Dra. M. L. Ortiz. Dep.

Microbiologa y Parasitologa

Lunes

Material general en el Laboratorio de Microbiologa.

1.-Placas Petri con medio de cultivo slido. 2.- Tubos de ensayo con medio de cultivo lquido. 3.- Tubos de ensayo con medio de cultivo slido inclinado. 4.-Matraz para turbidimetria. 5.Mechero Bunsen. 6.Pipetas. 7.-Microplacas. 8.Asas de siembra. 9.- Asa de Digralsky. 10.- Micropipeta automtica. 11.- Pipeteador manual. 12.- Puntas de pipeta automtica. 13.Placas Petri. 14.- Jarra de anaerobios. 15.- Placas de contacto Rodac. 16.Lmina para anlisis de superficies.

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Lunes

L-1.- Preparacin y esterilizacin de material y medios de cultivo.

Los mtodos de esterilizacin ms utilizados son: - Flameado: Se emplea para esterilizar agujas, asas de siembra, pipetas, cuellos de tubos y matraces, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero los utensilios que se vayan a esterilizar.

Asa y Aguja de siembra

Esterilizacin del asa de siembra

Diferentes tipos de Horno Pasteur

Se esteriliza en horno Pasteur, a 180oC durante 2 horas. -Calor seco: Se usa para esterilizar material de vidrio debidamente preparado. Las placas Petri de vidrio se envuelven juntas en papel manila.Tubos de ensayo, probetas y matraces Erlenmeyer se taponan con algodn graso. Las pipetas se envuelven en papel manila despus de colocar en la boquilla un trocito de algodn, que acta como filtro impidiendo la contaminacin del material absorbido con los microorganismos del operador y, a la vez, acta como protector de ste, evitando la llegada del lquido a la boca.

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Lunes

-Calor hmedo: Autoclave. Se emplea para la esterilizacin de medios de cultivo.

Se pone agua en el fondo hasta cubrir las resistencias. Se introduce el material y se cierra la tapa apretando los tornillos. Se enciende el autoclave y se espera hasta que desprende un chorro de vapor, lo que indica que todo el aire que contena el autoclave ha sido eliminado. Se cierra la espita y se sigue calentando hasta que el manmetro seale 1 atmsfera, manteniendo esta presin durante 20 minutos. Pasado este tiempo, se apaga y se deja descender la temperatura hasta que el manmetro marque cero. Se abre la espita y la no salida de vapor indica que la presin interna ha cesado. A continuacin se abre el autoclave. - Filtracin: Se emplea para esterilizar sustancias sensibles al calor
Medio a esterilizar

Embudo Pinza de sujeccin Filtro de celulosa Plataforma de vidrio Vacio

Medio estril

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Lunes

L.2.- Resiembra de bacterias en tubo de agar inclinado

1.- Esterilizar el asa de siembra a la llama del mechero

2.- Destapar el tubo con microorganismo y flamear la boca, sin soltar el tapn

3.- Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar

4.- Tomar el tubo con medio estril, destapar y flamear la boca

5.- Introducir el asa con el microorganismo hasta el fondo y deslizar en zig-zag

6.- Esterilizar el asa de siembra a la llama del mechero

7.- Flamear la boca del tubo y tapar

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Martes

M-1.- Aislamiento de microorganismos en placa.

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Agar Levine EMB

Peptona Lactosa Hidrogenofosfato dipotasico Agar Eosina Azul de metileno 10 g 10 g 2g 15 g 0,4 g 0,065 g
Es un medio selectivo y diferencial semejante al Mac Conkey. La presencia de los colorantes inhibe el crecimiento de las bacterias Gram+. La lactosa es utilizada va fermentativa por las enterobacterias con produccin de cido, Cando la acidificacin es muy intensa los colorantes precipitan, lo que origina colonias negruzcas con brillo metlico caractersticas de E. coli. E. coli forma colonias de 2-4 mm con brillo metlico caracterstico. Enterobacter aerogenes forma colonias de 4-6 mm con centro pardo grisaceo y no brillo metlico Proteus, Salmonella y Shigella, forman colonias transparentes por no utilizar la lactosa.

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Agar Cetrimide
Peptona de gelatina Cloruro de magnesio Sulfato de potasio N-cetil-N,N,N-trimetil amonio bromuro Glicerina Agar-agar 20 g 1,4 g 10 g 0,3 g 10 ml 13 g

Es un medio selectivo para aislamiento de Pseudomonas. La Cetrimida (Cetil-trimetil-amonio-bromuro) sirve para conseguir una notable inhibicin de la flora acompaante. Una concentracin de 0,3 g/l ejerce una suficiente inhibicin de los microorganismos acompaantes, perjudicando minimamente el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Estas colonias forman un pigmento verde-azulado (piocianina) y son fluorescentes a la luz UV.

Prueba de la oxidasa

Prueba del O/F

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Manitol salado
Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Manitol Rojo fenol Agar Agua destilada 10 g 1g 75 g 10 g 0,025 g 15 g 1.000 ml

Es un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus. La alta concentracin de sal permite solo el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los que se encuentran, entre otros, los del genero Staphylococcus. La fuente de carbono es el manitol que se degrada con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje en el colorante Rojo de fenol, que cambia a color amarillo.

Staphylococcus aureus forma colonias puntiformes rodeadas de un halo amarillo.

Prueba de la DNAsa

Prueba de la Coagulasa

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Lunes

Microscopio ptico: partes principales. A) Base. B) Fuente de iluminacin. C) Diafragma. D) Brazo. E) Platina. F) Macro y Micromtrico. G) Condensador. H) Objetivos. I) Ocular

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Lunes

L-3.- Observacin de microorganismos. La observacin de los microorganismos se realiza con el microscopio ptico. L-3.1.- Observacin en fresco 1.- Depositar una gota de agua en un porta y con el asa de siembra estril tomar una muestra del tubo con el microorganismo. 2.- Mezclar las bacterias con el agua sin extender la muestra. Colocar un cubreobjetos encima de la suspensin bacteriana y observar al microscopio, anotando la forma de la bacteria y si presenta movilidad L.3.2.- Observacin con tinciones - Tincin simple: se emplea un solo colorante. - Tincin diferencial: se emplea ms de un colorante y se ve el comportamiento de las bacterias frente a ellos. - Tincin negativa: Lo que se colorea es el medio que rodea a la bacteria permaneciendo sta sin teir.

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Lunes

L-3.2.1.- Tincin simple de azul de metileno.

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin con Azul de Metileno 5

2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio Micrococcus luteus

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Mircoles

M.4.1.- Tincin de corpsculos metacromticos:

El gnero Lactobacillus, forma grnulos con caractersticas tintoriales diferentes a las del resto del citoplasma que se denominan corpsculos metacromticos.

1.- Hacer un frotis con Yogurt

2.- Cubrir la preparacin con Azul de Metileno 5

3.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Corpsculos metacromticos

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Mircoles

Agar Sangre Extracto de carne Triptona NaCl Agar Sangre de oveja desfibrinada Agua destilada 10g 10g 5g 20g 7% 1000ml Es un medio de cultivo enriquecido y diferencial que permite el crecimiento de gran nmero de microorganismos. Se emplea para determinar las reacciones de hemlisis

-hemlisis: lisis parcial de los glbulos rojos, se forma un halo verdoso alrededor de la colonia. -hemlisis: lisis completa de los glbulos rojos, aparece una zona transparente alrededor de la colonia. -hemlisis: no actan sobre los glbulos rojos, no forman ningn halo.

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Lunes Tincin

L-3.2.3.- Tincin de Gram

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de 2.- Tomar la muestra agua en un porta con el asa de siembra

3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.- Cubrir la preparacin con Cristal Violeta 2

2.- Aadir Lugol (mordiente) durante 1

3.- Decolorar con Alcohol 96 hasta que no suelte colorante

4.- Lavar con agua

5.- Teir con Safranina 1

6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

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Lunes

L-3.2.- Tincin de Gram Cocos Gram Bacilos Gram -

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Lunes

L-3.2.- Tincin de Gram Cocos Gram + Bacilos Gram +

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Agar Levine EMB

Peptona Lactosa Hidrogenofosfato dipotasico Agar Eosina Azul de metileno 10 g 10 g 2g 15 g 0,4 g 0,065 g
Es un medio selectivo y diferencial semejante al Mac Conkey. La presencia de los colorantes inhibe el crecimiento de las bacterias Gram+. La lactosa es utilizada va fermentativa por las enterobacterias con produccin de cido, Cando la acidificacin es muy intensa los colorantes precipitan, lo que origina colonias negruzcas con brillo metlico caractersticas de E. coli.
E. coli forma colonias de 2-4 mm con brillo metlico caracterstico. Enterobacter aerogenes forma colonias de 4-6 mm con centro pardo grisaceo y no brillo metlico Proteus, Salmonella y Shigella, forman colonias transparentes por no utilizar la lactosa.

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Agar Cetrimide
Peptona de gelatina Cloruro de magnesio Sulfato de potasio N-cetil-N,N,N-trimetil amonio bromuro Glicerina Agar-agar 20 g 1,4 g 10 g 0,3 g 10 ml 13 g

Es un medio selectivo para aislamiento de Pseudomonas. La Cetrimida (Cetil-trimetil-amonio-bromuro) sirve para conseguir una notable inhibicin de la flora acompaante. Una concentracin de 0,3 g/l ejerce una suficiente inhibicin de los microorganismos acompaantes, perjudicando minimamente el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Estas colonias forman un pigmento verde-azulado (piocianina) y son fluorescentes a la luz UV.

Prueba de la oxidasa

Prueba del O/F

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Manitol salado
Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Manitol Rojo fenol Agar Agua destilada 10 g 1g 75 g 10 g 0,025 g 15 g 1.000 ml

Es un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus. La alta concentracin de sal permite solo el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los que se encuentran, entre otros, los del genero Staphylococcus. La fuente de carbono es el manitol que se degrada con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje en el colorante Rojo de fenol, que cambia a color amarillo.

Staphylococcus aureus forma colonias puntiformes rodeadas de un halo amarillo.

Prueba de la DNAsa

Prueba de la Coagulasa

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Mircoles

Agar Sangre Extracto de carne Triptona NaCl Agar Sangre de oveja desfibrinada Agua destilada 10g 10g 5g 20g 7% 1000ml Es un medio de cultivo enriquecido y diferencial que permite el crecimiento de gran nmero de microorganismos. Se emplea para determinar las reacciones de hemlisis

-hemlisis: lisis parcial de los glbulos rojos, se forma un halo verdoso alrededor de la colonia. -hemlisis: lisis completa de los glbulos rojos, aparece una zona transparente alrededor de la colonia. -hemlisis: no actan sobre los glbulos rojos, no forman ningn halo.

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Miercoles Jueves

V-3.2.- Observacin de las colonias de microorganismos viables.

V-3.3.- Observacin microscpica de los hongos y actinomicetos .

Penicillium sp.

Aspergillus sp.

Alternaria alternata.

Streptomyces sp.

Scharomyces cerevisiae.

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