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Eletroforese de Aloenzimas A anlise de propriedades eletroforticas de aloenzimas (enzimas com a mesma funo, mas com padres de migrao eletroforticos

distintos codificados por alelos do mesmo locus tem sido extensivamente empregada no estudo dos Triatominae. Esta metodologia representou, por dcadas a primeira escolha para examinar a taxonomia e os relacionamentos evolutivos de inmeros organismos, incluindo insetos (Thorpe & Sol-Cava 1994, Loxdale & Lushai 1998, Dujardin et al. 2002). Anlises no nvel intraespecfico possibilitam (1) a avaliao do grau de variabilidade gentica dentro de determinada espcie ou populao (dado pelo nmero esperado de indivduos heterozigotos nos loci analisados He), (2) a deteco de desvios do equilbrio de Hardy-Weinberg [H-W] intrapopulacional (atravs da observao do excesso ou dficit de heterozigotos FIS), e (3) a estimao de nveis de estruturao gentica (medida como a diferenciao entre populaes com base no componente interpopulacional da variao gentica total FST). Por fim, (4) nveis de fluxo gnico (i.e. migrao efetiva) entre populaes podem ser estimados (Thorpe & Sol-Cava 1994, Fras & Dujardin 1996, Loxdale & Lushai 1998, Dujardin et al. 2002). Aloenzimas so marcadores adequados para o estudo da variao intra-especfica na maioria dos grupos de insetos vetores (Loxdale & Lushai 1998). Contudo, triatomneos em particular tendem a apresentar nveis muito baixos de variabilidade aloenzimtica (tanto em termos de heterozigosidade quanto de loci polimrficos), o que impe certa limitao do uso deste marcador para estudos populacionais. Ainda assim, alguns estudos foram capazes de detectar variao suficiente que permitisse a realizao de inferncias sobre estrutura populacional. Populaes de T. infestans, por exemplo, so panmticas dentro de vilarejos Andinos na Bolvia e no Peru, mas altamente estruturadas (e seguindo o modelo de isolamento por distncia) entre vilarejos. Anlise das freqncias allicas permitiu a determinao da rea provvel de origem de T. infestans (Dujardin et al. 1998b). Estudos posteriores indicaram que estruturao dentro de localidades tambm ocorre, sugerindo que a unidade populacional bsica representada pelas prprias habitaes humanas (Brenire et al. 1998). Empregando metodologia similar, Noireau et al. (1999b) mostraram que a unidade panmtica de populaes bolivianas de T. sordida (grupo aloenzimtico 1) maior do que a descrita para T. infestans, com desvios ao equilbrio de H-W detectado somente entre populaes distando mais de 20km entre si; isso sugere uma melhor capacidade de disperso de T. sordida do que se supunha anteriormente (Noireau et al. 1999b). Alm disso, a baixa diversidade aloenzimtica em Triatominae tem sido vista como possvel indicao de maior vulnerabilidade ao controle qumico, j que seria menos provvel que resistncia a inseticidas surgisse em populaes geneticamente empobrecidas (Schofield et al. 1995, Guhl & Schofield 1996, Schofield & Dujardin 1997, Dujardin et al. 1998a, 2002, Monteiro et al. 2001). Em taxonomia (ou sistemtica alfa, i.e., identificao e descrio de espcies), a eletroforese de aloenzimas usada na distino de espcies crpticas e na determinao do status correto de populaes duvidosas. Deteco de isolamento reprodutivo entre duas ou mais espcies crpticas particularmente fcil quando suas populaes so simptricas. Isso ocorre porque a premissa se as populaes pertencem ao mesmo pool gnico, elas tm que estar trocando genes pode ser usada como hiptese nula. Ento, se loci apresentarem alelos diferentes fixados nas duas populaes (i.e., forem diagnsticos), a hiptese nula rejeitada em favor da hiptese alternativa da existncia de mais de um txon ocorrendo naquela rea (para mais detalhes ver Thorpe & Sol-Cava 1994). Esse raciocnio no pode ser aplicado a populaes aloptricas, entre as quais troca gentica pode no ocorrer simplesmente devido separao geogrfica. Esses casos requerem a comparao de valores de distncias genticas par-a-par entre populaes, queles da literatura. Este mtodo tambm funciona bem, pois, desde que um nmero grande de indivduos e loci so amostrados, distncias genticas so muito maiores entre populaes de espcies proximamente relacionadas do que entre populaes co-especficas. Valores de corte de distncia gentica (D, Nei 1972) para distino de espcies tm sido sugeridos como D 0,16 (Thorpe & Sol-Cava 1994). Em insetos de importncia medica, valores de D > 0,1 so considerados indicativos de nvel especfico (Noireau et al. 1998). Em triatomneos, valores mdios de D = 0,504 0,341 foram detectados em 30 comparaes interespecficas, enquanto populaes co-especficas (142 comparaes) foram separadas por valores mdios de D = 0,013 0,009 (Dujardin et al. 2002).

Em geral, quando diferenas claras (loci diagnsticos em simpatria ou distncias genticas grandes, em alopatria) foram detectadas entre populaes, a concluso usual foi de que mais de um txon estava envolvido, ou devido a erros de identificao (e.g., R. colombiensis identificado equivocadamente como R. prolixus) ou especiao crptica (como com T. sordida) (Moreno et al. 1999, Noireau et al. 1998, respectivamente). A caracterizao de diversas populaes cromticas de T. brasiliensis pareciam representar uma exceo quando diferenas aloenzimticas fixas foram encontradas entre populaes co-especficas (Costa et al. 1997). A viso alternativa de que vrios txons distintos estavam envolvidos foi posteriormente sustentado por anlise de seqncias de DNA (Monteiro et al. 2004). Vrios exemplos ilustram o uso de aloenzimas na avaliao da taxonomia de triatomneos. A ausncia de diferenas fixas entre R. prolixus (um vetor de grande importncia) e R. robustus (silvestre e de importncia mdica secundria) da Venezuela levou sugesto de que se tratassem do mesmo taxon (Dujardin et al. 1991, Harry et al. 1992a, b, Harry 1993, Solano et al. 1996). Uma comparao de aloenzimas de indivduos de prolixus e robustus cuja identidade fora confirmada previamente por DNA mitocondrial continuou sem detectar diferenas. Esse achado foi interpretado como indicao de divergncia recente ao invs de co-especificidade (Monteiro et al. 2002). Em casos similares, aloenzimas revelaram diferenciao negligencivel entre espcies proximamente relacionadas dentro dos complexos phyllosoma e oliveirai (Flores et al. 2001, Noireau et al. 2002). T. sordida, T. garciabesi, T. guasayana e T. patagonica so muito parecidas morfologicamente, mas apresentam tendncias sinantrpicas distintas; suas reas de distribuio que se sobrepe e alta variabilidade anatmica intraspecfica dificultam sua identificao (Gorla et al. 1993). Eletroforese de aloenzimas confirmou sordida, guasayana e patagonica como txons vlidos e levaram revalidao de T. garciabesi e ao descobrimento de duas espcies crpticas dentro de T. sordida (Garca et al. 1995, Panzera et al. 1997, Jurberg et al. 1998, Noireau et al. 1998). A identidade especfica de T. petrochii foi tambm confirmada por aloenzimas (Monteiro et al. 1998). Por fim, a identificao por aloenzimas de espcimes vindos do campo (incluindo ninfas) tem sido fundamental no desenvolvimento de investigaes eco-epidemiolgicas meticulosas. Aps a definio de marcadores aloenzimticos para vrias espcies e populaes, Noireau e colaboradores investigaram profundamente os ecotpos, o comportamento e a significncia epidemiolgica de vrios triatomneos bolivianos (Noireau et al. 1998, 1999a, 2000a, b, Noireau & Dujardin 2001). Descoberta importante foi o achado de focos silvestres de T. infestans so muito mais amplos do que se acreditava, estendendo dos planaltos Andinos as reas do Chaco boliviano (Noireau et al. 2005). A interpretao evolutiva de dados aloenzimticos tem sido feito mediante a interpretao do relacionamento direto entre zimogramas e genes. Relaes filogenticas podem ser investigadas atravs da comparao de medidas de distncia gentica derivadas de freqncias allicas (e.g., Nei 1972). Anlises cladsticas se baseiam na capacidade de identificao dos estados primitivos (plesiomrfico) e derivado (apomrfico) dos caracteres do grupo estudado mediante comparao com um grupo de fora (outgroup); somente caracteres derivados e compartilhados (sinapomrficos) so usados nas inferncias filogenticas (Avise 1994, Thorpe & Sol-Cava 1994). Com base nessas premissas, o relacionamento filogentico de vrios grupos de triatomneos tem sido explorado usando aloenzimas. Esses estudos, em geral, envolvem a avaliao de distncias genticas entre poucas espcies proximamente relacionadas (e.g., Garca et al. 1995, Pereira et al. 1996b, Solano et al. 1996, Panzera et al. 1997, Flores et al. 2001), mas investigaes mais completas foram realizadas com membros da tribo Rhodniini. Usando tcnicas fenticas trs agrupamentos principais foram identificados dentro do gnero Rhodnius: um grupo basal (pallescens (ecuadoriensis-colombiensis)) e dois grupos irmos (prolixus (nasutusneglectus)) e (stali (pictipes-brethesi)) (Chvez et al. 1999). A maior parte desses relacionamentos foi confirmada por anlises cladsticas, embora o grupo (brethesi (pictipes-stali)) tenha aparecido como o mais basal no cladograma; a posio de Psammolestes coreodes dentro da tribo no pde ser resolvida satisfatoriamente (Dujardin et al. 1999a). Mais recentemente, a filogenia de Rhodniini foi estudada usando-se 12 loci enzimticos. Anlises de distncia gentica produziram um dendrograma mostrando a parafilia de Rhodnius, com Psammolestes tertius como grupo irmo do grupo prolixus dentro do cluster (domesticus (Ps. Tertius (nasutus-neglectus) (prolixus-robustus))). Um segundo grupo era constitudo de (pictipes (brethesi (pallescens-ecuadoriensis))) (Monteiro et al. 2002).