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Gel de Electroforesis En la mayora de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (sulfato duodecil de sodio policramida)

en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reduccin, las protenas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo elctrico, migran al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las protenas, la tasa de migracin viene determinada por su peso molecular. Las molculas ms pequeas migran ms rpidamente que aquellas con pesos moleculares mayores.

Preparacin de la Muestra El mtodo elegido depender del tipo de muestra de partida, de la localizacin sub celular de la protena y de las condiciones ptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epitopo proteico. En la tabla 1 se resumen los mtodos mecnicos que habitualmente se utilizan en la extraccin de protenas para inmunotransferencia. A menudo, en muestras tisulares de animales, se requiere el uso de un proceso mecnico para la disrupcin de la compleja matriz celular. Disrupcin mecnica que suele preceder a un proceso qumico de lisis celular, mediante el uso de solucin tampn que contiene detergentes, dirigida a enriquecer la protena de inters dentro del extracto final. Las clulas en cultivo, frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solucin tampn con detergente y sin la aplicacin de mtodos mecnicos.

La estructura qumica de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las protenas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar segn las caractersticas del grupo polar: inicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no inicos si no poseen carga o zwiterinicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. La eleccin de la substancia detergente, depende en parte de la localizacin, dentro de la clula, de la protena de inters, citoplasmtica, unida a la membrana, dentro de orgnulos celulares como el ncleo y las mitocondrias, etc. Las protenas citoplasmticas se pueden unir a las protenas del citoesqueleto, afectando as a los procesos de fraccionamiento subcelular. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampn y detergentes, ms utilizados habitualmente, segn el tipo de protena y localizacin subcelular. Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la protena de inters. Por tanto, es importante evitar, durante la preparacin de la muestra, cualquier actividad protesica. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradacin de protenas: Evitar excesivos ciclos de congelacin/descongelacin. Trabajar rpido y mantener las muestras en fro durante todo el proceso. Aadir inhibidores de la proteasa en el tampn de lisis.

Adems de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, en particular en estudios de fosforilacin. En la tabla 3 se muestran los inhibidores de proteasa y fosfatasa de uso ms habitual.

Tampn de carga de muestras Los componentes del tampn de carga varan, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes tpicos de un tampn de carga para detectar protenas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. No se utilizarn ni SDS, -mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Previamente a la carga del gel, las muestras se someten a una incubacin a 95C durante 5-10 minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/reduccin es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubacin no es necesaria.

Materiales
Extraccin de Protenas

Tubos eppendorf de 2 ml y 600 l Centrfuga a 13000 rpm durante 10 min a 4C Juego de micropipetas Hielo Cmara multipozos o gradilla para eppendorf

Para realizar electroforesis

Cmara de electroforesis Fuente de poder Bao Mara 95C. Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 l.
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Para realizar el Western Blot Cmara de transferencia Cajas de plstico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones. Fuente de poder

Reactivos
Preparacin de Geles PAGE (electroforesis en gel de poliacrilmaida) Solucin Acrilamida-Bis Solucin 0.5 M tris-HCl pH 6.8 Acrilamida 14.6 g Tris-base 6g Bis-acrilamida 0.4 g Agua desionizada 100 ml Agua desionizada 50 ml Ajustar a pH 6.8 con HCl Almacenar a 4 C Solucin 1.5 M tris-HCl pH 8.8 Tris-base 18.5 g Agua desionizada 100 ml Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4 C SDS al 10 % SDS Agua desionizada
Mtodo de Laemmli
0.375 M Tris-HCl ph 8.8

Persulfato de Amonio al 10% Persulfato de amonio 1g Agua destilada 10 ml (Preparar slo lo necesario o guardar por 10 das a 4C)

10 g 100 ml Almacenar a TA

Gel Separador

Agua Desionizada 1M tris-HCl ph 8.0 SDS 10% Acrilamida/Bis (29.2% -0.8%) Persulfato de Amonio 10% TEMED Monmero total

8% 1.71 ml 1.87 ml 50 l 1.33 ml 25 l 2.5 l

10% 1.38 ml 1.87 ml 50 l 1.66 ml 25 l 2.5 l

Cantidad 12% 1.05 ml 1.87 ml 50 l 2 ml 25 l 2.5 l 5 ml

15% 0.54 ml 1.87 ml 50 l 2.5 ml 25 l 2.5 l

Gel Alineador 0.125 M Tris-HCl ph 6.8 Agua Desionizada 0.5 M tris-HCl ph 6.8 SDS 10% Acrilamida/Bis (29.2% -0.8%) Persulfato de Amonio 10% TEMED Monmero total

4% 2 ml 0.83 ml 33 l 444 l 17 l 3.30 l 3.33 ml

Nota: Preparar el minigel SDS-PAGE de 0.75 mm con concentracin de 8 a 15% de acuerdo al tamao de partcula. Utilizar el isobutanol para eliminar burbujas del gel separador.

Buffer para muestras 4X Preparacin de las muestras de protenas Tris-HCl pH=6.8 (0.5 M) 0.6 ml del de 1.5 M Glicerol 0.8 ml SDS al 10 % 1.6 ml del de 20% Azul de bromofenol 0.05 % 0.4 ml -mercaptoetanol 0.4 ml Agua desionizada 4.2 ml Almacenar a T ambiente. 8 .0 ml Buffer de corrida Electroforesis 1X Tris Base 3g Glicina 1.44 g SDS 1g Agua desionizada 1 L 10 X 30 g 14.4 g 10 g 1L Western Blot TBS 2.42 g de Tris-HCl (20 mM) 8 g de NaCl (137 mM) Ajustar el pH a 7.6 Aforar a 1 litro
TBS-Tween 20 0.05% 1.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.

Buffer de transferencia Tris-base 3.03 g Glicina 14.4 g Metanol 200 ml SDS 0.5 g Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8.3.

Leche al 5 % (Solucin Bloqueadora) TBS 1X 10 ml Tween 20 (0.1%) 0.01 ml Leche descremada 0.5 g Nota: se prepara fresca justo antes de utilizarse. Marcador de Peso Molecular (MPM) Membrana de Nitrocelulosa o PVDF Rojo de Punceau al 0.4% Opcional para membrana de nitrocelulosa Solucin de Quimioluminiscente (partes iguales) Solucin estabilizadora de Peroxidasa Solucin de Luminol/Amplificador Agua ultrapura Se hidratan las membranas por 15-30 segundos
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Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)


La especificidad de la PCR depende, fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de hibridacin y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reaccin (adems de depender de la secuencia de los cebadores). Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en la fase de hibridacin, ms especfica es la reaccin. Esto se debe a que a mayor temperatura ms dificultada se ve la unin entre el cebador y la cadena molde; en condiciones de temperaturas de hibridacin elevadas el cebador slo se unir a la cadena molde si son complementarios en todos sus nucletidos. Por otra parte, en un determinado rango, incrementos en la concentracin de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de la reaccin; los iones facilitan la unin del cebador a la cadena molde y permiten la incorporacin de los nucletidos a la cadena creciente. Reactivos Tabla 1. Concentraciones de almacenamiento, concentraciones empleadas en la reaccin y volumen a aadir de los principales componentes de una PCR considerando un volumen total de 25 l Componente Concentracin a la que Concentracin final en Volumen a aadir se conserva la reaccin Tampn 10X 1X 2.5 MgCl2 25 mM 1 mM 1 Cebador 10 M 0.4 M 1 dNTPS 10 mM 0.4 mM 1 Taq polimerasa 5 unidades/l 1 unidad/25 l 0.2

Fundamento Es una tcnica que se utiliza para identificar y localizar protenas basadas en la capacidad de unin a anticuerpos especficos, luego de separar las protenas en un gel de SDS-PAGE, las bandas de protenas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa (electrotransferencia), las bandas individuales de protena se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas para la protena de inters.