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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS.

Fundada en 1551
FACULTAD DE CÌENCÌAS BÌOLÓGÌCAS
E.A.P. DE CÌENCÌAS BÌOLÓGÌCAS
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios
en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
TESÌS Para optar el Título Profesional de: BÌÓLOGO con Mención en Genética
AUTOR
ANGELA RENEE ARIAS RAMÍREZ
LIMA - PERÚ 2002
AGRADECIMIENTOS .
1
ABREVIATURAS . .
3
RESUMEN .
5
ABSTRACT .
7
1. INTRODUCCIÓN .
9
1.1. OBJETIVOS . .
10
1.1.1. GENERALES .
10
1.1.2. ESPECÍFICOS . .
10
2. ANTECEDENTES .
13
2.1. DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA . .
13
2.1.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA . .
14
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA .
14
2.1.3. NÚMERO DE CROMOSOMAS . .
15
2.1.4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA .
15
2.1.5. IMPORTANCIA NUTRICIONAL .
15
2.2. METABOLITOS SECUNDARIOS .
16
2.2.1. GLUCOSINOLATOS . .
16
2.2.2. ALCALOIDES .
19
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS . .
20
2.3.1. CULTIVO DE CALLOS . .
22
2.3.2. HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO . .
23
2.3.3. EL EXPLANTE .
24
2.3.4. CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS . .
25
2.4. CROMATOGRAFÍA . .
26
2.5. ELECTROFORESIS EN GEL .
27
3. MATERIAL Y MÉTODOS .
29
3.1. INDUCCIÓN DE CALLOS . .
29
3.1.1. MATERIAL VEGETAL .
29
3.1.2. EXPLANTES . .
30
3.1.3. MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS .
30
3.1.4. INDUCCIÓN DE CALLOS . .
30
3.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
31
3.2.1. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS . .
31
3.2.2. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES . .
32
3.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS .
33
3.3.1. ELECTROFORESIS .
33
3.3.2. EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS .
33
3.3.3. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD . .
33
4. RESULTADOS . .
35
4.1. INDUCCIÓN DE CALLOS . .
35
4.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
38
4.2.1. GLUCOSINOLATOS . .
38
4.2.2. ALCALOIDES .
38
4.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS .
39
5. DISCUSIÓN .
41
5.1. INDUCCIÓN DE CALLOS . .
41
5.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
43
5.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS .
45
6. CONCLUSIONES . .
47
7. RECOMENDACIONES .
49
BIBLIOGRAFÍA .
51
APÉNDICE . .
57
AGRADECIMIENTOS
Al profesor Rolando Estrada, por todo el apoyo y cariño que me brindó mientras estuve en el
LRGB.
Al Dr. César Fuertes, investigador del Instituto de Química Orgánica Aplicada a la
Farmacia, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica sin cuya asesoría, apoyo y enseñanzas este
trabajo no hubiera podido llevarse a cabo.
A mis padres, Juan y Hortensia por su amor, apoyo y paciencia.
A mis hermanos Marina, Nina, Juana. Lena, Paul y Eva por su amor y apoyo incondicional.
A Juan Diego y Alessia que vinieron a iluminar nuestras vidas y llenarlas de esperanza y
alegría.
A mi mamá Eloy, a mi mamá Jessi y a mi papá César, y a mis primos aunque sería más
adecuado decir hermanos.
A Verónica, Delcy y Enrique, por enseñarme a querer y a sentirme querida como nunca
antes y a Luchito Alanya con todo mi cariño.
A Mary Gálvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que siempre llevo en el
corazón y a Miles por su amistad sincera y su entusiasmo contagiante.
A mis amigos de la Facultad de Ciencias Biológicas, en especial a Nancy, Maggi, Miriam,
María Esther, Ingrid, al profesor Mariano, a la profesora Caleen Távara, y a todos los amigos que
conocí en esta casa de estudios y que no puedo enumerar por razones de espacio.
A mis amigos del LRGB, los “dinosaurios” César, Fredy, Rafo, Pepe, Flor, Margarita, y
Augusto que me hicieron sentir bienvenida y en mi segundo hogar, a los que siguieron llegando:
Héctor, Indira, Mariellix, Alberto, Elisa, Gilmar, Roberto, Gerardo, Nancy, las profesoras
Vidalina y Yolanda para compartir preocupaciones y alegrías, los chicos que hoy están
empezando su camino en especial a Arturo, Alex, Ivett y Joel.
AGRADECIMIENTOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 1
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
2 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
ABREVIATURAS
IAA - Ácido indol acético
IBA - Ácido indolbutírico
NAA - Ácido Naftalenacético
2,4D - Ácido 2,4-diclorofenoacético
BAP - Bencil amino purina
KIN - Kinetina
ZEA - Zeatina
2ip - 2-isopentenidenina
ABREVIATURAS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 3
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
4 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
RESUMEN
Lepidium peruvianum Chacón (maca), es una crucífera altoandina, que crece a entre los 3,500 y
4500 m.s.n.m. Originaria de la meseta del Bombón, en los departamentos de Junín y Pasco; por
sus cualidades medicinales y su alto valor nutritivo, es una planta de alto interés económico,
cuyo cultivo se ha extendido a otras regiones de nuestro país. En el presente trabajo se estudió la
susceptibilidad de la especie a las técnicas del cultivo de tejidos como herramienta de producción
de metabolitos secundarios. Se realizó la inducción de callos en diferentes explantes de L.
peruvianum utilizando la auxina 2,4-D y la citoquinina Kinetina, en un factorial de medios con
diferentes concentraciones auxina/citoquinina. Se obtuvieron callos en la mayoría de los medios
usados, la relación de hormonas más eficiente fue 1 µM auxina/citoquinina. Se evaluó la
presencia de glucosinolatos y alcaloides en los callos obtenidos y se compararon con muestras
control de hipocótilos de maca. Se observó la presencia variable de dos fracciones de
glucosinolatos en los callos, en la mayoría de los casos las manchas tuvieron una coloración más
intensa en los callos que en los controles. De otro lado se observó una alta variabilidad en la
presencia de alcaloides y otros metabolitos no identificados en los callos obtenidos en este
trabajo. También se evaluó cualitativamente la presencia de mirosinasas en los callos obtenidos,
observándose bandas positivas en los callos y las muestras de plantas de maca.
RESUMEN
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 5
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
6 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
ABSTRACT
Lepidium peruvianum Chacón, is a Cruciferae native from the Andes. It grows between 3,500
and 4500 m. Original from the Bombón plateau, located at the Peruvian localities Junín and
Pasco. It became in a crop with a high economical value, due its medicinal and nutritional
properties. Actually, it is extended to other regions of the country. The main objective of this
research is to study the tissue culture ability of the crop to use in vitro tissues as a tool for
secondary metabolite production.
Leaves, petioles, roots and hypocotils of L. peruvianum were tested as explants to induce
calli. Different concentrations of 2,4-D and Kinetin, in MS basic medium were tested. Calli were
induced in most of the media tested, the most efficient hormone ratio auxin/citokinin was 1. It
was evaluated the presence of glucosinolates and alkaloids in the callus induced and compared to
maca hypocotils as control sample. Two glucosinolates fractions were obtained from calli
analyzed. It was found one or two fractions according to the callus and in most of the cases the
concentration was higher in callus than in control. In the other hand, it was observed a high
variability in the alkaloid fractions and other unidentified metabolites extracted from the calli
evaluated in this work.
It was also evaluated the presence of myrosinases in the calli studied, and it was found
positive bands either in callus as in maca hypocotils.
ABSTRACT
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 7
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
8 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
1. INTRODUCCIÓN
Lepidium peruvianum Chacón, "maca", es una crucífera calificada como una de las raíces
y tubérculos andinos (RTA) de más alto contenido proteico. Crece entre los 3,500 y 4500
m.s.n.m (King, 1988). Originaria de la meseta del Bombón, entre los departamentos de
Junín y Pasco, es la única Brassicacea domesticada de los andes y el único cultivo que
reemplaza el cultivo de las papas amargas en esas altitudes (regiones suni y puna de los
departamentos de Junín y Pasco), soportando condiciones ambientales extremas, como
cambios de temperatura de 18° C a - 10° C en un solo día, fuertes vientos, y poca
disponibilidad de agua. La maca es una pequeña planta arrosetada de hojas postradas,
cuya raíz tuberosa es rica en azúcares, otros carbohidratos, proteínas y minerales
esenciales, lo que la convierte en una excelente fuente alimenticia, siendo utilizada
principalmente por las poblaciones rurales de la sierra central, mientras que fuera de su
área de cultivo tradicional aún no es conocida completamente (Aliaga 1999, National
Research Council. 1989)
En la última década del siglo XX, la maca que se consideraba como un cultivo en
proceso de extinción (Castro de León 1990) ha empezado a cobrar importancia gracias al
redescubrimiento de su alto valor nutritivo, energético y medicinal. Una de las principales
propiedades medicinales atribuidas a la maca es la de potenciador de la fertilidad, y su
acción sobre la conducta sexual, propiedad por la que ya era usada en el incanato
(Johns, 1980).
Se han realizado muchos estudios sobre la actividad fertilizante de la maca,
hallándosele propiedades como potenciador de la fertilidad en ratas (Chacón, 1961 y
1. INTRODUCCIÓN
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 9
Ninanya 1995), propiedades estrogénicas marcadas, (Lamas y Upumayta, 1993), como
potenciador de la actividad espermática (Yauri y Valerio, 1991). Estos efectos están
relacionados a la presencia de glucosinolatos aromáticos (Johns, 1980), y de alcaloides
en la planta (Chacón, 1992). Sin embargo los metabolitos de "maca¨ no han sido
estudiados a profundidad, desconociéndose las propiedades de muchos de ellos.
Los glucosinolatos han sido descritos desde hace mucho tiempo, junto con las
mirosinasas (las enzimas que los degradan) como un sistema característico del orden de
las Capparales. Este sistema está involucrado en la defensa de la planta contra insectos
y patógenos. Además, los productos de la degradación de los glucosinolatos están
relacionados con efectos negativos en el ser humano, como la probable inhibición del
yodo en la tiroides producida por los tiocianatos, derivados de la hidrólisis de los
glucosinolatos por acción de la mirosinasa (Daxenbichler y colb., 1964). Pero otro lado,
recientemente estos metabolitos han adquirido interés debido a sus propiedades
anticarcinogénicas (Quiros, 1999).
Anteriores estudios realizados en los alcaloides de Lepidium peruvianum Ch.
muestran que estos compuestos tienen efectos estimulantes sobre la fertilidad femenina
(Chacón, 1990). Por lo descrito anteriormente se eligieron pues los alcaloides y
glucosinolatos para evaluar la posibilidad de utilizar el cultivo de tejidos vegetales para la
producción y estudio de los metabolitos secundarios de maca, debido a que los cultivos
de tejidos y suspensiones celulares pueden ser manipulados para obtener una gran
variedad de productos naturales usados en las industrias de alimentos y farmacéutica. De
hecho esta técnica ya ha sido utilizada a escala industrial en la producción de metabolitos
secundarios (Nuñez y Ochoa, 2000).
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. GENERALES
· Evaluar la producción de metabolitos secundarios de Lepidium peruvianum Ch. bajo
condiciones de cultivo in vitro.
1.1.2. ESPECÍFICOS
· Determinar la composición de un medio de cultivo óptimo para la inducción de callos
en diferentes explantes de L. peruvianum Ch.
· Determinar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum
Ch.
· Comparar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum Ch.
con la que se presenta in vivo.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
10 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
· Determinar la presencia de mirosinasas en callos de L. peruvianum Ch. y compararla
con la que se presenta in vivo.
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 11
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
12 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
2. ANTECEDENTES
2.1. DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA
El género Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en
prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más grandes
dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y Europa han sido
estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las especies endémicas Andinas
(Quiros 1999).
Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira (1986),
existían 11 especies clasificadas del género Lepidium a la que agrega Lepidium
peruvianum Chacón como una nueva especie.
De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue domesticada
hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier (1986, citado por
Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el Perú.
La maca parece haber jugado un papel importante en la economía prehispánica, y
durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los tributos exigidos por el
Encomendador (Chacón, 1990).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 13
2.1.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
División: Angiospermae
CIase: Dicotyledoneae
SubcIase: Archichlamydeae
Orden: Papaverales
FamiIia: Brassicaceae
Genero: Lepidium
Especie: Lepidium Peruvianum Chacón. Sp. Nov. Antes L. Meyenii Walp.
Nombre Comun: Maca, Maca-Maca, Maino, Ayak Chichira, Ayac Willku, Ginseng
Peruano.
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal en la sierra alta,
(no se tienen referencias respecto a su comportamiento en menores altitudes) siendo
autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de 5 meses con una floración que
dura dos meses. Las flores se abren en series sucesivas, presentando cuatro etapas: flor
cerrada con anteras sin dehiscencia, flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor
abierta con estructuras florales en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales
entrando en senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de
8 meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el
ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da generalmente
entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos (Aliaga, 1999).
La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita como
tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de hipocótilo (Aliaga
1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León (1964), éste es un eje carnoso
derivado del hipocótilo cuya parte superior termina en una superficie plana de la que
brotan de 6 a 15 hojas; mientras la inferior es cónica y se alarga en una raíz ancha y
fuerte con dos áreas irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.
Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio morado (la parte
superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero se pueden encontrar
también maca de color rosado, crema-morado, amarillo-negro, plomo, y raras veces
morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por los campesinos y el mercado es el
color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999).
El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas, compuestas
bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase vegetativa son grandes (10
÷ 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm) en la fase reproductiva (Tello y colb.
1992 y Aliaga, 1999).
La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas 1994), con el eje
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
14 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con cuatro sépalos, cuatro
pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un ovario súpero bicarpelar y
bilocular, con un óvulo en cada lóculo de placentación axilar. Su fórmula floral es:
K
4
C
4
A2-4G
2
(León, 1964 y Aliaga, 1995).
El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides de 2-3 mm
de ancho y 4 ÷ 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998) el color de las
semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga, 1999).
2.1.3. NÚMERO DE CROMOSOMAS
Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8 con 54 ÷ 56
cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células madres de plantas en
floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la maca es un poliploide disómico
del número cromosómico básico del género: n = 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64
cromosomas.
2.1.4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e inclusive en
regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden sobrevivir, altitudes que se
encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes (National Research Council. 1989); el
cultivo de la maca (luego de la colonia), estuvo restringido a los departamentos de Junín y
Pasco, en las regiones suni y puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de
Junín; a altitudes de 4100 ÷ 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras
localidades de estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.
Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la distribución del
cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de cultivo de la planta
disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778, Hipólito Ruiz lo circunscribe la
región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta tendencia se mantuvo hasta la década de
los ochenta, en la que el área de cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999).
En la década de los 90 esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su
cultivo se extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la
maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y Apurímac (Aliaga,
1999).
2.1.5. IMPORTANCIA NUTRICIONAL
La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada como alimento,
aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras (National Research
Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces andinos, es una de las
especies con mayor valor alimenticio; con un alto contenido de aminoácidos esenciales,
comparables con los recomendados por la FAO ÷ OMS, siendo altos sus valores de
lisina, tirosina y fenilalanina. La fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 15
organismo para la biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de
minerales de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver
apéndice)
2.2. METABOLITOS SECUNDARIOS
Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no tienen una
función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos fundamentales de los
organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).
Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta de los
depredadores, competir ventajosamente con otras plantas, atraer polinizadores y
simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a los que se vean
sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991). Las evidencias de
una estricta regulación metabólica de estos productos nos indicaría que cumplen un rol
importante en la sobrevivencia de las plantas.
2.2.1. GLUCOSINOLATOS
Los glucosinolatos son una clase tioglucósidos restringidos a las dicotiledóneas limitados
a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y especies (Kjaer, 1973), los que
son almacenados en diferentes tejidos de la planta, siendo una fuente significativa del
contenido de azufre y minerales de la planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981),
se encuentran en muchos cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la
mirosinasa, conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las
Capparales (Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en
muchas brassicaceas económicamente importantes, como la mostaza, calabazas,
brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes produce, como una
respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular que exponen los glucosinolatos
almacenados a la acción de las enzimas que los degradan, las mirosinasas, produciendo
isotiocianatos, nitrilos, cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros
factores (Fig 1) (Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad
de las hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la
susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados, (Mithen y
col. 1995)
La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies fue hecha
por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb., 1981), en 1973,
Kjaer puntualizó: "entre el vasto número de productos secundarios vegetales, aquellos
que presentan una distribución discontinua junto con un llamado inmediato a los sentidos
humanos (olor, sabor, color) han adquirido, por razones obvias, una posición prominente
en discusiones acerca de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación
y, más fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos...
constituyen un grupo con algunas de las características anteriores." ... "La complejidad
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
16 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por ejemplo dentro de
Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la posición biológica e importancia
de este grupo de constituyentes vegetales químicamente bien definido y en constante
crecimiento".
Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de tioglucósidos en
Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia de algunos de ellos son
indeseables por algunos efectos tóxicos de los productos de su degradación (Josefsson,
1967), tales como nitrilos, isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas
(Bones y Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo
estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de
glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para mejorar la
palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o, aumentándola como se trata de
hacer en brócoli con el glucosinolato glucorafanina, que al hidrolizarse forma sulfurofano
con actividad anticancerígena (Quiros, 1999).
Las especies del género Lepidium son usualmente ricas en bencil isotiocianatos
(Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs (1981), sugiere que las
propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los productos de los glucosinolatos
de maca, los isotiocianatos aromáticos, bencilisotiocianato y el p-metoxibencil
isotiocianato, el último de los cuales también se encuentra en mashua.
Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen el mismo
núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una oxima sulfonada y un
grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste el carácter variable (Bones y
Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la actividad biológica del glucosinolato al
determinar la naturaleza de los productos resultantes del daño de los tejidos de la planta,
(Mithen y colb., 1995). La naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los
glucosinolatos aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los
alifáticos (bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas,
por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por un
catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles e
hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se diferencian sólo
en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran número de glucosinolatos,
se usan nombres semisistemáticos, en los que el nombre de la cadena R es seguido por
el sufijo "glucosinolato¨.
Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los d- aminoácidos, Valina, Alanina,
Leucina, Ìsoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer, 1973), en una serie de
reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el carbón d se transforma en el
carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981), aunque solo siete corresponden a
aminoácidos proteicos (antes mencionados), los restantes derivan de modificaciones de
la cadena lateral, que probablemente a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos
no proteicos (Chapple, y colb., 1994 y Larsen, 1981).
Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado muchas
técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de capa fina,
cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio de los productos
de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de los productos de la
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 17
degradación enzimática pueden causar resultados erróneos, (Larsen, 1981).
El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la producción
de -D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que nuevamente pueden ser
descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)
Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en vacuolas
celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes ricas en
glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas aún no se ha
definido su localización celular (Rodman, 1981).
Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de Argelia, de
acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el género Ìsatis y reubicando el género
Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el valor taxonómico de estos
compuestos.
2.2.1.1. EL SISTEMA MIROSINASA - GLUCOSINOLATO
Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas están
invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer, 1973), así, sin
excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la planta por esta enzima.
Las mirosinasas se encuentran en idioblastos especializados ricos en proteínas llamados
células de mirosina (Rodman, 1981) que se encuentran en el tejido parenquimático
(Bonnes y Rossiter, 1996), éstos se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn,
1979; citado por Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran
separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la
masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).
Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza, (Kjaer, 1968)
posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la familias Caparaceae,
Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se ha encontrado en los hongos
Aspergillus sydowi y Aspergillus niger, en la bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de
mamíferos y en los áfidos que atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae.
Pero estas enzimas parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones
y Rossiter, 1996)
Fuente: Bonnes y Rossiter. 1996. The Myrosinase ÷ Glucosinolate System, its
Organization and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
18 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede producir: a)
isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un pH normal; b) nitrilos, cuando la
hidrólisis ocurre a pH ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la mirosinasa se presenta con
una pequeña proteína conocida como proteína epitioespecificadora; d) tiocianatos, que
son producidos solo por tres de los glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl,
bencil, y 4-(metiltio) butilglucosinolatos.
MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel separando varias
isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de Rhoeadales, cada especie
tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También encontraron que este patrón variaba
de acuerdo a la parte de la planta de la cual se hicieran los extractos.
Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas enzimas
puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo al órgano y edad
de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta diferencia.(Bonnes y
Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas particulares corresponden a
condiciones endógenas encontradas en las plantas, o al organismo blanco o a los
glucosinolatos que predominan en el tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996).
2.2.2. ALCALOIDES
Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos secundarios de
moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia económica debido a sus
propiedades farmacológicas, las mismas que han sido usadas desde la prehistoria hasta
la actualidad. Son los metabolitos mas frecuentes en el reino vegetal, habiéndose
encontrado cerca de 10,000 alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con
flores, principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999).
Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o más átomos
de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad farmacológica (Lock, 1994)
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 19
La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los aminoácidos,
principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque algunos alcaloides se
encuentran en varios géneros o aún en una familia, la mayoría de las especies presentan
un patrón único, genéticamente determinado. Por otro lado su distribución está restringida
a determinados órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins,
1999).
No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la planta, aunque
se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son amargos, lo cual es considerado
universalmente como un carácter repelente. Todos son biológicamente activos, muchos
significativamente tóxicos y otros con propiedades antibióticas. Frecuentemente los
tejidos que acumulan alcaloides son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que
pueden ser atacados por herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de
las plantas no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los
organismos vivientes (Lock, 1994).
Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico, utilizando
soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el extracto crudo de
alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de amoniaco y carbonato de
sodio, para extraerlos luego con solventes orgánicos.(Lock, 1994)
Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la cromatografía de capa
fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el uso de Sephadex LH-20 por
elución y la cromatografía líquida de alta perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son
muy variados y el agente revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya
aplicación produce manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).
La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides en
Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto alcaloideo de
maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación de la maduración los
folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio. Posteriormente Yllesca, (1994), en un
estudio fitoquímico de la planta encontró 3 alcaloides en los extractos metanólico y
butanólico de maca de los ecotipos amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col.
obtuvieron cuatro fracciones de alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado
Dini y colb., (1994), detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de
polvo de maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff.
Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha determinado
su estructura.
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS
El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta y
proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su potencial
intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas mediante las
cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se cultiva asépticamente en
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
20 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
un medio de composición definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
(Roca y Mroginski, 1991).
Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de Schleiden y
Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la célula es capaz de tener
autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en células somáticas con la observación
de la formación y cicatrización de callos en áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret,
1982).
Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados
por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret 1982), quien trabajó
con células de palizada, pelos glandulares y pelos de estambres de Tradescantia; pero
aunque logró que las células sobrevivieran entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento
celular, probablemente debido a que eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió
células altamente diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho
después que en 1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que
Gautheret logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en
Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White
demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate (Dodds y
Roberts 1982).
Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de callos
indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos, por lo que se
puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos nutricionales para el
crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para entonces ya se había descubierto la
auxina ÌAA (Went, 1926, citado por Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se
estudiaron diversas sustancias que favorecían el crecimiento celular de los tejidos
cultivados in vitro (Gautheret 1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que
recibieron el nombre de citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962,
Murashigue y Skoog propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y
citoquininas que permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982).
También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis, que
sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el principio de
la propagación vegetativa determinando cuales eran los tipos de meristemos que eran
capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel aplicó estos principios en la
propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).
Muir (1953 ÷ 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los callos que
eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones celulares,
desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y de otro tipo de
cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y cultivo de protoplastos y
otros. (Dodds y Roberts 1982).
Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:
a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines.
b) Bioconversión y producción de compuestos útiles.
c) Ìncremento de la variabilidad genética.
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 21
d) Obtención de plantas libres de patógenos.
e) Propagación de plantas.
f) Conservación e intercambio de germoplasma.
2.3.1. CULTIVO DE CALLOS
El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante usado, y la elección
de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Para la
obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de explante que contenga células
nucleadas, y éste se seleccionará en función a razones prácticas como disponibilidad,
facilidad de manipulación, homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta
respuesta puede variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad
ontogénica y tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de
incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa amorfa
desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y Roberts 1982), y
sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en otros desintegrándose a
medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este crecimiento depende de la
relación entre la planta de origen, el medio de cultivo, las condiciones ambientales y el
tiempo de incubación; algunos callos crecen fuertemente lignificados y de textura dura,
mientras otros se rompen fácilmente en pequeños fragmentos, estos callos son llamados
friables (Dodds y Roberts, 1995), estos callos son los mejores para la iniciación de
cultivos celulares.
El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en tres fases
de desarrollo: Ìnducción, en la que el metabolismo es estimulado antes de la mitosis;
división celular en el que las células del explante revierten a un estado meristemático; y
por ultimo diferenciación celular y expresión de algunas vías metabólicas que llevan a la
formación de metabolitos secundarios (Dodds y Roberts, 1995).
La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada por
hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su inducción in vitro en
explantes vegetales sin causar estrés, depende de la introducción de reguladores de
crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y Ochoa, 2000).
Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son: el explante y
el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y opcionales que contenga. Los
nutrientes esenciales consisten en las sales inorgánicas, fuentes de carbono y energía,
vitaminas y fitohormonas (Gamborg y Shyluk, 1981). Otros componentes como
compuestos nitrogenados, ácidos orgánicos y sustancias complejas pueden ser
importantes pero son opcionales.
Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el tejido original,
es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en el mismo medio por un
tiempo prolongado lleva al agotamiento de los nutrientes, a la gradual desecación del
agente gelificante y a la acumulación de metabolito que pueden resultar tóxicos para el
callo (Dodds y Roberts, 1995).
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
22 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis semanas, con
cultivos mantenidos en medio agar a 25°C o más, pero en realidad este tiempo varía con
la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts, 1995).
Carhuaz en 1997 (comunicación personal), indujo callos en maca, utilizando un
factorial de cuatro citoquininas (BAP, KÌN, ZEA y 2ip) y cuatro auxinas (ÌÌA, ÌBA, NAA y
2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 µM, concluyendo que el 2,4-D en el rango
de 0.1 ÷ 10.0 µM el regulador más efectivo para promover la formación de callos,
coincidiendo con Gamborg y colb. (1981), quienes indican un rango óptimo de 1- 5 µM
para la acción del 2,4-D y con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la
kinetina como los reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas.
2.3.2. HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO
Se llama hormona o fitohormona a aquellas sustancias orgánicas naturales que a bajas
concentraciones ejercen una profunda influencia en los procesos fisiológicos de la planta
(Hopkins, 1999), mientras que las sustancias sintéticas con las mismas propiedades son
llamadas reguladores de crecimiento, y no son consideradas como hormonas vegetales
(Dodds y Roberts, 1995).
Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas, ácido
absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son las mas
usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con poca frecuencia y
generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual modo el ácido absícico y el
etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y Roberts, 1995).
En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies económicamente
importantes, en muchas de ellas se han inducido callos, incluyendo a Brassica oleracea,
B. napus y Arabidopsis thaliana, los requerimientos para inducir callos en esta familia
pueden ser cubiertos con muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones,
estas concentraciones y la hormona a ser elegida, así como la respuesta de crecimiento
varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se utiliza una auxina y una
citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las citoquininas la más usada es la Kinetina,
mientras que la auxina utilizada con más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación
auxina:citoquinina más eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983).
2.3.2.1. AUXINAS
Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por primera vez por
Went en 1926, quien describió la acción elongadora del ÌAA en coleóptidos de avena.
Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las cuales la más usada en cultivo
de tejidos es el ÌAA, y otras sintéticas o reguladores de crecimiento de las cuales las más
usadas son el 2,4-D, el NAA y el ÌBA (Krikorian, 1991).
Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son el
crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos en
respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas
concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4-D, se ha
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 23
observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro. Este regulador es
la auxina más efectiva para la proliferación de callos usándose a concentraciones de 10
-7
÷ 10
-5
M y aún en ausencia de una citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980).
Además de inducir la proliferación celular, el 2,4-D tiende a suprimir la morfogénesis
del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de diferenciación (Yeoman
y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea mas estudiada, la auxina mas
usada en la obtención de callos en diferentes explantes es el 2,4-D, sea junto a una
citoquinina o a leche de coco (Morris y Altmann, 1994).
2.3.2.2 CITOCININAS
En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la promoción de la
citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de ADN, llamándolo cinetina
(Kinetina, KÌN) y propusieron el término cinina para denominar las sustancias naturales y
sintéticas que presentaban el mismo tipo de actividad biológica. Posteriormente para
evitar confusiones con la sustancia usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el
nombre citocinina para estas sustancias (Krikorian, 1991).
Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división celular en
el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a las 18 h
(Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la formación de brotes e
inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).
Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo compuestos
sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y Roberts, 1995).
Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así algunos cultivos
no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una auxina y no de una
citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado además que en todos los casos
las citoquininas a altas concentraciones (10 ÷25 mg/l) inhiben la formación de callos
(Yeoman y Forche, 1980).
En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó un factorial
de medios con cuatro auxinas (ÌAA, ÌBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro citoquininas ( BAP, KÌN,
ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100 M, utilizando como explantes, la
raíz, hoja, peciolo e hipocótilo.
2.3.3. EL EXPLANTE
Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del origen del tejido
aislado (explante), los explantes que contienen células del cambium pueden formar callos
sin adición de reguladores de crecimiento; pero la mayoría de los explantes requiere de
uno o más reguladores de crecimiento para iniciar la formación de callos (Dodds y
Roberts, 1995). Esta respuesta también depende del estado fisiológico del tejido y del
tiempo de escisión, (Yeoman y Forche, 1980).
Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos exógenos de
la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y citoquininas 4) extractos
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
24 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995).
2.3.4. CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS
Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos secundarios,
pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a programas intensivos de
mejoramiento genético y se presentan además problemas técnicos y económicos para su
cultivo (Dodds y Roberts, 1995).
El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos secundarios
cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede resultar difícil o
económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera necesario, por el riesgo de
sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las pequeñas cantidades de compuesto
presente en la planta o por los controles a los que se someten a las plantas productoras
(Robert y colb., 1991). Por otro lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar
el cultivo de estas plantas (Dodds y Roberts, 1995).
La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser seleccionada para
generar compuestos útiles fue introducida en la década de 1970, en la década de los
ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en cooperación con la industria privada,
produjeron shikonina de Lithospermum erythrorhyzon y saponinas de ginseng
respectivamente (Hara, 1996).
La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la planta
asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del uso del cultivo
de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios. En la planta el
rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de la distribución geográfica
y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en su población. Luego de establecer
una estrategia de producción in vitro, la empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la
primera producción industrial del compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de
shikonina producida in vitro (Robert y colb., 1991).
En la década de los noventa el número de compuestos producidos por cultivo de
tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener compuestos raros en
los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta tecnología es la producción
comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso usado en cosméticos (Hara, 1996).
Actualmente existen al menos tres programas de búsqueda de compuestos con
actividad biológica, llevados a cabo por las industrias farmacéuticas, cada año varios
cientos de plantas son colectados y se intenta en ellas la inducción de callos, con un éxito
de cerca al 50%. Cerca del 10% de los callos muestra alguna forma de actividad (
Schripsema, y colb., 1996).
Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto puro es
estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas han sido
publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los dehidrodiconiferil alcohol
glucósidos aislados de cultivos celulares de Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y
colb., 1996).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 25
La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de reducir el
número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a suspensiones celulares
representa una reducción considerable de los niveles de ciertos metabolitos secundarios,
ocurriendo algunas veces la pérdida completa de productividad para ciertos productos, lo
que no significa que los cultivos celulares no sean capaces de producir compuestos de
interés, por el contrario, Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996)
demostraron que los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.
Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de metabolitos
secundarios son las siguientes:
· Producción a escala industrial
· Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis química
· Reducción de los costos de producción a largo plazo
· Eliminación de la dependencia en materia de importación
· Producción continua y controlada de sustancias independientemente de los factores
del medio ambiente.
· Precios estables
· Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento final y de
los mercados.
Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la productividad
del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de los metabolitos
secundarios) (Becker, 1987).
2.4. CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de mezclas y
sustancias, por adsorción selectiva (Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001) y
fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en 1903, quien descubrió que los
pigmentos de las plantas podían separarse al filtrarlos con éter de petróleo a través de
una columna de carbonato de calcio. Pero el desarrollo de esta técnica empieza
realmente en 1931, cuando, posteriormente otros investigadores introducen otros
materiales como las columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).
Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográficas de acuerdo a los
adsorbentes usados, la cromatografía de columna utiliza sílica, alúmina y sílica gel; en la
cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra sobre un vidrio o una película
plástica, mientras que en la cromatografía de papel, una muestra líquida fluye sobre el
papel adsorbente. Otras técnicas cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que
permite la separación de sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica
donde un gas puede ser descompuesto en iones que interactúan con el adsorbente; la
cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño uniforme, y
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
26 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
finalmente, la cromatografía líquida de alto perfomance (HPLC) donde el adsorbente es
líquido, esta técnica es ampliamente usada actualmente (Microsoft® Encarta® Online
Encyclopedia 2001).
2.5. ELECTROFORESIS EN GEL
La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las partículas cargadas
migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia de un campo eléctrico
aplicado externamente. Este movimiento se realiza en interacción con la matriz
circundante, la cual actúa como un filtro molecular, generándose como consecuencia,
tasas diferenciales de migración para las proteínas contenidas en una muestra (Garfin,
1990).
Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de papel y
acetato de celulosa, y se utilizaron principalmente para separar aminoácidos, péptidos y
mezclas proteicas mal separadas por cromatografía (Freifelder, 1979), los soportes
pueden ser relativamente inertes, como papel, acetato de celulosa, silicagel, alúmina y
celulosa y actuar como tamices moleculares como son los geles de almidón, agarosa y
poliacrilamida (Hames, 1981, citado por Gálvez, 1990).
El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), por
proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta resolución (Garfin,
1990).
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero de
acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N'-metilen-bisacrilamida. Esta
polimerización es catalizada por un sistema generador de radicales libres, compuesto por
persulfato de amonio, que actúa como iniciador, y un acelerador, el
tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de radicales libres a partir del
persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la polimerización del gel (Garfin, 1990).
Otro agente donante de radicales libres es la riboflavina, pero a diferencia del persulfato
de amonio requiere de luz y oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma
leuco, la cual inicia la polimerización (Gálvez, 1990)
Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la acrilamida y la
bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la concentración de acrilamida
aumenta, determinando sus propiedades como tamiz.
La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas
netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan
principalmente para separar y categorizar mezclas de proteínas; pero no para medir la
pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos
sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad
electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la
misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(SDS ÷ PAGE)(Garfin, 1990).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 27
La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas
netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan
principalmente para separar y categorizar mezclas de proteínas; pero no para medir la
pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos
sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad
electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la
misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium dodecyl
sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma que las proteínas
migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este caso deben ser tratadas
con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Gálvez, 1990).
El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en 1970 (Garfin,
1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de geles: un gel de
separación y uno de concentración, ambos geles tienen diferentes porosidades y pH,
sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo, donde la muestra se apila antes de
pasar al gel de separación que se halla inmediatamente debajo y que posee un tamaño
de poro más pequeño. Además, se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos,
esta discontinuidad permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de
concentración, resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
28 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. INDUCCIÓN DE CALLOS
Para la inducción de callos se siguió un protocolo en base al trabajo realizado por
Carhuaz en 1997 (comunicación personal) según se describe a continuación.
3.1.1. MATERIAL VEGETAL
Se utilizaron plántulas de maca amarilla, morada y negra, germinadas in vitro en medio
Murashigue y Skoog (1962), sin hormonas, suplementado con vitaminas, mioinositol,
pantetonato de calcio, 20% de sucrosa, y 2% de gelrite.
Las semillas fueron gentilmente proporcionadas por el Ìng. Rolando Aliaga (CÌMA ÷
UNA) y provinieron de la comunidad de Huayre-Junín.
3.1.1.1. DESINFECCIÓN
La desinfección de las semillas se realizó adecuando el protocolo de desinfección de
rutina usado en el LRGB, de la manera siguiente:
Ìnmersión en alcohol al 70%: 1 minuto
3. MATERIAL Y MÉTODOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 29
Ìnmersión en hipoclorito de Na al 2%: 10 minutos
Enjuague con agua destilada estéril: 1 minuto, cuatro veces
3.1.1.2. CONDICIONES DE CULTIVO
Las condiciones del cuarto de cultivo fueron: 18°C, 1,500 Lux, fotoperíodo de 16 h de luz.
A los 40 días, las plántulas tuvieron el tamaño de hoja necesario para obtener dos
explantes: apical y proximal.
Los colores del ecotipo de maca correspondiente a cada plántula de origen fueron
denominados utilizando la siguiente nomenclatura:
M1 = Ecotipo amarillo, M2 = Ecotipo morado, M3 = Ecotipo negro.
3.1.2. EXPLANTES
Los explantes obtenidos fueron los siguientes:
· E1: Región apical de la hoja (Aprox. 0.5 cm de longitud x 0.5 en la base).
· E2: Región proximal de la hoja del mismo tamaño que el explante anterior. Los
bordes de las hojas fueron cortados para obtener una mayor área de inducción de
callos.
· E3: Porción de peciolo aprox. 1 cm de longitud.
· E4: Hipocótilo completo, incluyendo la roseta meristemática, la mayoría de ellos
medía tuvieron aproximadamente 0.4 cm.
· E5: raíces segmentos sin puntas de aprox.1 cm se escindieron de la región proximal.
3.1.3. MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS
Se utilizaron dos hormonas vegetales para la inducción de callos, una auxina (2,4-D) en
concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µM y una citoquinina (kinetina) en concentraciones
de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µM; como medio básico se utilizó el medio descrito por Murashige y
Skoog (1962) al que se le agregaron mioinositol 100 ppm, pantotenato de calcio 2 ppm,
vitaminas: tiamina 2 ppm, piridoxina 0.5 ppm, ácido nicotínico 0.1 ppm y glicina 0.5 ppm;
2% de sucrosa y 0.2% de gelrite, tal como se utiliza en rutina en el LRGB, obteniéndose
un factorial de 17 medios de inducción semisólidos con diferentes concentraciones de
hormona incluyendo el control negativo.
3.1.4. INDUCCIÓN DE CALLOS
Se sembraron los explantes en placas petri descartables con 25 ml de medio de
inducción, haciendo cinco repeticiones por cada medio de inducción. Las placas se
mantuvieron en oscuridad a 25°C. realizándose evaluaciones a partir de los 25 días de
siembra con un intervalo de 10 días por evaluación durante dos meses, estas
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
30 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
evaluaciones fueron cualitativas para confirmar el crecimiento de los callos.
A los dos meses de crecimiento se hizo el primer subcultivo en placas petri
descartables con medios de inducción frescos, a los cuatro meses se evaluó el material
midiendo el área ocupada por cada callo sobre una cuadrícula milimetrada, para
determinar así la masa relativa de los mismos y por consiguiente el medio con mayor
rendimiento en masa. Seguidamente, se realizó el subcultivo de todos los callos en el
medio K (ver apéndice), a partir de entonces se realizaron subcultivos cada dos meses
hasta los ocho meses cuando se cosecharon los callos para la extracción de metabolitos
secundarios.
3.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Se realizaron cromatografías de papel para la detección de glucosinolatos y
cromatografías de capa fina ascendente para la detección de alcaloides tanto en los
callos obtenidos como en los controles, no se utilizó una sola línea celular debido a la
pequeña cantidad de materia seca obtenida de los callos como consecuencia de su alto
porcentaje de humedad. Para la extracción de los metabolitos se utilizaron 30 mg muestra
estabilizada.
La estabilización se realizó secando los callos en una estufa a 37° C por 36 horas
para luego molerlos y guardar los frascos en un lugar seco y sin luz. Como control, se
usaron muestras de hipocótilos amarillos morados y negros provenientes de la localidad
de Huayre y estabilizadas en las mismas condiciones que los callos. Los callos se
clasificaron de acuerdo al color y naturaleza del explante del que provenían, así un callo
proveniente de la zona apical de la hoja de ecotipo amarillo se denominó M1E1 y así
sucesivamente (ver apéndice). Esta clasificación nos facilitó el manejo de las muestra en
las cromatografías.
Antes de la pulverización de las muestras se determinó el % de humedad.
3.2.1. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS
Para la extracción y cromatografía de glucosinolatos se adecuó el protocolo de rutina
utilizado por el Dr. César Fuertes en el Ìnstituto de Química Orgánica Aplicada a la
Farmacia, en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de
San Marcos (ver apéndice), como se describe a continuación:
Para la extracción etanólica se tomaron 30 mg de cada tipo de callo y se pusieron a
macerar en 2 ml de etanol al 96% durante dos semanas. Se sembraron, 100 alicuotas de
cada uno de estos extractos en hojas de papel Wathman N° 1 de 11 x 29 cm y se
colocaron en un tanque de cromatografía de papel descendente, dejándose desarrollar
por 22 horas.
Como sistema solvente se usó una solución de n-butanol:etanol:agua (4:1:4) descrito
por Kjaer en 1968.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 31
Después de retirar los papeles del tanque de cromatografía se secaron a
temperatura ambiente e inmediatamente se revelaron para lo cual se pulverizaron
primero con una solución de nitrato de plata:acetona 15 mg/ml, y luego de dejar secar por
unos minutos, con una solución de KOH:Etanol 20 mg/ml. Se dejaron secar las hojas de
papel unos minutos y se colocaron en una estufa caliente. Una vez obtenidas las
manchas indicadoras, se colocaron los cromatogramas en una solución decolorante de
hiposulfito de potasio al 5%, durante 20 hrs.
3.2.2. EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES
Se utilizaron 30 mg de cada muestra, las que se pusieron a macerar en éter etílico,
realizándose tres extracciones sucesivas.
La cromatografía de capa fina se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Stahl
(1958 y 1965), en cromatofolios de silicagel GF254 ( para las cromatografías preliminares
se usaron cromatofolios de 2 x 10 cm) y cromatoplacas Kieselgel 60 G F254 (Merck) de
20 x 20 cm.
En las cromatografías preliminares se realizaron con las muestras de hipocótilos de
maca (controles) y se probaron las siguientes soluciones para el sistema solvente:
· Benzol: éter dietílico: metanol: amoniaco (75: 75: 6: 0.7);
· Cloroformo: metanol: amoniaco (2: 0.12: 0.02);
· Cloroformo: metanol (2: 1), (2: 0.25), (2: 0.15) y (2: 0.12), siendo esta última la que se
utilizó en la estandarización de la cromatografía.
Se desarrollaron cromatografías de muestras acidificadas y sin acidificar.
Para el revelado de las placas se utilizó el reactivo de Dragendorff y posteriormente
el reactivo yodoplatinato de potasio.
Antes de revelar las placas se observaron en el espectro de luz UV.
En vista de la ausencia de resultados congruentes en la primera cromatografía, se
procedió a estandarizar la extracción en una muestra de hipocótilos de varios colores, la
cantidad de metabolitos no deseables para la cromatografía fue bastante alta por lo que
se procedió a lavar el extracto acidificando el extracto etéreo con HCl acuoso,
recuperándose la fase acuosa a la cual, luego de ser alcalinizada con NaOH
concentrado, se le agregó dos volúmenes de éter etílico para recuperar la fase orgánica.
Se cromatografió este extracto en una cromatoplaca Kieselgel 60 F F254 (Merck) de 20 x
20 cm. Se revelaron los bordes de la placa con el reactivo de Dragendorff modificado por
Munnier (1955) y el reactivo yodoplatinato de potasio, aislando luego las regiones
correspondientes a las manchas positivas.
Una vez obtenidas las fracciones positivas para alcaloides, se cromatografiaron los
extractos de callos y los controles, junto con el extracto etéreo y sus cuatro fracciones, las
que se usaron como un control extra.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
32 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
3.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS
3.3.1. ELECTROFORESIS
Se utilizó la electroforesis en geles de policrilamida (PAGE) para separar las mirosinasas,
los geles y buffers fueron preparados de acuerdo al sistema de Laemmli (1970), pero
eliminando el uso de SDS y mercaptoetanol tanto de las soluciones de los geles como de
las de los buffers para obtener una PAGE en condiciones no denaturantes. La
concentración de los geles fue de 8.6 y 7.5%.
Las corridas en los geles se llevaron a cabo con una corriente constante de 30 mA, el
voltaje inicial fue de 80 V y el final de 250V. La duración de las corridas fue de 5 horas.
3.3.2. EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS
Se llevó a cabo adaptando el protocolo de MacGibbon y Allison (1964): 0.5g de muestra
fueron molidos en un mortero frío con 2 ml de buffer Tris-Cl pH 6.8, se centrifugó a 10,000
rpm por 4 min, se tomaron 80 µl del sobrenadante a los que se añadieron mercaptoetanol
5 µl, glicerol 10 µl y 5µl de un stock de azul de bromofenol preparado para los
procedimientos de rutina del LRGB. Se colocaron 50 µl de muestra en cada pocillo del
gel.
Se utilizaron hipocótilos y hojas de campo.
3.3.3. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD
Se adaptó la modificación del método de detección de actividad basado en la formación
de bandas de BaSO
4
, descrito por MacGibbon y Allison (1970), esta modificación fue
gentilmente proporcionada por el Dr. Atle Bones en una comunicación personal (1999).
Para adaptar este protocolo se utilizó un extracto etanólico de semillas de mostaza,
preparado moliendo 100 g de semillas y macerándolas en 250 ml de alcohol etílico al
96%.
Cuando los geles fueron removidos, fueron colocados entre dos placas de vidrio e
incubados a 50°C en una solución acuosa de ácido ascórbico 1mM; Acetato de Bario
10mM; Buffer Tris-Cl 0.5 M; pH 6.8 200 ml/L; extracto etanólico de semillas de mostaza
300 ml/L.
Cuando se hicieron evidentes las bandas, los geles fueron fotografiados con una
cámara digital DAGEMÌT CCD100 en blanco y negro.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 33
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
34 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
4. RESULTADOS
4.1. INDUCCIÓN DE CALLOS
En la primera evaluación, realizada a los 25 días de la incubación (Foto nro. 1), se
observó la turgencia de las zonas del explante en donde se formarán los callos y la
formación de pequeños callos en varias zonas de los cortes. La tabla Nro. 1 muestra la
presencia de callos en los explantes (+).
La Tabla Nro. 2 muestra los resultados obtenidos en cada medio en los tres colores
de maca. Como muestra el gráfico Nro. 1 (apéndice) el medio K es el que produjo una
mayor área de callos callos y los medios Ì y M los que no produjeron callos. Las
variaciones de respuesta de cada ecotipo, pueden verse en el gráfico Nro. 2 (apéndice)
TABLA Nro. 2. Área ocupada por Ios caIIos (mm
2
) en una cuadrícuIa miIimetrada
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 35
COLOR
MEDIO DE
CULTIVO
AMARILLO MORADO NEGRO TOTAL
(mm)
A 15 37 46 98
B 701 640 1416 2757
C 2610 2438 1977 7025
D 1894 2445 2984 7323
E 13 45 68 126
F 1079 1445 719 3243
G 1338 1461 1468 4267
H 1295 1622 1512 4429
Ì 0 0 0 0
J 1286 725 779 2790
K 3831 3608 2913 10352
L 2090 2225 2458 6773
M 0 0 0 0
N 816 962 492 2270
O 1428 1807 1474 4709
P 1550 1631 1878 5059
Q 2357 2249 2489 7095
El mayor número de callos en total, se obtuvo con el medio D, como se puede ver en
la Tabla Nro 3. El ecotipo negro como se puede ver en esta tabla rindió el mayor número
de callos. El gráfico Nro. 3 (apéndice) muestra las variaciones de respuesta de cada
ecotipo.
TABLA Nro. 3. Número de caIIos obtenidos 2 meses después deI primer subcuItivo
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
36 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
COLOR
MEDIO DE CULT. AMARILLO MORADO NEGRO TOTAL
A 2 3 5 10
B 13 22 22 57
C 19 12 22 53
D 23 28 25 76
E 2 6 5 13
F 18 19 17 54
G 19 19 24 62
H 24 24 19 67
Ì 0 0 0 0
J 14 14 14 42
K 25 23 22 70
L 19 29 22 70
M 0 0 0 0
N 11 13 9 33
O 22 24 25 71
P 14 15 18 47
Q 21 23 27 71
TOTAL 246 274 276 796
La Tabla Nro. 4 muestra el número de callos por explante en el ecotipo amarillo. El
mayor número de callos se logró en el medio K, mientras que en los medios Ì y M no se
obtuvieron callos (gráfico Nro. 4, apéndice).
La Tabla Nro. 5 muestra el área total obtenida en cada medio por cada explante en el
ecotipo amarillo. Siendo el medio K el que produjo una mayor área (gráfico Nro. 5).
La Tabla Nro. 6 muestra el número de callos por explante en el ecotipo morado. El
mayor número de callos se logró en el medio L, mientras que en los medios Ì y M no se
obtuvieron callos (gráfico Nro. 6).
La Tabla Nro. 7 muestra el área total obtenida en cada medio en cada explante en el
ecotipo morado. Siendo el medio K el que produjo una mayor área (gráfico Nro. 7).
La Tabla Nro. 8 muestra el número de callos por explante en el ecotipo negro. El
mayor número de callos se logró en el medio Q, mientras que en los medios Ì y M no se
obtuvieron callos (gráfico Nro. 8).
La Tabla Nro. 9 muestra el área total obtenida en cada medio en cada explante en el
ecotipo negro. Siendo los medio D y K los que produjeron una mayor área (gráfico Nro.
9).
En 10 de los medios se obtuvieron callos friables, como puede verse en la Tabla Nro.
10, el medio en el que se logró mayor cantidad de callos friables fue el medio K y el
explante en el que se obtuvo mayor cantidad de callos friables fue la raíz (E5), tanto en el
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 37
ecotipo amarillo y morado como en el negro. (Gráfico Nro. 10)
Se observó que algunos callos presentaban zonas pigmentadas de negro. El mayor
número se presentó en los explantes E5 (raíces) tanto en el ecotipo amarillo y morado
como en el negro; y en el medio L, como se puede apreciar en la Tabla Nro. 11.
En los medios C, D, K, L y O se observaron algunos callos completamente negros
tabla Nro. 12 y 12A, gráfico Nro. 11 (apéndice)
4.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Los callos mostraron un porcentaje de humedad de 94%.
4.2.1. GLUCOSINOLATOS
La presencia de las fracciones se observó como una mancha negra como puede
apreciarse en las fotografías. Se observaron dos fracciones que se nominaron como
fracción 1 y fracción 2 (Fotografías 2 ÷6).
En 13 de las muestras se observaron dos fracciones de glucosinolatos. En las siete
muestras restantes (M1E2, M1E3, M2E2, M2E3, M2E5, M3E3, y callo negro), se observó
la presencia de la fracción 1, como puede apreciarse en la Tabla Nro. 13.
4.2.2. ALCALOIDES
En las cromatografías preliminares se observó la separación de cuatro fracciones al usar
como solvente la solución Cloroformo:metanol 2:0.12. Las muestras acidificadas
desarrollaron una sola fracción, mientras que las sin acidificar mostraron cuatro
fracciones.
Los resultados de la primera cromatografía (de todas las muestras) se observan en la
fotografía Nro. 7.
En el extracto lavado de hipocótilos de maca se obtuvieron cuatro fracciones que
fueron positivas tanto para el reactivo de Dragendorff.
Estas fracciones también fueron positivas para el reactivo yodoplatinato de potasio,
la fracción N°1 de color amarillo fue la de mayor Rf, y se presentó en la mancha más
grande, la fracción N° 2 de color plomizo debajo de ésta se halla en cantidades
pequeñas. La fracción N° 3 presentó un color marrón oscuro. La fracción N° 4 que se
encontró en el punto de siembra presentó un color azul cemento (Fotografía Nro 8).
En la segunda cromatografía de todas las muestras, se observó la presencia de las
fracciones 1, 3 y 4, la segunda fracción no se observó en ninguna de las muestras,
incluyendo el extracto patrón, (fotografía Nro.9).
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
38 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Al observar la cromatoplaca en la lámpara de luz ultravioleta, los patrones de
extractos de callos presentaron una gran cantidad de fracciones de metabolitos
mostrando patrones diferentes para cada muestra (Fotografía Nro 10). Las fracciones
correspondientes a los alcaloides no mostraron fluorescencia.
4.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS
Se observó un patrón de una sola banda por muestra (foto), las bandas se observaron
demasiado cerca del borde superior del gel por lo que no se midieron los Rf.
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 39
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40 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
5. DISCUSIÓN
5.1. INDUCCIÓN DE CALLOS
1. La respuesta a las diferentes concentraciones de hormonas fue variable. La mayor
producción de callos se obtuvo con los medios K,( 0.5/0.5 µM 2,4-D/µM KÌN), D ( 1/0 µM
2,4-D/µM KÌN) y Q (10/10 µM 2,4-D/µM KÌN) los medios C ( 0.5/0 µM 2,4-D/µM KÌN), L (
1/0.5 µM 2,4-D/µM KÌN) y P ( 1/1 µM 2,4-D/µM KÌN) tuvieron una respuesta menor a los
anteriores pero superior a los demás. Del mismo modo los medios M ( 0/1 µM 2,4-D/µM
KÌN) e Ì ( 0/0.5 µM 2,4-D/µM KÌN) no produjeron ninguna respuesta callogénica, mientras
que el medio E ( 0/0.1 µM 2,4-D/µM KÌN) produjo una bajísima respuesta. De todo esto y
de la observación del comportamiento de los explantes en los demás medios, podemos
inferir que la presencia del 2,4-D es de mayor importancia para la inducción de callos que
la KÌN, siendo inclusive suficiente para la callogénesis. Esta observación es congruente
con el análisis estadístico realizado para esta prueba, el cual nos muestra que el 2,4-D
tiene un efecto estadísticamente significativo en la inducción de callos. Siendo su
significancia mayor que la de la auxina y la interacción de ambas hormonas. Este
dominancia ya fue señala da en otras ocasiones, Dodds ( 1982) hace referencia a su uso
junto con el agua de coco para inducir la proliferación celular, al parecer esta alta
eficiencia del 2,4-D en la inducción de callos se debe a la alta disponibilidad de auxinas
en los tejidos de la mayoría de las dicotiledóneas ( Jacobsen, 1983)
5. DISCUSIÓN
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 41
2. En crucíferas, los callos son generalmente iniciados y mantenidos en medios que
presentasn una relacion auxina, citoquinina mayor que 1. en nuestro caso en presencia
de la KÌN, la concentración de 2,4-D que dio mejores resultados fue la de 0.5 µM, ya que
en concentraciones mayores el rendimiento del medio disminuye, aun cuando la relación
con la citoquinina es 1/1. Por otro lado, podemos ver que la presencia de la KÌN potencia
la efectividad del 2,4-D siempre y cuando su concentración no exceda la del 2,4-D, pues
en estos casos el rendimiento del medio disminuye. Esta disminución de la actividad
podría estar relacionada a la toxicidad del 2,4- D, pues como reportan Carew y Krueger
(1977, citados por Yerman. 1980 ) tiene efectos inhibitorios a concentraciones de 1 mgr.
por litro. De la misma la disminución en la producción de callos cuando la relación
auxina/citoquinina disminuye pueden explicarse por la actividad inhibitoria que tienen las
citoquininas cuando se presentan en altas concentraciones (Yeoman y Forsche, 1980).
3. El medio que produjo mayor número de callos fue el medio D, seguido por los
medios O, Q, K y L, el rendimiento de masa en los medios D y Q está relacionado al
número de callos generado más que al tamaño de los mismos. La significancia de cada
una de las hormonas en el número de callos producidos es mayor para el 2,4-D que para
la KÌN, sin embargo la combinación de ambas hormonas no tiene un efecto significativo
en el número de callos obtenidos. (ver apéndice: análisis estadístico) lo cual nos indicaría
que cuando el objetivo es lograr un mayor número de líneas celulares quizá sería
conveniente experimentar con una sola hormona, especialmente el 2,4 ÷D.
4. La mayor efectividad del 2,4 ÷D corresponde a la esperada, pues es congruentes
con los resultados obtenidos por Carhuaz en Lepidium peruvianum (1997, sin publicar) y
por los resultados obtenidos en el cultivo de tejidos de diferentes especies de la familia
Cruciferae. (Flick y colb. 1983)
5. La respuesta de los ecotipos a cada uno de los medios de cultivo no fue uniforme,
como puede observarse en los gráficos 2C, 2D y 2E, siendo el ecotipo negro el que
presento mayor diferencia, sin embargo estas diferencias no son demasiado grandes.
6. La masa de callos obtenidas en cada uno de los ecotipos fue mayor en el medio K
en todos los casos, mientras que los medios con los que se obtuvo un mayor número de
callos fue diferente para cada ecotipo (K, L y Q para amarillo, morado y negro
respectivamente) lo que nos muestra que la respuesta de los explantes respecto al
número de callos por explante no es uniforme. Al analizar la respuesta de los explantes
por ecotipo, se ha observado que las raíces tienen una respuesta significativamente
diferente a los otros explantes. Mientras que para la respuesta de los explantes en
relación del área ocupada por los callos se observa una respuesta descendente de raíz a
hoja. Es así que en ambos casos las raíces son los tejidos de mayor potencial
callogenético.
7. El medio A no contiene hormonas, sin embargo en este medio se produjo una
pequeña cantidad de callos, estos podrían deberse a la presencia de hormonas
endógenas en este explante que permiten la callogénesis como respuesta al corte, esto
sería coherente con la observación de que este es el explante que produce mayor
número y masa de callos en todos los ecotipos y medios y al hecho de que en las raíces
se producen auxinas endógenas (Hopkins 1999).
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
42 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
8. No se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de explantes de
hoja, lo cual es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos, de otro lado el
medio Q fue el que produjo el mayor número de callos en estos explantes.
9. Los peciolos e hipocótilos tuvieron una respuesta mucho mayor a los tratamientos
siendo el hipocótilo el más susceptible de los dos, esto tendría relación con la presencia
de tejido meristemático en este explante.
10. El medio que produjo mayor cantidad de explantes friables fue el medio K,
aunque la cantidad obtenida de este tipo de callos fue bastante pequeña, lo cual se
podría deber a una predisposición de la especie o al tipo de actividad de las hormonas
usadas, de todos modos a diferencia del número de callos obtenido y el área ocupada por
los callos, en este caso puede observarse que la interacción de las hormonas tiene un
efecto más significativo que el de las hormonas solas.
11. Los explantes que produjeron la mayor cantidad de callos friables fueron los
provenientes de las raíces, mientras que los provenientes de los hipocótilos produjeron
menor cantidad de callos friables que los pecíolos, siendo igual que en los explantes de la
región terminal de la hoja. En este caso no se observaron diferencias significativas entre
los explantes de hoja terminal y proximal, aunque el menos susceptible fue el explante
proximal. Si bien la raíz y el hipocótilo produjeron mayor número de callos friables, la
diferencia entre ambos explantes no fue significativa.
12. El efecto del color del ecotipo en la obtención de callos friables fue
significativamente diferente para el color amarillo, mientras que entre el ecotipo morado y
negro, las diferencias no fueron significativas.
13. La presencia de callos con pigmentación negra puede explicarse por la presencia
de metabolitos secundarios en los callos, el número obtenido en los explantes
provenientes del ecotipo amarillo fue similar al obtenido del ecotipo negro, y ambos
fueron superiores a la cantidad obtenida en el ecotipo morado, por otro lado la cantidad
de callos totalmente negros obtenido en el ecotipo morado fue mucho mayor que en los
ecotipos negro y amarillo. Esto nos indicaría que esta pigmentación no está relacionada
con el color del ecotipo del que proviene el explante.
5.2. DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
14. Los callos de Lepidium peruvianum Ch. sí producen glucosinolatos. Pero la
producción de estos metabolitos varía de acuerdo al callo, pudiendo ser mayor o menor.
Se encontraron callos en los que se formaron solo una de las fracciones. Esto demuestra
que el cultivo de callos de maca, puede ser utilizado para hallar líneas que produzcan un
solo tipo de glucosinolato, o los produzcan en cantidades mayores a las obtenidas en
campo.
15. Los explantes provenientes de peciolo(E3) y de la parte proximal de la hoja (E2)
mostraron una sola fracción de glucosinolatos en casi todos los casos, esto sugeriría que
el origen de los explantes estaría involucrado en la cantidad y tipo de glucosinolatos
5. DISCUSIÓN
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 43
producidos. Para poder comprobar esta posibilidad se tendría que realizar pruebas con
un tamaño de muestra estadísticamente significativa.
16. El origen de los explantes no parece ser la causa de la variabilidad de la
producción de callos. Pues los callos con diferentes patrones cromatográficos provienen
de diferentes tipos de explante y de plántulas de diferentes ecotipos. Sin embargo en este
caso también se observa una variabilidad alta en el explante E5.
17. Los Rf de cada una de las fracciones es muy similar pero no igual para cada
extracto, esto puede deberse a que, por el tamaño de la cámara, las muestras no se
pudieron desarrollar en una sola cromatografía por lo que no estuvieron sujetas a
condiciones idénticas.
18. El mayor tamaño de las manchas de glucosinolatos en los extractos de callo,
indican una mayor concentración del metabolito en éstos. Esto nos brinda muy buenas
expectativas para su producción in vitro.
19. En los cromatogramas de glucosinolatos se observan manchas débiles a lo largo
del cromatograma, estas manchas fueron asumidas como porciones de glucosionatos la
por la mirosinasa, (Kjaer, 1970). Sin embargo, Genyi y col. reportaron en el año 2001, la
presencia de otros glucosinolatos en maca, si bien en pequeñas cantidades. Debido a
esto estas no podemos asegurar que manchas correspondan a artefactos o a esos
glucosinolatos.
20. Los patrones cromatográficos de alcaloides muestran una gran variabilidad, así
como los patrones de los metabolitos con fluorescencia a la luz UV, esto nos indicaría
que los callos tienen una gran variabilidad respecto a su producción de metabolitos, lo
que sería de gran utilidad en el caso de necesitarse la explotación de alguno de estos.
Los extractos que mostraron una presencia notablemente mayor de una de las fracciones
de alcaloides fueron los de los callos M3E3 y M3E4.
21. La fracción N° 2 del extracto de alcaloides, no es detectable cuando se
cromatografiaron cantidades pequeñas de extracto, por lo que su ausencia en la
cromatografía de los extractos de callos y controles no indican ausencia necesaria del
metabolito.
22. El hecho de que algunos extractos de callos muestren mayor presencia de
algunas fracciones de callos y dada la pequeña cantidad en la que parecen encontrarse
en los hipocótilos, el cultivo de callos o suspensiones celulares puede ser utilizada para
lograr mayores cantidades que permitan el estudio de las propiedades y actividad
biológica de estos compuestos.
23. La poca cantidad de alcaloides que presenta la planta, puede ser aumenta en el
cultivo de tejidos utilizando callos con mayor tiempo de incubación, pues, la producción
de metabolitos secundarios aumenta al iniciarse la fase estacionaria (Yeoman y colb.
1980), y la de los alcaloides es inversamente proporcional a la tasa de crecimiento
(Carew y Krueger, 1977). Esta propiedad debe ser tomada en cuenta tanto en el caso de
desear producir alcaloides como otros metabolitos.
24. El hecho de que en algunos callos se observe manchas mas intensas que en el
hipocótilo y que en otros casos se observen fracciones que no se presentan en las
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
44 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
muestras de hipocótilos, nos indicaría el gran potencial de la planta, pues usualmente los
cultivos de tejidos vegetales producen metabolitos en pequeñas cantidades (Yanadi y
Fujita, 1983), por otro lado la alta variabilidad de la producción de metabolitos merece que
se realicen investigaciones posteriores para determinar si estas variaciones son
fisiológics o genéticas, dado del potencial mitogénico del 2,4-D y el aumento de la
variabilidad producido por la técnica de cultivo de tejidos (Reisch, 1983).
5.3. DETECCIÓN DE MIROSINASAS
25. La detección de mirosinasas fue cualitativa, con la finalidad de determinar únicamente
la presencia de mirosinasas en los callos e hipocótilos, pues para una evaluación
cuantitativa, se requeriría de mayores estudios de la presencia de esta enzima en esta
especie.
26. El que las bandas de mirosinasas no migraran mucho más allá de la parte
superior del gel, a pesar de dejarlas correr por encima del tiempo requerido de acuerdo a
la migración del frente de corrida, nos indicaría que estas proteínas tienen un gran peso
molecular, esto estaría en concordancia con los resultados obtenidos por MacGibbon y
Allison (1970) en otras especies y a la vez nos indicaría que la mirosinasas de maca son
mas grandes que las de otras especies estudiadas.
5. DISCUSIÓN
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 45
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
46 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
6. CONCLUSIONES
1. Lepidium peruvianum es susceptible a la inducción de callos con auxinas y
citoquininas.
2. La auxina 2,4-D es eficiente en la inducción de callos, siendo su concentración
óptima la de 0.5 µM.
3. La relación óptima 2,4-D/KÌN es de 1
4. El comportamiento de los callos de L. peruvianum es altamente variable respecto a
la presencia de metabolitos secundarios.
5. Lepidium peruvianum es una especie que presenta condiciones óptimas para
realizar estudios de producción de metabolitos secundarios in vitro.
6. La enzima mirosinasa sí está presente en los callos y plantas de campo de L.
peruvianum. Estas enzimas son de gran tamaño molecular.
6. CONCLUSIONES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 47
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
48 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
7. RECOMENDACIONES
1. Recomendamos iniciar un estudio del metabolismo secundario de callos de L.
peruvianum, "maca¨ que nos permita determinar los factores que induzcan la producción
de metabolitos in vitro.
2. También es necesario profundizar el estudio de alcaloides de maca, para
determinar la estructura y actividad biológica de los mismos.
3. Realizar estudios histoquímicos que determinen la distribución de los
glucosinolatos y mirosinasas en la planta.
4. Sería recomendable realizar la caracterización de las mirosinasas de L.
peruvianum y compararlas con las descritas en otras especies.
7. RECOMENDACIONES
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 49
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
50 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
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BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
56 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
APÉNDICE
FOTOGRAFÍA Nro.1. Primera evaluación de los explantes a los 25 días de incubación
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 57
FOTOGRAFÍA Nro. 2. Callo a los dos meses de incubación
FOTOGRAFÍA Nro. 3. Callo después de dos meses del primer subcultivo
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
58 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFÍA Nro.4. Cromatografía en papel de glucosinolatos en las muestras M1E1,
M1E2, M1E3, M1E4.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 59
FOTOGRAFÍA Nro. 5. Cromatografía en papel de glucosinolatos en las muestras M2E1,
M2E2, M2E3, M2E4.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
60 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFÍA Nro. 6. Cromatografía en papel de glucosinolatos en las muestras M3E1,
M3E2, M3E3, M3E4.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 61
FOTOGRAFÍA Nro. 7. Cromatografía en papel de glucosinolatos en las muestras M1E5,
M2E5, M3E5, callo negro.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
62 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFÍA Nro. 8. Cromatografía en papel de glucosinolatos en las muestras de
hipocótilos y callo blanco.
FOTOGRAFÍA Nro. 9. Cromatografía preliminar de alcaloides.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 63
FOTOGRAFÍA Nro. 10. Cromatografía comparada de alcaloides, revelados con el reactivo
de Dragendorff y reactivo yodoplatinado.
FOTOGRAFÍA Nro. 11. Cromatografía de alcaloides
1 = M1E1, 2 = M1E2, 3 = M1E3, 4 = M1E4, 5 = M1E5, 6 = M2E1, 7 = M2E2, 8 =
M2E3, 9 = M2E4, 10 = M2E5, 11 = M3E1, 12 = M3E2, 13 = M3E3, 14 = M3E4, 15 =
M3E5, 16 = Hipocótilo amarillo, 17 = Hipocótilo morado, 18 = Hipocótilo negro. Callo
negro = callo pigmentado totalmente, callo blanco = callo sin ninguna pigmentación. E =
extracto etéreo de hipocótilos de maca.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
64 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFÍA Nro. 12. Cromatograma expuesto a la luz uv. mostrando la presencia de
diferentes metabolitos.
1 = M1E1, 2 = M1E2, 3 = M1E3, 4 = M1E4, 5 = M1E5, 6 = M2E1, 7 = M2E2, 8 =
M2E3, 9 = M2E4, 10 = M2E5, 11 = M3E1, 12 = M3E2, 13 = M3E3, 14 = M3E4, 15 =
M3E5, 16 = Hipocótilo amarillo, 17 = Hipocótilo morado, 18 = Hipocótilo negro. Callo
negro = callo pigmentado totalmente, callo blanco = callo sin ninguna pigmentación. E =
extracto etéreo de hipocótilos de maca.
FOTOGRAFÍA Nro. 13. Patrones de bandas de electroforesis de mirosinasas de callos e
hipocotilos.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 65
GRAFICO Nro 1. Área total de los callos sobre una cuadricula milimetrada.
GRAFICO Nro 2A. Área total ocupada por los callos sobre una cuadricula según el medio
de cultivo.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
66 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro 2B. Área total ocupada por los callos en una cuadricula milimetrada según
el color.
GRAFICO Nro 3. Numero de callos obtenidos en los diferentes colores de maca.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 67
GRAFICO Nro 4. Numero de callos obtenidos. ecotipo amarillo.
GRAFICO Nro 5. Área total ocupada por los callos sobre una cuadricula milimetrada.
ecotipo amarillo.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
68 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro 6. Numero de callos obtenidos. ecotipo morado.
GRAFICO Nro 7. Área total ocupada por los callos sobre una cuadricula milimetrada.
ecotipo morado.
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 69
GRAFICO Nro 8. Numero de callos obtenidos. ecotipo negro.
GRAFICO Nro. 9. Numero de callos friables por explante y color.
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
70 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro. 10. Numero de callos negros obtenidos por explante y ecotipo.
FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO.
REGULADORES DE
CRECIMIENTO
KIN
0 µM 0.1 µM 0.5 µM 1 µM 10 µM
0 µM A E Ì M -
0.1 µM B F J N -
2.4-D 0.5 µM C G K O -
1 µM D H L P -
10 µM - - - - Q
FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 71
2,4-D KIN
(uM) (uM)
A 0.0 0.0
B 0.1 0.0
C 0.5 0.0
D 1.0 0.0
E 0.0 0.1
F 0.1 0.1
G 0.5 0.1
H 1.0 0.1
Ì 0.0 0.5
J 0.1 0.5
K 0.5 0.5
L 1.0 0.5
M 0.0 1.0
N 0.1 1.0
O 0.5 1.0
P 1.0 1.0
Q 10.0 10.0
COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG (1962)
CONSTITUYENTES mM Mg/It
MACRONUTRÌENTES
KNO3 18.8000 1900.00
NH4NO3 20.6000 1650.00
CaCl2.2H2O 3.0000 440.00
MgSO4.7H2O 1.5000 370.00
KH2PO4 1.2500 170.00
MÌCRONUTRÌENTES
MnSO4.4H2O 0.1000 22.30
ZnSO4.7H2O 0.0300 8.60
H3BO3 0.1000 6.30
KÌ 0.0050 0.8300
NA2MoO2.2H2O 0.0010 0.2500
CoSO4.6H2O 0.0001 0.0250
CuSO4.5H2O 0.0001 0.0250
FeSO4.7H2O 0.1000 27.80
Na2EDTA 0.1000 37.30
FUENTE: Laboratorio de Recursos Genéticos y Biotecnología - UNMSM.
COMPOSICIÓN ANALÍTICA DE MACA
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
72 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
%
Agua 10.4
Proteínas 10.2
Lípidos 2.2
Carbohidratos 59
Fibra 8.5
Ceniza 4.9
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
COMPOSICIÓN MINERAL DE MACA (mg/ 100 g de materia seca)
Mg/100 g
Fe 16.6
Mn 0.8
Cu 5.9
Zn 3.8
Na 18.7
K 2050
Ca 150
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L. 1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
COMPOSICIÓN AMINOACÍDICA Y CALIDAD PROTEICA DE "MACA"
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 73
Aminoácido (Rt,
min)
mg/g proteína Aminoácidos
esenciaIes patrón de
Ia FAO-OMS 1973
Indice
químico
mg/g
proteína
Acido Aspártico
(2.7)
91.7 - -
Acido Glutámico
(4.0)
156.5 - -
Serina (10.1) 50.4 - -
Histidina (14.2) 21.9 - -
Glicina (15.1) 68.3 - -
Treonina (15.7) 33.1 40 83
Arginina (22.5) 99.4 - -
Alanina (24.5) 63.1 - -
Tirosina (25.2) 30.6
} 60 143
Fenialanina (37.8) 55.3
Metionina (30.8) 28 35 80
Valían (31.3) 79.3 50 158
Ìsoleucina (35.7) 47.4 40 118
Leucina (38.1) 91 70 130
Lisina (47.0) 54.5 55 99
Triptofano n.d. 10 n.d.
OH-prolina (33.8) 26.6 - -
Prolina (43.1) 0.5 - -
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DE
GLUCOSINOLATOS
Extracción
· Macerar las muestras en etanol al 96% por 3 días como mínimo.
· Filtrar
· Guardar la solución y con el residuo hacer una nueva extracción con etanol.
· Filtrar y guardar con la solución anterior.
Cromatografía en papeI
· Cortar las hojas de papel de 11 x 29 cm. Hacer tres dobleces a 2, 4 y cm del borde
del papel para que sirvan de soporte de la hoja en el tanque de cromatografía.
· A 5 cm del borde hacer una marca con lápiz y hacer pequeñas equis en ella donde se
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
74 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
va a sembrar la muestra.
· Colocar una alicuota de cada muestra en cada marca, dejar secar, repetir 40 veces.
· Colocar los papeles en las bandejas de soporte del tanque de cromatografía, y
sujetar con las varillas respectivas. Agregar el solvente a las bandejas y tapar
herméticamente el tanque.
· Dejar desarrollar durante la noche.
· Retirar del tanque de cromatografía y secar.
· Pulverizar con una solución de nitrato de plata: acetona 15 mg/ml, dejar secar unos
minutos
· Pulverizar con una solución de KOH: Etanol 20 mg/ml, dejar secar unos minutos.
· Colocar los cromatogramas en una estufa caliente.
· Retirar de la estufa cuando se forman las manchas negras, (indicadoras de la
presencia de glucosinolatos).
· Sumergir en una solución de hiposulfito de potasio al 5% por 20 - 24 para decolorar.
· Secar
· Fotocopiar inmediatamente.
Preparación deI soIvente
· Hacer una solución de n-butanol:etanol:agua 4:1:4 en una pera de decantación.
· La mezcla se realiza en orden: mezclar primero el n-butanol y el etanol, agitar y
agregar el agua, agitar bien y dejar reposar sin mover 24 hr.
· Se obtienen dos fases: una acuosa y una orgánica (superior), desechar la fase
acuosa.
Preparación deI reveIador
· Solución de nitrato de plata: acetona (para 100 ml.)
· Preparar una solución saturada de nitrato de plata y agua: diluir 1.5 gr. de nitrato de
plata en 0.5 ml. de agua destilada, si no se disuelve calentar ligeramente a baño
María
· Disolver en 80 ml. de acetona y agregar agua destilada hasta disolver el precipitado
que se haya formado.
· Usar inmediatamente.
SoIución de hidróxido de potasio: etanoI. SoIución aI 2% (para 100 mI)
· Disolver 2 gr de KOH en 0.5 ml de agua destilada y completar a 100 ml con etanol.
· Preparación de la solución de hiposulfito de sodio al 5% (decolorante)
· Disolver 2 gr de hiposulfito de sodio en 400 ml de agua destilada.
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA DE ALCALOIDES
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 75
Extracción
A. Extracto crudo:
· Colocar las muestra estabilizada en un frasco y humedecer con amoniacoy dejar en
oscuridad por 48 hr.
· Agregar éter etílico agitar y reposar varios días.
· Filtrar o centrifugar.
B. Extracto lavado:
· Macerar la muestra con una solución de agua: etanol (4:1).
· Acidificar hasta pH 3 ó 4 con HCl.
· Centrifugar o filtra para recuperar la fase acuosa.
· Alcalinizar la fase acuosa con NaOH u otro álcali, hasta pH 8 ó 9.
· Poner en una pera de decantación y agregar una cantidad similar de eter etilico,
agitar y recuperar la fase orgánica.
· Repetir esta extracción.
Cromatografía de capa fina ascendente.
· Sembrar las muestras en un cromatograma de silicagel
· Colocar el solvente en el tanque de cromatografía de capa fina ascendente, cerrar
herméticamente y dejar saturar.
· Colocar la cromatoplaca en el tanque, cerrar herméticamente y dejar desarrollar.
· Cuando el solvente llega al tope de la placa, sacar la cromatoplaca del tanque, dejar
secar y pulverizar con el revelador.
Preparación deI soIvente
· Mezclar en el tanque de cromatografía cloroformo:metanol u otra sol en las
proporciones adecuadas en nuestro caso la proporción fue 2: 0.12.
Preparación deI reveIador
Reactivo de Dragendorff (modificado por Munnier)
SOLUCÌÓN Ì. Disolver 17 gr de subnitrato de bismuto y 200 gr. de ácido tartárico en
800 ml de agua destilada.
SOLUCÌÓN ÌÌ. Disolver 160 gr de yoduro de potasio en 400 ml de agua destilada.
· Mezclar las soluciones Ì y ÌÌ en una proporción 1: 1
PARA USAR: disolver 100 gr. De ácido tartárico en 50 ml de esta mezcla y 500 ml de
agua destilada.
El stock puede almacenarse durante meses. La solución diluida puede almacenarse
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
76 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
por unas semanas.
Reactivo YodopIatinado
· Diluir 3ml de ácido cloroplatínico al 10% en 97 ml de agua destilada.
· Agregar 100 ml de solución de yoduro de potasio al 6%.
Este reactivo puede almacenarse por largo tiempo.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
ANÁLISIS de varianza para efectos fijo con medidas repetidas
DISEÑO DE DOS FACTORES
PARA EL EFECTO DE LOS MEDIOS EN LA MASA TOTAL DE CALLOS OBTENIDOS
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i = 1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1

2

3

4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i = 1, 2,3,4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij = 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
Región crítica
Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=

2

3

4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3,4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 77
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
Scua gI mcua f
ss2,4-D 3071 3 1024 29.3*
ssKÌN 112.5625 3 37.5208333317*
ssinter 284 9 94.673611112.705639747
sserrores 11197 32 349.9121094
sst 14665 47
Región crítica
Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO AMARILLO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=

2

3

4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
Región crítica
Fcal >Critico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO AMARILLO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=

2

3

4
=0
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
78 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
Regios crítica
Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO MORADO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=
= µ
2
= µ
3
= µ
4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 213 3 71 31*
ssKÌN 8 3 3 1
ssinter 50 9 17 7
sserrores148 32 2
sst 419 47
Región crítica
Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO MORADO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 79
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=
= µ
2
= µ
3
= µ
4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 3E+063 875861 14*
ssKÌN 1E+053 49762 1
ssinter 6E+059 189788 3
sserrores4E+0664 64090
sst 7E+0647
Región crítica
Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto
*estadísticamente significativo exlste efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO NEGRO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=
= µ
2
= µ
3
= µ
4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
80 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
scua gI mcua f
ss2,4-D 207 3 69 38*
ssKÌN 13 3 4 15*
ssinter 17 9 6 4
sserrores927 64 14
sst 1165 47
Region crítica
Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto
*estadísticamente significativo exlste efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO NEGRO
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
H1:Al menos un ¡ i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=
= µ
2
= µ
3
= µ
4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 2E+06 3E+00 8E+05 60*
ssKÌN 3E+05 3E+00 1E+05 70*
ssinter 2E+06 9E+00 8E+05 50*
sserrores 9E+05 6E+01 1E+04
sst 6E+06 5E+01
Region crítica
Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto
*estadísticamente significativo exlste efecto
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO
Multiple Comparisons
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 81
Dependent Variable: TABLA4
Tukey HSD
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
(Ì) N (J) N
E1 E2 1.0625 .7611 .632
E3 -.4375 .7611 .978
E4 -.6250 .7611 .923
E5 -1.5625 .7611 .005
E2 E1 -1.0625 .7611 .632
E3. -1.5000 .7611 .290
E4. -1.6875 .7611 .185
E5. -2.6250 .7611 .008
E3 E1. .4375 .7611 .978
E2. 1.5000 .7611 .290
E4. -.1875 .7611 .999
E5. -1.1250 .7611 .000
E4 E1. .6250 .7611 .923
E2. 1.6875 .7611 .185
E3. .1875 .7611 .999
E5. -.9375 .7611 .000
E5 E1. 1.5625 .7611 .005
E2. 2.6250 .7611 .008
E3. 1.1250 .7611 .000
E4 .9375 .7611 .000
* Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO AMARILLO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA5
Tukey HSD
si p
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
82 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std. Error p.
(Ì) N (J) N
E1 E2 29.4375 91.8309 .998
E3 -92.5625 91.8309 .851
E4 -302.5625 91.8309 .013
E5 -390.0000 91.8309 .001
E2 E1 -29.4375 91.8309 .998
E3. -122.0000 91.8309 .674
E4. -332.0000 91.8309 .005
E5. -419.4375 91.8309 .000
E3 E1. 92.5625 91.8309 .851
E2. 122.0000 91.8309 .674
E4. -210.0000 91.8309 .161
E5. -297.4375 91.8309 .015
E4 E1. 302.5625 91.8309 .013
E2. 332.0000 91.8309 .005
E3. 210.0000 91.8309 .161
E5. -87.4375 91.8309 .875
E5 E1. 390.0000 91.8309 .001
E2. 419.4375 91.8309 .000
E3. 297.4375 91.8309 .015
E4 87.4375 91.8309 .875
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA6
Tukey HSD
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 83
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
p
(Ì) N (J) N
E1 E2 -.4375 .7739 .980
E3 -1.4375 .7739 .349
E4 -1.7500 .7739 .169
E5 -2.3750 .7739 .024
E2 E1 .4375 .7739 .980
E3. -1.0000 .7739 .697
E4. -1.3125 .7739 .443
E5. -1.9375 .7739 .000
E3 E1. 1.4375 .7739 .349
E2. 1.0000 .7739 .697
E4. -.3125 .7739 .994
E5. -.9375 .7739 .002
E4 E1. 1.7500 .7739 .169
E2. 1.3125 .7739 .443
E3. .3125 .7739 .994
E5. -.6250 .7739 .003
E5 E1. 2.3750 .7739 .024
E2. 1.9375 .7739 .000
E3. .9375 .7739 .002
E4 .6250 .7739 .003
Estadísticamente significativo existe diferencias <0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO MORADO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA7
Tukey HSD
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
84 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
p
(Ì) N (J) N
E1 E2 19.1250 88.6138 1.000
E3 -144.2500 88.6138 .485
E4 -298.7500 88.6138 .010
E5 -419.3125 88.6138 .000
E2 E1 -19.1250 88.6138 1.000
E3. -163.3750 88.6138 .357
E4. -317.8750 88.6138 .005
E5. -438.4375 88.6138 .000
E3 E1. 144.2500 88.6138 .485
E2. 163.3750 88.6138 .357
E4. -154.5000 88.6138 .414
E5. -275.0625 88.6138 .022
E4 E1. 298.7500 88.6138 .010
E2. 317.8750 88.6138 .005
E3. 154.5000 88.6138 .414
E5. -120.5625 88.6138 .654
E5 E1. 419.3125 88.6138 .000
E2. 438.4375 88.6138 .000
E3. 275.0625 88.6138 .022
E4 120.5625 88.6138 .654
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA8
Tukey HSD
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 85
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
Sig.
(Ì) N (J) N
E1 E2 -.1875 .7752 .999
E3 -.9375 .7752 .746
E4 -1.0625 .7752 .648
E5 -2.1250 .7752 .000
E2 E1 .1875 .7752 .999
E3. -.7500 .7752 .869
E4. -.8750 .7752 .791
E5. -1.9375 .7752 .006
E3 E1. .9375 .7752 .746
E2. .7500 .7752 .869
E4. -.1250 .7752 1.000
E5. -1.1875 .7752 .050
E4 E1. 1.0625 .7752 .648
E2. .8750 .7752 .791
E3. .1250 .7752 1.000
E5. -1.0625 .7752 .030
E5 E1. 2.1250 .7752 .000
E2. 1.9375 .7752 .050
E3. 1.1875 .7752 .030
E4 1.0625 .7752 .002
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO NEGRO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA9
Tukey HSD
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
86 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
Sig.
(Ì) N (J) N
E1 E2 23.8750 87.2393 .999
E3 -65.3750 87.2393 .944
E4 -197.1875 87.2393 .170
E5 -339.3750 87.2393 .002
E2 E1 -23.8750 87.2393 .999
E3. -89.2500 87.2393 .844
E4. -221.0625 87.2393 .094
E5. -363.2500 87.2393 .001
E3 E1. 65.3750 87.2393 .944
E2. 89.2500 87.2393 .844
E4. -131.8125 87.2393 .559
E5. -274.0000 87.2393 .020
E4 E1. 197.1875 87.2393 .170
E2. 221.0625 87.2393 .094
E3. 131.8125 87.2393 .559
E5. -142.1875 87.2393 .483
E5 E1. 339.3750 87.2393 .002
E2. 363.2500 87.2393 .001
E3. 274.0000 87.2393 .020
E4 142.1875 87.2393 .483
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
ANÁLISIS de varianza para dos efectos fijos
EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIALES
Hipótesis
¡ i Para el factor 2,4-D
Ho: ¡
1=
: ¡
2=
: ¡
3=
: ¡
4=
0
µ i Para el factor KÌN
Ho µ
1=
= µ
2
= µ
3
= µ
4
=0
H1 Al menos una µ
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KÌN
Ho: (¡ µ)ij= 0
H1 Al menos una (¡ µ)ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crítico =9.36
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 87
scua gI mcua f
ss2,4-D 80 3 48.7430556 12*
ssKÌN 14 3 34.5763888911*
ssinter 87 9 45.8402778 15*
sserrores119. 32 3.72916667
sst 299.8125 47
Región crítica
Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto
*estadísticamente significativo existe efecto
EFECTO DEL COLOR EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIABLES
Multiple Comparisons
Dependent Variable: tabla 10
Tukey HSD
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
.
(Ì) (J)
Amarillo Morado .8125 .9009 .002
Negro .8750 .9009 .006
Morado Amarillo -.8125 .9009 .002
Negro 6.250E-02 .9009 .997
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FIABLES
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA 9
Tukey HSD
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
88 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Sig.
(Ì) N (J) N
E1 E2 23.8750 .999
E3 -65.3750 .944
E4 -197.1875 .170
E5 -339.3750 .002
E2 E1 -23.8750 .999
E3. -89.2500 .44
E4. -221.0625 .094
E5. -363.2500 .003
E3 E1. 65.3750 .944
E2. 89.2500 .044
E4. -131.8125 .049
E5. -274.0000 .024
E4 E1. 197.1875 .170
E2. 221.0625 .094
E3. 131.8125 .049
E5. -142.1875 .483
E5 E1. 339.3750 .002
E2. 363.2500 .003
E3. 274.0000 .024
E4 142.1875 .483
Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05
COEFICIENTE DE VARIABILIDAD DE LA PRESENCIA DE GLUCOSINELATOS
EN HIPOCOTILOS Y CALLOS DE MACA
Fracción 1 Fracción 2
Fraccion 1 Correlation
Coefficient
1.000 .650
Sig.
(2-tailed)
. .600
N 80 80
Fraccion 2 Correlation
Coefficient
.650 1.000
Sig.
(2-tailed)
.600 .
N 16 16
Ho Exite variabilidad
H1 No existe variabilidad
APÉNDICE
"Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 89
Si p<0.05 se rechaza la hipótesis nula
En el presente problema p=0.6>0.05 entonces se concluye que existe variabilidad
BiotecnoIogía y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacón, "Maca"
90 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor"