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El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas: Se evita los procesos de aislamiento y purificacin enzimtica. Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celular natural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente la vida til del sistema permitiendo la reutilizacin del material cataltico. El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar una ptima actividad, adems de brindar buenas condiciones de temperatura y pH. Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimticas.
Inmovilizacin celular
Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo Sencillez de preparacin Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparacin Bajo costo Alta resistencia mecnica Baja o nula interferencia en los procesos de purificacin de productos Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos de produccin y/o biotransformacin
Inmovilizacin celular
Adsorcin a soportes inertes Bolillas de vidrio Virutas de madera, etc Inclusin en estructuras preformadas Biorreactores de fibra hueca Espumas de poliuretano Membranas de nylon
+
n
CaCl2
Ca
OO O O O O O OO O
Ca
O-
O O O O OO
Ca
OO O O O O O OO O
Ca
O-
O O O O OO
Ca
Ca
Solucin de Ca++
Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial producidos en sistemas de clulas vegetales inmovilizadas
Especie
Catharanthus roseus Catharanthus roseus Catharanthus roseus
Matriz
Agarosa Alginato Alginato
Producto
Catelamina Alcaloides indlicos Ajmalicina
Comentarios
Suministro ajmalicina Prolonga capacidad biosinttica Prolonga estabilidad y capacidad biosinttica (220 dias con cambio de medio) Prolonga estabilidad y capacidad biosinttica (180 dias con cambio de medio) de
Catharanthus roseus
Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial producidos en sistemas de clulas vegetales inmovilizadas
Especie
Daucus carota
Matriz
Alginato
Producto
5--hidroxidigitoxigenina fenoles
Comentarios
Tcnica: Suministro de precursor (digitoxigenina) No hay variaciones con respecto a cultivos no inmovilizados
Daucus carota
Alginato
Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial producidos en sistemas de clulas vegetales inmovilizadas
Especie
Digitalis lanata
Matriz
Alginato
Producto
Comentarios
Digitalis lanata
Alginato
Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial producidos en sistemas de clulas vegetales inmovilizadas
Especie
Beta vulgaris Capsicum frutescen
Matriz
Nylon
Producto
Betacianina
Comentarios
Incrementa acumulacin Incrementa rendimiento
Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial producidos en sistemas de clulas vegetales inmovilizadas
Solanum
Especie
Morinda citrifolia Talictrum minus Solanum surretense Lithospermun erithrorhysum
Matriz
Alginato Alginato Alginato Fibra hueca
Producto
Comentarios
Antraquinonas Incrementa acumulacin intracelular Berberina Solasodina fenoles Incrementa liberacin Incrementa liberacin Incrementa rendimiento.
El empleo de clulas inmovilizadas ofrece una serie de ventajas vinculadas al estado fisiolgico y al diseo y modo de operacin del proceso fermentativo. El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generacin de gradientes fsicos y qumicos que conducen a un mayor grado de diferenciacin. Al estar minimizada la tasa de reproduccin celular la inestabilidad gnica se disminuye notablemente. Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante cuando la produccin esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial
Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y produccin facilitando el empleo de estrategias como la elicitacin bitica y abitica o la permeabilizacin para incrementar la produccin Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento para mantener la viabilidad y capacidad biosinttica. las clulas inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolucin sin riesgo de lavado de los cultivos Es posible controlar el tamao de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulacin y/o produccin de metabolitos.
Con la biomasa entrampada es ms sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo ms comn es realizar una de crecimiento previo a la inmovilizacin y la segunda de produccin inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria. En cultivos inmovilizados se facilita la remocin de inhibidores metablicos se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte
Con inmovilizacin es posible lograr: sistemas de produccin de metabolitos de una vida til prolongada puesto que se puede reutilizar la biomasa y realizar una recuperacin continua de los productos. Es posible inducir la liberacin al medio extracelular los metabolitos de inters que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la produccin de compuestos secundarios y la realizacin de procesos de bioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio de cultivo.
Races transformadas
Ginsensidos Panax ginseng Rotenona Vincristina, vinblastina Quinina, quinidina Reserpina Derris elliptica Catharantus roseus Cinchona Rauwolfia
Agrobacterium rhizogenes .
Bacteria del suelo gram negativa causa la enfermedad de las races en cabellera
Agrobacterium tumefaciens
La infeccin de muchas especies in-vitro con el microorganismo patgeno Agrobacterium rhizogenes permite obtener clones de races estables y en condiciones axnicas
Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosinttica de las races de las plantas que les dieron origen
Las races neoplsicas producidas por A. rhizogenes se caracterizan por : su alto ndice de crecimiento y su estabilidad gentica
Estos cultivos producen niveles de metabolitos secundarios comparables a las plantas intactas
Opinas Auxinas
TR
Genes Rol A, B, C y D
TL
Origen de Replicacin
El T-ADN es el sector del plsmido que se transfiere a las clulas husped Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales para la transferencia En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL) Ambas codifican para funciones rizognicas una vez integradas a la clula husped La regin TR especifica la sntesis de agropinas y auxinas Regin TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D) implicados en el desarrollo morfolgico de las races mediante la sensibilizacin de las clulas al efecto auxnico El gen rol D induce la formacin de tejido de callos mientras que los genes rol A, B y C regulan el tamao, grado de ramificacin, alteraciones de tropismo y dems caractersticas de las races en cabellera
Hairy roots are fast growing and plagiotropic They require no external supply of growth hormones
The plagiotropic characteristic is advantageous as it increases the aeration in liquid mediumand roots grown in air have an elevated accumulation of biomass.
Una vez establecidos los cultivos de races transformadas se pueden desarrollar a partir de pequeos inculos y obtener buenos ndices de crecimiento.
El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales ya que la agitacin mecnica causa injurias que conducen a la formacin de callos.
En los medios lquidos se forman esferas de races con las raicillas jvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazn de tejido viejo en el interior
La restriccin nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxgeno da origen a un bolsillo de tejido senescente Debido a las ramificaciones las races forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro de oxgeno.
Las principales ventajas de utilizar cultivos de races transformadas, en cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de cultivos dediferenciados son:
Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con fitorreguladores para desarrollar biomasa Las races transformadas crecen rpidamente, son robustas y vigorosas Sintetizan metabolitos secundarios caractersticos de las races de las plantas de las cuales provienen La sntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que, a diferencia de los cultivos de clulas indiferenciadas, son genticamente estables por perodos prolongados de cultivo El cultivo masivo de races transformadas es sencillo y tiene potencialidad para desarrollarse en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicacin industrial de estos procedimientos