutrofilos

LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin de las clulas en maduracin y de los grnulos de los eosinofilos anormales.

2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

MIELOPEROXIDASA
La demostracin citoqumica de esta enzima se basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de perxido de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reaccin.

BENCIDINA

H2O2 MPO

Resultados. siempre patrones granulares!


ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol) GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrn granular intenso en

toda la serie granuloctica mieloide y en menos del 3% de los blastos en MO. Los blastos mieloides dan un patrn caracterstico polar, en casquete.

EOSINFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo

conserva la coloracin parda.

BASFILO (+) en 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: (+) patrn granular escaso o disperso

NORMALES. .

PATOLOGICOS

ESTRES OXIDATIVO Scorificacin de MPO en granulocitos:


Se categorizaron los neutrfilos de acuerdo al contenido de grnulos presente en

el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.


Grado 1: Escasas granulaciones teidas dispersas (fig.3 y 4)

Grado 0: Sin granulaciones teidas. (fig. 1 y 2)

Scorificacin de MPO en granulocitos:


Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el ncleo (fig. 5) Grado 3: abundantes granulaciones teidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el ncleo. (fig.6 )

Scorificacin de MPO en granulocitos:


Grado 4: granulaciones que cubren la clula completamente dndoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

FOSFATASA ALCALINA
La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a ph

alcalino y acta sobre grupos esteres fosforados liberando el ion fosfato.


La actividad de la FA granuloctica es marcadora de la

granulacin especifica de los neutrfilos.


Inicialmente se pens que la FA estaba localizada en grnulos

especficos (secundarios), pero se demostr que esta asociada con un componente membranoso del citoplasma identificado como una estructura tubular de forma irregular distinta de los grnulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmticas.

Alfa-naftil fostato
ph alcalino FAL

naftilo
Colorante diazoico

fosfato

Compuesto diazotado

Cuidados: Efectuar la reaccin en frotis de no mas de 24 hs. Conservar los preparados en heladera envueltos en papel absorbente con un desecador. Ph de la reaccin

Se encuentran actividad FA en algunas clulas maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)

La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma

ndice de actividad de FAL


Es la suma de los grados de positividad de 100 neutrfilos. Score: 95+/-20

Grado 0: sin reaccin Grado I: coloracin difusa o con pequeos puntos

coloreados
Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general

en la zona del hilio nuclear.


Grado III: mayor granulacin oscura, tie todo el

citoplasma.
Grado IV: completamente oscuro

FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato.
La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los sndromes linfoproliferativos crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dnde existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin centrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida (+) tartrato resistente

LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

ESTEARASAS
4 sustratos:
Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato -naftil-acetato -naftil-butirato

hidrolizados sal diazoica

precipitado insoluble

ESTERASAS
Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar steres en sus componentes cidos y alcoholes. Existen diferentes variedades segn el substrato empleado.

GR y su progenie Naftil butirato/ acetato Naftil cloro acetato Normales (-) (+) M6

Granulocitos y su progenie (-) o con algunas granulaciones F Resit (+++++)

Linfocitos y su progenie (-) o + dbil

Monocitos y su progenie (+++++) Fluoruro sensible (+)

Idem

(-)

LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS: monoblastos teidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrfilo teido de azul (cloroacetoesterasa)

EN RESUMEN..
Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos Mb Seg PAS Lbl Lin Mbl Mon Mg Pq PEbl GR

Fe

MPO

FAL

FAC

ANAE

NCAE

Sudan Black

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