IDENTIFICACIN Y CATALOGACIN DEL BANCO DE GERMOPLASMA MUNDIAL DE OLIVO DE CRDOBA MEDIANTE MARCADORES MORFOLGICOS Y MOLECULARES PROYECTO CAO98-001

I. Trujillo, D. Barranco, A. Belaj y L. Rallo. Departamento de Agronoma. Universidad de Crdoba. E.T.S.I.A.M. Avda. Menndez Pidal s/n. 14080. Crdoba.
RESUMEN
La identificacin varietal en olivo es crucial para salvaguardar el patrimonio gentico de la especie, as como para cumplir los objetivos en programas de mejora gentica por cruzamientos y para la autentificacin varietal de plantas de vivero. Se ha completado la descripcin morfolgica de las variedades que han entrado en produccin en el Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba (320). Asimismo se ha confirmado la autenticidad varietal de los distintos rboles del banco pertenecientes a la misma variedad (849) mediante el empleo de muestras de endocarpos (muestras control) autnticas procedentes de los respectivos pases de origen. Se ha optimizado la metodologa de extraccin del ADN y condiciones de amplificacin por PCR a partir de protocolos utilizados en otras especies vegetales. En el germoplasma de olivo evaluado (215 cvs de 17 pases) se encontr una gran variabilidad para los 30 cebadores seleccionados. El alto nivel de polimorfismo que oscil de 71% (Albania) a 93% (Cuenca Mediterrnea) es una consecuencia y a la vez un testimonio de la gran diversidad que existe en la especie. Los marcadores RAPD han mostrado ser de gran utilidad para el buen manejo del Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba. En este sentido, se ha identificado material procedente tanto de trabajos de prospeccin (Siria) como de otras colecciones (Albania). Los marcadores RAPD han confirmado la existencia de diferencias entre variedades designadas localmente por la misma denominacin genrica (como Manzanilla, Lechn, Gordal, Alameo etc.). Igualmente, el empleo de RAPDs ha permitido confirmar y detectar sinonimias hasta ahora no citadas. La gran capacidad demostrada por los marcadores RAPD en olivo, ha permitido la identificacin fiable de la totalidad de los genotipos analizados (215) mediante la combinacin de slo 6 cebadores. La evaluacin del poder discriminante de cada uno de los cebadores empleados en el estudio del material representativo de la Cuenca Mediterrnea (103) indica que con un nmero pequeo de cebadores (5) se puede identificar tericamente un nmero casi ilimitado de variedades. En todos los mbitos geogrficos estudiados se han encontrado asociaciones entre las variedades y su difusin geogrfica. Los resultados obtenidos en el estudio de individuos procedentes de trabajos de seleccin clonal, indican que se puede encontrar variabilidad intracultivar en olivo mediante el empleo de marcadores RAPD pero cuando se encuentra dicha variabilidad es muy baja.

Palabras clave: Olivo, Germoplasma, Identificacin varietal, RAPDs.

INTRODUCCIN
Actualmente se considera que existe una gran diversidad de cultivares, cuyo nmero se estima en ms de 2000 genotipos (Lavee, 1994). A pesar de su importancia, este gran patrimonio gentico en olivo no ha sido suficientemente estudiado ni explotado (Angiolillo et al. 1999). La conservacin y el estudio de los recursos genticos del olivo implica, al igual que para el resto de especies frutales, el establecimiento de colecciones en campo (bancos de germoplasma). El principal problema de las colecciones es la correcta identificacin del material existente, as como de las nuevas entradas. Dicha identificacin es crucial para cumplir los objetivos en programas de mejora gentica por cruzamientos as como para la autentificacin varietal de plantas de vivero. La presencia de muchas sinonimias (la misma variedad con distintos nombres) y homonimias (distintas variedades con el mismo nombre) como consecuencia de criterios genricos de denominacin acentan la necesidad de la identificacin varietal en olivo. El Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba representa la coleccin ms completa del mundo, incluye un total de 356 cultivares de 17 pases diferentes (del Ro, comunicacin personal) lo que representa un porcentaje elevado de la variabilidad de la especie en la cuenca mediterrnea. El material vegetal del mencionado banco ha sido principalmente descrito en base al uso de caracteres morfolgicos y/o agronmicos. En este sentido, el esquema pomolgico empleado por Barranco y Rallo (1984) ha demostrado ser muy til para la identificacin del material cultivado en Espaa y el establecimiento de las sinonimias correspondientes. Sin embargo, los mtodos morfolgicos poseen ciertos inconvenientes, tales como su dependencia de las condiciones ambientales, la necesidad de usar un nmero elevado de caracteres y el hecho de que requieren el empleo de rganos no siempre presentes (fruto y endocarpo).

Recientemente, con el fin de completar y ampliar la informacin obtenida por los marcadores morfolgicos, se han utilizado con xito los marcadores RAPDs. Paralelamente en esta coleccin se estn empleando otros marcadores moleculares (SSRs) que aportarn un mayor conocimiento del material disponible (Rallo et al. 2000; de la Rosa et al. 2002; Belaj, sin publicar; Trujillo, comunicacin personal).

METODOLOGA
a) Caracterizacin e identificacin morfolgica La caracterizacin primaria se ha llevado a cabo en las variedades del Banco de Germoplasma Mundial de Olivo "Alameda del Obispo" del CIFA de Crdoba que han tenido produccin durante la ejecucin del proyecto. Para ello se ha utilizado un esquema pomolgico adaptado del descrito por Barranco y Rallo (1984) que incluye 4 caracteres de la hoja, 2 de la inflorescencia, 10 del fruto y 11 del endocarpo. Por otro lado, la confirmacin de identidad de los diferentes rboles del banco se ha realizado mediante el contraste de endocarpos con muestras control autnticas y procedentes de la zona de origen de su cultivo. Para las variedades espaolas stas procedan de los trabajos de prospeccin y en el caso de las variedades extranjeras procedan, previa peticin, de centros de investigacin sobre el olivo de los pases originarios de cada variedad. Dicho estudio se ha realizado en un total de 849 rboles. b) Caracterizacin e identificacin por marcadores moleculares Se ha puesto a punto la tcnica RAPDs (polimorfismo de fragmentos de ADN amplificados al azar), Para ello se ha adaptado, la metodologa de extraccin del ADN en hoja as como las condiciones de amplificacin por PCR (reaccin en cadena de ADN polimerasa) a partir de protocolos utilizados en otras especies leosas (Belaj et al, 2001). Se ha evaluado la capacidad discriminante de los RAPDs en el principal material cultivado en la Cuenca Meditrranea (215 variedades de 17 pases) procedente del Banco de Germoplasma Mundial de Olivo Alameda del Obispo del CIFA de Crdoba. Asimismo se han evaluado 10 clones de Arbequina y 10 de Manzanilla de Sevilla procedentes de trabajos de seleccin clonal realizados por el Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries (IRTA), Centro Max-Bove (Tarragona) y de la Escuela Universitaria de Ingenieria Tcnica Agricola, Cortijo de Cuarto (Sevilla) respectivamente.

RESULTADOS

a) Caracterizacin e identificacin morfolgica Se ha completado la descripcin morfolgica de las denominaciones que han entrado en produccin en el banco hasta la fecha, un total de 320. Dicha informacin ha sido integrada en la base de datos existente en el Departamento de Olivicultura del Centro de Investigacin y Formacin Agraria de Crdoba. De los 849 rboles estudiados, se ha confirmado su identidad en 765 (Figura 1), para los restantes 84, no se dispona de muestras control. En estos casos se ha comprobado si los distintos rboles pertenecientes a la misma variedad localizados en las diferentes parcelas de la coleccin son copias o no. De los rboles contrastados, 693 (90,6 %), son autnticos, si bien en algunos casos de sinonimias se sugiere el cambio de denominacin por la ms extendida. Por el contrario, se ha comprobado que 72 rboles (9,4 %) son errneos , si bien de stos, en 31 casos se ha podido conocer la identidad por tratarse de variedades bien conocidas. Por otro lado, los rboles contrastados pertenecen a un total de 240 variedades, de las cuales 218 (90,8 %) son autnticas y 22 (9,2 %) errneas. De stas 22 se ha podido conocer la identidad de 9 variedades.

849 (270 cvs) RBOLES

765 (240 cvs) Identificados

84 (30 cvs) No identificados

693 (218 cvs) Autnticos

72 (22 cvs) No autnticos

31 (9 cvs) Conocidos

41 Desconocidos

Figura 1. Confirmacin de autenticidad varietal del Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba. b) Caracterizacin e identificacin por marcadores RAPD 1. Puesta a punto de la tcnica PCR-RAPD

Se ha optimizado la metodologa de extraccin del ADN y condiciones de amplificacin por PCR a partir de protocolos utilizados en otras especies vegetales. Por otro lado, se han optimizado las condiciones de separacin de los productos de amplificacin mediante el empleo de geles de poliacrilamida, matriz de separacin de mayor resolucin que la agarosa. Ello ha permitido aumentar la seguridad en la seleccin de las bandas y las posibilidades de discriminacin varietal al aumentar el nmero de marcadores nicos. PCR-RAPDs en olivo. 2. Evaluacin del polimorfismo RAPDs

En total, se han analizado 300 cebadores, de stos, se seleccionaron finalmente 30 en base al polimorfismo y consistencia de las amplificaciones. El polimorfismo obtenido para dichos cebadores en el germoplasma de olivo evaluado (215 cvs de 17 pases) fue muy elevado. El nmero total de bandas por cebador oscil de 4 a 11 con una media de 6.7 bandas por cebador,mientras que el nmero de bandas polimrficas por cebador oscil de 1 a 10 (con una media de 5.4). La frecuencia de las bandas polimorficas oscil de 0.02 (bandas presentes tan slo en una variedad) a 0.98 (bandas ausentes en tan slo una variedad) y la frecuencia media de estas bandas fue de 0.50. El polimorfismo total oscil de 71% (Albania) a 93% (Cuenca Mediterrnea) siendo los valores de polimorfismo encontrados en el caso de Siria y Espaa, intermedios. Estos resultados son una consecuencia y a la vez un testimonio de la gran diversidad que existe en la especie.

3.

Uso de los marcadores RAPD en la identificacin

3.1. Identificacin a priori de nuevas accesiones Se ha identificado material procedente tanto de trabajos de prospeccin (Siria) como de otras colecciones (Albania). En el caso de Siria, se analizaron un total de 42 accesiones y varios rboles por cada accesin (en total 84 individuos). Se encontr tan slo una duplicacin (Dan 136/1003) y el resto (41 accesiones) representaron genotipos distintos. Se detectaron tan slo 2 errores de plantacin y/o etiquetado en el banco. Este hecho demuestra que cuando se utiliza un buen esquema de manejo en la coleccin se pueden evitar errores de propagacin. Se encontraron 12 casos de homonimias (petenecientes a 29 accesiones) que se pudieron identificar mediante el empleo de 3-4 cebadores, lo cual indica la gran capacidad discriminante de los marcadores RAPD. En el caso del material procedente de Albania se evaluaron 21 accesiones (19 variedades y 2 acebuches) todos resultaron genotipos distintos. Se encontraron tan slo 2 casos de homonimias (4 accesiones). 3.2. Deteccin de Homonimias y Sinonimias Los marcadores RAPD han confirmado la existencia de diferencias entre variedades designadas localmente por la misma denominacin genrica (como Manzanilla, Lechn, Gordal, Picual, Alameo etc.) y cuya identidad diferente se haba evidenciado ya con marcadores morfolgicos e isoenzimas. De la misma manera, los RAPDs han demostrado que denominaciones genricas dentro del material sirio y albans, no descritas previamente, engloban genotipos distintos. Nuestros resultados junto con estudios previos en olivo han puesto en evidencia la capacidad de los RAPDs para detectar homonimias con un nmero reducido de cebadores. Igualmente, el empleo de RAPDs ha permitido confirmar y detectar sinonimias hasta ahora no citadas. En total se ha comprobado que 33 denominaciones pertenecen realmente a 14 variedades diferentes (Cuadro 1). Cuadro 1. Sinonimias detectadas en el Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba. Sinonimias Detectadas Azapa-Arauco Lucio-Blanquillo Bolvino-Negral Cj Cakir-Valanolia Frantoio-Cellina-Oblonga Grappolo-Leccio di Corno Manzanilla Cacerea- Azeitera-Negrihna Manzanilla de Sevilla-Redondil Mollar de Cieza-Gordal del Centro-Redonda de Torrijos- Redonda de Mora de Toledo Moraiolo-Carboncella Morona-Manzanilla de Zahara Ocal- Llorn de Castuera-Pudriaco Picholine Marocaine -Caivano Blanco Verdial de Badajoz-Original Total : 33 Denominaciones pertenecientes a 14 variedades

3.3. Evaluacin de eficiencia de los marcadores RAPD en la identificacin La gran capacidad obtenida por los marcadores RAPD en olivo, ha permitido la identificacin fiable de la totalidad de los genotipos analizados (215) mediante la combinacin de slo 6 cebadores: OPA-19+OPI-12+OPK07+OPK-17+OPP-19+OPX-01. La evaluacin del poder discriminante de cada uno de los cebadores empleados en el estudio del material representativo de la Cuenca Mediterrnea (103) indica que con un nmero pequeo de cebadores

(5) se puede identificar tericamente un nmero casi ilimitado de variedades (Figura 2) y con una probabilidad de confusin muy baja (4.84 x 10-8) y que bajo la hiptesis de independencia de marcadores se necesitara la combinacin de tan slo 4 cebadores para identificar todo el material vegetal presente actualmente en el Banco de Germoplasma (356 variedades). Sin embargo, los marcadores moleculares no siempre son independientes. Por ello como un caso prctico se estudi la capacidad discriminante de los marcadores RAPD en 82 variedades procedentes de Espaa. Los resultados obtenidos indican que el 28% de las variedades se identificaron con un cebador (OPA-19) (Figura 3). La adicin de un segundo cebador (OPF-06) hizo posible la identificacin de 63.4% de las variedades. El porcentaje de las variedades increment a 76.8% y 90% cuando se aadieron un tercer (OPX-01) y un cuarto cebador (OPX-03). El empleo de un quinto cebador OPI-12 se necesit para la identificacin del resto de las variedades (10%). Es interesante destacar que se han encontrado un alto nmero de patrones nicos (53) para 38 variedades espaolas, lo que supone otra alternativa para la identificacin de variedades y certificacin de plantas de vivero. 3.3. Estimacin de las relaciones genticas entre variedades con marcadores RAPD En todos los mbitos geogrficos estudiados (17 pases de la Cuenca Mediterrnea) se han encontrado asociaciones entre las variedades y su difusin geogrfica. En este sentido, cabe mencionar las asociaciones de las variedades procedentes del Mediterrneo Oriental (Egipto, Israel, Libno, Palestina, Siria, y Turqua), Central (Albania, ExYugoslavia, Grecia, Italia, y Tunez) y la agrupacin conjunta de las variedades del Mediterrneo Occidental (Marruecos, Espaa y Portugal). Tambin dentro de pases se han encontrado pautas geogrficas de asociacin. Por ejemplo, la agrupacin separada de la mayora de las variedades espaolas de la zona de Levante en comparacin con el resto de las variedades de nuestro pas, las variedades de la parte interior de Albania se agruparon separadamente de las variedades de la costa y la mayora de las variedades sirias de la parte central de este pas se agruparon conjuntamente.

Escala logaritmica
1000

No. de pares indistinguibles (Xk)

100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Tamao de muestra

Figura 2. Estimacin del nmero estadstico de pares de variedades indistinguibles (Xk) cuando se aplica uno o varias combinaciones de cebadores en un nmero creciente de variedades.

Figura 3. Identificacin de las variedades espaolas con distintas combinaciones de cebadores. 3.4. Evaluacin de la variabilidad intracultivar con marcadores RAPD Arbequina Para este estudio se emplearon 64 cebadores RAPDS. De los 10 clones evaluados, se encontraron diferencias en tan slo 2 (denominados C3 y C12). El polimorfismo encontrado para los RAPDs entre los clones y la variedad original fue del orden de 33% (26 % entre C3 y la variedad original y 16% entre C12 y la variedad original). El 45% del polimorfismo de los RAPDs se debi a bandas presentes en los clones polimrficos y ausentes en la variedad original. El alto polimorfismo observado (comparable con el polimorfismo observado con estos marcadores entre los individuos procedentes de un cruzamiento y los posibles parentales) y la presencia de bandas polimrficas ausentes en la variedad original exluyen la posibilidad de mutaciones somticas y de autofecundacin. Nuestros resultados sugieren el cruzamiento intervarietal como origen de las diferencias entre los clones y la variedad Arbequina. Manzanilla de Sevilla Al igual que en el caso de Arbequina se encontraron tan slo 2 clones diferentes (31 y 44) de los 10 evaluados. El polimorfismo encontrado entre los clones y la variedad original fue bastante bajo 4.5% (3.4 % entre 31 y la variedad original y 2.2% para el clon 44). Una parte de este polimorfismo se debi a bandas presentes en los clones polimrficos y ausentes en la variedad original. El nivel muy bajo del polimorfismo encontrado y la presencia de bandas polimrficas ausentes en la variedad original exluyen la hiptesis de cruzamientos intervarietales y de autofecundacin. Nuestros resultados sugieren la presencia de mutaciones somticas como origen de las diferencias entre los clones y la variedad Manzanilla de Sevilla. A su vez estos resultados indican que se puede encontrar variabilidad intracultivar en olivo mediante el empleo de marcadores RAPD pero cuando se encuentra dicha variabilidad es muy baja.

CONCLUSIONES
La caracterizacin morfolgica junto con el desarrollo y empleo de marcadores de ADN (RAPDs) ha permitido que la mencionada coleccin sea la mejor identificada de las existentes y se considere en la actualidad la coleccin de referencia a nivel mundial. Por otro lado, dicha informacin ha permitido la actualizacin del ndice de denominaciones varietales del banco (356 variedades de 17 pases).

La incorporacin de marcadores de ADN (RAPDs) ha demostrado ser de gran utilidad para el buen manejo del Banco de Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba ya que ha permitido: Identificar nuevas accesiones antes de su establecimiento en campo. Confirmar y detectar homonimias y sinonimias existentes entre variedades de la misma o diferente procedencia geogrfica. 3. Identificar inequvocamente un elevado nmero de variedades con un reducido nmero de cebadores (215 cvs con 6 cebadores). Por otro lado, el elevado poder discriminante obtenido para los cebadores seleccionados permiten identificar tericamente un nmero casi ilimitado de variedades. 4. El empleo de marcadores de ADN (RAPDs) han aportado informacin sobre las relaciones genticas entre las variedades del Banco Germoplasma Mundial de Olivo de Crdoba. Dicha informacin junto con la informacin agronmica del banco est siendo utilizada para la seleccin de genitores en el programa de mejora gentica que se desarrolla en Crdoba por miembros de la Universidad, CIFA y CSIC. Los marcadores RAPD se han mostrado de utilidad para discriminar entre clones de la misma variedad lo que contribuye a la defensa de los derechos de obtentor de la seleccin clonal. En olivo, la identificacin y certificacin de material vegetal de vivero es muy importante en estos momentos de gran actividad viverstica y donde el material circula entre regiones y pases. El screaning del banco con marcadores RAPD ha permitido definir la combinacin de cebadores que permiten la identificacin segura, rpida y econmica de las principales variedades que se estn propagando comercialmente en Espaa. En este sentido, dichos resultados se estn utilizando para la realizacin del "Plan Experimental para la obtencin y control de plantas certificadas del olivo" puesto en marcha por la Consejera de Agricultura y Pesca de la Junta de Andaluca y dentro del cual se ha de realizar la certificacin de la identidad varietal del material vegetal seleccionado. AGRADECIMIENTOS 1. 2.

Este trabajo ha sido financiado por el Instituto Nacional de Investigacin y Tecnologa Agraria y Alimentaria por el proyecto CAO98-001 y por el proyecto europeo FAIR-CT95-0689).

SUMMARY
The identification of olive cultivars is crucial to safeguard the genetic patrimony of the species, as well as to complete the objectives of cross breeding and to certify nursery plants. Morphological description of the denominations that have entered in production in the World Germplasm of Cordoba (320 cultivars) has been completed. The cultivar authenticity of the different trees belonging to the same variety has also been confirmed using as control authentic samples coming from the countries of origin of these cultivars. It has been optimized the methodology of DNA extraction and PCR amplification conditions starting from protocols used in other vegetable species. A great variability was found in the olive germplasm evaluated (215 cvs of 17 countries) by means of 30 selected primers. The high polimorfism level that oscillated from 71% (Albania) to 93% (Mediterranean Bassin) is a consequence and at the same time a testimony of the great diversity found in the species. RAPD markers has shown to be of great utility for the good management of a germoplasm bank. In this meaning, plant material obtained from collecting expeditions (Syria) as well as from other collections (Albania) has been identified by these markers. At the same time, RAPD markers has confirmed the existence of differences among cultivars that were locally designated by the same generic denomination (as 'Manzanilla', ' Lechn', ' Gordal', ' Picual', ' Alameo' etc.). The use of RAPDs has allowed the confirmation and the detection of synonymy cases up to now not mentioned. The high discrimination capacity of RAPD markers in olive has made possible the reliable identification of all the genotypes analyzed (215) by the combination of only 6 primers. The evaluation of the discrimination power of each primer on a representative sample of Mediterranean Bassin (103) indicates that an almost unlimited number of cultivars can theoretically be identiified by a small number of primers (5). Associations between the cultivars and their geographical diffusion have been observed in all the geographical areas studied. The results obtained in the study of individuals coming from works of clonal selection, indicate that it is possible to find intracultivar variability in olive by means of RAPDs but the variability found is very low.

Key words: Olive, Germplasm, Cultivar Identification, RAPDs. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Angiolillo, A., M. Mencuccini, and L. Baldoni 1999. Olive genetic diversity assessed using amplified fragment length polymorphisms. Theor. Appl. Genet. 98:411-421. Barranco, D. and L. Rallo 1984. Las variedades de olivo cultivadas en Andaluca. Ministerio de Agricultura, Junta de Andaluca, Madrid, Spain.

Belaj, A., I. Trujillo, R. de la Rosa, L. Rallo, and M.J. Gimnez 2001. Polymorphism and discriminating capacity of randomly amplified polymorphic markers in an olive germplasm bank. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126:64-71. De la Rosa, R., C. James, and K.R. Tobutt 2002. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite in olive (Olea europaea L.) and their transferability to other genera in the Oleacea. Primer note. Mol. Ecol. In press. Lavee, S. 1994. Porqu la necesidad de nuevas variedades de olivos?, p. 29-37. In: Olivicultura. Fundacin "La Caixa"-Agrolatino, Barcelona, Spain. Rallo, P., G. Dorado, and A. Martin 2000. Development of simple sequence repeats (SSRs) in olive tree (Olea europaea L.). Theor. Appl. Genet. 101:984-989.