ANALISIS DE FLUJOS METABOLICOS EN BACILLUS SUBTILIS

I. INTRODUCCION.Bacillus subtilis es el microorganismo Gram + mas ampliamente estudiado. Sin embargo, por mucho tiempo se postuló que era un microorganismo estrictamente aerobio y por tanto existen relativamente pocos estudios en condiciones anaeróbicas e inexistentes en condiciones controladas en fermentadores. Desde el punto de vista cinético, estequiométrico y energético no se conoce a detalle como crece y que vías de fermentación son activas en presencia de nitrato como aceptor de electrones, así mismo no se sabe si esporula o sí inicia este proceso en estas condiciones, Durante el crecimiento de B. subtilis en glucosa, sin limitación de oxígeno, se produce ácido acético como subproducto. Esto sucede como respuesta a un exceso en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un incremento en el flujo glicolítico a ácido pirúvico, el cual la célula es incapaz de utilizar en su totalidad para biosíntesis en el ciclo de Krebs (Phalakornkule, et al., 2000; Blencke, et al., 2003). Este fenómeno ocurre cuando existe glucosa en el medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de la proteína CcpA (proteína de control catabólica), regiones reguladoras CRE (elementos de respuesta catabólicos) en los promotores de algunos genes entre los cuales están ackA y pta (acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la vía de producción de ácido acético e incluyendo también algunos genes de las rutas del catabolismo de la glucosa (Prescan-Siedel et al., 1999). En estudios empleando modelos de flujos metabólicos desarrollados para la cepa 168 de B. subtilis, se encontró que en cultivo continuo limitado por glucosa, el flujo de carbono (milimoles de carbono/gCélula-h) al través de la ruta de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y la síntesis de las enzimas que componen el ciclo, se incrementa conforme aumenta la velocidad de crecimiento, siendo drásticamente reprimidas solamente a velocidades de crecimiento muy altas como las que se observan en el crecimiento por lote (0.6 h-1) y conforme la concentración de glucosa se incrementa (Goel et al., 1993). La proteína CcpA también esta involucrada en la fuerte represión que

(1991) cultivando a Bacillus licheniformis en condiciones anaeróbicas. et al. subtilis . por lotes o en continuo. 1999). Figure 1: Metabolic Network of B.ocurre en casi todos los genes necesarios para el ciclo de Krebs (Tobisch. Haciendo uso de esta metodología. de balances estequiométricos.. Por medio de la velocidad de crecimiento. es posible calcular las velocidades específicas (flujo metabólico) y el porcentaje de la fuente de carbono que es catabolizada por la glicólisis y el ciclo de las pentosas. de consumo de glucosa y la acumulación de los metabolitos formados en condiciones anaerobias. este procedimiento fue inicialmente propuesto por Papoutsakis y Meyer (1985). Bulthuis et al. encontraron que hasta un 52 % de la glucosa es metabolizada por la vía de pentosas.

Se introdujeron los datos obtenidos de la ruta metabolica de bacillus subtilis en el programa excell. 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 G6P R5P GAP 3PG PEP Pyr OAA AKG NADH FADH r1 -1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 2 r2 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 1 0 3 r3 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 4 r4 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 5 r5 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 1 0 6 r6 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 7 r7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 8 r8 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 9 r9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 10 r10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 11 r11 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 AcCoA 0 MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES 12 G6P R5P GAP 3PG PEP Pyr OAA AKG NADH FADH 1 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 13 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 16 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 17 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0 19 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 22 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 23 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 AcCoA 0 MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS12 REACCIONES (12 AL 23) ..II. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS 1.

2.-Siguiendo los datos extraídos del paso anterior. se dispuso a utilizar el programa Matlab. con el cual se añadieron los siguientes: .

. en comando se obtuvo lo siguiente: .3.Al correr el programa.

. ya que permite organizar el conocimiento metabólico de un microorganismo en una red de reacciones bioquímicas y provee una medida del grado de ajuste entre varias vías metabólicas (Varma y Palsson.. CONCLUSIONES  El calculo de flujos desconocidos se da por la siguiente formula : En matlab se aplico: % flux calculation qc=-inv_S_C * S_M * qm donde S_c : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES S_M : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS REACCIONES(12 al 23) Q_M : QUE CONTIENE LOS FLUJOS MEDIDOS  El cálculo de flujos metabólicos es una herramienta de la ingeniería metabólica y una determinación fundamental en estudios cuantitativos de fisiología celular.III. es importante que la consistencia de los datos sea . 1997.. 2002).  Una poderosa herramienta para la determinación de los flujos en la red de reacciones bioquímicas es el análisis de flujos metabólicos (AFM). 1995. 1994. 1998. cuando las condiciones ambientales cambian los flujos metabólicos son redistribuidos de manera que se mantenga el balance de óxido-reducción en la célula (Varma y Palsson. Nissen y col. 1998).  El grado de ajuste entre vías metabólicas se entiende como la producción de intermediarios en unas y el consumo de los mismos en otras. en el cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo estequiométrico que describe la bioquímica del microorganismo (Jørgensen y col. Torres y Voit. Stephanopoulos y col. Nielsen. Sin embargo.. 1994. Stephanopoulos y col. por ejemplo. ya que el análisis cuantitativo del metabolismo requiere datos experimentales. 2001).

confirmada. antes de utilizarlos en la determinación de flujos metabólicos (Stephanopoulos y col. En éste último caso. el modelo estequiométrico y los flujos extracelulares medidos permiten calcular.  Se utilizo el comando “length” que devuelve el número de componentes de un vector. Para usar esta función debe definir el vector antes de llamar a la función. flujos extracelulares no medidos o incluso algunos que sí fueron medidos pero fueron intencionalmente omitidos en los cálculos. 1998).  En algunos casos. el grado de concordancia entre los flujos medidos y las predicciones del modelo. que define la cantidad de elementos máximos que tiene un vector.  Lista de reacciones : Glucose + ATP = glucose-6-P + ADP Glucose-6-P + 2NADP = ribulose-5-P + C02 + 2NADPH Ribulose-5-P = ribose for nucleic acid Ribulose-5-P = 3 fructose-6-P + 5 TP 2 1 Glucose-6-P = fructose-6-P Fructose-6-P + ATP = 2 TP + ADP TP = triglycerides PEP = pyruvate + ATP Pyruvate = AA (from pyruvate pool) Pyruvate = organics (other than acetate) Pyruvate + NAD = ACoA + C02 + NADH ACoA = AA (from ACoA pool) ACoA = membrane ACoA + ADP = acetate + ATP ACoA + OM = isocitrate Isocitrate + NADP = a-KetoG + C02 + NADPH a-KetoG = AA (from a-KetoG pool) a-KetoG + FAD + GDP + 2NAD = OAA + C02 + FADH + GTP + 2NADH .. además de los flujos intracelulares. pueden servir para validarlo.

Bailey. 1979.3 ADP + iy = 1. S.Aiba. JE 1991. . M.3 ATP) + FAD  Las especies consideradas son las siguientes: Glucose Glucose 6-P Ribulose 5-P NA (from ribose) Fructose 6-P Cell wall AA (from Glucose pool) TP Triglycerides PG AA (from PG pool) NA (from PG pool) PEP AA (from PEP) Pyruvate AA (from pyruvate) IV.3 ADP) + 502 = . Towards a science of metabolic engineering. Biotechnol. Matsuoka.(1. Science 252: 1668. Bioeng.(1. Identification of metabolic model: Citrate production from glucose by Candidu lipolytica.3 ATP + NAD FADH + .OAA = NA (from OAA pool) OAA = AA (from OAA pool) Pyruvate + C02 = OAA NADH + 1. Organics (other than acetate) ACoA AA (from ACoA pool) Membrane Acetate Isocitrate a-KetoG AA (from a-KetoG pool) OAA Nucleic acid (from OAA pool) NADPH NADH FADH C02 02 REFERENCIAS . 21: 1373-1386.1675 ..

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