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Pruebas Bioquímicas

Lysine Iron Agar (LIA)
La descarboxilacion es el proceso por medio del cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especificas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina, una diamina y CO2. Las tres descarboxilasas mas importantes usadas para la identificación bacteriana son: lisina, ornitina y arginina. Reacción: en el proceso de descarboxilacion irreversible no oxidativo el aminoácido L-lisina sufre la descarboxilacion para dar cadaverina (una diamina) y CO2 por acción de la enzima especifica lisina descarboxilasa. El pH del medio aumenta (hacia la alcalinidad) debido a la producción de CO2 y esto lo podemos notar con el indicador purpura de bromocresol por lo tanto: Prueba positiva: Purpura turbio a un purpura amarillento apagado (producido por la cadaverina) Prueba negativa: Color amarillo claro y brillante Salmonella typhimurium : prueba positiva (purpura)

Motility Indole Ornithine (MIO)
Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. 1- Presencia de ornitina descarboxilasa

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y CO2. 2- Presencia de Indol

La desaminación y la hidrolisis tiene lugar con el agregado de una molécula de agua en presencia de la enzima triptofanasa. Primeramente ocurre una desaminacion reductiva por lo cual es extraído el NH2 del aminoácido triptófano y liberado como NH3, esta degradación del triptófano provoca la liberación de indol, Acido piruvico, amoniaco y energía. Resultados: Presencia de ornitina descarboxilasa: color amarillo a un color purpura Presencia de indol: color amarillo a color rojo Motilidad: presencia de turbidez Salmonela Typhimurium Ornitina descarboxilasa: Positivo Produccion de indol: negativo Motilidad: positivo

Sulfide Indole Motility (SIM)
Medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de ácido sulfhídrico en las bacterias miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Salmonella typhimurium da negativo a producción de indol, da positivo a movilidad y da positivo a la producción de H2S. El triptófano es un aa que puede ser oxidado por ciertas bacterias para la producción de: Indol, escatol e Indolacético, para ello intervienen un conjunto de enzimas llamadas Triptofanasa. Una enzima triptofanasa con su coenzima piridoxal fosfato, cataliza la reacción de desaminación e hidrólisis (sale -NH2 forma de NH3) del triptófano, cortando la molécula Y dando como productos: Indol, acido pirúvico y amoníaco.

Una vez que se produce Indol, éste se combina con el aldehído del reactivo (indicador) de Kovacs o de Erlich, dando un compuesto de color rojo violáceo en la superficie del medio (capa alcohólica).

En el caso de la presencia de Salmonella typhimurium no se produce éste color rojo en la capa alcohólica, la superficie sólo toma el color amarillo del reactivo de Kovacs o de Erlich. Interpretación de Resultados: Turbidez alrededor de la punción de siembra: existe movilidad de la bacteria (+). Formación de un precipitado negro (sulfuro de hierro a partir del tiosulfato): producción de ácido sulfhídrico (se debe mantener a un pH mayor a 7.2) (+). Compuesto color rojo en la superficie del medio (capa alcohólica): Producción de Indol

Malonato
Medio liquido útil para determinar la capacidad de un organismo para utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. Salmonella typhimurium da negativo a ésta prueba bioquímica. El malonato es un inhibidor enzimático, que inhibe de forma competitiva la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, y de esta forma interrumpe la oxidación del succinato a fumarato (en el ciclo de Krebs).

El ácido malónico inhibe al acido succínico porque es estructuralmente similar (análogo) a éste. Por lo que tanto malonato como el succinato compiten por los sitios activos de la enzima succinato deshidrogenasa. Cuando existe más concentración de malonato, éste encierra todos los sitios activos de la enzima y así inhibe al sustrato normal (succinato).

Al estarse llevando a cabo la inhibición por medio del malonato, se empieza a acumular succinato. Una acumulación de ácido succínico interrumpe el ciclo de Krebs así como el ciclo del ácido glioxílico, lo cual priva a la bacteria de su fuente de energía. Entonces un organismo será capaz de crecer y reproducirse sólo si puede fermentar o usar el malonato de sodio como su única fuente de carbono. Se usa azul de bromotimol como indicador de pH: Ácido: color amarillo, pH: 6 Alcalino: color azul de Prusia intenso, pH: 7.6 Nota: la alcalinidad se debe a que la cepa utiliza tanto malonato como fuente de carbono, así como sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, formándose NaOH (responsable de la alcalinidad)

Interpretación de resultados Prueba positiva: color azul claro a azul de Prusia intenso en todo el medio. Prueba negativa: no se observa cambio de color verde, o amarillo (únicamente fermentación de glucosa)

UREA
Se utiliza para determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Es una prueba útil para distinguir Proteus de otras bacterias entéricas Gram−. El sustrato urea es una diamida de el acido carbónico y todas las amidas (RCO-NH₂) son rápidamente hidrolizadas. La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica (ureasa) para dar dos moléculas de amoniaco. En solución, la urea hidroliza, dando carbonato de amonio como producto final.

La ureasa es considerada una enzima constitutiva, dado que es sintetizada por ciertas bacterias sin tener en cuenta la presencia o ausencia de su sustrato (la urea) y se clasifica como una amidasa ya que cataliza la hidrólisis de las amidas. La ureasa actúa sobre los enlaces C-N del compuesto (el nitrógeno es disociado en amoniaco), con excepción de los que contienen enlaces peptidicos. Se utiliza rojo de fenol como indicador.

El pH óptimo para la actividad de la ureasa es 7. Interpretación de resultados Los productos como el amoniaco y dióxido de carbono, alcalinizan el medio haciendo virar el rojo fenol del amarillo al rojo (rojo-rosado)

En la prueba negativa no se presenta cambio de color (amarillo), salmonella typhimurium resulta negativa para la actividad de la ureasa.

SACAROSA
En esta prueba se determina la capacidad de un organismo de fermentar (deradar) un hidrato de carbono especifico. La fermentación e un proceso metabólico de oxidación-reduccion anaeróbico en el cual un sustrato orantico sirve como el aceptor de hidrogeno final (aceptor electrónico) en lugar del oxigeno. El tipo de productos finales producido por la fermentación de lo hidrato de carbono depende de vario factores como: El tipo de organismo que lleva a cabo el proceso de fermentación, la naturaleza del sustrato que debe ser fermentado y factores ambientales como el pH y la temperatura. Algunas bacterias pueden fermentar anaeróbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras, son incapaces de utilizar la glucosa. Existen distintas clases de fermentación (alcohólica, del acido láctico, del acido propionico y fermentaciones del grupo coliforme) producidas por las bacterias, y cada una depende de los productos finales característicos formados. La fermentación acida mixta es característica de los miembros de las enterobacteriaceae y estos degradan la glucosa con formación de una variedad de productos finales. Los microorganismos acidos mixtos producen: acido formico, acético, láctico (fermentación láctica) y succínico; etanol (fermentación alcoholica) y CO₂ y H₂ pero no butilenglicol.

Fermentación alcohólica El Indicador de pH es rojo de fenol

Justificación Debido a la patogenicidad del serotipo typhimurium, merece que se le reconozca como un medio común de enfermedades de tipo gastrointestinal, lo que afecta a la población más susceptible, los estudiantes, principalmente porque éstos se encuentran expuestos a ingerir alimentos contaminados (mal preparados y/o mal procesados en su distribución). Tipo de muestreo El muestro se realizo mediante un procedimiento conocido como muestro aleatorio simple, es el procedimiento probabilístico de selección de muestras más sencillo y conocido. Consiste en la selección de la muestra de una población finita, en el que el proceso de extracción se garantiza a cada uno de los elementos de la población, tengan la misma oportunidad de ser incluidos en dicha muestra. En este tipo de muestro se seleccionan muestras utilizando números o dígitos aleatorios al azar mediante un computador o un mediante un dispositivo (calculadora) con la función RND (RAND). Tipo de estudio El estudio realizado es de tipo prospectivo de corte transversal. En un estudio prospectivo, los datos que conciernen al estudio se colectaran de acuerdo a los objetivos específicos de la investigación, mientras que en un estudio de corte transversal, la o las variables de estudio se miden en solo una vez. Comentarios y Conclusiones Podemos considerar que estos resultados son favorables y se deben a la baja prevalencia de Salmonella typhimurium (3.3%) de acuerdo a los datos obtenidos en Brasil. La detección de este serotipo en los estudiantes de la FCQB no fue posible, sin embargo esto no implica la ausencia de la bacteria en la población de estudio debido a hábitos de higiene y/o alimentación inadecuados. Resultados No logramos el aislamiento del serotipo typhimurium en las 42 muestras procesadas.