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APLICADA A LA HEMATOLOGIA
La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos: enzimas, metales pesados, sustancias orgnicas molculas de depsito y otras sustancias.
CITOMORFOLOGIA.
CITOQUIMICA.
90-95%
99-100%
MUESTRAS UTILIZADAS
EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA PUNCION DE MDULA SEA PUNCION DE GANGLIOS LCR
TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:
Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se
Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.
estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos (azul de metileno). coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante (Sudn III)
Las reacciones citoqumicas pueden tambin clasificarse segn el mecanismo qumico involucrado 1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mnimo pero no un mximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccin contina y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores errneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rpidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.
CITOQUMICA ELCTRNICA
CITOQUMICA FLUORESCENTE
INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE
CITOQUMICA AUTOMATIZADA
que pueden observarse e interpretarse con el microscopio ptico comn. de elevada sensibilidad
Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica,
se fijan sobre distintas estructuras de las clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores
de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.
determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos, mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.
Citoqumica automatizada:
CITOQUIMICA ELECTRONICA:
CITOQUIMICA FLUORESCENTE:
INMUNES
NO INMUNES
INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE
Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante despus se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta concentracin de protena como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los anticuerpos. La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de hidrgeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio tico.
CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:
reactivos
Determinacin de tiempos exactos para cada uno de los pasos dem de temperatura (especial para enzimas) Tiempo y condiciones de la inmersin para la lectura Dimetros y conservacin idneos de los elementos sobre los cuales
clulas.
reaccin .
CITOQUIMICA CLASICA
reconocimiento por:
principios no enzimticos Hidratos de carbonos: PAS Fe hemosidernico: PERLS Lpidos: Red Ol/Sudan Black Hemoglobina fetal: elucin acida MPO FAL FAL ESTEARASAS CATALASAS ENZIMAS HIDROLITICAS principios enzimticos
TINCIONES CLASICAS
1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS
-C-C-
ALDEHIDOS
PURPURA
ACIDO PERYODICO
SCHIFF
TINCION DE PERLS
Se basa en la liberacin de los iones frricos de su
unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico.
Por esta reaccin se detecta el Fe
Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad en la acumulacin de Fe en las mitocondrias (azul de Prusia)
n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofgico. Bsicamente se presentas 3 patrones: 1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con sobrecarga frrica. 2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o ausente: es el patrn caracterstico de la anemia ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance frrico negativo. 3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.
HEMOGLOBINA FETAL
Test de Kleihauer-Betke
La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos. Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.
Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguneo Rh(-).
Tie tanto los grnulos azurfilos inespecficos como los especficos de los neutrofilos
LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin de las clulas en maduracin y de los grnulos de los eosinofilos anormales.
MIELOPEROXIDASA
La demostracin citoqumica de esta enzima se basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de perxido de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reaccin.
BENCIDINA
H2O2 MPO
toda la serie granuloctica mieloide y en menos del 3% de los blastos en MO. Los blastos mieloides dan un patrn caracterstico polar, en casquete.
BASFILO (+) en 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: (+) patrn granular escaso o disperso
NORMALES. .
PATOLOGICOS
FOSFATASA ALCALINA
La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a ph
especficos (secundarios), pero se demostr que esta asociada con un componente membranoso del citoplasma identificado como una estructura tubular de forma irregular distinta de los grnulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmticas.
Alfa-naftil fostato
ph alcalino FAL
naftilo
Colorante diazoico
fosfato
Compuesto diazotado
Cuidados: Efectuar la reaccin en frotis de no mas de 24 hs. Conservar los preparados en heladera envueltos en papel absorbente con un desecador. Ph de la reaccin
Se encuentran actividad FA en algunas clulas maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)
La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma
coloreados
Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general
citoplasma.
Grado IV: completamente oscuro
FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato.
La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los sndromes linfoproliferativos crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dnde existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.
El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin centrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.
LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.
ESTEARASAS
4 sustratos:
Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato -naftil-acetato -naftil-butirato
precipitado insoluble
ESTERASAS
Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar steres en sus componentes cidos y alcoholes. Existen diferentes variedades segn el substrato empleado.
GR y su progenie Naftil butirato/ acetato Naftil cloro acetato Normales (-) (+) M6
Idem
(-)
LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS: monoblastos teidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrfilo teido de azul (cloroacetoesterasa)
EN RESUMEN..
Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos Mb Seg PAS Lbl Lin Mbl Mon Mg Pq PEbl GR
Fe
MPO
FAL
FAC
ANAE
NCAE
Sudan Black