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Bloque III: Anlisis de molculas.

Metabolmica y anlisis comparativo de muestras

Organizado por:

- Prof. Javier Abada y Dra. Ana M Alvarez


Dept. Plant Nutrition, Estacin Experimental Aula Dei (CSIC)

Zaragoza, 8 de julio de 2009


Isidro Masana Agilent Technologies Especialista Productos LC/MS Divisin Biociencia y Anlisis Qumico
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

LC-MS

ICP-MS GC-MS

Mass Spec/tacular
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Isidro Masana Agilent Technologies Especialista Productos LC/MS Divisin Biociencia y Anlisis Qumico
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009

PROGRAMA:

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

1.- Breve Introduccin a la Metabolmica. 2.- Requisitos Analticos e Instrumentacin Requerida 3.- Fases de un Estudio Metabolmico por MS. 4.- Introduccin al Software Requerido en un Estudio Metabolmico por MS 5.- Ejemplos de Resultados.

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1.- Introduccin a la Metabolmica

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

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Qu es la Metabolmica?
Metabolmica es el estudio sistemtico de las pequeas molculas orgnicas (metabolitos) presentes en un sistema biolgico Utiliza el anlisis estadstico multivariante para correlacionar:
- variaciones en la concentracin de metabolitos. - con distintas propiedades de 2 o ms grupos de muestras comparadas (organismo, rgano, tejido, clula, fluido,).
Cuales son las diferencias en su composicin qumica que se correlacionan con las diferencias observadas?

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Las 4 Piedras Angulares de una Clula Viva Soluciones Agilent en Hardware y Software
2.-Transcriptoma
- Gene Expression Arrays: SplicingArrays - GeneSpring GX Resolver

1.- Genoma

RNA DNA

- aCGH Arrays ChIP on Chip Arrays - GS Genotyping CGH Analytics ChIP Analytics

Protenas
3.- Proteoma
Tcnica anlisis:

CH2OH

LC/MS Spectrum Mill y GeneSpring MS


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Metabolitos
Metabolmica comparte: Instrumentacin LC/MS con Protemica Bioinformtica GeneSpring con Prot. & Genmica

4.- Metaboloma
Tcnica anlisis:

LC/MS & GC/MS


GeneSpring MS
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Aportaciones de la Metabolmica en Investigacin Agroalimentaria


- Mejorar el Rendimiento de las Cosechas:
Mejorar su produccin. Mejorar su tolerancia a productos fitosanitarios Mejorar su resistencia a sequas, a pesticidas, Mejorar su valor nutricional.

- Optimizar el tratamiento de Alimentos


Mejorar su valor nutricional. minimizar la formacin de txicos optimizar el uso de ingredientes, nutrientes y aditivos

- Mejorar las propiedades funcionales de alimentos - Evaluar el impacto de la nutricin en los procesos biolgicos y patolgicos.
-

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Objetivos en Investigacin Biomdica


- Identificacin de nuevos BIOMARCADORES para diagnstico precoz de enfermedades - Evolucionar Medicina diagnstico-curativa (basada en el tratamiento de la enfermedad) Medicina que promueva la salud (evite la enfermedad)
- Requiere el desarrollo de una Medicina: Predictiva, Preventiva, Personalizada, Participativa - Requiere un detallado conocimiento de los procesos biolgicos/ bioqumicos que tienen lugar en el organismo y como stos estn influenciados por:
- el desarrollo de una enfermedad - la ingesta de un frmaco - la alimentacin/ dieta seguidas

- Se deber estudiar el impacto de estos factores en el perfil del genoma, proteoma y metaboloma del organismo.
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Posibles Aplicaciones NO Metabolmicas del Anlisis Comparativos de Muestras


Aplicando las mismas estrategias y herramientas analticas Descubrimiento y Validacin de Protenas como Biomarcadores. Identificar los compuestos responsables de episodios de contaminacin medio ambiental o alimentaria. Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos anmalos de un lote de productos, con su origen, con tratamientos a que han sido sometidos, Estudiar las similitudes y diferencias de composicin entre sus productos y otros semejantes en el mercado. Estudiar el impacto del tratamiento de un alimento en su composicin. Optimizar condiciones de procesos de Extraccin / Sntesis (temperatura, pH, presin,.) para maximizar su eficiencia A partir de muestras de referencia, poder clasificar/AUTENTIFICAR muestras desconocidas, materias primas, segn su origen, tipo, tratamientos a que han sido sometidas,. .
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2.- Requisitos Analticos e Instrumentacin Requerida en Metabolmica

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

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Caractersticas de los Metabolitos


El Reto para el investigador
Gran diversidad de propiedades qumicas y concentraciones:
Muy diferentes estructuras qumicas Muy distintas concentraciones y reactividades. Distintas volatilidad (mayora de analitos NO voltiles)

Amplio rango de Pesos moleculares entre 50 y 1600 Da Elevado nmero de metabolitos a estudiar:
Mamferos ~ 2.500 a 15.000 Plantas ~ 50.000 a 200.000

Los metabolitos pueden ser:


conocidos (admiten target analysis) desconocidos (NO admiten target analysis requieren mtodos
de anlisis genricos)

Complejo fondo qumico de las matrices biolgicas.


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Metabolmica y comparacin de muestras

Month07/07/2009 ##, 200X

Requisitos Analticos de la Metabolmica


Requiere tcnicas con un muy amplio rango de aplicabilidad. Muy elevada selectividad, especificidad y sensibilidad Poder cuantificar relativamente MILES de compuestos des/conocidos
100,000

Peso Molecular

10,000 LC/MS-

LC/MS API-Electrospray

APPI

El acoplamiento Cromatografa / Espectrometra de Masas (LC/MS y GC/MS) es la tcnica que ofrece mejores prestaciones para estudios metabolmicos (componentes minoritarios y
mayoritarios).

1.000

LC/MS-APCI

GC/MS
muy polar Las mismas herramientas (hardw. & soft) y estrategias aplican a anlisis comparativos de muestras en todo tipo de industria
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no polar
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Polaridad del analito/ Solubilidad en Agua

Instrumentacin Tpica LC/MS, CE/MS & GC/MS utilizada en Metabolmica:


(LC-) ICP/MS

LC/MS

TOF LC/MS

QqQ LC/MS

Metalo-metabolitos

Ion Traps LC/MS

GC/MS
HPLC-Chip

GC/MS-Q CE/MS GC/MS-QqQ Metabolitos voltiles

Quads LC/MS

Q-TOF LC/MS
Todo tipo de metabolitos

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Qu es un Espectrmetro de Masas?: Componentes y Funciones de un Sistema LC/MS, GC/MS o CE/MS


Cromatgrafo: Separacin Espectrmetro: Deteccin

HPLC
(LC)

Espectrmetro de MASAS (MS)


Fuente de Iones
Presin Atmosfrica

PC
para Control del instrumento y Procesado de la Informacin Cromatogramas & Espectros

GC
CE
D

Sistema de Filtrado de Iones segn su Masa


Alto vaco

Detector de Iones

HPLC, GC o CE: separar los diferentes componentes de la muestra para que estos lleguen al detector a distinto tiempo. MS: ionizar* los compuestos procedentes del HPLC, GC o CE y determinar su masa (m/z: masa/carga).
*Para poder ser detectadas las molculas necesitan ser ionizadas.
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TOF

Informacin Proporcionada por LC-GC-CE /MS.


Ejemplo Drogas de Abuso mediante LCMS-TOF Nota aplicacin 5989-0667EN TIC (Total Ion Chromatogram) Informacin cuantitativa: - rea pico
(TIC: no selectiva - IC: selectiva)

Informacin cualitativa (ID): -Tiempo Retencin - Espectro de Masas

4 1

IC (Ion Chromatogram) m/z 300.0-300.2 IC: CROMATOGRAMA SELECTIVO


Utilizados para cuantificacin relativa en metabolmica

Ismeros => igual m/z exacta Se requerir su separacin cromatogrfica

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Espectros LC/MS, CE/MS (Ionizacin a Presin Atmosfrica API ) versus GC/MS (Ionizacin por Impacto Electrnico - EI)
Intensidad
5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5

Clenbuterol

+TOF MS: 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent


277.087

Espectro LC/MS (API-ESI)

[M+H]+=277.0874

279.084

Contribucin del Cl(37) de aprox. 2/3 2 tomos Cl

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

m/z (masa/carga)
Abundance 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 86 OH

#103730: Clenbuterol

Espectro GC/MS (EI)


57 41 71 0 40 60 80 99 127 140 154166 190 243 259

Cl
HN H2N CH3 CH3

Cl

H3C

276

Clenbuterol
PM = 276 Da
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m/z-->
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100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

Cmo Obtener Informacin Estructural en LC/MS de Compuestos No Aislados?: LC/MS/MS


+

Sistemas LC/MS/MS (QqQ / Q-TOF / TRAP):


se fragmenta en celda de colisin o en la trampa de iones. Muy til cuando existe coelucin de compuestos (p.e. en matrices complejas)
m1 m2 m1

+ +
MS/MS del in aislado (m1) en Q1

QTOF
1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4

Filtro Masa n 1
132.0624 168.0385

Celda Colisin

Filtro Masa n 2
Cl

OH

+TOF MS: Experiment 2, 5.688 to 5.849 min from lowhigh03.wiff Agilent

203.0076 205.0046

Clenbuterol
HN H2N Cl H3C

CH3 CH3

0Cl
149.0898
133.0675 140.0202

1Cl
170.0359

2Cl

[M+H]+=277 (Clenbuterol

0.0

totalmente fragmentado) 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
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3.- Fases de un Estudio Metabolmico para Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores por MS e Instrumentacin Requerida

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

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Fases Analticas en un Estudio Metabolmico por MS


1 Fase: Comparacin de Perfiles de Metabolitos
Objetivo: localizar metabolitos diferenciales o correlacionados con propiedades de determinadas poblaciones de muestras biolgicas. Requiere automatizar la comparacin estadstica de la concentracin de miles compuestos des/conocidos en un n relativamente reducido de replicados de diversas poblaciones.
- La comparacin cuantitativa es relativa (sin patrones) - Se trabaja con mtodos genricos (MS en modo scan)

2 Fase (opcional): Identificacin de los metabolitos de inters (Qu metabolito es? slo necesario saber si hay que
interpretar las rutas metablicas).
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Fases Analticas en un Estudio Metabolmico por MS


3 Fase: Validacin de de los metabolitos de inters
- Para evaluar la variabilidad biolgica natural, se trabaja con un n elevado de replicados de las diversas poblaciones sujetas a estudio.
- Se trabaja con mtodos especficos y muy selectivos (MS/MS).

4 Fase: Interpretacin Resultados.


- Requiere la identificacin de los metabolitos de inters Metabolmica: Trabajo muy multidisciplinar; requiere de la colaboracin de mdicos, bilogos, qumicos, estadsticos, informticos,..
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8.0e6

Tipos de GC/MS segn la Fase del Estudio Metabolmico

7.0e6 6.0e6 5.0e6 4.0e6 3.0e6 2.0e6 1.0e6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time, min 20 22 24 26 28 30 Intensity, cps

1 y 2 Fase: Comparacin Perfiles e Identificacin de Metabolitos:


- GC/MS-Q en modo barrido Scan (y software de deconvolucin). Identificacin de compuestos a comparar automticamente entre muestras: - GC/MS utiliza su identificacin en bibliotecas universales de espectros.
- LC/MS requiere la especificidad y selectividad de la masa exacta.
(Los espectros LC/MS/MS dependen de las condiciones y equipo NO existen bibliotecas universales).
Abundance

OH
#103730: Clenbuterol 86 9000

Cl CH3 CH3

8000

HN H2N H3C

Clenbuterol C12H18Cl2N2O [M+H]+= 277.0874


Intensidad
5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5

M+1
+TOF MS: 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent

7000

Cl
6000

5000

4000

3000 57 2000 41 1000 71 99 0 40 m/z--> 60 80 100

Espectro GC/MS Clenbuterol M


127 190 140 154166 120 140 160 180 200 220 243 259 276 240 260 280

Espectro LC/MS Clenbuterol

277.087
279.084

Contribucin del Cl(37) de aprox. 2/3 2 tomos Cl

1.0e5

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

m/z (masa/carga)

3 Fase: Validacin de los metabolitos de inters


- QQQ (modalidad MRM) o Q (modalidad SIM)
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Tipos de LC/MS segn la Fase del Estudio Metabolmico


1 Fase: Comparacin Perfiles

Abundancia

Tiempo d retenci e n

sa Ma

/z) (m

- TOF (o QTOF en modo MS) que proporcionen masa exacta e


independiente de la concentracin del metabolito con buena sensibilidad.

2 Fase (opcional): Identificacin de los metabolitos de inters


- TOF o QTOF en modo MS buscando en bases de datos de masa exacta de metabolitos (p.e. MetLIN). - QTOF confirmar identificacin mediante MS/MS con masa exacta. RMN puede ayudar a identificar metabolitos mayoritarios.

3 Fase: Validacin de los metabolitos de inters


- Ideal QqQ en modo MRM (MS/MS). - QTOF en modo MS/MS - TOF y QTOF modo MS extrayendo cromatogramas de iones con ventanas de rango de masa muy pequeas (20-30mDa) gran selectividad.
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Fase Comparacin Perfiles. Requisitos en LC/MS: Masa Exacta


x107 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 x107 10 20 30 40 50 Counts vs. Acquisition Time (min)

Exactitud Masa (ppm) 165 ppm 10ppm 5 ppm 2 ppm

LC/MS en Metabolmica (perfilado) Requiere Masa Exacta para:


Especificidad en la comparacin.

N posibles frmulas empricas 209 13 7 2

Tecnologa QUAD/TRAP

TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extraccin de informacin especfica de cada metabolito/compuesto con mtodos de adquisicin genricos (modo barrido).

Masa Exacta independiente de la concentracin del analito. Buena Sensibilidad en modo barrido (mtodos genricos MS-SCAN).
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Fase Comparacin Perfiles: Selectividad Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta.
Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina IC: 277.1 m/z - Ventana Extracin 1 Da Clenbuterol S/N = 14

Rango extraccin tpico Cuadrupolo

LC/MS-TOF Agilent 6210

IC: 277.087 m/z - Ventana Extracin 0.016 Da S/N = 102

+/- 30ppm

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Robustez Masa Exacta Agilent QTOF & TOF: m/z independiente de la concentracin
Fipronil peak from 7.37 7.46 minutes. Instrument was run in 4 GHz mode for optimum resolution, mass accuracy and sensitivity
0.4ppm

Disponer de masa exacta robusta es clave para la especificidad y selectividad en la comparacin de resultados por LC/MS

1.8ppm

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Exactitud de Masa y Resolucin QTOF & TOF: m/z independiente de la concentracin


Mass spectrum @ RT = 7.379 min Signal height: 320.000 counts Mass deviation: 0.4 ppm

Annotations show m/z and resolution


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Exactitud de Masa y Resolucin QTOF & TOF: m/z independiente de la concentracin


Mass spectrum @ RT = 7.461 min Signal height: 500 counts Mass deviation: 1.8 ppm

La INDEPENDENCIA de la masa exacta con respecto a la concentracin facilita la comparacin entre compuestos con gran diferencia de concentracin entre las distintas poblaciones.

Annotations show m/z and resolution


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4.- Introduccin al Software Requerido en un Estudio Metabolmico por MS


x107 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 x107

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

10

20 30 40 Counts vs. Acquisition Time (min)

50

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Softwares Estudios Metabolmicos por MS


Soft. Instrumentos
Objetivo: descubrir y cuantificar todos los metabolitos ionizados

GC/MS Anlisis Preparacin Muestra LC/MS Anlisis

Soft. Comparacin Estadstica Multivariante Anlisis Estadstico Comparat.

Validacin Metabolitos

Peak Finding

Normalizacin de Datos

Potenciales Metabolitos Diferenciales


Identificar Metabolitos

Soft. Deconvolucin

Extraer automticamente la informacin para cuantificar relativamente MILES de compuestos desconocidos

Interpretacin Resultados
Soft. Identificacin Metabolitos y ayuda interpretacin resultados
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Deconvolucin 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass Hunter Molecular Feature Extractor(LC/MS)
En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo

TIC (suma de los 3) TIC & Espectro


Componente 1 Componente 2 Componente 3 Deconvolucin

Picos deconvolucionados y espectros


[M+H]+

Componente 1

[M+Na]+

Componente 2
[M+H]+

E.C.C.: Suma de intensidades de sus iones especficos


[M+Na]+

[2M+H]+

Componente 3
[M+H]+

Ejemplo con espectros de LC/MS API-LC/MS apenas produce fragmentacin


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1. Determinar las masas (m/z) de todos los compuestos ionizados. 2. Determinar las reas de los cromatogramas especficos de cada compuesto (ECCs: Extracted Compound Chromatograms suma de las
respuestas de los iones caractersticos de cada compuesto).

3. Comparar las reas normalizadas especficas de cada compuesto entre todas TIC las muestras.
ECCs 0La identificacin para comparar el mismo metabolito se realiza por igualdad de - Tiempo de Retencin normalizados

- LC/MS: masa exacta del compuesto GC/MS: identificacin biblioteca

ECC: Datos Deconvolucionados con Agilent M.F.E.

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Ejemplo Listado de Compuestos Detectados por el Algoritmo Mass Hunter Molecular Feature Extractor

+ 20 compuestos en 1 minuto

Las estadsticas se efectuarn comparando intensidades de seal especficas de compuestos con igual -Tiempo de retencin

Metabolmica: Informacin comparada entre muestras: tiempo, abundancia y masa

- Masa exacta (LC/MS) o identificacin espectro EI en GC/MS

Listado Compuestos Ionizados

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50

Counts vs. Acquisition Time (min) 40 30 20

10

1 2 3 4 5 6 7 x10 7

1 Fase: Extraccin Informacin Metabolitos por Deconvolucin del 3D (tr, m/z, Intensidad)

x107 7 6 5 4 3 2 1 10 20 30 40 50 Counts vs. Acquisition Time (min)

5.- Ejemplos de Resultados

La Espectrometra de Masas, una Herramienta Esencial en Metabolmica y Anlisis Comparativo de Muestras

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Ejemplo 1: Estudio Metabolomico Infeccin Bacteriana en Arroz: Influencia lneas de Arroz y cepas Bacteriales
Bacteria salvaje

PX099

Bacteria transgnica PX099 RaxST -Resistente a la plaga


2 tipos bacterias

2 Tipos de Arroz (TP...)

2 tipos de bacteria (PX)

Transgenic Salvaje + Condition AvrXa21 Pptido


(Class)

TP309 TP309-Xa21

PXo99 6 (A)
Blanco control tratado Blanco control SIN tratar

6 (C) 6 6 6 (D)

TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje TP309-Xa21 arroz transgnico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada (A) (B) (C) (D) genticamente: PXO99 (RaxST-). PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una protena tipo sulfotransferasa capaz de generar el pptido AvrXa21. PXO99 RaxST- : bacteria modificada genticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el pptido AvrXa21. Pptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genticamente (TP309-Xa21)

6 6 NA(B)

PXo99

RaxST-

TP309 TP309-Xa21

2 tipos arroz (TP) Los replicados de muestras de la poblacin son importantes LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)

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Deconvolucin de Cromatogramas LC/MS de Arroz mediante Agilent Molecular Feature Extractor (MFE)
MFE deconvoluciona cromatogramas para localizar los tiempos de retencin / masa /abundancia de todos los compuestos ionizados. Evala isotpos, aductos y coeluciones. Parmetros utilizados:
Mx. carga iones = 1 Umbral Deteccin en altura (o S/N)
Iones Positivos: 1000 Iones Negativos: 500

Muestra adquirida con LC/MS-TOF (o QTOF)

Nmero tpico de molecular features (/compuestos) encontrados:


Iones Positivos ~ 1500 Iones Negativos ~ 400 Aprox. 1900 compuestos/muestra (la gran mayora desconocidos)
MFE Tr, m/z, Int.

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GeneSpring MS: Anlisis Estadstico Multivariante.


Ejemplo combinacin de Anlisis de PCA con ANOVA
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadsticamente fiables

Proporciona una mucha mejor diferenciacin de clases

7-INF 2 3-INF 5

6-RES 2

3-INF 7-INF

6-RES

1 2 3-INF

3 Ensayos con Arroz salvaje


4 5 6-RES 7-INF

4 Ensayos con Arroz transgnico


sin tratar control bacteria salvaje mod. genet.

+info: Nota de Aplicacin Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN Pgina 36
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GeneSpring MS: ANOVA de 1-va con Datos de Arroz Filtrados mediante Tukey Post-hoc Test: modo Iones Positivos 7 Condiciones Biolgicas Comparadas
----Arroz Transgnico
Bact. Salvaje

------ -----

Arroz Salvaje

------

Rojo: estadsticamente diferentes

7 Condiciones Biolgicas Comparadas

Arroz Trangnico

Resisten.

Bact. Modif. Gen.

Azul: estadsticamente equivalentes

Arroces

Bact. Salvaje

Resisten.

Bact. Modif. Gen.

Bact. Salvaje

Infeccin
Arroz Salvaje
Arroces

Bact. Salvaje

Infeccin

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadsticamente fiables


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GeneSpring MS: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-va


con Datos de Arroz Filtrados: modo Iones Positivos
La comparacin mediante ANOVA de 1-va se realiz para encontrar molecular features (/compuestos) de inters biolgico.
Se evaluan 7 condiciones biolgicas. De la comparacin de resultados se concluye: Immunity features: (42) metabolitos relacionados con la resistancia Infected features (22) metabolitos relacionados con la infeccin Bacterial features (25) metabolitos producidos por las bacterias Rice line features (170) metabolitos relacionados con diferencias en las lneas de arroz Diagrama de Venn Comparando Arroz Infectado Vs. Resistente

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Ejemplo 2: Optimizacin Proceso de Extraccin de Metabolitos de Glbulos Rojos


PARMETROS INFLUENCIAN RENDIMIENTO EXTRACCIONES LQUIDO/LQUIDO: pH fase acuosa (parmetro estudiado en este ejemplo) Proporciones fase acuosa/orgnica Adicin de sales / modificadores orgnicos fase acuosa Temperatura ...
PREPARACIN MUESTRA: 1.- Centrifugar sangre (con citrato como anticoagulante) y eliminacin del sobrenadante. 2.- Lavado con PBS (solucin salina de tampn fosfato) para eliminar los metabolitos del exterior de los glbulos. 3.- Quenching y lisado de la membrana de los glbulos para liberar los metabolitos de su interior. 4.- Adicin modificador fase acuosa (metanol). 5.- Adicin fase orgnica (cloroformo). 6.- Extraccin lquido-lquido a diferentes pHs fase acuosa. 7.- Evaporacin a vaco y reconstitucin fase acuosa.

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Influencia pH en n Metabolitos Extrados


Distribucin 1211 metabolitos distintos identificados en MetLin DB por su masa exacta con <10ppm error (LC/MS-TOF)

Incluye compuestos no identificados en MetLin DB

+ inf. en nota aplicacin: Maximizing Metabolite Extraction for Comprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN Pgina 40
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Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios Metabolmicos


LC/MS-TOF: Biomarcadores de bajo peso molecular
de Cncer Pancretico
Poster ASMS: Mayo Proteomics Research Center, Mayo Clinic - La fraccin de bajo peso molecular del plasma es una fuente viable de potenciales biomarcadores de cncer pancretico y mediante unos 20 metabolitos permiten discriminarlo en pacientes diabticos vs. no diabticos

LC/MS-QTOF & QqQ: Changes in phopholipase expression in the CNS of SIVinfected macaques.
Gary Siuzdak & others. The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 118 Number 7 July 2008

CE/MS-TOF: Ophthalmic Acid as an Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption Tomoyoshi Soga & others. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 24, pp. 1676816776, June 16, 2006
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Tpicos Anlisis de Metabolopatas mediante MS


Tpicos compuestos a seguir - Aminocidos - Acyl carnitinas - cidos orgnicos - cidos grasos - LC/MS-QQQ

Fenilcetonuria (PKU): se controla con la relacin de PHE / Tyr, donde Tirosina es el producto natural del metabolismo de la fenilalanina. Niveles elevados de Phe en relacin con Tyr indica problemas en la conversin natural de este metabolito. PKU es una enfermedad que se puede tratar (slo por el control de la dieta) y es importante tratarla lo antes posible, ya que puede conducir a dao cerebral y retraso mental.
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Conclusiones
- La Espectrometra de Masas acoplada a cromatografa proporciona una excelente herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores. - En LC/MS la disponibilidad de una masa exacta robusta e independiente de la concentracin del analito es clave para el xito del estudio. - Se requiere del uso de potentes herramientas de software para: - Extraer la informacin cuantitativa especfica de cada compuesto ionizado. - Automatizar la cuantificacin relativa y comparacin de miles de compuestos mediante un potente software de anlisis estadstico multivariante que ofrezca anlisis de componentes principales (PCA). - Todas estas herramientas son aplicables a todo tipo de empresas que requieran estudios comparativos.

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Metabolomics Brochure Agilent Metabolomics Laboratory: The breadth of tools you need for successful metabolomics research - 5989-5472EN Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice - 5989-6234EN Agilent Software for Metabolomics: Software tools for each step in metabolomics data analysis - 5989-6172EN Biological sample preparation for successful metabolomic analysis - 5989-6326EN Considerations for Choosing GC/MS or LC/MS for Metabolomics - 5989-6327EN Selection Guide Choosing Instrument Systems for Metabolomics Analyses - 5989-6328EN Webcasts An Introduction to Metabolomics Analysis using Mass Spectrometry - Steve Fischer, Agilent Technologies Novel Mass-Based Approaches to Global Metabolomics - Gary Suizdak, Scripps Institute, CA More coming. Offers GeneSpring MS Trial CD Plus Tutorial Data

Application Note

Product Note

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Preguntas?

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