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TEMA 9.- CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC) Diferencias y semejanzas de la cromatografa lquida de alta resolucin y la cromatografa de gases. En CG la fase mvil es un gas y en HPLC es un lquido. En cromatografa de gases la fase mvil es un mero vehculo sin embargo en cromatografa lquida participa de manera activa en la separacin Esquema de instrumentacin empleada en HPLC idntico al de la CG con la salvedad de sustituir la bombona de gas a presin por un sistema de impulsin (bomba de lquidos) y que el sistema de inyeccin, cmara de vaporizacin en gases, es un simple introductor de muestra en lquidos a temperatura ambiente. Desde el punto de vista de la aplicacin , la CG gaseosa podemos separar eficazmente aquellas sustancias relativamente voltiles y termoestables (que posean sin descomposicin trmica apreciable una presin de vapor suficiente sin sobrepasar los 350C), mientras que en HPLC es aplicable a especies no voltiles (no se volatilizan a temperaturas inferiores a 350 C) o termolbiles;. En CG distinguamos 2 modos de trabajar, en isoterma (T constante) o con temperatura programada. En HPLC distinguimos entre mantener la composicin de la fase mvil constante durante todo el proceso de separacin y se dice que es una separacin en condiciones isocrticas o bien variarla, y en este caso se trata de una elucin en gradiente En cromatografa de gases se pueden utilizar dos tipos de columnas de relleno y capilares, en HPLC son siempre de relleno.

En comn tienen: - una columna permanente y reutilizable de alta eficacia - sistema de termostatizacin de la columna (aunque con finalidad distinta) - circulacim continua de la fase mvil - deteccin en continuo de los solutos eludos

- visualizacin grfica del resultado, en el cromatograma. El tratamiento cuali y cuantitativo es idntico.

Clasificacin de la cromatografa de liquidos en funcin de: -Modos de separacin -Cromatografa lquido-slido (adsorcin) - *Cromatografa lquido-lquido (reparto) - Cromatografa de exclusin - Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de particin o de reparto (lquido-lquido) Dentro de esta tenemos la cromatografa clsica de reparto lquido-lquido y la de fases enlazadas. La diferencia entre ellas radica en la forma en como se retiene la fase estacionaria sobre las partculas soporte del relleno, en lquido-lquido de la fase estacionaria lquida se retiene sobre la superficie del soporte por adsorcin fsica mientras que en la de fases enlazada se retiene sobre la superficie del soporte por medio de enlaces qumicos. En la actualidad la de fases enlazadas ha desplazado totalmente a la clsica. Los soportes para casi todos los rellenos de fases enlazadas, son partculas de slice mecnicamente resistentes, porosas y uniformes, con dimetro de 3.5 a 10 m. la superficie de estas partculas est constituida por grupos silanol (Si-OH) qumicamente reactivos. Las fases estacionarias se fijan mediante la reaccin de estos Si-OH y un organoclorosilosano de formula general Si(CH 3)2RCl dando lugar a un siloxano.

Las propiedades de la fase estacionaria dependen de la naturaleza del grupo R. Ejemplos de fases estacionarias son aquellas en las que R contiene un grupo funcional ciano (-CN), -alcohol (-OH), amino

(NH2). Dentro de la cromatografa de reparto distinguimos entre cromatografa en fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase mvil apolar o menos polar que la estacionaria; y cromatografa en fase inversa, dnde la fase estacionaria es no polar y la fase mvil polar o relativamente polar (puede ser una disolucin acuosa tamponada, metanol, acetonitrilo o mezclas de este con agua). Las fases estacionarias no polares ms utilizadas son aquellas donde el grupo R es una cadena de hidrocarburo, -noctil (C8) o n-octodecil (C18).

*El 90 % de las separaciones de HPLC se realizan por cromatografa de fase enlazadas en fase inversa.

Eleccin de la fase mvil La fase estacionaria debe de tener una polaridad considerablemente distinta a la de la fase mvil. See puede trabajar con una composicin de la fase mvil contante durante todo el anlisis, en ese caso se denomina elucin isocrtica, y es adecuada para la separacin de mezclas de compuestos cuya polaridad vara en un rango pequeo. Cuando la polaridad de los analitos a separar vara en un amplio rango, para conseguir una separacin ideal de todos debe de variar la polaridad de la fase mvil durante su anlisis y en ese caso decimos que trabajamos con elucon en gradiente. INSTRUMENTACIN. En la siguiente figura *** se representa el esquema funcional de un equipo general de cromatografa lquida.

Como se puede apreciar, los componentes bsicos son: - Una bomba para propulsar la fase mvil - Un mecanismo de introduccin de la muestra - Una columna que contenga la fase estacionaria - Un detector para determinar la separacin que tiene lugar y proporcionar datos que permiten una evaluacin cuali y cuantitativa de los resultados. Esto puede conseguirse por registro de la respuesta del detector en forma de cromatograma o bien, puede emplearse adems, un equipo de tratamiento de datos.

SISTEMAS DE ALMACENAMIENTO DE DISOLVENTES.

Recipientes para disolventes (generalmente de vidrio)de 1 a 2 L de capacidad). Estos recipientes estn equipados con un sistema de desgasificacin para eliminar los gases disueltos en los disolventes (en general oxigeno y nitrgeno). El proceso de desgasificacin de los disolventes puede llevarse a cabo por diferentes medios: 1-.Calentando el disolvente hasta su punto de ebullicin. 2-.Introduciendo el recipiente del disolvente en un bao de ultrasonidos o insertando una sonda de ultrasonidos en su interior. 3-. *Sometiendo el disolvente a un vaco moderado. 4.- *Utilizando sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la disolucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad, normalmente se burbujea una corriente de helio a travs del disolvente.

El burbujeo de He a travs del disolvente es una de las opciones ms usadas. Adems de los dispositivos para la desgasificacin a los recipientes de los disolventes tambin se les incorpora un dispositivos para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. Adems es conveniente tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, filtrndolos a vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin.

BOMBAS. El disolventes o mezclas de disolventes son impulsados por la bomba hacia la columna pasando por

el sistema de inyeccin Se utilizan tres tipos de bombas Bombas neumticas o a presin constante. Bombas a flujo constante -.-Reciprocas -.-De desplazamiento constante o de jeringa

BOMBAS DE FLUJO CONSTANTE

Reciprocas:

Son las que se utilizan en aproximadamente el 90% de los equipos de HPLC comerciales

La bomba reciproca ms sencilla es la de pistn simple (esquema en la figura). El lquido entra y sale de la cmara del pistn mediante vlvulas unidireccionales (el lquido entra pero no retrocede). El principal inconveniente de este tipo de bombas es que es que suministra lquido de una forma discontinua mediante una serie de pulsos ( estp nos dara mucho ruido en la lnea base del cromatograma) La forma ms adecuada de minimizar las pulsaciones es utilizando sistemas de doble pistn recproco alternante, de forma que mientras un pistn impulsa lquido el otro est rellenandose y comienza a impulsar momentos antes de que el primero deje de hacerlo. Como resultado los perfiles de los flujos se solapan reduciendo as hasta niveles muy bajos siendo menores cuanto mayor sea el solapamiento. (Ver figura)

Estas bombas tienen la ventaja de que la cantidad de lquido que pueden suministrar es ilimitada y se pueden mantener en rgimen de trabajo durante largos periodos de tiempo facilitando la automatizacin de los sistemas cromatogrficos. El cambio de disolventes es sencillo y rpido y los volumenes muertos mnimos,, facil adaptacin a la elucin en gradiente, flujos constantes prcticamente independientes de la viscosidad de la fase mvil y de la contrapresin de la columna .

SISTEMAS DE INYECCIN DE LA MUESTRA. Introduccin de la muestra: las muestras lquidas se inyectan directamente y las slidas deben

disolverse. Como en cualquier tcnica cromatogrfica resulta necesario que los componentes de la muestra entren en la columna en forma de una banda estrecha, de lo contrario no podr producir picos estrechos. El inyector deber estar diseado para introducir pequeos volmenes de muestra (ej 20L), en un sistema hermtico sometido a elevadas presiones, sin romper las condiciones de equilibrio obtenidas entre la fase mvil y la fase estacionaria. En HPLC para la introduccin de la muestra los dispositivos que ms se utilizan son las denominadas VALVULAS DE BUCLE. Pueden dividirse en dos grupos: 1.-Valvulas de bucle externo 2.-Valvulas de bucle interno. El bucle es un tubo metlico, y la longitud del mismo se elige en funcin de la cantidad de muestra que se quiere inyectar . Las vlvulas de bucle externo tienen la ventaja de que puede cambiarse el tubo para la introduccin de diferentes volmenes de nuestra. En las de bucle interno, el bucle est perforado en el interior del cuerpo de la vlvula; por lo que si se quieren acomodar el inyector para la introduccin de volmenes de muestra diferentes hay que cambiar todo el dispositivo.

El funcionamiento de estas vlvulas se muestra en la figura.

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Estas vlvulas tienen dos posiciones una posicin de llenado, la muestra se introduce con ayuda de una jeringa en el bucle, en esta posicin el flujo de fase mvil que procede de la bomba pasa por la otra conduccin de la vlvula hacia la columna. Cuando el rotor de la vlvula se gira hacia la posicin de inyeccin, el flujo de disolvente que procede de la bomba se ve forzado a pasar a travs del tubo que contiene la muestra siendo de esta forma arrastrada hacia la columna. Para conseguir la mxima reproduciblidad en el bucle (de capacidad fija, 20, 50L) se introduce una cantidad superior a su capacidad ya que de esta forma llenamos completamente el bucle saliendo el exceso por una va de desecho. si inyectamos una cantidad inferior a la capacidad del mismo la precisin est limitada por la medida en la jeringa.

COLUMNAS Y RELLENOS: Columnas: las ms empleadas en cromatografa lquida son de longitudes comprendidas entre 1525 cm, y relleno por partculas entre 3.5 y 10 m. El dimetro interno de las columnas suele estar entre 2 y 5 mm.

Influencia del Tamao y Porosidad de las Partculas del relleno en la Eficacia de la Separacin *Las particulas utilizadas inicialmente en la cromatografa lquida eran bastante grandes (40 m o ms) y totalmente porosas en todo su cuerpo, pero esto llevaba a un excesivo ensanchamiento de las

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bandas.

Solucin a este problema. 1.-Recubrir un slido de cuerpo no poroso con una fina capa de la fase porosa. 2.- Para conseguir picos ms estrechos tambin es importante reducir el tamao de las partculas dejandolas porosas y que las partculas tengan un dimetro suficientemente uniforme y una forma regular

Pero no se pueden usar partculas extremadamente pequeas por el relleno sera tan compacto que la fase mvil no podra ser bombeada a su travs, por eso existe un lmite inferior del tamao de las partculas. Actualmente se dispone de rellenos de partculas pequeas y uniformes, con dimetros de 3.5 m y 10 m.

SISTEMAS DE DETECCIN: TIPOS DE DETECTORES DE HPLC Detector de ndice de Refraccin: Es el detector ms universal de los habitualmente empleados. El ndice de refraccin es una caractertica fsica de cada compuesto. Este tipo de detectores no puedan ser empleados en eluciones

en gradiente. Y se han de mantener a T constante. No son tan sensibles como la mayora de los otros detectores

Detectores Espectroscpicos UV/VIS: No son detectores universales, pero resuelven muchos de los casos ms habituales en el laboratorio y por tanto son los ms utilizados. puesto que un gran nmero de sustancias absorben apreciablemente en la regin UV y un nmero inferior (pero importante) lo hacen en el VIS

Existen diversos tipos de detectores UV/VIs cuya diferencia fundamental reside en la mayor o menor

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facilidad para modificar la longitud de onda de trabajo: - Detectores de longitud de onda fija - Detectores de longitud de onda variable - Detectores de longitud de onda programable - Detectores de longitud de onda mltiple o de diodos

Detectores de Fluorescencia: Los detectores de fluorescencia son tambin muy utilizados , debido a su gran sensibilidad. Son ms selectivos que los anteriores.

Otros Detectores: Detectores electroqumicos: (Coulomtricos y amperomtricos), Detector de conductividad: Detector de Masas