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EL CICLO CELULAR Y LA CARCINOCENESIS

F. Sol Balcells

Los urlogos manejamos trminos comunes en el diagnstico y tratamimto de los tumores vesicales: tumor superficial o infiltrante, carcinoma in situ, reseccin endoscpica, cistectoma radical, instilaciones endovesicales, cuimioterapia sistmica ... Para los investigadores el carcinoma vesical se interpreta con diferente lenguaje: factores de crecimiento y sus receptores, oncogen ras, oncogen myc, protena p'i3, gen del retinoblastoma ... Los conocimientos de 10s 1nvesti:;adores empiezan a traducirse en mtoclos de mejorar el diagnstico y el pron,tico (estudio por inmunohistoqumica del p53 en tumores vesicales por ejemplo, as como en mtodos teraputicos, alg:unos de ellos en estudio clnico). Al urlogo le compete en este rriomento comprender la terminologa de la Biologa Molecular, y para ello debe einpezar por conocer la fisiologa celular normal, y de ello deducir las causas por las que se modifica hasta pasar una clula normal a ser una clula cancerosc. Los agentes exgenos o endgenos que pueden alterar la normal funcionalidad celular lo hacen mediante lesitjn de su DNA. La clula intenta (y generalmente consigue) reparar el D N A alterado, y la clula sigue entonces en su ciclo de divisin, o bien, si no lo consigue, la clula muere (apoptosic;). Pero en ocasiones la clula sobrevive a la lesin del DNA, sin reparar la misma,

quedando una alteracin gentica permanente o sea un fenotipo maligno. As pues la clula ante su DNA lesionado tiene tres opciones: dividirse despus de reparar la lesin, morir si no lo consigue o sobrevivir bajo distinto fenotipo. ;En qu punto y cmo se repara la lesin del D N A ? >Por qu mecanismos la clula se vuelve cancerosa?
Cel. normal (sigue su ciclo de divisin)

reparacin del DNA


sobrevive con DNA

maligno)

agentes endgenos

Fp?

no reparacin del

muerte DNA celular (apoptosis)

Regulacin del ciclo celular. La vida es un permanente equilibrio entre dos fuerzas, una positiva y otra negativa. La homeostasis de los tejidos normales se mantiene por un balance o equilibrio entre proliferacin y muerte celular. Se produce un tumor cuando el crecimiento celular excede a la muerte celular, ya sea por aumento del nmero de clulas en proliferacin, por disminucin del nmero de clulas que mueren, o por ambos hechos a la vez. En trminos de Biologa Molecular, esta homeostasis se traduce en forma

simplista en la actuacin de proto-oncogenes (seales positivas) y genes supresores de tumor (TSG), con seales negativas. Los proto-oncogenes actan en forma de estmulo para dar lugar a protenas que actan como factores de crecimiento (Growth-Factor: GF) o sus re-

regulan el reloj del ciclo celular

nuo en 18-25 horas. Primeramente la clula entra en la denominada fase C,, de 6 a 12 horas de duracin, en la que efecta una valoracin de su masa celular y del entorno, realizando la sntesis de enzimas y protenas precisas para el doblaje del DNA. A la fase G, le sucede la fase S (6-8 horas) de sntesis o replicacin del DNA, y a ella la fase G, (3-4 horas) en que se comprueba si la duplicacin del D N A ha sido completa, entrando finalmente la clula en la fase M o de mitosis (1 hora) en que se produce la duplicacin celular. La clula resultante puede seguir tres caminos distintos: a. Diferenciacin celular definitiva b. Entrar en fase de aquiescencia o reposo (Gol c. O bien, reiniciar el ciclo de divisin celular (G,)

ceptores (GFr). Los genes supresores de tumores actan como factores de regulacin del crecimiento celular. Hasta el momento se han identificado ms de 100 proto-oncogenes y unos 15 genes supresores de tumores y sin lugar a dudas su nmero crecer a medida que se incremente el conocimiento en Biologa Molecular. ;Cmo actan los proto-oncogenes y los genes supresores de tumor en el ciclo celular normal? La accin de los proto-oncogenes y los TSG, se ejerce a travs de las protenas que producen y debe ser comprendida en trminos de cmo y de qu manera influencian el reloj del ciclo celular. La clula se divide para dar dos clulas hijas idnticas en un proceso conti-

1
CICLO
M ( l h ) duplicacloii c c l u l l r

celular y de la T Slnteslr de enzimas y potelne precisas para la fase S

o
S (6-8H) replicac16n del DNA

La clula sale de la fase Go y entra en

G , o directamente pasa de la fase de


mitosis a G1, por estimulacin producida por factores extracelulares activadores, los Growth Factors. Los GF o factores de crecimiento son protenas

originadas por la activacin de protooncogenes. Entre los principales cabe citar: *Epidermal Growth Factor (ElSF), producto del oncogen C-erb-B2 *Fibroblast Growth Factor (FGF), del oncogen lnt-2 *Platelet Derived Growth Factor (PDCF), del oncogen C-sic *Insulin Like Growth Factor (113F), del oncogen ros *Transforming Growth Factor a (TGFa), con el mismo receptor que el EGF *Transforming Growth Factor B-1 (TGF B - l ) , con efecto inhibidor EGF, PDGF, FGF y TFG-a actan ,- nivel de la parte inicial de la fase C 1 del ciclo celular, mientras que el IGF acta en su fase final. El EGF, polipptido de 53 aminoicidos, producido por el proto-oncogeri Cerb-B2 es el ms conocido de los CF, siendo preciso para la proliferaci~y desarrollo de las clulas del ectoderino, mesodermo, y endodernio, deserrpeando un iniportantsimo papel er la embriognesis, en la diferenciacin celular, y en la angiognesis. El TGF B-1, acta en sentido contrario, como inhibidor del ciclo celulsr a nivel de G,, pudiendo evitar su e n t r d a en la fase S.

Una vez la clula alcanza el puntc Gl-S y empieza la sntesis del DNA se vuelve insensible a los GF, y sigue en forma autnoma su progresin en el ciclo celular. "En contraste con las clulas normales, las clulas cancerosas tienen disminuida su respuesta frente a los Growth Factor estimuladores (EGF) en fase G, y tienen perdida su capacidad de detener su crecimiento en respuesta a las seales inhibitorias del TGF-El". En otras ocasiones la oncognesis se debe a un aumento en la cantidad de GF estimuladores o de sus receptores y en caso de aumento de TGF-B1 por la insensibilidad a la respuesta inhibidora. Los GF transmiten su seal a la clula mediante su unin al receptor especfico. Los receptores de los factores de crecimiento son protenas, tambin producto de proto-oncogenes (erb-B1, cfms, c-kid, neu ...) con actividad tirosin-

IGF /
(protenas con actividad tirosinKinasa)

protmncogenes: erb-B-1 - EGFr / c-frns - CFS-1 c-kit neu

2' mensajero (sistema transmisor de seales en cascada)

Factores de
J

ciclo celular

1
149

kinasa. La mayor parte de receptores de los factores de crecimiento transmiten su seal va tirosin-kinasa intracelular, es decir, mediante enzimas que modifican la conducta de las protenas mediante fosforilizacin de la tirosina. Se han identificado ms de 50 receptores

con actividad tirosin-kinasa. Cada receptor del factor de crecimiento viene originado por un determinado y especfico proto-oncogen, y as el erb-B1 es el responsable de la produccin del receptor del EGF, el oncogen c-ros del receptor del IGF, etc. La unin del factor de crecimiento a su receptor da lugar a un sistema transductor de seales o segundo mensajero, constituido por protenas citoplasmticas, originadas por estmulos de otros oncogenes, con una serie de reacciones bioqumicas en cascada hasta llevar el estmulo a los oncogenes intranucleares. El mecanismo interno intracelular de la accin de los factores de crecimiento se ha estudiado especialmente a travs del EGF. De su unin con el receptor especfico (EGFr) se origina una seal estimuladora que activa el proto-oncogen intracitoplsmico ras21, el cual a su vez activa el proto-oncogen raf, quien a travs de una serie de seales intermediarias, lleva el estmulo a los proto-oncogenes intranucleares, activando el cmyc, conjuntamente con el c-fos y el c-jun, que actan como factores de transcripcin. El factor de crecimiento Transforming Growth Factor B-1 (TGF B-1) acta como inhibidor del crecimiento celular, pudiendo detener el ciclo en forma reversible en la parte final de la fase G,, antes de su entrada en la fase S. Tiene asin~ismo un receptor especfico con actividad tirosin-kinasa. Su accin inhibitoria se produce por impedir la fosforilizacin del pRb y por tanto la actividad de las "ciclin-dependent-kinasa" cdk), tal como se describir ms adelante. El TGF 51 acta pues regulando la

F a 1 (inh& crecimiento celular)

la tosforilizacibn del pRb y por tanto la aciivldad de la cdk

GF

'Cascada de sefialrs 1ntracitupl6tmkas y nuclrarrs"

proliferacin celular, y asimismo modula el sistema inmune, activndose como respuesta a la lesin tisular. Puntos de control del ciclo celular. El ciclo celular viene regulado por varios controles o puntos de restriccin, que evitan el pase a la fase siguiente si se demuestra algn defecto en la fase anterior. Los dos principales puntos de restriccin o control son el paso G,-S y el paso G,-M.

Puntos d e control o restricci6n d e l ciclo celular ,2* punto da rasmcsin (021~)

El ms importante de los puntos de


control es el primer punto de restriccin (paso G,-S o punto start que se ejerce mediante las acciones del gen del retinoblastoma (Rb) y el gen p53. El gen del gen del retinoblastoma situado en la banda 14 del cromosoma 13 (1 3q14), codifica una protena de 1 1 0 aminoci-

dos (p110 Rb), que cambia su fosforilizacin durante el ciclo celular. Esta fosforilizacin o desfosforilizacin es precisamente lo que regula su actividad. En G 1 la pRb no est fosforizacia y se une al factor de transcripcin E,'. A nivel del punto de restriccin G1-S se fosforiliza por la actividad de los complejos "ciclina-kinasa-dependientes" (cdk), con lo que se libera el E,F y se posibilita la transcripcin. Los complejos ciclina -ciclin-kinasa- dependientes (cicl,nacdk) ejecutan su funcin regulacora mediante la fosforilizacin de las prctenas involucradas en los puntos de transicin, tales como el pRb. La ciclina acta como elemento regulador y la protena kinasa dependiente (cdk) acta como unidad cataltica. El gen Rb da lugar a la protena pRb que se encuentra desfosforilizada er la fase M y G,, quedando unida a la fase G 1 al factor de transcripcin E , F . Al Ilegar al punto start la pRb se fosforiliza por la accin del complejo ciclin-cd(2, con lo que cede el factor de transcripcin E,F, que acta sobre el oncoE,en myc, para estimular la replicacin del DNA. Existen una serie de genes que inhiben la fosforilizacin del pRb, y por tanto la inactivan, tales como el MT!>.1 productor de la protena p16, el WAL.l productor de la p21 y el TGF-B.l p.0ductor de la p27. La liberacin del E,F, al desprenderse del pRb por su fosforilizdcin, posibilita la entrada de la cliila en fase de sntesis. El otro importante factor de conti.01 en el punto Gl-S es el gen tumor supt*esor p53 con su protena p53 "Wild--ype" o nativa, que identifica los posibles errores del D N A y frena el ciclo celular si lo precisa. El gen p53 se encuentra c m

inhibidores de la fosforilizaci6n Y por tanto de la actaci6n

Y
J plSC MTS -1 fosforilicin del pRb por accin de la ciclina / cdk2 C P ~ ? * T G F B ~ ~ d k 4 ~ ~ 2 f ~ p53 ~ ~ F - 1

la banda 1 3 del brazo corto del cromosoma 17 (1 7p13), contiene 1 1 exones y codifica una protena de 393 aminocidos y 53 kb (p53 Wt), que da lugar a un RNA m de 2,5 kd que es quien produce la protena p53, llamada as por tener una longitud de 53 kd. La p53 se acumula en el citoplasma en la fase G,y penetra en el ncleo, si no existe lesin en el DNA; durante unas 3 horas, para permitir la replicacin del DNA. Luego se acumula de nuevo en el citoplasma. La p53 bloquea la replicacin del ILNA si existen errores en el mismo, evitando el paso de G 1 a S, ya sea pasando la clula a la fase G , y procediendo si es posible a su reparacin, o bien, si no consigue su normalizacin lleva la clula al fenmeno

'

lesin DNA reparacin y reentrada en G1

El p53 es el "guardin del genoma"

apoptosis

denominado Apoptosis, "suicidio inducido" o "muerte programada". El p53 a su vez es controlado por el gen MDM.2 (que codifica la protena p93). La protena p53 acta sobre el gen WAF.l (p21), que segn hemos indicado antes inhibe la fosforilizacin del pRb (correlacin entre pRb y p53). La clave de que se produzca la transicin, paso de G,a S en el ciclo celular, viene controlada por la activacin de las "ciclin-dependent-kinasas" (cdk)

Trabajos recientes demuestran que el proto-oncogen myc, al ser estimulado por mitgenos o citokinas, o como consecuencia de una mutacin oncognica, o por la prdida de un gen tumor supresor, desencadena una simulttiea apoptosis y proliferacin celular, dependiendo el resultado final del nivel de bcl-2, capaz de inducir o inhibir el nmero de clulas en apoptosis. La apoptosis y la necrosis son dos tipos totalmente distintos de muerte celular. La necrosis es una respuesta patolgica a la lesin celular severa: la cromatina forma grumos, se hinchan las mitocondrias, se lisa la membrana en citoplasmtica y la clula derrama su contenido en su entorno, dando lugar a un proceso intlamatorio. La apoptosis (del griego apoptosis = hojas cadas del

Protooncogen bcl-2 (18q21)= gen antiapoptosis (regulador negativo de la apoptosis)

que, como se ha sealado antes, fosforilizan en el punto de restriccin y activan protenas especficas para transmitir la orden de sntesis del DNA. Frente al p53 que acta como gen tumor supresor, capaz de inducir la muerte celular, se contrapone el proto-oncogen bcl-2 o gen antiapoptosis (18q211, que acta como regulador negativo de la apoptosis. El proto-oncogen bcl-2 fabrica una protena citoplsmica de 26 kd, que se encuentra en la cara externa de la membrana nuclear, en el retculo endoplasnia y en la membrana externa de las mitocondrias. La protena bcl-2 posibilita que la clula sobreviva frente a diversos insultos, tales como: radiacin, drogas citotxicas, etc.

/ d : 0 2 ~[ + T I 1
rso

mutacin onwgen

1
1

inhibe apoptosis proliferacin celular

rbol), es una respuesta celular fisiolgica frente a determinadas seales o consecuencia de la ausencia de otras seales. Se trata de un fenmeno activo y genticamente controlado: la cromatina se condensa en grandes masas junto a la membrana nuclear, el citoplasma se "arruga" y la clula se fragmenta en los denominados "cuerpos apoptticos", rodeados por la membrana citoplsmi-

ca, siendo fagocitados por las cliilas vecinas. En la apoptosis la destruccin celular se produce sin ruptura de la arquitectura celular y sin dar lugar a inflamacin. La clula muerta rpidamente desaparece por fagocitosis, lo que clificulta el reconocimiento de la apoptosis, su deteccin en los tejidos normales. U n programa de "suicidio celular' es ventajoso para el organismo al poder eliminar clulas no precisas o clclas "peligrosas", y para salvaguardar tina correcta homeostasis celular. Los priricipales genes reguladores de la apoptc)sis son: el p53 y el bcl-2.

lugar al cese del crecimiento incontrolado y producir cambios morfolgicos semejantes a los de las clulas en semescencia. La importancia del p53 en la hemostasis tisular ha hecho que reciba la denominacin de "guardin del genoma". Resumen del ciclo celular normal. La regulacin del crecimiento tisular es

NECROSIS
~rms4rnka 1~

APOPTOSIS
(o rnuelte proida)

reparacin (en 00)

/\

smmorbmica %a l

Los genes Rb y p53 ambos TSG, s9n genes que regulan la senescencia (vejez) celular. El escape de la vejez celular es una etapa importante en la pr0g.esin neoplsica, creciendo las cluias tumorales en forma indefinida en Jn medio de cultivo adecuado, es decir, se vuelven inmortales. La inmortalizaci(3n celular es un factor de crecimiento tumoral incontrolado, permitiendo la progresin maligna del tumor. La reintroduccin de los genes Rb y p53 a un cultivo de clulas tumorales puede dar

consecuencia del equilibrio entre factores positivos y negativos, capaces de dar lugar a seales que actan sobre el ncleo, induciendo agentes especficos a actuar como factores de transcripcin, a travs de la familia de las protenas ciclinas-cdk, para seguir las clulas en su ciclo celular y lograr su divisin. Diferentes proto-oncogenes codifican protenas estimuladoras (GF), que unindose a receptores especficos dan lugar a seales intracitoplasniticas que por una cascada de interacciones llevan el estmulo a genes del ncleo que actan como factores de transcripcin y hacen pasar el D N A a RNA mensajero, con la consiguiente produccin de una nueva protena, capaz asimismo de estimular la sucesiva proliferacin celular. En contraste con los factores de estmu-

lo al doblaje celular existen mecanismos reguladores inhibitorios, como el TGF-B1 y las protenas de 2 genes tumor supresor, el Rb y el p53, capaces de detener el ciclo celular en G,. Este delicado balance de factores de crecimiento estimuladores y factores inhibitorio~ dirige el ciclo celular y regula la normal proliferacin celular.
GF estimulantes GF inhibidores

CARCINOGNESIS: SU DESCRIPCIN DESDE EL PUNTO DE VISTA DEL CICLO CELULAR La alteracin de reloj de ciclo celular, en cualquiera de sus delicados y precisos mecanismos de actuacin, da lugar a la proliferacin celular normal incontrolada, (cncer). Y por tanto cualquiera de los fenmenos descritos: aumento de los efectos estimulantes o disminucin de los inhibidores, es responsable de una alteracin de la normal homeostasis tisular. Aumento de factores de crecimiento o sus receptores. Uno de los mecanismos por el cual los tumores gnito-urinarios mantienen una proliferacin celular incontrolada es por la estimulacin autocrina de factores tales como el EGF o el EGFr. En el cncer de prstata, tan-

to en las lneas celulares andrgenosensibles como en las andrgeno-insensibles, existe una sobre-produccin de TGF-a y EGFr, dando como resultado una continuada proliferacin celular. Asimismo en el cncer de vejiga se ha demostrado una sobreexpresin de EGF y EGFr, tanto ms elevados los niveles cuanto ms invasor sea el tumor, con menor tiempo libre de recidiva. Sobreexpresin de TCF-B1. La mayor parte de los tumores gnito-urinarios presentan aumento de TGF-B1 , pero con reducida sensibilidad a los efectos inhibitorios sobre el crecimiento. En el cncer de prstata, al progresar el tumor, las clulas adquieren resistencia a los efectos inhibitorios del creciniiento del TGF-B1, especialmente en los casos avanzados. As pues en lugar de inhibir el crecimiento tumoral, lo potencia. Por otra parte, el TGF-B1 es un factor angiognico y anula el efecto del sistema inmune del husped. As pues su sobreexpresin equivale a progresin tumoral y conducta muy maligna del tumor. Mutacin del proto-oncogen ras p21. Su sobreexpresin o mutacin es responsable de una permanente estiniulacin de la cascada de seales intracelulares. Los distintos miembros de la familia ras (Ha-ras, Ky-ras, N-ras) son sobreexpresados en muchos tumores. En el cncer de prstata se presenta sobreexpresin de ras p21 en estadios avanzados, especialmente en los metastsicos. Tambin es bastante frecuente una elevacin de ras p21 en el cncer vesical de alto grado, siendo tambin comn una elevacin de ky-ras y n-ras en los tumores testiculares, no habindose demostrado mutaciones del gen

ras en los tumores renales. Sobreexpresin del proto-oncogeii cmyc. Tambin es bastante comn en los tumores urolgicos. La sobreexpresin del oncogen c-myc hace que el ciclo celular no se detenga en los puntos de control. El 67% de las piezas de proiitatectoma radical por cncer de prstata presentan elevacin de c-myc, sierldo del 86% en el cncer vesical G3 y del 73% en el cncer renal, no habindose demostrado sobreexpresin en los tumores testiculares. Aumento de ciclinas. Se ha d e m ' x trado aumento de ciclina D , en el c;incer vesical y en el cncer renal. La !,obreexpresin de ciclina D, lleva a la persistencia de la hiperosforilizaci5n del pRb, por lo que no se detiene el 5 clo celular en el punto G , . Mutacin o prdida del gen supresor pRb. La mutacin o prdida del gt'n pRb da lugar a una incapacidad de aetencin del ciclo celular en el punto tJe restriccin. Se encuentra dictia alteracin en gran nmero de cnceres (le prstata, en 1/3 de los tumores vesical 2s (especialmente en el tipo invasor) sieido rara esta alteracin en el cncer r3nal y en los tuniores testiculares. Mutacin o prdida del gen supresor p53. La mutacin del proto-oncog~n p53 da lugar a una protena distinta ce la que normalmente produce. En Icigi~r de producir la protena p53 "Wild Typc*" produce una protena mucho ms estable por lo que puede ser detectada pcir inmunohistoquniica. El alto riesgo de transformacin mziligna en ausencia de p53 se debe prclbablemente a una menor oportunida~J de reparar el D N A alterado y a la incapacidad de eliminar por apoptosis las
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clulas que no pueden ser reparadas. Gran nmero de cnceres humanos presentan mutaciones de p53: el cncer de prstata en estadios avanzados, los cnceres vesicales infiltrantes y/o de alto grado, siendo en cambio ms raro el de carcinonia renal y en los tumores testiculares tipo seminoma. U n factor que puede contribuir a la curabilidad de algunos tumores por las drogas quimioterpicas es la posibilidad de que estos agentes produzcan una rpida apoptosis por ser lesionado el D N A de las clulas con p53 normal. Es

mutacin del protooncogen p

prdida de los

2 genes p53

decir, ante una clula tumoral pero con p53 normal la quimioterapia puede dar lugar a la apoptosis celular y por tanto la curacin del paciente. Si en dicha
Papel del pS3 en la quimioterapia antiumoral

clula\
normal

Tm con alguna con pa

recidiva caula resistente del Tm pm mutado1 (resistente vol del Tm a.!a-qt)=

(y -

poblacin de clulas tumorales existen algunas con mutacin del gen p53, la accin de la quimioterapia destruir por apoptosis las clulas con p53 normal pero las que presenten el p53 mutado son resistentes a la quimioterapia, obtenindose una disminucin del volumen del tunior, con posterior recidiva tumoral por progresin de la poblacin no sensible a la quimioterapia. RESUMEN La presentacin realizada permite poder entender la terminologa utilizada

por los investigadores en Biologa Molecular frente a la oncognesis. Gracias a la descripcin en detalle de la normal fisiologa del ciclo celular, la descripcin de sus niecanismos de regulacin, de los efectos estimulantes e inhibitorios de los factores de crecimiento, podemos ahora fcilmente interpretar el lenguaje utilizado y de esta forma estar preparados para salvar gracias al puente establecido el vaco de conocimietitos y establecer de esta forma utia. relacin cada vez ms necesaria en la prctica clnica diaria con la Biologa Molecular.

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