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Laboratrio de Citogentica e Diversidade Vegetal

Departamento de Biologia Geral, CCB, Universidade Estadual de Londrina Tel: 43 3371 4509 Fax: 43 3371-4417 - Campus Universitrio Caixa Postal 6001, CEP: 86.051-990 Londrina Paran - Brasil

Mtodo de Feulgen

A reao de Feulgen uma tcnica citoqumica, especfica para DNA. Ela pode ser utilizada de modo qualitativo e quantitativo. Por muito tempo, esta reao foi usada em mtodos de quantificao do DNA, mas atualmente isso tem perdido fora devido ao desenvolvimento de mtodos de citometria de fluxo baseados no emprego de fluorocromos. Para a citogentica, esta fornece preparaes limpas e de excelente contraste. Apesar de ser um mtodo um pouco mais trabalhoso e demorado, quando comparado com outras tcnicas de colorao convencional, os cromossomos aparecem visualmente mais delimitados, com as constries primrias e secundrias mais evidentes. Alm disso, devido especificidade para o DNA, outros componentes como RNA, ribonucleoprotenas e citoplasma no so corados. Uma desvantagem a instabilidade do corante. As lminas preparadas pelo mtodo de Feulgen podem reduzir a intensidade ou perder a colorao com mais facilidade ao longo do tempo nas lminas permanentes, enquanto que aquelas coradas com Giemsa e Hematoxilina, por exemplo, permanecem com bom contraste por muito mais tempo. Esta reao baseada nas propriedades qumicas da fucsina e na ao hidroltica do HCl sobre o DNA. Em condies ideais, o HCl 1M a 60 C, promove a retirada das bases pricas do DNA, deixando um ponto para uma ligao aldedica no carbono 1 da pentose. Neste sentido, se houver uma hidrlise cida curta, no haver uma boa remoo de purinas e, consequentemente, a colorao do DNA ficar muito fraca. Em uma situao contrria, se a hidrlise for muito forte, haver rompimento da maior parte dos componentes da cromatina, esta ficar mais solvel e colorao tambm ser fraca. Medidas fotomtricas de absoro mostram a relao entre a hidrlise e a colorao.

Medidas de absoro em vrios tempos de hidrlise indicam que a hidrlise em HCl 1 M a 60 C por 12 minutos adequado para produzir grupos aldedo livres na molcula de DNA, permitindo que a fucsina incolor no reativo de Schiff reestabelea a ligao aldedica,

recuperando desse modo a colorao.


Henry and Stefano (1948)

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A pararosanilina, um componente da fucsina bsica, a responsvel por estabelecer a ligao aldedica que ficou disponvel aps a hidrlise. Assim, a fucsina que estava incolor no reativo de Schiff ganha um cor prpura-lils. Quando maior for a concentrao de DNA no ncleo, mais intensa ser a colorao, desde que a hidrlise prvia tenha sido adequada. Ao que parece, esta colorao no eficaz para RNA por dois motivos: i) o RNA tem uma hidroxila no carbono 2 da pentose. Contudo a pararosanilina depende de um hidrognio naquela posio para estabelecer a ligao aldedica e ii) por ser de fita simples pode ser mais facilmente desnaturado nas condies de hidrlise.

O preparo e a conservao do reativo de Schiff crtico para um bom resultado na reao de Feulgen. A seguir colocamos alguns detalhes sobre o preparo e a conservao:

Reativo de Schiff 1. Dissolva 1 g de fucsina bsica em 200 mL de gua destilada pr-aquecida a 60 C. Agite a soluo constantemente com um basto de vidro ou em agitador magntico at que a soluo esfrie; 2. Adicione 10 mL de HCl 1M e homogeneze a soluo. O HCl dever ser preparado na hora do uso, dissolvendo 0,835 mL de HCl P.A. em 9,165 mL de gua destilada; 3. Adicione na sequncia 2 g de metabissulfito de potssio e homogeneze a soluo durante 10 minutos usando um basto de vidro ou um agitador. Ao adicionar o HCl e o metabissulfito, a soluo liberar um gs de cheiro ruim e txico. Por isso, aconselhvel trabalhar dentro de uma capela com exausto;

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4. Transfira todo o volume para um frasco escuro ou encoberto por papel alumnio, tentando recuperar ao mximo o sedimento de fucsina. Homogeneze vrias vezes durante uma hora e guarde o frasco protegido da luz por pelo menos 24 horas; 5. Adicione o equivalente a uma colher das de sopa de carvo ativado em p, homogeneze algumas vezes ao longo de 4 horas. Filtre a soluo em papel de filtro, diretamente para um frasco seguramente limpo, seco e protegido da luz. Neste ponto, a soluo filtrada dever estar completamente incolor; 6. Estoque em geladeira por tempo indeterminado;

7. Testa a capacidade de colorao pingando uma gota do filtrado em um pedao de papel de filtro. Um corante adequado dever produzir um halo prpura-lils no limite da rea atingida, mantendo o interior branco. Se toda a rea ficar corada logo no primeiro momento, proceda com novo tratamento com carvo ativado por 24 horas e nova filtragem. Faa isso sempre antes do uso, sobretudo quando a soluo estiver estocada por um perodo longo.

Reao de Feulgen para a obteno de metfases e fases da mitose e meiose

1. Retire as amostras pr-fixadas e lave-as em gua destilada. Normalmente utilizamos pelo menos trs banhos de 5 min cada, com agitao freqente e com um volume de gua maior que 20 vezes o volume da amostras; 2. Se as amostras forem muito duras, um tratamento com celulase (2%) e pectinase (20%) poder ser includo neste ponto. 3. Transfira as amostras para um frasco contendo HCl 1M, e deixe durante 10 a 12 minutos a a 60 C, preferivelmente em banho-maria; 4. H alternativas para a hidrlise, como em HCl 5M por 30 minutos temperatura ambiente. 5. Como as amostras ficaro bem moles depois da hidrlise, ser difcil transferi-las para outro frasco, assim aconselhvel esgotar o cido com uma pipeta e adicionar gua destilada (20 vezes o volume da amostras ); 6. Lave as amostras por pelo menos 10 min, cheque a integridade dos meristemas usando uma lupa (estereomicroscpio); 7. Retire o mximo possvel de gua, sem deixar as razes secarem, e adicione rapidamente o reativo de Schiff, com volume suficiente para cobrir as amostras. Agite a soluo e deixe em ambiente totalmente escuro at que os meristemas fiquem com uma colorao prpura-lils bem forte;

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8. Remova o corante e adicione gua destilada (2 banhos de 10 minutos). Neste ponto aconselhvel usar frasco transparente e ambiente iluminado, para conseguir identificar os meristemas corados; 9. Transfira um ou mais meristemas para uma lmina, enxugue o lquido e adicione rapidamente uma gota de cido actico 45% (evite exposio longa ao cido, pois ele remove a colorao e evite colocar uma gota com volume muito grande, pois haver a chance de perder boas clulas pelas bordas da lamnula). O preparo das lminas poder ser feito tambm em carmim actico 1% ao invs de cido actico 45%, porm, o carmim deixa precipitados, podendo sujar boas metfases, apesar de acentuar a colorao; 10. Prepare a lmina por disseco e esmagamento; 11. Remova a lamnula em nitrognio lquido, ou de outro modo e deixe secar na bancada; 12. Antes de montar a lmina permanente, cheque a colorao; 13. Se houver algum problema na colorao, mas havendo muitas metfases boas, a colorao poder ser acentuada com uma exposio ao corante Giemsa 1% por um minuto (isso feito para no perder a lmina); 14. Monte a lmina permanente usando Entellan, Permount ou Balsamo do Canad e estoque-a em ambiente escuro.

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