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Ins Neri

Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Nova de Lisboa

2011-2012

CICLO CELULAR

Todas as clulas provm de clulas pr-existentes, sendo necessria a ocorrncia de um ciclo celular como forma de uma clula se dividir em duas clulas-filhas geneticamente iguais entre si e clula que as originou (clula-me). Cada ciclo celular compreende duas etapas:

Interfase

Ciclo Celular
Mitose

etapa mais longa do ciclo celular; a clula prepara a sua diviso


etapa na qual ocorre a diviso celular, por mitose

Ciclo celular: srie de eventos ocorridos entre duas mitoses; tem como objectivos: - crescimento celular; - replicao do DNA; - distribuio dos cromossomas duplicados pelas clulas-filhas; - diviso celular. A durao do ciclo celular varia consoante o tipo de clula (12 horas em clulas do epitlio intestinal; 20 horas nos fibroblastos de mamferos em cultura; 1 ano em clulas hepticas humanas). Cada ciclo celular compreende vrias fases:

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Na maioria das clulas, a coordenao entre as diversas fases do ciclo celular dependente de um sistema de controlo de pontos de verificao e retroalimentao checkpoints que previnem a entrada na prxima fase do ciclo at que os eventos da fase anterior estejam completos. A funo de grande parte dos checkpoints assegurar que os cromossomas incompletos ou danificados no se replicam e sejam passados para as clulas-filhas.

INTERFASE

A interfase caracterizada pelo crescimento celular e pela replicao do DNA; trata-se de um perodo de grande actividade biossinttica, transcrio de genes, sntese proteica e crescimento em massa. A interfase compreende trs fases distintas: fase G1 (ou GAP1): a clula encontra-se metabolicamente muito activa e cresce continuamente; fase S: ocorre a replicao do DNA, passando cada cromossoma a ter dois cromatdeos; fase G2 (ou GAP2): o crescimento continua e d-se a sntese das protenas necessrias para o incio da Mitose.

A transio entre as fases G1 e S e a transio entre a fase G2 e a fase mittica necessitam da interveno de complexos ciclina-CDK: - as CDK so cnases dependentes de ciclinas que constituem a poro catalttica do complexo; - as ciclinas so as subunidades reguladores do complexo. Ao longo da interfase surgem vrios checkpoints, que procuram que a clula avance para fases posteriores do ciclo na ausncia de anomalias no DNA.

Fase G1

a etapa mais longa da interfase dura cerca de 45 % do tempo total do ciclo celular. Verifica-se sntese de RNA, de enzimas e de protenas necessrias sntese de DNA , assim como a formao de organelos celulares. Existe um notvel crescimento celular. A clula monotoriza as condies ambientais internas e externas e o tamanho. Durante G1, o DNA modificado pela aco de vrias protenas que se ligam s origens de replicao formando o complexo pr-replicao. Nesta fase registam-se dois checkpoints um ponto de restrio, que impede a clulade prosseguir para as restantes etapas do ciclo celular, caso no sejam verificadas as condioes

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ambientais favorveis ou caso a clula no possua o tamanho adequado, e um checkpoint de danos no DNA. Ambos os pontos de controlo esto ausentes em clulas tumorais.

Caso as condies ambientais extra ou intracelulares no sejam favorreis, as clulas saem do ciclo celular e entram na fase G0: - apesar de possuirem um metabolismo activo, fazendo, por exemplo, sntese proteica, no tm capacidade de se dividir. - ocorre uma represso activa dos genes necessrios para a mitose. - Pode ser: temporrio estado quiescente durando dias ou anos, at que, atravs de estmulos (condies ambientais favorveis, por exemplo), a clula reentra no ciclo celular (ex.: clulas hepticas); permanente ocorre em clulas altamente diferenciadas, incapacitadas de se dividir (ex.: clulas nervosas, cardacas, neuroniais e algumas clulas musculares estriadas).

Fase S

A fase S ou de sntese corresponde fase de replicao do DNA e dos cromossomas. Verificase a estrutura dupla dos filamentos de cromatina , a sntese de histonas e a replicao dos centrolos. A replicao inicia-se nas origens de replicao distribudas ao longo do DNA, tratando-se este processo de uma replicao semiconservativa, bidireccional e que ocorre no sentido 5 para 3 de cada cadeia da molcula dupla de DNA. Este fenmeno tm associadas diversas protenas que modificam o DNA, formando o complexo pr-replicao. medida que se d a replicao do DNA, as protenas que intervm neste processo vo sendo inactivadas, de modo a evitar que o DNA possa ser replicado mais do que uma vez em cada ciclo celular. Esta etapa dura cerca de 34% do tempo total de cada ciclo celular.

Fase G2

Caracteriza-se por ser a etapa na qual as clulas se certificam da qualidade do DNA, aps o processo de replicao ter ocorrido, verificando desta forma se a replicao ocorreu devidamente e assegurando que esta terminou. Ocorre sntese de molculas necessrias para a diviso celular , como os centrolos. Os cromossomas duplos so bem visveis em microscopia ptica.

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Nesta fase, a clula apresenta o dobro da quantidade de DNA (4n) relativamente cluladiplide original (2n). Apresenta um checkpoint para danos no DNA, sendo que, no caso de este no se ter replicado apropriadamente ou se enocntre danificado, a clula no entra em mitose (defeitos neste checkpoint esto associados ao aparecimento de tumores). Representa cerca de 16% do tempo de cada ciclo celular.

Coesina e Condensina na condensao dos cromossomas

A coesina permite a coeso das duas cadeias da molcula de DNA, ligando-se a esta. Quando ocorre a condensao dos cromatdeos irmos, uma parte da coesina separase da molcula de DNA, permanecendo uma poro desta associada ao centrmero do cromossoma. A condensina liga-se molcula de DNA durante o processo de condensao da cromatina, contribuindo assim para a condensao dos cromatdeos irmos.

A REGULAO E OS PONTOS DE CONTROLO DO CICLO CELULAR

Os pontos de controlo do ciclo celular checkpoints so a maquinaria do ciclo celular que ciclicamente activa ou inactiva as protenas-chave. So mecanismos de regulao do ciclo e impedem erros durante a diviso celular. Os checkpoints garantem que os cromossomas esto intactos e que cada etapa da clula completada antes da prxima fase. Os checkpoints necessitam da interveno de complexos ciclina-CDKs (Cyclin-dependent protein kinases):

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Protenas cnases: so enzimas que fosforilam protenas (adio de um grupo fosforilo) e activam-nas; Protenas ciclnas: s se tornam activas quando ligadas a cnases; a sua concentrao varia de forma cclica durante o ciclo celular. Complexo ciclina-CDK: intervm no controlo do ciclo celular, sendo constitudo por cnases heterodimtricas, formadas por ciclnas sub-unidade reguladora e CDK cnases dependentes de ciclnas, que constituem a sub-unidade cataltica (as protenas inibidoras das CDK so as CDKI CDK inhibitory proteins).

Activao de CDK (activao das ciclinas)

Fosforilao inibitria de CDK (inibio das ciclnas)

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Protenas Inibitrias de CDK CDKI

Diferentes complexos ciclinas-CDK activam diferentes passos do ciclo celular: TCM Biologia Molecular

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Complexo ciclina-CDK G1-CDK

G1/S-CDK S-CDK M-CDK

Ciclina CDK Ciclina D (nos mamferos CDK4, CDK6 existem as ciclinas D1, D2 e D3) Ciclina E CDK2 Ciclina A CDK2, CDK1 (inicialmente chamada cdc2) Ciclina B CDK1

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Fase G1

A progresso em G1 regulada por dois checkpoints: - Ponto de Restrio; - Checkpoint de danos no DNA em G1. Ambos os checkpoints esto ausentes em vrias clulas tumorais, sendo que estas continuam a proliferar-se na ausncia de sinais ambientais favorveis ou com danos no DNA.

Fase S

medida que as protenas replicam o DNA, elas vo sendo inactivadas de modo a prevenir que o DNA possa ser replicado mias do que uma vez por cada ciclo celular.

Fase G2

Existem um checkpoint de danos no DNA, prevenindo a entrada em mitose na presena de DNA no replicado ou danificado (defeitos neste mecanismo de controlo pode levar ao aparecimento de cancro).

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Transies do Ciclo Celular

Transio G1-S: O ponto de restrio regula a expresso de genes necessrios progresso no ciclo celular atravs das protenas pRb e E2F. O factor E2F actua no final de G1; activa vrios genes que codificam protenas envolvidas na sntese de DNA e oxiribonucletideos e estimula a transcrio de genes que codificam as ciclinas A e E e CDK2. Inicialmente, E2F encontra-se inactivo atravs da pRb, sendo que esta promove a desacetilao e metilao de histonas, o que leva a que a cromatina assuma uma forma transcricionalmente inactiva. A interaco pRb e E2F com regies promotoras alvo impede a transcrio de vrios genes, bloqueando a progresso no ciclo celular. Para passar o ponto de restrio, necessria a fosforilao da pRb pela CDK4/6, havendo a dissociao de pRb e E2F, com consequente activao de E2F, permitindo que este active a transcrio de genes necessrios entrada na fase S e que ocorra a acetilao de histonas e, deste modo, a transcrio activa da cromatina. Uma vez passado o ponto de restrio, as clulas esto aptas a entrarem em fase S e percorrer a totalidade do ciclo celular. O complexo formado entre a CDK2 e a ciclina E actua ao nvel da fosforilao da pRb, o que resulta numa mais rpida e eficiente transio entre G1 e S; na fase terminal de G1, h a interveno do complexo CDK2-ciclina A.

Checkpoint de danos no DNA em G1: Impede a progresso no ciclo celular na presena de erros no DNA; A protena supressora de tumores p53 gene regulatrio essencial neste checkpoint (encontra-se mutada em cerca de 50% dos cancros humanos); Os nveis de p53 so regulados pela protena Mdm2, que promove a degradao da p53 quando os seus nveis so elevados;

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Em situaes normais, a Mdm2 liga-se p53, levando sua degradao no proteossoma; Na presena de danos no DNA, a p53 fosforilada pela cnase ATM, estabilizando-se. Isto impede que Mdm2 se ligue p53 e que esta seja degradada. A p53 um factor de transcrio que, quando estabilizado, promove a transcrio da protena p21. Esta inibe os complexos ciclina-CDK em G1, essenciais para que a clula possa entrar na fase S. Desta forma, nveis elevados de p53 impedem a clula de entrar na fase S, permitindo-a corrigir os danos presentes no seu DNA.

Checkpoint de danos no DNA em G2: Impede a entrada em mitose de clulas com DNA danificado em G 2 ou em caso de replicao incompleta; Este atraso possibilita clula a correco dos erros no DNA antes de entrar em mitose; Caso os danos no sejam possveis de reparar, a clula desencadeia um mecanismo de morte celular entra em apoptose; O checkpoint de danos no DNA da fase G2 envolve trs componentes: sensores (Rad1, Rad 9), transmissores (cnases como ATM) e efectores (Chk1); Quando existem danos no DNA ou no caso de a replicao ter sido incompleta, as protenas de checkpoint ATM e Rad 1/9 fosforilam a protena Chk1,

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activando-a. Esta, por sua vez, fosforila a Cdc25, inactivando-a. Como Cdc-25 activa tem um importante papel na entrada da clula em mitose, a sua inactivao leva a que a clula fique mais tempo em G2 para que tente corrigir os danos verificados a nvel do seu DNA.

Transio G2 Fase Mittica: A entrada da clula em mitose requer a actividade de uma protena heterodimrica, o MPF (Mitosis Promoting Factor): - encontra-se presente no citoplasma, apresentando uma actividade cclica, ou seja, a sua actividade encontra-se aumentada qaundo a clula vai entrar em mitose ou meiose e mnima quando a clula chega ao fim de uma mitose ou de uma meiose; - promove a entrada em mitose ao induzir a desintegrao do invlcuro nuclear, a condensao da cromatina, reorganizao radical do citoesqueleto perda de adeso entre as clulas e a matriz extracelular e a reorganizao do retculo endoplasmtico e do complexo de Golgi; - o MPF, visto ser um heterodmero, composto por ciclina B (poro reguladora da actividade de CDK1) e CDK1 (poro cataltica do MPF, sendo necessria para a entrada em mitose). A fosforilao da CDK1 na treonina 161, por parte da CAK, e a desfosforilao na treonina 14 e na treonina 15 (que estavam fosforiladas por aco do Wee1 e do Myt1), por aco da Cdc25, tm um efeito activador da CDK1, o que permite a entrada da clula na fase mittica; Uma vez que a clula se encontra em mitose, a ciclina B degradada e a CDK1 fosforilada.

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MITOSE

A fase mittica a etapa do ciclo celular atravs da qual o ncleo das clulas eucariticas se divide, originando dois ncleos-filhos geneticamente idnticos entre si e clula-me e com um nmero diplide de cromossomas. A mitose ocupa uma pequena fraco temporal do ciclo celular entre 2% a 5% do tempo total de durao do ciclo. Engloba cinco fases: profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. A citocinese o processo atravs do qaul ocorre diviso celular, ocorrendo paralelamente mitose (e no depois da telofase).

Fases da Mitose

Profase: verifica-se a condensao do DNA, apresentando-se este sob a forma de cromossomas, de modo que seja possvel uma diviso equitativa de DNA pelas duas clulas-filhas, quer em termos de quantidade, quer em termos de qualidade. Ocorre tambm o incio da formao do fuso mittico (ou fuso acromtico) por parte dos microtbulos, sendo que este fuso se encontra organizado a partir de dois centrossomas, garantindo a bipolaridade do processo. Prometafase: ocorre a desintegrao do invlcuro nuclear por fosforilao da lmina nuclear (rede de filamentos inetrmdios). Nesta fase, a mais longa da mitose, os microtbulos comeam a capturar os cromossomas, atravs de estruturas especializadas dos cromossomas, os cinetocoros existe uma associao entre os microtbulos e as protenas cinetocoro. na prometafase que os cromossomas se comeam a alinhar no equador da clula. O fim desta etapa assinalado pela ligao de todos os cinetocoros cromossomais a microtbulos. Metafase: caracteriza-se pelo alinhamento dos cromossomas ao nvel do plano equatorial da clula, encontrando-se equidistantes de ambos os plos do fuso mittico. Anafase: ocorre a separao dos cromatdeos, num processo que implica a activao do complexo promotor da anafase APC (anaphase promotor complex) ou ciclossoma. O complexo promotor da anafase APC ou ciclossoma uma enzima que permite a destruio proteoltica de protenas regulatrias especficas, nomeadamente a ciclina B, responsvel pela actividade da CDK1 e da proteina securina que inibe a aco proteoltica da enzima Separase responsvel pela degradao das coesinas. A

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degradaco das coesinas leva separao dos cromatdeos que constituiam os cromossomas e subsequente migrao para polos opostos. Esta migrao acontece essencialmente atravs do encurtamento das fibras do cinetocoro a partir do prprio cinetocoro que pode envolver a proteina motora dinena e pelo prprio afastamento dos polos devido actividade de proteinas motoras da familia das cinesinas (neste caso as cinesinas bipolares) que promovem o deslizamento de uma outra classe de microtbulos interpolares. A degradao da ciclina B est envolvida na descondensao cromossmica, que se regista posteriormente. Inactivao de Securina pelo APC

Inactivao de M-ciclina por APC-Cdc20

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Esta etapa caracterizada por duas fases: Anafase A: etapa inicial, na qual ocorre a separao dos cromatdeos irmos em direco ao plo negativo dos microtbulos atravs da libertao da coesina que junta os cromatdeos irmos. Verfica-se o incio do movimento de separao dos cromossomas pela despolarizao dos microtbulos cinetocoros e pela perda de tubulina no terminal +. Isto provoca um encurtamento dos microtbuos cinetocoros, havendo um fluxo de cromossomas para os polos do fuso e uma despolarizao do terminal -. Anafase B: segunda etapa da anafase, verificando-se a segregao dos cromatdeos irmos para cada plo da clula. Existe a seprao dos polos do fuso: as protenas motoras cinesina-5 do terminal + que cruzam com os terminais + dos microtbulos interpolares puxam os polos, assim como os motores dinena que ligam o terminal + dos microtbulos astrais ao crtex da clula. Telofase: a ltima etapa da mitose caracteriza-se pela regenerao do invlcuro nuclear, desintegrao do fuso mittico e descondensao dos cromossomas. Verficase um reposicionamento dos organelos celulares: as mitocndrias crescem e dividemse a partir de outras e o retculo endoplasmtico e o complexo de Golgi, fragmentados no incio da mitose, agregam-se aos cromossomas na telofase. O final da telofase acompanhado pelo final da citocinese. Citocinese: permite a diviso do citoplasma celular atravs de um anel contrctil constudo por filamentos de actina e de miosina. O anel contrai-se e permite a separao do citoplasma e, como tal, a formao de duas clulas-filhas em fase G1. Inicia-se aquando da anafase e termina com o fim da telofase. Durante a anafse, o fuso mittico sinaliza a formao de um sulco na posio mediana dos plos da clula, assegurando que a citocinese s se finalize no final da mitose.

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Fuso Mittico

Estrutura especializada e temporria formada por microtbulos que medeiam o movimento e o posicionamento dos cromossomas durante a mitose, o que permite a captura dos cromossomas atravs do seu cinetocoro e o afastamento dos cromossomas para clulas opostas. O citosqueleto modificado para modificar os cromossomas durante a mitose. O fuso mittico formado por microtbulos que medeiam o movimento e o posicionamento dos cromossomas drurante a mitose. Este fuso constitudo por trs classes de microtbulos: - microtbulos astrais: estendem-se desde os centrossomas at ao crtex celular, orientando o fuso mittico no eixo da diviso celular; - microtbulos dos cinetocoros: envolvidos na ligao dos plos do fuso mittico aos cinetocoros dos cromossomas, sendo por isso responsveis pela procura e captura de cromossomas; - -microtbulos polares: estendem-se de cada centrossoma at ao seu homlogo contralateral; esto envolvidos no movimento inicial dos centrossomas e na manuteno da estrutura do fuso mittico. Todos os microtbulos em cada metade do fuso mittico tm a mesma polaridade, excepto os microtbulos polares, que se estendem para alm da regio mdia da clula.

O fuso mittico encontra-se unido atravs de dois tipos de interaces: Interaces laterais pela mistura das extremidades dos microtbulos polares; Interaces entre os microtbulos cinetocoro e o cinetocoro de cada cromatdeo.

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Microtubule-biding proteins e microtubule motor proteins cooperam na ligao do cinetocoro ao microtbulo, enquanto subunidades de tubulina so adicionadas ou libertadas. A ligao dos microtbulos aos centrossomas efectuada atravs dos cinetocoros. Uma vez ocorrida a aproximao lateral entre um microtbulo e um cinetocoro, uma variante citoplasmtica de dinena vai levar captura dos cromossomas por parte dos microtbulos, sendo os cromossomas posteriormente movimentados. O nmero de microtbulos ligados ao cinetocoro aumenta medida que a mitose progride, atingindo o mximo na anafase. de referir que, na espcie humana, cada centrmero se liga a entre 20 e 30 microtbulos. Numa situao normal, cada cinetocoro de um mesmo cromossoma encontra-se ligado a um plo diferente. No entanto, a geometria dos cromossomas leva a que possam ocorrer erros nas ligaes entre os microtbulos e os cinetocoros: ambos os cinetocoros podem encontrarse ligados por microtbulos a um mesmo centrossoma ou um mesmo cinetocoro pode captar microtbulos provenientes de plos diferentes.

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Caso situaes como estas no sejam corrigidas, podemos encontrar clulas-filhas com um nmero anormal de cromossomas, havendo um checkpoint mittico que permite monotorizar a ligao dos microtbulos do cinetocoro.

Instabilidade dinmina dos microtbulos

Os microtbulos so polmeros de dmeros de tubulina, sendo estruturas altamente dinminas, que constantemente polimerizam, por aco da hidrlise de GTP, e despolimerizam. esta instabilidade dinmica que permite uma orientao dos microtbulos e, dessa forma, durante a mitose, os microtbulos tornam mais curtos, menos estveis e mais dinmicos, ocorrendo maior quantidade de polimerizaes e despolimerizaes por unidade de tempo, qaundo comparando com a interfase.

Alinhamento dos cromossomas na placa mittica

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Para a clula entrar em anafase, os cromossomas devem estar dispostos de forma alinhada no plano equatorial da clula. Assim que um cinetocoro captado por um microtbulo de um dado plo, ocorre incialmente a migrao do seu cromossoma para esse plo, como forma de ocorrer uma maior captao de microtbulos, sendo esta migrao auxiliada pelas dinenas, protenas motoras que permitem o transporte no sentido negativo dos microtbulos. Contudo, cada cromossoma migra depois para o plano equatorial da clula ao longo dos microtbulos, movimento que operado pela CENP-E (cinesina 7). Vrias protenas motoras da famlia das dinenas e cinesinas participam nos processos de migrao dos cromossomas e na aquisio da sua conformao (cromocinesinas protenas da famlia das cinesinas, estando associadas cromatina; ajudam no deslocamento dos braos dos cromossomas) e nos processos dinmicos dos microtbulos (protenas bipolares ligam-se aos microtbulos adjacentes da mesma polaridade ou com polaridade inversa). medida que ocorre migrao cromossomal, existe remoo de tubulina ao nvel dos microtbulos prximos do plo negativo (prximos dos centrossomas) e adio de tubulina ao nvel dos microtbulos prximos do terminal positivo (prximos dos cinetocoros), sendo este processo designado por fluxo microtubular. Ao nvel dos cromossomas, para que se verifique a sua migrao, ocorre instabilidade direccional, com coordenada polimerizao de microtbulos a nvel de um dos cinetocoros (que empurra o cromossoma) e despolimerizao de microtbulos no noutro cinetocoro (que puxa o cromossoma).

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Centrossoma

A presena do fuso mittico possvel devido aos centrossomas organelos que actuam como centros organizadores de microtbulos, entendidos como plos do fuso mittico. So constitudos por dois centrolos, dispostos perpendicularmente, rodeados por uma massa amorfa de protenas (o material pericentriolar, onde os microtbulos so reciclados). Em corte transversal, um centrlos apresenta nove tripletos de microtbulos. Os centrossomas duplicam-se na fase S do ciclo celular, formando-se, no final desta fase, dois pr-centrlos, que sofrem maturao no final da fase G2, originando-se dois centrossomas independentes que migram para regies opostas da clula quando esta entra em profase. Vrias clulas tumorais apresentam mais do que dois centrossomas, o que contribui para a instabilidade gentica, para uma segregao errada dos cromossomas e para uma desigual distribuio cromossmica nas clulas-filhas. Os microtbulos possuem um complexo em anel de y-tubulina (y-TURC), sendo que este permite a polimerizao dos microtbulos a uma determinada concentraocrtica de tubulina. Este complexo essencial para a formao do fuso mittico e, por isso, para a diviso celular.

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Ciclo do Centrossoma

O ciclo do centrossoma comea na fase G1, aps a duplicao dos centrolos e outros componentes do centrossoma pela S-CDK. Na fase G2, os dois pares de centrolos-filhos encontram-se desenvolvidos, apesar de ainda se encontrarem presentes no interior de um s centrossoma. Na mitose, os pares separam-se e migram para regies opostas do ncleo, estabelecendo a bipolaridade da clula em diviso. Cada centrossoma nucleia um conjunto radial de microtbulos astrais, movimentando-se esta estrutura para os plos da clula. No final da mitose, cada clula-filha recebe um centrossoma com um par de centrolos.

Cinetocoro

um complexo proteico do centrmero que medeia a ligao dos cromossomas ao microtbulo cinetocoro, promovendo a captura e o transporte dos cromossomas. Existem dois cinetocoros em cada clula, sendo constitudos por trs camadas uma placa externa, que formauma interface entre os microtbulos e o cromossoma; uma placa interna que contacta com a heterocromatina; e uma camada fibrosa constituda por protenas motoras da famlia das dinenas. O cinetocoro tem vrias funes: Prende e liga o terminal dos microtbulos aos cromossomas; Gera fora suficiente para mover os cromossomas ao longo dos microtbulos; Regula a seprao dos cromossomas e a sua translao para plos opostos da clula.

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Checkpoint do Fuso Mittico

Para uma clula entrar em anafase necessria a ocorrncia prvia de um checkpoint mittico. Este constitudo por vrias protenas (tais como as Mad e as Bub), que se encontram presentes nos cinetocoros, desde o incio da mitose at ao momento em que os cinetocoros no se encontram ligados ou bi-orientados. Estas protenas imitem sinais de espera para a clula, de modo que no ocorra a anafase. Quando todos os cinetocoros se encontram ligados a microtbulos, deixam de ser emitidos sinais de espera por parte das protenas que integram o checkpoint mittico e a clula pode entrar em anafase. Quando os microtbulos no se ligam ao cinetocoros, as protenas Mad1, Mad2 e protenas Bud encontram-se ligadas a este e inactivam o complexo APC-Cdc20, pela separao de APC e Cdc20. Assim que se verifica a ligao dos microtbulos ao cinetocoro, as protenas Mad desligam-se do cintocoro e o complexo APC-Cdc20 activado.

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