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HONGOS Y LEVADURAS

MARCO TEORICO A) HONGOS o mohos Pertenecen al reino Fung Son eucarioticos, heterotrficos y se reproducen asexualmente mediante la formacin de esporas o yemas. Se caracterizan por su falta de clorofila y por la presencia de una pared celular rgida que contiene quitina, glucamanosa y a veces celulosa Son saprofitos, viven en materia orgnica muerta y no necesitan de luz para poder crecer. Habitan en ambientes hmedos (suelo, plantas muertas)

B) LEVADURAS Son hongos unicelulares de morfologa esfrica o elptica que, salvo ciertas excepciones, se reproducen por gemacin o fisin. Necesitan oxigeno para su crecimiento adems de minerales y vitaminas especiales (tiamina, biotina, inositol, acido pantotenico. No ocasionan toxiinfecciones alimentarias. Las escasas levaduras patgenas existentes causan alteraciones en los alimentos, especialmente en los azucares y en los cidos, pero no causan problemas sanitarios. Desde el punto de vista comercial entre la mas importante tenemos a la Saccharomyces cerevisae (industria panadera y cervecera)

Factores de crecimiento PH optimo 4.5 6.5, y las tolerantes de 2.8 -8.5 Temperatura optima: 25C aunque algunas se pueden reproducir a 0C y pueden vivir entre 5 37C Son osmotolerantes Actividad de agua 0.65

Hongos importantes en alimentos Quesos famosos, como el Roquefort, Brie o Camembert, El moho Penicillium roquefortii da el sabor caracterstico En el pan, particularmente las levaduras, juegan un papel muy importante en su elaboracin. La levadura tiene una capacidad nica para producir alcoholes como el alcohol etlico (que sirve para elaborar bebidas alcohlicas como el vino o el aguardiente) y dixido de carbono o CO2 (resultante de la descomposicin del carbono) a partir de azcares como la glucosa, en ausencia de oxgeno. El Aspergillus tamarii y otras especies de hongos imperfectos se utilizan en Oriente para producir salsa de soya, fermentando el poroto de soya

Tambin hay hongos que atacan los alimentos provocando daos en el producto como en el caso de: Aspergillus determinan coloraciones amarillentas verdosas u oscuras algunas especies producen aflatoxinas elaboran proteasas Aspergillus spp. en almacenamiento de alimentos como pescado seco y leche condensada, granos de cereales y compotas, queso y materiales de envasado. Son importantes las especies que producen micotoxinas Fusarium en los cultivos aparece algodonoso con tonalidades rosa, deterioran muchos frutos y verduras Las pudriciones terminales causadas por Fusarium spp. se introduce en frutas y vegetales por heridas y reventaduras o roturas hechas en el manejo de las frutas y hortalizas La descomposicin de las frutas puede ser causada por varias especies de Fusarium que se encuentra en el suelo y frutas antes de la cosecha, seleccin y almacenamiento Adems Aspergilius repens : Mantequilla Wallemia sebi : Carnes (coloracin chocolate en los embutidos) Botrytis cinerea : legumbres frescas (por almacenamiento prolongado prolifera un moho en forma de tela de araa blanco griscea (moho gris).

Lecvaduras de inters clinico Candida albicans vive normalmente en la atmsfera vaginal, por cuanto aqu el ph es cido (5,0-4,0). En verdad, la Candida se localiza en la mucosa del intestino delgado Mientras la localizacin vaginal puede ser considerada como una localizacin secundaria Localizacin cutnea (presencia de machas hongosas cuando se expone al sol) puede representar la localizacin secundaria Toxicidad de Hongos

Las micotoxinas y sus orgenes fngicos Micotoxinas Mohos responsables Toxicidad Aflatoxinas B1, B2, G1, G2, Aspergillus flavus Mutgeno, teratgeno, Aspergillus parasiticus M1, M21 cancergeno, hepatotxico, nefrotxico, neurotxico. cido penicilnico Penicillium puberulum Citotxico Penicillium cyclopium Penicillium suavolens Aspegillus ochraceus Aspergillus sulphureus Ocratoxina A y B Aspegillus ochraceus Teratgeno, hepatotxico, Penicillium viridicatum nefrotxico, neurotxico Zearalenona Fusarium graminearum Efectos endocrinos Esterigmatocistina Aspergillus versicolor Aspergillus regulosos T2 Fusarium tricinctum Citroviridina Penicillium citroviridia cido ciclapiaznico Penicillium ciclopium Rubratoxina Penicillium rubrum Penicillium purpugerum Luteoskirina Penicillium islandicum Tricotecenos Fusarium divers Citotxico, irritante de las mucosas Cladosporina Cladosporium cladosporoides Tremrgenos Penicillium patulans Neurotxico Aspergillus flavus

Los cereales: El trigo, el maz, la cebada, la avena pueden contaminarse y podremos encontrar en estos cereales todo tipo de micotoxinas, como las aflatoxinas, las ochratoxinas A y B, el cido penicilnico, los alcaloides del cornezuelo, la zearalenona. Las oleaginosas:

En los granos y sus residuos encontramos sobre todo especies de Aspergillus (Aspergillus flavus) Fusarium y Penicillium. Aspergillus flavus aparece principalmente en determinados

lotes de man; pero tambin encontramos los granos de girasol, lino, soya, contaminados con aspergillus, aunque se trata de especies poco txicas. Frutos y verduras. Los frutos y las verduras pueden recubrirse de una multitud de hongos en fase de espora y si las condiciones de cosecha y almacenamiento son favorables, estas esporas proliferan y originan podreduras diversas. Las carnes y productos de charcutera

Es posible encontrar la aflatoxina en los huevos y tambin la ochratoxina en el caso de intoxicaciones. Leche y productos lcteos. Las micotoxinas como la aflatoxina pasa a la leche y puede ocurrir que algunos residuos de semillas ricos en aflatoxinas determinen su presencia en la leche de ganado. Productores y colectores deben dedicar especial atencin a este problema.

FUNDAMENTO Se usa para realizar el estudio de si un alimento se encuentra contaminado con estos microorganismos, esto puede ocurrir debido a que la materia prima usada estaba contaminada o a que el producto a estado en malas condiciones de almacenamiento

OBJETIVO Conocer el procedimiento e importancia de la determinacin de hogos contaminantes en los alimentos. Aprender los mtodos de aislamiento y determinacin de hongos contaminantes. Diferenciar los mtodos de determinacin de hongos contaminantes.

AGAR OGY (agar oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura (base))

AGAR OGY (Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura) Agar selectivo segn Mossel y col.(1970) para la demostracin y numeracin de mohos y levaduras en todo tipo de material de investigacin (alimentos, material clnico, etc.). El agar-oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido Descripcin y recomendado como medio de rutina para la investigacin de mantequilla. Uso: En la investigacin de muestras de heces procedentes de pacientes tratados con Tetraciclina, las Enterobactericeas slo son inhibidas de manera insuficiente. En tales casos, es preferible el empleo de Gentamicina en vez de la Oxitetraciclina. Disolver 30 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min. A 121C), dejar enfriar hasta unos Extracto de 5,0 50C, incorporar 0,1 g/litro de levadura 10,0 Oxitetraciclina en forma de D(+)glucosa 15,0 solucin acuosa o 0,05 g/litro Composicin: Agar-agar Preparacin de Gentamicina (1 mL/litro de (g/L) Gentamicina en solucin) y Aditivo: verter en placas. Oxitetraciclina 0,1 pH: 6.5 + 0,2 o Gentamicina Las placas con medio de 0,05. cultivo son claras e incoloras. El material objeto de investigacin se homogeniza, eventualmente, con solucin Ringer (Tabletas de RINGER), se diluye y se extiende sobre las placas mediante esptula. Empleo e interpretacin Incubacin: hasta 5 das a temperatura ambiente (aprox. 22C). Contar el nmero de colonias de hongos por placa y mediante el factor de dilucin, calcular el nmero de grmenes del material objeto de NOMBRE:

investigacin.
MATERIALES 2 botellas esteriles 6 placas petri estriles 1 pipetas estriles de 10 ml 3 pipetas estriles de 1ml mechero esptula Drigalsky Agua peptonada balanza electrnica Agar Ogy Una capsula de oxatetraciclina

PROCEDIMIENTO Previamente preparamos nuestro agar, al cual le agregamos oxitetraciclina para inhibir el crecimiento de bacterias y procedemos a plaquear

Colocamos la mitad de nuestra muestra en agua peptonada y lo mezclamos enrgicamente. Dejamos reposar para que sedimente un poco

Separamos 10ml de la muestra en 90ml de agua peptonada. Realizamos las diluciones 10-2, 10-3

Realizamos la siembra por diseminacin en el Agar Ogy , colocando 0.1 ml de cada dilucin y diseminamos con ayuda d ela esptula de Drigalsky la cual hemos esterilizado previamente.

Incubamos a 25 C de 3 a 5 dias

PROCEDIMIENTO SEGN LA NORMA Preparacin y dilucin de las muestras de alimentos: 1- tarar un matraz vaco y pesar en el 10gr de la muestra del alimento. 2- Aadir un volumen diluyente igual a 9 veces la muestra ( 90ml). As se logra la dilucin 10-1 ( el diluyente debe ser agua de triptona, solucin Tween 80 o solucin Ringer). 3- Hacer funcionar la licuadora un tiempo suficiente segn la velocidad, para conseguir 15000 a 20000 revoluciones, teniendo en cuidado en que la duracin de la operacin no exceda de 2,5 minutos. 4- Agitar el homogenizado ( dilucin 10-1) y pipetear una porcin de 10 ml a otro matraz o botella con 90 ml de diluyente, obtenindose la dilucin 10-2. 5- Mezclar el liquido cuidadosamente, aspirando 10 ml con pipeta estril. Transferir estos 10 ml a otro matraz con 90 ml de diluyente y mezclar, as se obtendr la dilucin 10-3. 6- Repetir los pasos hasta obtener las diluciones buscadas. Al final de las diluciones desechar siempre 10 ml, para homogenizar volmenes.

Numeracin de levaduras y mohos en placa

1. Pipetear por duplicado a las placas Petri estriles alcuotas de 1 ml a partir de la dilucin 10-1,10-2 y10-3 si se sospecha alto porcentaje de contaminacin. 2. Agregar rpidamente a las placas Petri 15 ml de agar YGC licuado y temperado. 3. Mezclar inmediatamente las alcuotas con el agar mediante movimientos de vaivn y rotacin. Para este fin se pueden seguir los siguientes pasos: Mover la placa 5 veces de arriba hacia abajo en una direccin. Rotar la placa 5 veces en el sentido de las agujas del reloj. Mover la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo recto a la usada en el primer tiempo. Rotar la placa 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

4. Como control d esterilidad, adicionar a una placa Petri agar sin inocular. 5. una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas aerbicamente a 25C durante 5 das. 6. Realizar el recuento estndar en placa.

Identificacin de levaduras y mohos 1. Verter en placas Petri estriles 15 ml de agar PATATA-DEXTROSA licuado y temperado. 2. con un asa de siembra aislar por separado todos los tipos morfolgicos de colonias que hallan crecido, de las placas que hallan presentado mayor desarrollo de colonias. 3. Una vez solidificado el agar, sembrar por estras las muestras de hongos previamente aisladas. 4. Invertir las placas e incubar aerbicamente a 28C durante 7 das.

5. los mohos y levaduras se identifican mediante un examen morfolgico (microscpica y microscpicamente), fisiolgico y bioqumico(crecimiento en 18 substratos carbonados) , y los resultados se comparan con datos de especies conocidas.

DESCRIPCIN DE COLONIAS (EN AGAR PATATA DEXTROSA)

Alternaria:

Desarrolla colonias de micelio gris al principio, despus se tornan negras con periferias grisceas. Microscpicamente se observan filamentos tabicados con conidiforos cortos; sus macroconidias son de color pardo oscuro con tabiques longitudinales y transversales que se disponen uno tras otro.

Aspergillus :

Desarrolla colonias de color blanco al inicio, luego el color varia de acuerdo a la especie, pudiendo ser amarillo, amarillo naranja, verde azufrado, marrn claro o negro intenso. Microscpicamente presenta hifas tabicadas que originan conidiforos no tabicados que se ensanchan en su extremo distal, dando lugar a la cabeza aspergilar, que a su vez da origen a los esterigmas, de donde parten las conidias en cadena.

Chrysosporium:

Desarrolla colonias de aspecto pulvurulento, de un tono crema a amarillo. Microscpicamente se observa una gran cantidad de clamidosporas con unos pequeos tubrculos en su superficie. Sus hifas son tabicadas.

Cephalosporium:

Desarrolla colonias de micelio areo de color blanco rosado a blanco amarillento. Microscpicamente se observa la presencia de hifas septadas, conidiforos cortos que van a dar origen a conidias con o sin tabique transversal, hialinas, elipsoidales y aglutinadas en cabezuela en el extremo distal del conidiforo.

Fusarium:

Desarrolla colonias de micelio areo algodonoso de color rosado, violeta o amarillo en la superficie. Microscpicamente presenta filamentos tabicados que dan origen a cortos conidiforos verticilados; macroconidias multiseptadas, alargadas, levemente encurvadas y fusiformes.

Helminthosporium:

Desarrolla colonias de color gris al principio y despus forma un micelio central deprimido, de color negro mate, con periferia elevado de color gris. Microscpicamente se observan hifas septadas, con macroconidias de septos longitudinales en racimo sobre conidiforos cortos y nudosos.

Penicillium:

Desarrolla colonias azul-verdosas, pulvurulentas a causa de la abundante formacin de conidias. Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en su extremo distal, dando la apariencia de un pincel, cada ramificacin (esterigmas) da lugar a la formacin de conidias dispuestas en cadenas.

Rhizopus :

Desarrolla colonias de micelio areo denso, de aspecto algodonoso, de un color que varia entre blanquecino y el gris. Microscpicamente presenta hifas sin septos transversales; destacan hifas vegetativas cortas, agrupadas a manera de finas raicillas, a partir de los cuales se proyectan uno o varios filamentos largos (esporangiforos), que en su extremo distal presentan una estructura globosa, pigmentada de color oscuro (esporangio), que contiene en su interior gran cantidad de endoesporas.

Rhodotula :

Desarrolla colonias de aspecto cremoso (caracterstica de los hongos levaduriformes), de color rosado, debido a que forma pigmentos carotenoides. Microscpicamente se observan clulas ovoides o redondeadas, con o sin yema. A la coloracin de Gram se comportan como Gram positivos.

RESULTADOS Se obtuvo presencia de colonias solo en 1 de las 6 placas sembradas CONCLUSIONES Esto nos demuestra que nuestra muestra no se hallaba tan contaminada DISCUSIONES

Muestra del CET

Muestra Comedor OBU

BIBLIOGRAFIA depa.pquim.unam.mx/.../TecnicBasicas-Cuenta-mohos-levaduras_6530.pdf http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/proy_microbiologia.htm

PROTOCOLO DE DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS

Preparamos el agar Ogy y plaqueamos

10ml muestra

1ml

1ml

1m

90ml Agua Peptonada

9ml Agua Peptonada

9ml Agua Peptonada

101

10-2

10-3

0.1ml a cada placa

0.1ml a cada placa

0.1ml a cada placa

Incubar a 25 C / 3 5 dias