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Universidad Nacional del Comahue Facultad de Ingeniería IDEPA - Instituto de Investigación y Desarrollo de la Patagonia Norte CONICET-UNCo

Área disciplinaria: III. Competitividad y Diversificación Sustentable de la Producción Agropecuaria BIOTECNOLOGÍA DE LEVADURAS APLICADA A LA INDUSTRIA FRUTÍCOLA Y VITIVINÍCOLA DE LA PATAGONIA NORTE Autores: J. S. Saez, M. C. Lutz, M. C. Sosa, C. A. Lopes y M. P. Sangorrín Correos electrónicos: julieta.saez@conicet.gov.ar, mclutz@conicet.gov.ar

Palabras clave: biocontrol con levaduras, vinos, peras.

INTRODUCCIÓN En los valles irrigados de las provincias de Río Negro y Neuquén (Patagonia Norte, Argentina), se localiza la principal área productora de manzanas y peras de la Argentina, siendo de esta última producción, primer país exportador mundo. Otra tendencia notable de los últimos años es el incremento en la superficie destinada al cultivo de vides para vinificación y la implantación de nuevas bodegas. Ambas actividades son afectadas por la presencia de organismos indeseables que reducen la calidad y rentabilidad de los productos. En el proceso de vinificación existen especies de levaduras contaminantes capaces de producir defectos en los vinos, siendo la más conocida Dekkera bruxellensis. El deterioro del vino por parte de las levaduras puede relacionarse con la síntesis de altas concentraciones de sulfuro de hidrógeno u otros compuestos volátiles, ácido acético, varios ésteres y fenoles. Estos compuestos dan aromas desagradables, disminuyen o enmascaran los aromas frutales o florales propios de la uva o aportados por las levaduras durante la fermentación, e incluso producen cambios en el color del vino y en su estructura en la boca (Stratford, 2006). El desarrollo de levaduras indeseables puede ocurrir en distintas etapas durante la producción del vino. En todo caso, el manejo de estas contaminaciones en la bodega es complejo debido a que es prácticamente imposible su erradicación y su detección suele realizarse en forma muy tardía. Los métodos de control más comúnmente utilizados son: la higiene de equipos, cubas y barricas (uso de ozono), filtraciones y uso de ácido sórbico, ácido benzoico y dióxido de azufre. Sin embargo la utilización de estos últimos compuestos, en particular el dióxido de azufre, debe estar rigurosamente controlada debido a que altos niveles de estos en el vino pueden causar cambios organolépticos indeseados e incluso han sido relacionados con riesgos para la salud humana.

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y Botrytis cinérea. es susceptible a diferentes enfermedades fúngicas. bruxellensis y especies relacionadas.1.La pera durante su vida postcosecha (6 – 7 meses a -1º/0º C).1. Calvo et al. Sin embargo. se colectaron dos muestras de vinos con defectos provenientes de una bodega familiar (EP) del Alto Valle del río Negro (AVNR). En un primer muestreo. un 60% de los fungicidas usados habitualmente presentan riesgos oncogénicos para los consumidores (Leverentz. 3) son genéticamente estables y efectivas en bajas cantidades. Esta estrategia. Según la U. Las levaduras son organismos ideales paras ser usadas como antagonistas. Las levaduras de la especie Dekkera bruxellensis son responsables de serias pérdidas económicas en la industria del vino debido a su habilidad para producir compuestos fenólicos (Loureiro & Malfeito-Ferreira. Biocontrol de levaduras contaminantes en vinos 1. alícuotas de los vinos fueron inoculadas en medios líquidos de enriquecimiento y selectivos (Roccato et al. Un número representativo de colonias. resulta una de las alternativas más prometedoras para la sustitución de productos químicos. la búsqueda de especies contaminantes se basó en técnicas descriptas para D. sumado a la fuerte demanda social de alimentos sanos y con menos residuos químicos y una gran preocupación por la preservación del ambiente. micotoxinas u otros metabolitos que puedan comprometer la salud humana (Wan & Tian 2006. ocasionadas por Penicillium sp. en este trabajo se pretende desarrollar un sistema de biocontrol basado en el uso de levaduras indígenas o de sus principios activos para ser aplicados en la industria vitivinícola y en la poscosecha de frutas de pepita. debido a que: 1) pueden ser aisladas de los mismos alimentos que se quieren preservar. Estos cultivos se aislaron en los mismos medios sólidos descriptos anteriormente. 2) pueden utilizar un amplio rango de nutrientes y muchas pueden crecer a baja actividad de agua y bajos niveles de oxígeno. En este contexto. 2007).S. 2006).1. 2001 y Couto et al. 1. esta medida está siendo actualmente revaluada debido a los problemas de toxicidad provocados para el hombre y a la aparición de resistencias. Se destacan las podredumbres generadas por el “moho azul” y “moho gris”. dos de los ejes productivos de la Patagonia Norte. National Academy of Sciences. Para evitar el aislamiento de levaduras del género Saccharomyces (mayoritarias en vino). Ante las necesidades y exigencia planteadas. El uso de fungicidas sintéticos ha sido tradicionalmente la medida de control de estas enfermedades. proveniente de cada vino y de cada medio de cultivo fue aislado e identificado utilizando el método ITS- 2 . 2002). Aislamiento de levaduras contaminantes. En paralelo. propuesta a mediados del siglo XX. 4) tienen capacidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas y 5) no son patógenas y no producen esporas alergénicas. de acuerdo a su morfología y frecuencia. el control biológico de agentes contaminantes o patógenos en los alimentos. El aislamiento de levaduras contaminantes a partir de estas muestras se realizó por filtración del vino problema y posterior siembra en dos medios selectivos: GPY + cicloheximida + antibiótico (Medio 1) y GPY + carbonato de calcio + antibiótico (Medio 2). está aun hoy en desarrollo y solo unos pocos agentes de control biológico se encuentran disponibles en el mercado mundial. DESARROLLO 1. 2005).

Z. mientras que en los racimos dañados de estas zonas. aislándose con frecuencia de uvas. La levadura P. bruxellensis en el muestreo realizado. Nosotros hemos comprobado en que está relacionada con la producción de etilfenoles en mostos (Lopes et al. 2008). Los hisopos fueron posteriormente colocados en tubos con Medio 1 e incubados en agitación a 26 ºC. Alícuotas del cultivo fueron sembradas en los medios selectivos utilizados previamente. Sólo dos especies de levaduras fueron detectadas en ambos vinos y en los diferentes medios de cultivo utilizados: Pichia manshurica y Saccharomyces cerevisiae. tanto de zonas sombrías como luminosas. Resultó necesario evaluar si existía una única cepa o varias las causantes de esta alteración y si éstas podrían desarrollarse en vino y producir fenoles volátiles de manera diferencial (punto 1. uvarum fueron detectadas únicamente en una pileta cada una (8%). mostos y equipos de bodegas (Lopes et al. se aislaron a partir de superficies de los filtros utilizados en la bodega las especies P. Por ello. como fuente de potenciales antagonistas de las levaduras contaminantes. probablemente relacionada a defectos en los vinos analizados. granizo. 2009). membranifaciens.).RFLP descripto por Esteve-Zarzoso et al.4.) en el viñedo.4. cuatro en estadios medios y tres en el final de la fermentación. se procedió a la búsqueda de nuevos aislamientos de levaduras killer distintas a S.1.). guilliermondii. se incorporaron al trabajo 23 aislamientos de P. H. (1999). manshurica no había sido caracterizada hasta el momento como contaminantes de vinos. Sangorrín et al. Para evaluar la presencia de levaduras contaminantes en el viñedo. se procedió al hisopado de la superficie de 13 tanques de fermentación vacíos. etc. ya descritos por el grupo de investigación como productores de características indeseable en vinos. 1. 1.2. Se utilizaron medios sólidos selectivos para levaduras noSaccharomyces: Agar lisina (YCB + lisina + antibiótico) y GPY + cicloheximida + antibiótico. en un segundo muestreo se tomaron racimos sanos y dañados (daños por pájaros. Se recolectaron 12 bayas por racimo que se incubaron en el medio selectivo antes mencionado. Botrytis. en cambio las especies P. guilliermondii del cepario NPCC (North Patagonian Culture Collection) aislados de superficie de uvas y diferentes mostos de fermentación. manshurica. La identificación de los aislamientos se realizó por ITS-RFLP. hellenicus y Pichia guilliermondii. Búsqueda de nuevas levaduras killer adaptadas a condiciones de vinificación. En el 38% de las piletas no se obtuvieron aislamientos de levaduras. 2007. Estos resultados indicarían que la especie P. Por otra parte. manshurica y P. Candida boidinii se detectó en el 62% de las piletas. Se obtuvieron 3 . Rhodotorula mucilaginosa y H. está radicada en la bodega. No se encontró ningún aislamiento de D.1. se procedió al estudio de esta especie como agente contaminante de vinos (producción de compuestos fenólicos y resistencia a factores de stress típicos en vinificación.3. En los racimos sanos de zonas sombrías sólo se aisló Hanseniaspora uvarum. 2001). como así también a conocer la fuente de contaminación (viñedo o superficie de bodega). Para el aislamiento a partir de superficies de bodega. Esta especie encuentra ampliamente extendida en la región vitivinícola Patagónica. En una bodega (HC) del AVRN se muestrearon ocho tanques de fermentación: dos en estadios iniciales. Si bien el laboratorio ya contaba en la NPCC con una amplia colección de levaduras aisladas de ambientes de bodega con capacidad killer (Sangorrín et al.2. Para enriquecer el estudio con levaduras contaminantes poco estudiadas. Se detectaron las mismas especies tanto en racimos sanos como dañados provenientes de las zonas luminosas del viñedo: Hanseniaspora uvarum y Zygoascus hellenicus. punto 1. cerevisiae capaces de tolerar las condiciones de stress producidas durante la fermentación. uvarum. 1.

siendo el perfil B el mayoritario. P. Schizosaccharomyces pombe y H.003 ppm de biotina. Por otro lado. respuesta a estrés permitieron conocer la capacidad potencial como contaminantes de las cepas de estas especies para la industria vitivinícola.3 ppm de tiamina y 100 ppm de ácido p-cumárico) de todos los aislamientos de P. P. manshurica y cuatro de P.5. 0.074 mg/L de 4-etilfenol y 2.51 aislamientos que fueron identificados por ITS-RFLP como: Metschnikowia pulcherrima. manshurica y cuatro de P. temperatura. Los parámetros evaluados fueron: pH. SO2 libre y etanol. Los datos obtenidos fueron procesados mediante Análisis de Los patrones de Coordinadas Principales (ACoP) para evaluar las relaciones entre los aislamientos. 1. Se midió el crecimiento cada 20 días por DO a 640 nm. (51 aislamientos) y a otras provenientes de la NPCC (43 cepas) con el objetivo de seleccionar potenciales levaduras antagonistas.4. 1. azúcar. 0.B. fueron evaluados en su capacidad tolerar las condiciones de estrés presentes en el proceso fermentativo por medio de ensayos en placa (Belloch et al. manshurica. guilliermondii logró desarrollar. Wickerhamomyces anomala.6% etanol) esterilizados por filtración y adicionados con 100 mg/L de ácido p-cumárico (precursor de fenoles volátiles 4-vinilfenol y 4-etilfenol) se inocularon independientemente con tres aislamientos de P. 2009b). Ensayos de biocontrol por interacciones killer. guilliermondii (Lopes et al. 2008). membranifaciens y P.2. mientras que para P. Evaluación de características indeseables de las levaduras contaminantes. Se caracterizaron a nivel intraespecífico los aislamientos de P. 1% fructosa. guilliermondii. guilliermondii también se obtuvo un perfil único de RFLP-mtDNA. los aislamientos de P. 2008). membranifaciens. Por otro lado. se identificaron las cepas más peligrosas. Frascos conteniendo 70 mL de vino (12. De la NPCC se emplearon 14 cepas de M. Se evaluó la sensibilidad de las especies contaminantes frente a las levaduras killer aisladas del punto 1. membranifaciens y P. se realizaron cultivos en 20 mL en medio sintético (YNB. membranifaciens representativos de cada perfil mitocondrial. membranifaciens y P.6±0. Se evaluó por HPLC la producción de compuestos fenólicos derivados del ácido p-cumárico luego de dos meses de incubación (Salameh et al. 10% etanol. Se detectaron valores promedio de 0.D). una de P. Se obtuvo un perfil único de RFLP-mtDNA para todos los aislamientos de P. para P.3. guilliermondii aislados de la región. manshurica mientras que ninguno de P. membranifaciens se obtuvieron 4 perfiles (A. manshurica y P. y en conjunción con su producción de fenoles volátiles. tanto los provenientes de ambas muestras de vino como así también de las muestras de filtro. guilliermondii mediante RFLP-mtDNA. P. anomala. Para evaluar la capacidad de producir compuestos fenólicos en condiciones más controladas y homogéneas.C. uvarum. A los 60 días pudo corroborarse el crecimiento de la mayoría de los aislamientos de P. 1. Se evaluará próximamente el consumo del precursor ácido p-cumárico y la producción de fenoles volátiles por HPLC. manshurica. membranifaciens seleccionadas por su alta capacidad de producir fenoles volátiles y por su alta tolerancia a las condiciones 4 . pulcherrima.4 mg/L de 4-vinilfenol. 13 de T. manshurica. evidenciando por primera vez la capacidad de estas especies de levadura de producir estos compuestos en condiciones de vinificación. Torulaspora delbrueckii. delbrueckii y 16 de W. Como levaduras contaminantes se emplearon tres cepas de D. Caracterización de levaduras. cuatro cepas de P.7±3. bruxellensis (cepa tipo y de otros orígenes).

L. Se consideró cada fruto como una unidad experimental y se realizaron 4 réplicas de cada agua de lavado. 2001). Los frutos se conservaron a 4 ° C durante 50 días. se continuó el estudio de las toxinas producidas por T. Se evaluó la incidencia de la enfermedad (número de frutos enfermos con respecto al total de frutos inoculados) y la severidad (diámetro promedio de la lesión). Biocontrol de Penicilium expansum y Botrytis cinerea con levaduras antagonistas en pera 2. A partir de estas peras. Pichia guilliermondii Cepa killer NRRL Y-2075 USACH L3003 NPCC 1055 NPCC 1070 Dekkera bruxellensis NRRL Y-1411 CECT 2113 INTA VC20 P. Para la obtención de levaduras con potencial antagónico se empleó un protocolo de aislamiento selectivo basado en la metodología propuesta por Wilson et al. pulcherrima NPCC 1144 (aislada en el punto 1. Se utilizó el método de precipitación de proteínas con 80% de sulfato de amonio. anomala NPCC 1027 presenta una actividad killer superior al 90% frente a las doce cepas contaminantes (Tabla 1). NPCC 1038 W. CECT: Colección española de cultivos tipo. azucares. se tomaron muestras tanto de heridas sanas (realizadas artificialmente en el momento de entrada de la fruta al frigorífico) como de superficie de frutos. Las aguas de lavado obtenidas de las distintas muestras se inocularon en heridas de frutos sanos desinfectados superficialmente en las que posteriormente se colocó una suspensión de 10 conidios/mL de Penicillium expansum. membranifaciens NRRL Y-2026 INTA K21 USACH L2810 NPCC 1099 P. pulcherrima NPCC 1144. En particular W. aunque se continua profundizando el estudio en condiciones de fermentación. pH. Sensibilidad de las levaduras contaminantes de vinos frente a las levaduras killer seleccionadas. Los criterios de selección fijados en esta etapa 3 5 . y se corroboró la actividad killer sembrando una alícuota de este extracto en well en medio YPD-MB sólido inoculado con Candida glabrata 1x10 5 cél/mL. (1993). 2. Se evaluó la actividad y estabilidad de las dos toxinas a parámetros de interés enológico: etanol.2. procedentes de dos sistemas productivos distintos (producción orgánica y transición) luego de 150 días de conservación frigorífica (0/-1ºC). Las dos toxinas fueron estables a las condiciones de vinificación de estos parámetros. T. Mendoza.1. pulcherrima NPCC 1144 % Sensibilidad + + 67 + + 67 + + + 100 + + 67 + 33 + + + 100 + + + 100 + + 67 + 33 + + 66 + + 66 + + + 100 NRRL: ARS Culture Collection.ma: P. Se utilizaron peras de los cvs.). anomala NPCC 1027. delbrueckii NPCC 1032 y W. temperatura y dióxido de azufre. P. de Cuyo. USACH-L: Colección Univ de Santiago. manshurica Se procedió a la producción de los extractos crudos extracelulares de las tres cepas seleccionadas. Estos datos nos permiten asegurar que ambas toxinas resultarán interesantes para ser utilizadas en enología. anomala NPCC 1027 por su capacidad inhibitoria frente a varias cepas de las diferentes especies contaminantes evaluadas. delbrueckii NPCC 1032 y W. Al finalizar los ensayos se seleccionaron las cepas: M. Se utilizó el método de inhibición de crecimiento en placas de GPY-MB (Sangorrín et al.de stress enológico. Debido a la dificultad que presentó la producción del extracto crudo de M. Aislamiento de levaduras antagónicas. INTA: Collecion INTA. USA. delbruekki NPCC 1032 M.ma. Peoria. Chile. Packham´s Triumph y Beurre D´Anjou. anomala NPCC 1027 T. y considerando que esta especie fue la menos eficaz frente a las especies contaminantes (Tabla 1). Tabla 1.

el 65% fueron obtenidas de heridas.86 1.74%). Cryptococcus tephrensis (7. cinerea (aislamientos DP23 y DB16. que fueron seleccionados por su virulencia y resistencia a fungicidas) fueron inoculados en las mismas heridas a la CMI de cada uno. El 57.61%). expansum hasta los 210 días.89%). Packham's Triumph.48 a b b a b Organic Packham´s 0. lo que demuestra que la probabilidad de encontrar microorganismos con capacidad antagónica aumenta cuando el aislamiento original procede de heridas sanas. Para ello. dos tratamientos químicos (Tiabendazol y Captan) fueron llevados a cabo con fines comparativos.8S-ITS2 rDNA. Cryptococcus victoriae (15.45 3. siguiendo la técnica de Esteve – Zarzoso et al. expansum o B. De ese total.67%). representantes de las 11 especies identificadas. La identidad de un aislado representativo de cada especie fue confirmada por secuenciación del dominio D1/D2 del gen del 26S del rDNA. Cystofilobasidium infirmonimatum (4.72 2. Origen H eridas sanas Superficie T ransición Packham ´s 8. 6 6 . Tipo de Producción. Cultivar de pera. cinerea es mayor que la de P. Se emplearon 5 frutos por tratamiento. Cryptococcus albidus (14. 2. Rhodotorula glutinis (3.80%) y Rhodotorula mucilaginosa (1. Candida patagónica (3.59 b a D´Anjou 2.45 6. Los frutos se incubaron en cámaras de almacenamiento comercial (-1/0ºC) y se evaluó periódicamente la incidencia y severidad de la enfermedad correspondiente.52 7. expansum a la temperatura de conservación de la fruta.74%). No se encontraron diferencias en la proporción de levaduras recuperadas con respecto al cultivar ni al tipo de procesamiento productivo de origen. Un total de 107 levaduras fueron aisladas a partir de heridas sanas previamente inoculadas con las aguas de lavado (Tabla 2).28 % de las aguas de lavado empleadas respondieron a los criterios fijados.86 9.fueron: 1) reducción en más del 50 % de incidencia de la enfermedad y 2) reducción en más del 60% del diámetro de la lesión. (1999). Rhodothorula laryngis (5. Además. con una herida por cada uno de ellos. se consideraron distintos tiempos de incubación en cada caso. cinerea la evaluación del efecto antagónico se evaluó hasta los 100 días.48%).87%).62 0. Pichia membranifaciens (2.59 1. se inocularon 20 µl de una suspensión de 10 células/mL de la levadura a analizar en una herida (3x3 mm) realizada en la zona ecuatorial de peras sanas con madurez fisiológica sanitizadas del cv.44% de los aislamientos provino de heridas. El 23. Debido a que la velocidad de desarrollo de la podredumbre causada por B. mientras que en frutas inoculadas con P. Se evaluó la actividad antagónica individual de 33 aislamientos de levaduras: 10 de superficie de fruta y 23 de heridas. Selección de las levaduras antagónicas. Bioensayo.78%). Cryptoccocus weringae (8.76 23.28 .72 4.31 D ´Anjou 3. Posteriormente. 10 µl de una suspensión de conidios de P. Los aislamientos fueron identificados mediante PCR-RFLP de la región ITS1-5.2.02%). Tabla 2: Aguas de lavado que respondieron al criterio de selección.9 b TO TAL 15. Las especies identificadas y la frecuencia de las mismas respecto del total fueron: Aureobasidium pullulans (31.41%). En frutas inoculadas con B.

Uruburu. membranifaciens) lograron los porcentajes más altos (60-68%). Estos aislamientos están siendo actualmente re-evaluados bajo las mismas condiciones experimentales en la actual temporada de conservación (2009-2010). 1273 y 1274.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacer. Cap... se les suman: A. W. patagónica. Orlic.. (1999) Identification of yeast by RFLP analysis of the 5. Barbosa. A. & Conway. cinerea.. expansum. se seleccionaron los cinco aislamientos con mejor comportamiento frente a B. Janisiewicz.. dado que todos ellos a su vez protegieron totalmente de la enfermedad producida por P. Belloch. 15. & Querol. & Hogg . A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts Brettanomyces/Dekkera in wines.. (2002).. A. J. C. Systematic Bacteriology 49. NPCC 1259 y NPCC 1263 (C. cinerea para los estudios posteriores. expansum. tephrensis NPCC 1254 y R. Letters in Applied Microbiology 41. Calvente.. Benuzzi. E. pullulans NPCC 1262. E.A. Los tratamientos con fungicidas presentaron 100% de incidencia de la enfermedad y menos de 10% de reducción de la severidad. M. Entre ellos. S. patagonica). 251–257. Couto. Los resultados mostrados en este trabajo y la profundización a futuro de los ensayos en condiciones de las industrias correspondientes permitirán desarrollar estrategias de biocontrol de organismos indeseables mediante el uso de levaduras o de sus principios activos. Esteve-Zarzoso. & Querol. albidus). W. los aislamientos NPCC 1249 (C. 188–195. (2007). Frente a P..T. NPCC 1248 (C. el 30 % de los aislamientos logró controlar totalmente el desarrollo de la enfermedad (0 % de incidencia). CONCLUSION Los resultados mostrados en este trabajo y la profundización de los ensayos en condiciones de las industrias pertinentes permitirán desarrollar a futuro estrategias de biocontrol de organismos indeseables mediante el uso de levaduras o de sus principios activos.Al final del período de incubación. el 29% de los aislamientos de levaduras mostró valores de 40%-68% de reducción de la severidad de la enfermedad causada por B. B. V. Biological Control on Minimally Processed Fruits and Vegetables. International Journal of Food Microbiology 122. F. D.. Los fungicidas mostraron 0% de incidencia de esta enfermedad. (2005). S. glutinis NPCC 1264. 319 – 332. NPCC 1268 (C.329-33 Leverentz. J.. A. Barrio. C. B. (2008). 505–510. victoriae NPCC 1260. International Journal of Food Microbiology 113. C. En: Microbial Safety of Minimally Processed Foods. I. International Journal of 7 . weringae) y NPCC 1250 (P. Orellano de M. Biological control of postharvest spoilage caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea in apple by using the bacterium Rahnella aquatilis. C. & Sanz de Tosetti. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Belloch. victoriae). con excepción de C. Fermentative stress adaptation of hybrids within the Saccharomyces sensu stricto complex. Calvo. Por los resultados obtenidos. A los aislamientos antes mencionados.

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