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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA
BIOQUÍMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
Mg. Liz Andrea Gutierrez Quequezana
Mg. Jakeline Zanabria Galvez

AREQUIPA – PERÚ
2012

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto de hacer llegar al
interesado los alcances actuales de la bioquímica aplicada en el laboratorio.
Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el
desarrollo de la biología molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la
bioquímica como consecuencia natural.
La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica han determinado el
gran impulso que la bioquímica aplicada ha dado a la nueva tecnología de los bioprocesos.
Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el conocimiento previo
de la biología y de la bioquímica aplicada.
La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de Ingeniería Química las
destrezas básicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio
práctico de la bioquímica.

Los Autores

ÍNDICE
PROLOGO
ÍNDICE
PRÁCTICA 1: DETERMINACIÓN
PROTEÍNAS.
PRÁCTICA 2: CONCENTRACIÓN
DIÁLISIS.

ESPECTROFOTOMÉTRICA
DE

EXTRACTOS

PROTEICOS

DE
POR

PRÁCTICA 3: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL.
PRÁCTICA 4: SEPARACIÓN EN
AMINOÁCIDOS.

CAPA

FINA

DE

UNA

MEZCLA

DE

PRÁCTICA 5: REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS.
PRÁCTICA 6: DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS
PROTEÍNAS.
PRÁCTICA 7: METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.
PRÁCTICA 8: INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION
DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae INMOVILIZADA.
PRÁCTICA 9: EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES.
PRÁCTICA 10: DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.
PRÁCTICA 11: CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.
PRÁCTICA 12: EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.

La curva de calibración obtenida por este método. debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta. Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu+2 y las diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo tanto. Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen un color violeta Característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solución alcalina. se puede utilizar una proteína como patrón de calibración.PRÁCTICA 1 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS I. El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir enlaces químicos entre los pares de electrones libres del átomo de nitrógeno presente en los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas con el ion cobre. se . OBJETIVO Determinar la concentración de una solución de proteínas mediante la reacción de Biuret y el espectrofotómetro FUNDAMENTO: La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. II. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solución alcalina.

por lo que 1 se puede ignorar. cuya concentración es de 8 mg/mL preparada con agua destilada. La mayoría de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor. y de un detector. Espectrofotometría. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide en nm. Principios básicos La reacción de biuret es cuantificable.hará utilizando como patrón solución de peptona. Así la concentración desconocida de la sustancia será: C = Abs /e . Para ello se aplican técnicas fotométricas. C es la concentración de la muestra a medir (M). Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. mayor intensidad de color violeta. empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores). Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm. que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. es decir a mayor concentración de proteínas. que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir. se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz (a la longitud de onda de máxima absorbancia). que corresponden a los colores del arcoíris. Para cada sustancia determinada. de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una longitud de onda específica. de una longitud de onda determinada. 1 el espesor de la muestra. estas reacciones en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas. La luz es parte de la radiación electromagnética. cm-1). que se propaga de forma ondulatoria. La relación entre luz incidente (Io) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs) ó Densidad Óptica (DO) La ley de Beer-Lambert se formula como: Abs (DO) =e x C x 1 Siendo e el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática.

.III. midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de proteína. MATERIALES Y EQUIPO  Espectrofotómetro  Gradilla para tubos de ensayo  Tubos de ensayo  Vasos de precipitado  Probetas. Pipetas  Materiales: peptona. reactivo biuret IV. PROCEDIMIENTO Realización de una curva patrón: Como se desconoce el coeficiente de extinción molar (€) de las proteínas coloreadas con el reactivo biuret. a partir de la solución madre (Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla. para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solución problema y determinar su concentración gráficamente y también por regresión lineal. Para ello se dispone de una solución de 10 mg/ml de proteína (peptona) a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la fórmula: Ci x Vi = Cf x Vf Donde: Ci = concentración de la solución madre inicial Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial Cf= concentración final de la solución a preparar Vf= volumen total final de la solución a preparar En 8 tubos de ensayo se preparan. se procederá a construir una curva patrón.

5 1.0 4 8 4.0 2.0 0.Biuret Volumen Abs Final 570nm ml ml ml 0 0.0 0.0 4 8 Al añadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia. Utilizando regresión lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar concentración que en este caso es de la muestra desconocida. c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.0 3. d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las soluciones de los otros tubos.a Volumen preparar Sol.5 2. f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0). comenzando por el de menor concentración.5 0.5 4 8 4.0 4 8 2.5 3.0 4 8 1.0 1.0 4 8 3. secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro.5 4 8 3. . representando las concentraciones en el eje de abscisas y las Abs. se construye una recta en papel milimetrado.0 4.5 4 8 2.Sol. g) Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su concentración. secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.0 4 8 0.5 4 8 1.). Madre inicial Mg/ml ml Volumen Volumen agua Rx. h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración y que la relación es lineal: Y = a + b X (Y = A + B x Conc. Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro: a) Seleccionar la longitud de onda.Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 Muestra Conc.Fnal. e) Limpiar con agua la cubeta. en las ordenadas. 570 nm ( longitud de máxima absorbancia para la reacción del biuret) b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo blanco.

2 ¿Se podría determinar la concentración de cualquier muestra de proteínas con esta curva patrón? 5. e indique que consecuencias tendría sobre la determinación espectrofotométrica .3 ¿Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la reacción del Biuret? 5. 5.4 Investigue si existe alguna proteína en la que no este presente ninguna aminoácido con anillo bencénico en su cadena lateral.V.1 CUESTIONARIO ¿Cuál es la concentración de proteínas de la muestra? 5.

OBSERVACIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ VII.VI. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ VIII. BIBLIOGRAFÍA ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ .

II.  1Kg de azúcar. .  Piceta. los poros permiten la difusión de las moléculas de solventes.  Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solución de proteína al 0.  Llenar la bolsa de celofán con 50 ml de solución proteica.  Preparar un tazón con azúcar. cubriéndola por completo. con el azúcar. Se usan membranas de celofán (acetato de celulosa). FUNDAMENTO La diálisis es una técnica que separa las moléculas de acuerdo a su tamaño usando membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las macromoléculas que se deseen separar como las proteínas. pero bloquean el paso de proteínas por su gran tamaño.5%.PRÁCTICA 2 CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DIÁLISIS I. III. Los mecanismos de transporte son: osmosis. u otras de naturaleza semipermeable. y difusión por diferencia de concentración.  Solución de extracto proteico al 0. colodión. usando para tal fin la pipeta de 10 ml. y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas. y colocar allí la bolsa de celofán conteniendo la solución proteica.  Comprobar la concentración de proteína con el espectrofotómetro a 280 nm. OBJETIVO Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o solución que las contenga. de modo que no se presenten fugas al llenarla con una solución..  Untar toda la bolsa de celofán. IV.  Vaso de precipitados.5%. nitrocelulosa.  Pipeta de 10 ml. MATERIALES Y EQUIPOS  01 pliego de papel celofán. MÉTODO  Preparar una bolsa con el papel celofán. sales y otras moléculas pequeñas.

 Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azúcar. . observando los cambios ocurridos.  Mediar nuevamente la concentración de proteínas en el espectrofotómetro a 280 nm. Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solventes por osmosis. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Investigue la composición química de la membrana utilizada y explicar las razones de su porosidad. y las principales aplicaciones de cada una de ellas. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Efectúe los cálculos de variación en el volumen y la concentración de la proteína en solución. CUESTIONARIO Señale las principales técnicas de separación de solutos por membrana. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solutos por difusión debida a diferencias de concentración.  Medir el volumen de líquido que quedó en la bolsa de celofán y comparar con el volumen inicial. V.

_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ VI. BIBLIOGRAFÍA ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ . CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ VIII. OBSERVACIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ VII.

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PROCEDIMIENTO El proceso de determinación se hace en tres etapas: . En la primera.25xN III. OBJETIVO. Luego se aplica la relación siguiente: %N = ml. Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las proteínas a nitrógeno inorgánico. FUNDAMENTO El método de micro-kjeldahl es una simplificación hecha por HACH en el proceso Kjeldahl tradicional. se digiere el material por acción del ácido sulfúrico en presencia de oxidantes fuertes (peroxido de hidrógeno). previamente liberado por la acción de un álcali fuerte Na(OH).= peso del miliequivalente del nitrógeno Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples con 16% de N. el porcentaje de proteínas será: Proteína = 6. 2.N. Realizando el mismo análisis en un tiempo corto y con pequeñas muestras. luego este se combina con el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio. Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en una muestra desconocida. 3.meq = peso de nitrógeno en la muestra ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml) N. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas 1. normalidad del ácido Fc.PRÁCTICA 3 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL I. Factor de corrección del ácido meq.N. II.100 peso de muestra donde: ml. el amoniaco liberado se recibe en una solución de ácido débil en presencia de colorante indicador. En la segunda se destila el amonio. En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte cuantificando el nitrógeno presente.fc. de esta manera todo el carbono presente se libera como CO2 y nitrógeno como NH3.fc.meq.

 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta IV. Quitar la columna de fraccionamiento.25 g si es sólido) y colocar en el matraz de digestión  Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz  Verificar que el control automático del digestor este en 440ºC y que haya succión en la columna de fraccionamiento.  Añadir 10 ml de peroxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de un embudo de la columna de fraccionamiento.  El balón de destilación que contiene el digesto se añade 13 a 15 ml de hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc. Si el digesto no se torna incoloro.  Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. dando una coloración violeta. añadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare.1 N y valorizarla. DESTILACIÓN  El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un balón de destilación.  Medir 4 ml de muestra liquida (o 0. _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ .DIGESTIÓN.5 ml de ácido borrico al 4% ( en volumen) adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo.  Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado la temperatura indicada.  Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.  Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.  Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloración verdusca y su volumen sea mas o menos 3 veces del volumen inicial) TITILACIÓN. y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se haya enfriado. CUESTIONARIO Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.  Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.

_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ . _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ Explique porque la titilación se hace con ácido sulfúrico y no con un álcali.Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas simples y dos proteínas conjugadas Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de determinación del nitrógeno Efectué los cálculos y determine el contenido de proteínas en la muestra Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante la etapa de digestión Explique el objetivo de la etapa de destilación.

V. OBSERVACIONES
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VI. CONCLUSIONES
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VII. BIBLIOGRAFÍA

PRÁCTICA 4
SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOÁCIDOS
I.

OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de aminoácidos
presentes en una muestra biológica.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:
AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o
alcalina; éste proceso rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los cuales
pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por métodos cromatográficos.
 Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para
formarlos son los a -aminoácidos.

 Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.
 In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
 El pKa de los grupos carboxílo y amino de los alfa -aminoácidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
 Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá
perdido un protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la forma
ZWITTERION.
 En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos que se
incorporan a las proteínas.
 Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
 Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos
modificados que se hallan en las proteínas.

 La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas, básicas,
neutras) permite una gran complejidad funcional en las proteínas.
CROMATOGRAFÍA
Método de Separación
 Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados
presentes en mezclas complejas.
 En estos métodos se emplea:
- Fase estacionaria

: Sólido/líquido

- Fase móvil

: liquido/gas

 “Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase
estacionaria por medio de una fase móvil que fluye”.
 Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los
componentes de la muestra.
Cromatografía en Capa Fina
 Tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
 El soporte o Fase Estacionaria.
Es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido pueden ser.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de SO4Ca
que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

III. PROCEDIMIENTO: Primer Proceso: Sembrado de la muestra  Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.  El solvente comienza a subir por capilaridad.  Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y 2 mm de diámetro.  Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus componentes algunos migrarán rápidamente otros no. Tercer Proceso: Visualización o Revelado El producto puede verse:  Por sí mismo porque tiene color. .  La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm aproximadamente. Segundo Proceso: Elusión  Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de un solvente de elusión.  Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión “El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.

Elusión Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25) . PARTE EXPERIMENTAL:  Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras  Corrida cromatográfica.  Utilizando vapores de iodo. ( en este caso ninhidrina en butanol) Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo RF que se define como: La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia patrón en idénticas condiciones. usando una sustancia química como revelado. “La razón de estas distancias se designa por Rstd” IV.  Usando métodos químicos. el iodo se impregna donde está la mancha dando coloraciones amarillas profundas. Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.

Secar la placa con una secadora.2. hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa. - Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. . CUESTIONARIO: 5.Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación cromatográfica. Haga un esquema de los resultados observados.  Revelado del cromatograma - Una vez que haya alcanzado el frente del solvente. Identificar que aminoácidos están presentes en las muestras problemas. - Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0. Calcular los Rf de los estándares y muestras. 5. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una coloración azul violeta.1.  Identificación Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rfde los estándares y luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.3.1% en butanol sobre la placa.Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello. V. Rx. 5. .

5.9. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Qué métodos existen para el análisis de aminoácidos de las proteínas. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y alúmina.? Fundamente. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de intercambio iónico y cuáles son sus aplicaciones.7.6. La cromatografía en capa fina separa las sustancias según su peso molecular. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. 5.5. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________ .8. Haga el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.

VI. CONCLUSIONES _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ . OBSERVACIONES _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ VII.

VIII. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ .

PRÁCTICA 5 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS I. maltosa). número de átomos de oxigeno. Todos son óptimamente activos. El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis puesto que la coloración va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgánico. lixosa). ribosa. Diferenciar experimentalmente monosacáridos. Los hidratos de carbono más abundantes de la biósfera están constituidos por el almidón y celulosa que son polímeros de glucosa presentes en plantas. galactona. terrosas (treosa y eritrosa). La hidrólisis del almidón catalizada por ácidos lo convierte en varias clases de dextrinas. manosa. además. Estos polisacáridos tienen diferente configuración. siendo el almidón un glucósido y la celulosa un f -glucósido. en maltosa y por último en D (+) glucosa. II. y Monosacáridos Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o cetosas por el. Se les clasifica como: Polisacáridos (celulosa. FUNDAMENTO TEÓRICO: Se denominan carbohidratos o glucósidos los derivados aldehídicoscetónicos. lo cual sirve de indicador cualitativo sensible. OBJETIVOS:     Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos. . Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo y. algunas específicas. almidón) Trisacáridos (rafinosa) Disacáridos (sacarosa. tanto para ensayar el yodo como el almidón. Los grupos funcionales existentes en el almidón y en la celulosa son los grupos hidroxilo y acetal. fructosa). Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono en reductores y no reductores. También difieren en el tamaño teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidón. pueden ser hexoaas (glucosa. Estudiar las propiedades del almidón. dando en algunos casos derivados del furfural. reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensación según la cantidad de glucósidos o azúcares sencillos que se obtengan por hidrólisis de los policarbohidratos. disacáridos y polisacáridos. Todos los tipos de almidón producen un color azul con el yodo. pentosa (arabinosa. lactosa. Por el calor y la acción de ácidos fuertes se deshidratan. El almidón está distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y en tubérculos como reserva alimenticia para el momento de la germinación. xilosa.

agrégueles 1 ml. fructuosa 1%  Luna de reloj  Sol. glucosa 1%  Vaso de precipitados  Sol. 1 ml. sacarosa 1  Sol. 1 ml. de una solución de lactosa al 1%. de agua (testigo). Introducir los tubos en un baño hirviente. de una solución de almidón al 1% y en el último 1 ml. sacarosa 5%  Sol. lactosa 1%  Sol. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba. NaOH 10%  Sol. MATERIALES Y REACTIVOS  Reactivo Molisch  Tubos de ensayo  Reactivo Fehling  Pipetas  Reactivo Tollens  Baño de agua hirviente  Reactivo Seliwanoff  Pinzas  Reactivo Barfoed  Baño hirviente  Sol. deje resbalar por las paredes 2 ml. de una solución de sacarosa al 1%. 1 ml. A cada una agréguele 2 gotas de reactivo de Molisch. Reacciones Específicas  Reacciones de Fehling En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0. Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase entre los dos líquidos. de ácido sulfúrico concentrado. . de la solución de los carbohidratos utilizados en el experimento anterior. PROCEDIMIENTO: Reacciones genéricas de los carbohidratos  Reacción de Molisch En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de solución de fructuosa o levulosa al 1%.yodurado IV. formación de precipitados. de solución A de Fehling con 0.5 ml. 1 ml.III. de una solución de glucosa al1%.5 ml. observe si hay cambios de color. almidón 1%  Sol. HCl 10%  Sol. yodo . inclinando el tubo. de la solución B de Fehling.

Anote el color en los diferentes ensayos. ensayando su reacción frente al iodo. ácido clorhídrico al 10% en el segundo tubo. Luego caliente la solución coloreada a ebullición y observe el efecto. llévelos a baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes iguales de agua para el primer tubo. neutralícela y ensaye la reacción de una muestra frente al Fehling. pero muy lentamente. de las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente. del reactivo Bartoed luego añada 1 ml. Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuación la reacción de una porción de cada mezcla con la solución de Fehling. observe si hay formación de espejo de plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reacción. añadir a cada uno 2 ml. luego lleve los tubos a baño hirviente. Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo.  Reacción de Barfoed En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. Reacción de Tollens En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. observe el color de la solución. del reactivo Seliwanoff. añada 1 ml de ácido dorhídrico concentrado. luego llevar los tubos a baño hirviente y observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo. ¿Qué conclusiones deduce?  Ensayo del Almidón frente al Iodo En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%. observe también qué efecto produce el enfriamiento de la solución. de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente. Realice una comparación de estos resultados con los de la prueba de Fehling. de solución de sacarosa al 5%. de Reactivo de Tollens recientemente preparado. Hierva la solución y retire muestras de Y ml.  Hidrólisis de la Sacarosa En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. añada una gota de solución de Iodo . e hidróxido sódico acuoso al 10% en el tercero. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido. Los disacáridos también precipitan óxido cuproso. Formule estructuralmente los productos finales de la hidrólisis del almidón (un disacárido y un monosacárido).lodurada. ml. lo que indicará la presencia de monosacáridos. a intervalos próximos. .  Hidrólisis del Almidón En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de almidón al 1%. luego añada 3 gotas de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente. Introducir los tubos en un baño hirviente.  Reacción de Seliwanoff En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml.

R.1. CUESTIONARIO: 5. Elabore un diagrama de flujos del proceso de producción de la glucosa a nivel industrial. R Barfoed. R Fehling).V. OBSERVACIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ . 5.3. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis del almidón? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ VI. 5.2. Molish. Seliwanoff.4. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras de almidón? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Indique la composición de los reactivos utilizados en la práctica (R.

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _________________________________________________________________ VII. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ VIII. BIBLIOGRAFÍA ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ .

. El efecto ácido-básico en la solubilidad de las proteínas. la variación de tales factores es mínima por lo que son imperceptibles los cambios en la proteína. para los fines que se persiguen en esta práctica se les mencionara en forma general. 4. la temperatura y la constante dieléctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores. En las proteínas existen 20 tipos de aminoácidos diferentes los cuales están en un número y secuencia determinados por el código genético. Ecuación de Henderson-Hasselbach. Por fortuna. Las propiedades electroquímicas de las proteínas. PRERREQUISITOS: 1. en nuestro organismo. Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son: La fuerza iónica del medio. III. Agentes precipitantes de proteínas.PRÁCTICA 6 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS I. el pH. Por convención se acepta dividir a las proteínas en dos grupos: proteínas simples y conjugadas. Salting In y Salting Out. la proteína responde con una intensidad proporcional al cambio. las cuales presentan diferencias en sus propiedades químicas y físicas. el alumno será capaz de describir y demostrar de manera cualitativa las propiedades químicas de las proteínas en base a los siguientes aspectos: Solubilidad de las proteínas. OBJETIVOS: Al término de esta práctica. 3. Propiedades fisicoquímicas del agua. que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan drásticamente que desnaturaliza a la proteína. INTRODUCCIÓN: Se considera a las proteínas como polímeros biológicos de aminoácidos. II. las proteínas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variación de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural. esto es. 2. Con respecto a su tamaño. Sin embargo. siendo la más simple la estructura primaria y la más compleja la estructura cuaternaria cuya conformación depende de diferentes fuerzas químicas de atracción y repulsión que son ejercidas sobre la estructura molecular de la proteína y por lo tanto son responsables de su estabilidad.

Este mismo efecto ocurre al añadir sales metálicas cargadas electropositivamente. Sin embargo.0 4.5 1. Cuando la solución sea perfecta. Acetico 0.0N 0 0 0 0 0 0 0 0 1.62 1.0 7 5. La adición de una sal a una solución proteica modifica la constante dieléctrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la proteína.75 3 8.1 0 0 0.0 1. Con la adición de un ácido o una base a una solución proteica se alcanza un estado en que hay el mismo número de aniones que de cationes.0 1. El pH que determina el número igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoeléctrico.0 6 7. mediante la modificación las propiedades de los solventes.25 0 0 0 0 0 0 0 0 Ac. 20 mLde agua destilada y 5 mL de NaOH 1N. Preparar una solución de caseinato de sodio. Si la solución no está suficientemente clara. se agregan 5 mL de ácido acético 1 N. • Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuación Tubo pH Agua destilada 1 8. MATERIAL: 13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm 1 pipeta de 10 ml 5 pipetas de 5 ml 1 pipeta de 5 ml 1 gradilla V.38 2 7.2 Caseinato de Sodio 1.4 10 5. para establecer una relación con los efectos que se pueden presentar en el organismo.0 2. 1 Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.0 1. cuando se neutralizan.75 4 8. Fundamento Químico: Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solución en la cual se encuentran.0 9 7.5 5 8.01N 0. Experimento No.0 1.8 Ac.0 1.0 8. tomando 250 mg de caseína. Mezclar bien. cuando se añade exceso de una sal. Este efecto.0 1. Acetico 1.0 1.0 .6 3.IV.0 1. neutraliza la carga de la proteína y tiende a precipitar. Acetico 0. se neutralizan las cargas de la proteína y ésta tiende a precipitar. diluir a 50 mL con agua destilada.25 0.0 8 1. se puede filtrar.0 1.0 0 0 Ac. se presenta precipitación proteica. METODOLOGÍA: En esta práctica se trata de provocar cambios de solubilidad en proteínas que se encuentran en el organismo.

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________________________________________ 6. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________________________________________ . Reportar el punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor precipitación. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca la adición de un ácido o una base fuerte.2.Mezclar bien . Tubo pH Solubilidad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína ? ____________________________________________________________________ VI.1. esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad de la caseína en cada tubo. CUESTIONARIO: 6. De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el agua. Experimento No. Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Hendersosn-Hasselbach. 1 Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ 6.6. Explique cómo afecta un cambio en la constante dieléctrica del agua a la solubilidad de una proteína.5. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ 6. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ 6.6. Qué relación existe entre el punto isoeléctrico y la solubilidad de una proteína. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ 6.7. Qué es el Saltingout y qué tipo de compuestos pueden promoverlo. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.3. Qué es la ecuación de Henderson-Hasselbach y en que casos está indicado utilizarse.4. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ .

Mencione que propiedades fisicoquímicas de la albúmina le permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofóbicos a través de un medio acuoso. OBSERVACIONES _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ VIII. CONCLUSIONES _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ .6.8. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ VII.

BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ._______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ________________________________________________________________ IX.

2) Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la respiración celular. inhibidores no competitivos. presionándolo girar rápidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido. 3) Aplicar los conceptos de sustrato.Rojo Neutro 0 0 1 ml 0 Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.PRÁCTICA 7 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN. OBJETIVOS 1) Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica (fermentación) en levaduras. III. II. . modificación de pH e inhibidores en la interpretación de sus resultados.2. 3. oxido-reducción. Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elástico los 4 frascos. Glucosa 0 1 ml 1 ml 1 ml Sol. inhibidores competitivos. ponerlos a incubar en un baño de agua a 43°C. ACTIVIDADES Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae). NaF 0 0 1 ml 0 Agua 2 ml destilada(43°C) 1 ml 0 0 Sol. por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO2. Complete la siguiente batería de tubos: Tubos 1 2 3 4 Suspensión de 1 ml levadura 7% 1 ml 1 ml 1 ml Sol.1. I. La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción: C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol) El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas. 3. PROCEDIMIENTOS.

3.5. Al cabo de 30 min.1 M 4. Solución de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua destilada a 43°C y completar a 100 ml con agua destilada a 43°C. OBSERVACIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ . Cuál es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH. Solución rojo neutro 0. 3.4.02 M Papel pH.3. Solución de glucosa 0.1 M 3. 2. Soluciones: 1. Anote y discuta sus resultados. Marque el nivel final de la solución en el tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua.3. Solución de NaF0. IV.

V. BIBLIOGRAFÍA ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________________________________________________ . CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________________________________________________ VI.

OBJETIVOS 1) Inmovilizar S.agar. baguetas. 3) Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación II. I. Calibrar el baño de maría a 40ªC. por 30 minutos.MATERIALES. cerevisiae. IV. Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla. baño maría. 8 INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. solución de glucosa 5% .. En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada..ACTIVIDADES Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae). Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves. . La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción: C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol) El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas.PRÁCTICA. PRODUCCION DE ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA. . 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeración (aproximadamente 4ªC). refractómetro.. pipetas. Inmovilización de la enzima: Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y homogenizar. mosto de uvas .Equipos: Balanza. cerevisiae en soporte de agar.Material: balones.. hipodérmicas de 20cc. probetas. espátulas. . picetas. para mantener dentro del agar licuado.Material biológico: Levadura S.Reactivos: Agar-agar. con calentamiento y agitación constante. Tomar con una hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado. papel toalla. 2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas. Secar los pellets en papel toalla.PROCEDIMIENTO Acondicionamiento de materiales: Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua destilada. Colocar en una probeta de 100ml. por lo que se puede medir la fermentación por la producción de CO2 y por la concentración del producto formado o por la disminución de la concentración del sustrato (en grados Brix) III.

Obtención del mosto de uva: Obtener por prensado 50ml de mosto de uva. si estas están atrapadas en la matriz de agar-agar. 1. ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ 3.Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?.Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las células de levadura. Agitar la mezcla por 45 minutos.. To0mar una alícuota. Filtrar con una gasa el jugo obtenido. Leer los grados brix en el refractómetro para cada alícuota.. (o 50ml de una solución de glucosa al 5%). ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ 4. Tomar alícuotas cada 15 minutos.Explique las características coagulantes del agar-agar. considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.Presente al menos un caso detallado de aplicación de la inmovilización de enzimas.CUESTIONARIO.. _______________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ 5. ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ 2.-Indique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o células. V . ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ . Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro. Obtención de etanol: Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva.

Qué otros métodos para la inmovilización se utilizan? ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ VI.OBSERVACIONES Y COMENTARIOS _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ VI.CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ VIII.6.BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ....

.4. Las proteínas se encuentran en el interior de las células en un estatus particular. Equipo de filtración.  Remojar 200 gr. PROCEDIMIENTO. La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato úrea provoca la hidrólisis de esta con la consiguiente liberación de amoniaco y anhídrido carbónico. Balón de 500ml. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fría) . a pH fisiológico. Balanza. Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su actividad catalítica. IV. que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color amarilloanaranjado (complejo cuya fórmula se supone sea HgONH2I). cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a 420 nm. Gradilla de tubos. Extracción de la Enzima. reactivo Nessler.04 tubos de ensayo de 10 ml. De cubierta de frejol. II. III. papel filtro. MATERIALES Y EQUIPOS  150 gr. Este reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio. OBJETIVO.PRÁCTICA 9 EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES I. y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias. Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica. Vaso de precipitados de 500 ml. después de 24 horas remover la cáscara por fricción. 02 fiolas de 100ml. solución de úrea0. FUNDAMENTO. y proceder a escurrir el agua.  Espectrofotómetro.3 M. La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven las características estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.005 M de pH=7. agua destilada  Buffer fosfato 0. Baño María. Las enzimas son proteínas con acción catalítica. según la siguiente reacción. NH2 O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2 NH2 La actividad ureásica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). debido a la enzima ureasa presente en la cáscara.

(0.  Agregar 90 ml.  Después de incubar los tubos. Anotar la lectura de Absorbancia. Comprobación de La actividad enzimática.000 g.  Centrifugar la suspensión a 14. o pasar la solución por un filtro rápido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. CASCARA BUFFER AGUA EXTRACTO FINAL (ml) Determinación de espectrofotometría. De solución EDTA 0.8 ml de agua. Para atemperar al medio ambiente. Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado. presencia de proteínas en el extracto por Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret. En un balón de 500 ml.  Calibrar el espectrofotómetro a 420 nm. Volumen total 8 ml.  Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500 ml. Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570 nm.001 M.005 M.  Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml.  En ambos tubos agregar 0.  Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido. al tubo blanco 5. llevar a refrigeración.3 M y 1.  Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min. adicionar el Reactivo Nessler a los tubos. y 200ml. del extracto y 4. Para comprobar la presencia de proteínas.  Preparar un cuadro de resultados. Usando en ambos casos agua destilada fría.5 ml a cada tubo. Por 10 min. agitar suavemente.8 ml de agua.  Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco.5 ml de buffer fosfato. . De agua destilada. para lograr mezclar. De agua destilada. y enfriar a 4ºC.  Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min. 1 ml de agua y 4 ml de reactivo biuret. De buffer fosfato de sodio 0.  Dejar reposar por 4 min.2 ml de solución de úrea al 0. y licuar cuidando se mantenga baja la temperatura. mezclar ambas soluciones.  Agregar al tubo muestra 1. Preparar 200 ml.0 ml. De buffer fosfato previamente preparado.( PO4HNa2) .

La muestra de extracto dará coloración y un alta absorbancia por el amoniaco liberado. CUESTIONARIO. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ . Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y la refrigeración. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Diga que pruebas se tienen de haber extraído realmente enzimas vegetales. V. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se prepararon. Medir la absorbancia. Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la extracción de la enzima ureasa.

CONCLUSIONES _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ VIII. BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ ________________________________________________________________ .Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extracción utilizado en laboratorio. VI. OBSERVACIONES _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ VII.

DESARROLLO EXPERIMENTAL. Materiales. 2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O La intensidad del color formado será directamente proporcional a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medirá la absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado). la cantidad de productos formados. La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos.  Preparar 50 ml de solución de urea 0. La ureasa cataliza la descomposición de la úrea según la reacción: CO NH2 + H2O 2NH3 + CO2 NH2 La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de cualquier reacción puede ser determinada midiendo: 1. . Cualquiera de ellos.PRACTICA 10 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA I.5. Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado.3 M. lo cual se hace por medios espectrofotométricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color anaranjado castaño. Algunas fuentes comunes son las bacterias. o midiendo cualquiera de los productos (CO2 ó NH3) producidos en un tiempo determinado. Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo. OBJETIVO Determinar la capacidad catalítica o actividad enzimática de la enzima ureasa. FUNDAMENTO.3. La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico de la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza. III. o la cáscara de frejol. Ureaamidohidrolasa EC. mas no en el organismo humano. La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml de solución que transforma o produce 1 mg de sustrato ó producto por minuto medidas en las condiciones optimas de operación de la enzima. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reacción 2.(enz.1.5) II.

 50 ml de solución de ureasa 0. Determinación de la curva de calibración.001M  Reactivo Nessler.  baño de hielo.0 0.  02 fiolas de 50 ml.45 0. Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.0 6 30 0.06 7. Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio según la tabla siguiente: Patrón Concentración SO4(NH3)2 ml de Buffer Nessler Volumen Absorbancia Nº (NH3) mol/ml nmol/ml SO4(NH3)2 (ml) (ml ) final ml 420 nm.0 2 10 0.  08 tubos de ensayo.5 8. con EDTA 0.0 Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de calibración.47 0. 7.5 8.4 ( a 4ºC)  100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-4milimoles/ml) Material de vidrio.5 8.5 8.6 mg/ml en buffer fosfato pH. Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco.  01 gradilla para tubos.0 7.48 0.04 7. En ambos tubos agregar 0.0 3 15 0.01 7.46 0.  02 fiola de 100ml.02 7.4.0 0.2 ml de solución de úrea al 0. Blanco 00 0.49 0. Preparar 100 ml buffer fosfato 0.0 4 20 0.5 8.0 5 25 0.0 1 5.05M de pH=7.3 M y 1.44 0.  01 espectrofotómetro. .03 7. Medida de la actividad ureasica.5 8.5 8.  Incubadora a baño maría.05 7.5 ml de buffer fosfato.50 0.

8 ml de agua.Explique por qué durante la reacción debe incubarse a 37ºC . Volumen total 8 ml. Dejar reposar por 4 min. de solución de ureasa y 4. al tubo blanco 5.5 ml a cada tubo). (0. Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.Efectúe los cálculos para completar los datos de la tabla. Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos.Calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa en nmol de NH3 producido/min. IV. CUESTIONARIO 1. agitar suavemente. 3.Sacar el tubo de incubación e introducir en baño de hielo para detener la reacción.0 ml.. agitar. para lograr mezclar.. Después de incubar los tubos. 2.Agregar al tubo muestra 1. Para atemperar al medio ambiente. Leer la absorbancia a 420 nm.8 ml de agua... 4.Calcule la cantidad de NH3 producido en la reacción enzimática.

. 7..Encontrar la equivalencia por el cálculo del factor de equivalencia y por la determinación analítica de la ecuación de la curva. Explique por qué.. 6.Explique por qué es necesario contar con un blanco en las determinaciones de actividad enzimática. 9. amoniaco. y urea para cada tubo patrón usados en la construcción de la curva de calibración.. 8.Realizar los cálculos de micromoles de sulfato.5.Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad específica..Diga si la curva de calibración obtenida obedece a la ley de Beer. .

BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ . CONCLUSIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ III.I. OBSERVACIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ II.

La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa. DeMichaelis-Menten. La velocidad de las reacciones enzimáticas varían con la concentración del sustrato según una cinética autosaturante que se describa por la Ec. [S] Ks + [S] La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma: La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la Linearización de Lineweaver-Burk. Verificar la variación de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la concentración del sustrato. si previamente se le compleja con reactivo Nessler. para formarse amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente ecuación. NH2 CO + H2O 2NH3 + CO2 NH2 Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometría a  = 420 nm. . FUNDAMENTO.PRACTICA 11 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA I. II. V = Vmax. Cinética de MichaelisMenten. en cuyo caso toma la forma. OBJETIVO.

4. 2.  01 espectrofotómetro Espectronic 20D+  01 termómetro de 0. con EDTA.  Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de amonio al 5x10 -4 M  Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0. PROCEDIMIENTO.  20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M  50 ml de solución de ureasa 0.  Equipo de baño maría.  fiolas de 50 y 100 ml. En buffer fosfato de pH=7.3 M Calibración del Espectrofotómetro.  07 tubos de ensayo de 10 ml. Con ese fin se . Equipos y material de vidrio. y por tanto de actividad de la enzima se trazará una curva de equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs. 1 = 1 + [S] vVmaxKs III. 5.  02 matraz de 100 ml. A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de concentración del producto formado (NH3).  reactivo Nessler.6 mg/l. Preparación de muestras.Donde los parámetros anteriores se relacionan por la ecuación de una recta. MATERIALES Y EQUIPOS Materiales.  pipetas de 1. 0.  Agua destilada.  Baño de hielo. Concentración.100 ºC IV.5 nM. y 10 ml.

al 5x10-4 M  Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de Amonio. . Completar la siguiente tabla.  Preparar solución madre de SO(NH4)2. Por la dificultad del uso del NH3 se usará soluciones de sulfato de amonio.  A partir de la muestra madre de urea 0. haciendo los tratamientos estadísticos que sean necesarios. preparar 6 muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se muestra.3 M. Pruebas cinéticas. Tabla Nº 1 PATRON nº Sol.preparan soluciones de amoniaco de concentración conocida. sulfato(ml) de Contenido nmol Contenido nmol Equivalencia en de sulfato de NH3 nmol de úrea 1 50 2 100 3 150 4 200 5 250 6 300  Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de la práctica anterior. Tabla Nº 2 Muestra Nº Volumen de sulfato NH3 en la muestra Absorbancia tomado ( ml) (nmol) Blanco 1 2 3 4 5 6 Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación que relaciona DO vs [NH3]. para obtener diversas intensidades de color. calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su equivalencia con nmol de úrea. las que se neutralizan con reactivo Nessler.  Completar la siguiente tabla.

donde (p) es nmol de NH3 producidos.5 0.2 6.5 0.0 6. Blanco 0 0 7.2 0.0 0.6 0. y completar la tabla 4 Muestra 1 2 3 4 5 6 Blanco Tabla Nº 4 [urea] en Densidad óptica Nmol de NH3 Nmol de urea nmol/ml x10-2 (Abs) producidos que reaccionan 0.5 8 6 360 1. y (t) es el tiempo de reacción enzimática ( 15 min.5 0.6 6.  Para cada muestra calcular la velocidad de reacción mediante la relación v = P/t.) y completar la siguiente tabla.5 8 5 300 1. .5 8 1 60 0.5 0.5 0.0 5.3M fosfato 37°C ml 5 min.5 0.4 0.5 8 3 180 0.5 0.8 0.0 3.2 5. Preparar solución madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato Tabla Nº 3 Tubo Urea Urea Buffer Incubar Ureasa Incubar Baño Nessler Reposar Volumen Abs 37°C hielo ml final µMol o.5 8  Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la curva de calibración).0 4.0 6.8 0.1 1.5 8 2 120 0.4 6.8 6. 420 ml ml 3 min 15 min ml nm.0 - Tratamiento de datos.0 0.5 8 4 240 0.

Tabla 5 Muestra [S] nmol/ml. y ajustar a una curva autosaturante. Y Ks.  Estimar el valor de Vmax. 1/v . [S].  Determinar gráficamente los valores de Vmax. [S] y ajustar a una línea recta.  Graficar 1/v vs. 1/[S] V(nmol/min.) 1 2 3 4 5 6  Graficar v vs.

OBSERVACIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ VI. BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ . Escribir la ecuación que representa a esta reacción enzimática. V. CONCLUSIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ VII.

entre el 5 y el 10% del peso seco. Son componentes fundamentales de la célula y constituyen en conjunto. Por otra parte el ADN es el vehículo de la herencia que se transmite de padres a hijos de generación en generación. mitocondrias y cloroplastos. III. como el NaCl 2M. y por tanto de las enzimas necesarias para el funcionamiento celular. consiste en primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los núcleos. que se pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado de acridina. MARCO TEORICO El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el almacenamiento y la transferencia de la información genética. el detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del ADN. como las histonas. El alcohol tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista. Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando núcleo proteínas. . se produce el estallido de los núcleos. OBJETIVO Extraer ADN de un tejido animal II. Al añadir una solución hipertónica. FUNDAMENTO: El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla. Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la síntesis de proteínas. para ello se tritura el hígado de pollo en un mortero.PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO I. ya que suelen unirse a determinados tipos de estas. mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula y también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas cantidades. El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo .

.Añadir 1 ml de SDS 20%. 2. en la interface precipita el ADN. 8. CUESTIONARIO 1. por las paredes. 6. 3. dentro de un mortero. VI. que es el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN. ¿De qué está formada la cromatina? 2..Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta obtener una papilla.Con la ayuda de una varilla de vidrio.Triturar 10 gr de hígado de pollo. logrando se formen dos capas..Filtrar varias veces.IV. 4.Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M.. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M? 4. en una probeta de 100 ml. 7. para promover el rompimiento de las membranas celulares. sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN visibles a simple vista.Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío. con la adición de 5gr de arena lavada. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y etanol. ¿para qué añadimos arena al triturado? 3. MATERIALES             V.. verterlo todo a un vaso de precipitados. 5. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el hígado?. logrando separar los restos de tejido que quedaron sin romper membranas. ir removiendo en la misma dirección tratando de hilar las fibras de ADN.... ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina? 5..Medir el volumen del filtrado final. Hígado de pollo 10 gr Cloruro de sodio 2M Etanol 96|° SDS 20% Arena Varilla de vidrio vasos de precipitados Mortero Embudo Pipetas Probetas Gasa METODOLOGÍA 1. con que finalidad .

CONCLUSIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ X. OBSERVACIONES ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ IX.VIII. BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ .