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Protocolo comparativo de purificacin de la enzima -glutamil-transpeptidasa en Bacillus subtilis


1. 2. 3. 4. Introduccin histrica Breve descripcin de la enzima. Inters en el diagnstico de patologas Trabajos escogidos. Comentario crtico Protocolo de purificacin de la enzima GGT Bibliografa

5.

Introduccin histrica
La enzima -glutamil-transpeptidasa (GGT GGTP) fue descrita en rin de oveja por primera vez en 1950 (Hanes et al). Segn este grupo investigador, dicha enzima era capaz de catalizar la transpeptidacin de grupos -glutamil en aceptores de aminocidos y pptidos, en presencia de sustrato. Con posterioridad se demostr que el sustrato de hidrlisis era paulatinamente inhibido conforme progresaba la transpeptidacin, al incrementarse la concentracin de dichos aceptores. La -glutamil transpeptidasa cataliza la reaccin de transferencia de los grupos -glutamil del glutathin y de otros pptidos -glutamil a receptores tales como aminocidos, formando as compuestos -glutamil. Se trata de una transferasa localizada en la membrana celular que est presente en la mayora de los rganos parenquimatosos. Una enzima con caractersticas similares fue tambin identificada en 1960 a partir de tejidos humanos, por Orlowski y Szewszuk. En esa misma dcada fue descrita en diferentes rganos, tejidos y fluidos de animales de laboratorio, como hgado, rin, pncreas, pulmn, bilis, orina, suero, incluso en los eritrocitos (Goldbarg et al, 1963; Orlowski y Meister, 1965). Aunque es similar su distribucin orgnica en los diferentes animales, no es exactamente igual, y tiende a encontrarse con preferencia en determinados tejidos dependiendo de la especie (Braun et al, 1983). Aunque su actividad mxima parece ser renal, ello no es bice para que clnicamente su determinacin sea en casos de enfermedad heptica, de ah que sea la enzima de mayor sensibilidad para test hepticos. La actividad de la enzima en el suero de pacientes con dao heptico fue investigada por Szczeklin et al en 1961. Sus hallazgos fueron corroborados por el grupo de Pineda, Goldbarg y Rutenburg, atribuyndole importancia en el diagnstico de la enfermedad hepatobiliar pancretica y confirmando la elevacin de la enzima en el suero de pacientes caracterizados por un cuadro con afeccin hepatobiliar y pancretica (Rutenburg et al, 1963); estos completaron el estudio realizando el diagnstico de la patologa mediante un examen microscpico tisular. Aparte, esta enzima fue evaluada en relacin con episodios de dao isqumico cardiaco post-infarto (Agostini et al, 1965; Hedworth-Whitty et al, 1967; Ravens et al, 1969). Mediante la identificacin de esta enzima en suero se puede describir la obstruccin heptica y diferenciarla de un proceso meramente inflamatorio, en un caso de patologa infecciosa (Aronsen et al, 1965) o neoplasia (Aronsen et al, 1970). Villa et al (1966), pronosticaron la actividad de la enzima en concordancia con sus niveles sricos en dos enfermedades hepticas: a) la toxicidad heptica debida a tetracloruro de carbono produca un leve aumento de sta; b) en la hepatitis viral, pese a que se halla poco incrementada la enzima en la primera etapa de la enfermedad, alcanza un valor mximo durante la fase de recuperacin clnica. Es importante recordar que, al ser una enzima presente en la membrana del hepatocito, se eleva antes que otras en caso de dao heptico. Segn Zein et al (1970), no se trata de una enzima especfica de hgado sensu stricto, es til en alteraciones derivadas de la ingesta de alcohol, y es confirmatoria de hepatomas primarios y secundarios, en ausencia de ictericia.

Breve descripcin de la enzima. Inters en el diagnstico de patologas


La -glutamil-transpeptidasa es una enzima transferasa situada en la membrana celular, presente en la mayora de los rganos de tipo parenquimatoso; es ms abundante en hgado, vas biliares y pncreas. La deficiencia de esta enzima se caracteriza por el aumento de la concentracin de glutathin en plasma y orina. Al igual que la fosfatasa alcalina srica (FAS), sirve de indicador en casos de colestasia. Su funcin es la transferencia de grupos -glutamil entre pptidos (p.ej. de glutathin a otros pptidos o aminocidos). Como ya se ha dicho con anterioridad, la GGT est presente en las membranas celulares de muchos tejidos, incluyendo los riones, el conducto biliar, pncreas, hgado, bazo, corazn, cerebro, y vesculas seminales, como ocurre tambin con las transaminasas y la lactato-deshidrogenasa (LDH). Est involucrada

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en la transferencia de aminocidos a travs de la membrana celular y en el metabolismo de los leucotrienos. La enzima juega un papel clave en el ciclo de la -glutamil, una va para la sntesis y degradacin de glutathin y de destosificacin de drogas y xenobiticos. Su papel principal radica en el metabolismo del glutathin mediante la transferencia de la fraccin -glutamil a una variedad de molculas aceptoras como el agua, algunos L-aminocidos y pptidos, dejando el producto cistena para preservar la homeostasis intracelular del estrs oxidativo. Dicha reaccin se resume: (5-L-glutamil)-pptido + aminocido pptido + 5-L-glutamil El rango normal en humanos va desde 0 a 30 UI/ml. Sus niveles son similares en nios y adultos, y no se ven afectados durante el embarazo. Si tenemos en cuenta otras especies, los valores son diferentes: en bovinos est entre 20 y 27 UI/ml; en perro entre 5-6 UL/ml; en caballo entre 15-17 UI/ml, y en pequeos rumiantes entre 32-35 UI/ml. Su principal valor est en otorgarle especificidad (origen heptico) a las elevaciones de fosfatasas alcalinas. Sin embargo, hay otras causas que pueden producir elevaciones de GGT en ausencia de enfermedad heptica, como el consumo de ciertos medicamentos (p. ej. anticonvulsivantes) y el consumo de alcohol. En ocasiones se han detectado elevaciones espordicas de GGT en pacientes diabticos. La GGT tiene varios usos como marcador diagnstico en la clnica. Unos valores sricos elevados pueden ser evidentes en enfermedades hepticas, pancreticas y biliares. Su incremento, unido al de la FAS sugiere una alteracin a nivel biliar; no se ha concretado an cul de las dos es ms sensible a dao colestsico. La utilidad de la elevacin de la GGT frente al de FAS yace en descartar una patologa a nivel seo. La GGT tambin se eleva posteriormente al consumo excesivo de alcohol; una elevacin aislada y desproporcionada en comparacin con el aumento de otras enzimas hepticas puede indicar abuso de alcohol o hepatitis alcohlica. El aumento puede permanecer incluso 3-4 semanas despus de la ingesta. El alcohol puede aumentar la sntesis de GGT va induccin microsomal o la salida de la enzima directamente desde los hepatocitos.

Hepatitis alcohlica, evolucin de varias enzimas, das 0-40 [Whitfield et al, 1972]. A modo de resumen, un incremento en los valores de la GGT est relacionado con: - Txicos hepticos: en casos leves aumenta en pequea cuanta; en cuadros agudos presenta una elevacin superior a la que aparece en hepatitis crnicas y es similar al nivel que habra de transaminasas. - Hepatitis vrica aguda: la GGT aumenta menos que las transaminasas, aunque es la ltima en volver a sus niveles originales normales. - Hepatitis crnica: se encuentra con una elevacin superior al de las transaminasas. - Ictericia obstructiva: incremento ms alto y rpido que el de leucin-aminopeptidasa (LAP) y FAS. - Metstasis heptica: directamente proporcional a su extensin y evolucin. La elevacin puede ser moderada a alta.

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- Pancreatitis aguda y crnica: sobretodo al obstruir las vas biliares. Tambin en casos de nefrosis lipoidea y cncer renal. - Infarto de miocardio: a partir del 4-5 da se ve incrementada, estableciendo un pico mximo el 10 da post-isquemia.

Trabajos escogidos. Comentario crtico


- WU, Q.; XU, H.; ZHANG, L.; YAO, J. y OUYANG, P. (2006). Production, purification and properties of glutamyl-transpeptidase from a newly isolated Bacillus subtilis NX-2. J Mol Cat B Enz 43, 113-117. - SHUAI, Y.; ZHANG, T.; MU, W. y JIANG, B. (2011). Purification and characterization of -glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis SK11.004. J Agric Food Chem 59, 6233-6238. El proceso de purificacin y aislamiento de la enzima GGT vara con dependencia de numerosas variables. Entre ellas estara el organismo del que se parte para realizar la extraccin (bacteria, hongo, etc.). Por supuesto hay que valorar los conocimientos existentes en la actualidad y los de hace cincuenta aos, no es lo mismo analizar un trabajo desarrollado en este sentido en los aos sesenta, como el de Orlowski y Meister (1965). De ah que el presente trabajo estudio se base en el anlisis de la enzima GGT a partir de una bacteria concreta (Bacillus subtilis) y los trabajos de partida sean relativamente recientes (2006 y 2011). Las bacterias del gnero Bacillus spp. presentan extracelularmente la enzima GGT. En el trabajo de Wu et al (2006) se parti de muestras de tierra con antecedentes de presencia de B. subtilis. Para que estas bacterias produjeran la enzima, se les suministr un medio de cultivo enriquecido con glucosa, levadura, extracto de maz triturado, sulfato magnsico y fosfato dipotsico, y se incub en aerobiosis a 32C y agitacin durante 38 h. En cambio, en el trabajo de Shuai et al (2011) no se obtuvo el concentrado bacteriano del suelo, sino de un macerado de gambas, como ya hicieron en un estudio anterior (Shuai et al, 2010); el medio de cultivo tambin difiere del utilizado por los primeros investigadores (tiene sacarosa en lugar de glucosa, triptona, y carece de levadura, el resto es idntico). La incubacin se efectu igualmente en aerobiosis, pero a 37C y en agitacin slo durante 16 h. En ambos artculos se referenciaron una serie de pasos para la purificacin de la enzima y posterior valoracin proteica. En el de Wu et al (2006), tras centrifugar el cultivo obtenido a 10,000 rpm durante 20 min a 4C, se procedi a precipitar el sobrenadante mediante la adicin del mismo volumen de acetona durante 10 min a 0C. Posteriormente centrifug durante 30 min a 4C a una velocidad de 8,000 rpm, disolviendo el nuevo precipitado en una solucin buffer Tris-cido clorhdrico con sulfato amnico, a pH 8. Lo que qued insoluble fue retirado tras otra centrifugacin. Mientras este primer trabajo separaba claramente las etapas de purificacin, el de Shuai et al (2011) englob todo el proceso en un punto del apartado Materiales y mtodos. Las diferencias entre este segundo trabajo y el de Wu et al (2006), en cuanto a la primera fase de purificacin enzimtica, estriban en detalles como la centrifugacin del cultivo (30 min, en lugar de 20 min) a la vez que utiliza una malla de filtracin de 0.45 m, el nuevo producto lo precipita tambin con sulfato amnico (al 60-80%) y luego aade el buffer Tris-cido clorhdrico, tras centrifugar 20 min a 10,000 rpm. Finalmente deja dializando el producto contra esta solucin buffer toda la noche a 4C, en vez de centrifugar. En la siguiente fase, ambos estudios purificaron el extracto crudo enzimtico con columnas de sepharosa: el del ao 2006 con CL4B-Sepharose pre-equilibradas con buffer Tris-cido clorhdrico y sulfato amnico; el de 2011 utiliz DEAE-Sepharose con buffer Tris-cido clorhdrico suplementado con cloruro sdico. El de Wu et al (2006) procedi a lavar las columnas con el mismo buffer y resuspendi las protenas que haban quedado unidas a la membrana de sepharosa con una solucin gradiente de sulfato amnico aadida al mencionado buffer (Tris-cido clorhdrico). El de Shuai et al (2011) concentra las fracciones con GGT mediante una centrifugacin a alta velocidad en una membrana Amicon PM-10 y luego resuspende el producto obtenido en una columna Superdex 75 con buffer Tris-cido clorhdrico, a 5C. Mediante el protocolo seguido por este segundo trabajo se puede hallar la masa molecular de la enzima utilizando la columna Superdex 75, que ha sido calibrada previamente con las protenas ms frecuentes a modo de referencia (albmina srica bovina -BSA-, ovoalbmina, ribonucleasa, aprotinina y vitamina B 12). El azul dextrano, inocuo, se une a las fracciones vacas de la columna a modo de cemento para facilitar la reaccin. Las fracciones con actividad GGT fueron recogidas y analizadas mediante electroforesis (SDS-PAGE) como recoge otro estudio previo (Laemmli, 1970), con una especial modificacin para la GGT (Albert et al, 1961). En el trabajo de Wu et al (2006), la fraccin inicial obtenida en las columnas de sepharosa se purific mediante la tcnica de cromatografa de intercambio inico en otra nueva columna similar (DEAESepharose), pre-equilibrada con el mismo buffer Tris-cido clorhdrico. Se efecta un primer lavado con el buffer para luego establecer un gradiente de disolucin con agua Milli-Q y el buffer (suplementado con

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cloruro sdico) en cinco fases, es decir, en un principio se aade exclusivamente agua Milli-Q, luego una solucin con un 80% de agua Milli-Q y un 20% del buffer, y as hasta llegar, en fracciones del 20%, hasta el 100% del buffer, en el que se resuspendi el producto con actividad -glutamil. El extracto purificado fue analizado igualmente con electroforesis (SDS-PAGE), pero basndose en otro trabajo anterior (Weber y Osborn, 1969). En el trabajo primero (2006), para valorar la actividad de la GGT, hace referencia a un estudio previo (Meister et al, 1981), en el que se procede a incubar el producto obtenido con buffer Tris-cido clorhdrico, glutamil--nitroanilida y glicilglicina, a 37C durante 30 min, parando la reaccin tras aadir cido clorhdrico. La densidad ptica fue medida a 410 nm y se defini una unidad de enzima como la cantidad de la misma que liberaba 1 mol/min de -nitroanilina de -glutamil--nitroanilida a travs de la reaccin de transpeptidacin. El segundo trabajo (2011), resea el artculo previo realizado por el mismo grupo investigador donde tambin se explicaba el mtodo para determinar la actividad enzimtica (Shuai et al, 2010). La mezcla que se aade al producto obtenido es muy similar a la que describe el trabajo de Wu et al (2006), tiene -glutamil--nitroanilida, glicilglicina, pero el buffer est compuesto por borato e hidrxido sdico. Tambin lo incuba a 37C durante 30 min y detiene la reaccin con cido clorhdrico. La absorbancia y la definicin de la unidad enzimtica las evala de un modo idntico al trabajo de Wu et al (2006). En cuanto a la concentracin proteica, Shuai et al (2011) realiza el mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951), mientras que Wu et al (2006) hace lo propio con el mtodo de Bradford, ambos con el mismo estndar, la BSA (Bradford, 1976). Los resultados obtenidos en ambos artculos, por etapas y esquemticamente, fueron: Etapa de Protena Actividad Actividad Rendimiento purificacin total (mg) total (U) especfica (U/mg) (%) Sobrenadante 8572 5700 0.66 100 Precipitacin 1329 3298 2.48 57.86 con acetona CL4B53 1631 30.77 28.61 Sepharosa DEAE12 880 73.36 15.44 Sephodax Wu et al (2006) Etapa de purificacin Extracto crudo Fraccin de (NH4)2SO4 (60-80%) DEAESepharosa Superdex 75 Protena total (mg) 28.5 5.97 0.662 0.346 Actividad total (U) 672 520.5 389.33 Actividad especfica (U/mg) 23.57 87.18 587.8 Rendimiento (%) 100 77.45 57.9 34.57

F.P. 1.00 3.76 46.62 111.15

F.P. 0 3.7 24.9 28.99

232.36 683.4 Shuai et al (2011)

Protocolo de purificacin de la enzima GGT


1.- Organismo y muestras de partida: Bacillus subtilis muestreo efectuado en terrenos con antecedentes de dicha bacteria. 2.- Medio de cultivo: medio RPMI suplementado con L-Glutamina. 3.- Procedimiento de incubacin: en agitacin (60 rpm) en atmsfera con oxgeno (aerobiosis) a 37C durante 24 h. 4.- Centrifugacin del cultivo obtenido a 10,000 rpm durante 30 min a 4C. 5.- Precipitacin del sobrenadante con acetona durante 10 min a 0C. 6.- Centrifugacin a 8,000 rpm durante 30 min, a temperatura de 4C. 7.- Adicin de solucin buffer 0.05 mol/l de Tris-cido clorhdrico suplementada con 1 mol/l de sulfato amnico (70%), a pH 8. Dejar dializando toda la noche a 4C frente al buffer con sulfato amnico.

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8.- Purificacin del extracto crudo enzimtico con columnas de sepharosa (Hiprep DEAE-Sepharose FF 16/10) con solucin buffer 50 mM de Tris-cido clorhdrico + cloruro sdico. 9.- Centrifugacin a 15,000 rpm del producto obtenido en membrana Amicon PM-10 y resuspensin en columna Superdex 75 10/300 GL, con 50 mM Tris-cido clorhdrico. 10.- Recoleccin de las fracciones con actividad GGT y anlisis mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gel de acrilamida (12%) durante 50 min a 20 mA. 11.- Valoracin de la actividad de la GGT, a partir del producto con la fraccin de GGT, al que se aade 50 mmol/l de solucin buffer Tris-cido clorhdrico (pH 8), 5 mmol/l de -glutamil--nitroanilida y 20 mmol/l de glicilglicina. Se deja incubando a 37C durante 30 min, y se detiene la reaccin tras adicionar 0.1 mol/l de cido clorhdrico. 12.- Medicin de la absorbancia mediante espectrofotometra a 410 nm. 13.- Valoracin de la concentracin proteica mediante el mtodo de Bradford en una placa de ELISA con 96 pocillos, tras realizar una curva patrn con BSA diluida a diversas concentraciones (0, 20%, 40%, 60%, 80% y 100%) en buffer fosfato salino (PBS). Del mismo modo, dilucin del producto enzimtico GGT en PBS a concentraciones seriadas (20%, 60% y 100%). Tanto la curva patrn como las muestras problema deben analizarse por partida doble. Aqu se ve un ejemplo:

14.- Medicin de la densidad ptica mediante espetrofotometra a 595 nm.

Bibliografa
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Martha Gutirrez Ords Escuela Universitaria de Trabajo Social. Universidad de Len. Jos Manuel Martnez Prez Departamento de Sanidad Animal. Instituto de Ganadera de Montaa (Len).

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