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Metodologias analticas para avaliao da exposio a pesticidas

Microextraco em fase slida (SPME) de resduos de pesticidas das


amostrasde gua e doseamento por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massa (GC-MS)

Sofia BATISTA, Emlia SILVA & Maria J os CEREJ EIRA

a Introduo

Para a anlise de resduos de pesticidas, em particular em amostras de gua,
necessrio proceder-se extraco e concentrao dos analitos de interesse e ao seu
doseamento, geralmente, efectuado por cromatografia gasosa (GC) ou lquida (LC),
dependendo da sua polaridade, volatilizao e risco de decomposio a temperaturas
elevadas. Os compostos orgnicos volteis podem ser analisados por GC. Por seu
lado, os compostos polares ou no polares que se degradam pelo calor podem ser
analisados por LC, sem necessidade de derivatizao.
No Laboratrio de Ecotoxicologia da SAPI/DPPF, do ISA, equipado com um
cromatografo gasoso acoplado a espectrometria de massa, procedeu-se ao
doseamento dos pesticidas seleccionados para estudo que podem ser analisados por
GC-MS, tendo os restantes pesticidas seleccionados para estudo sido analisados por
cromatografia lquida no Instituto do Ambiente (ver ponto 3.6.2).
Para a extraco de resduos de pesticidas das amostras de gua recorreu-se
recente tcnica de microextraco em fase slida (SPME), que apresenta vrias
vantagens, como se refere no ponto seguinte.

b Aspectos gerais da microextraco em fase slida
*


Nos ltimos anos tem sido dada especial ateno s tcnicas de preparao das
amostras que minimizam o consumo de solventes orgnicos. Umas das tcnicas mais
promissoras baseia-se na microextraco em fase slida (SPME) que constitui uma
nova abordagem na extraco por adsorventes e resolve muitos dos problemas
associados com os mtodos tradicionais de extraco por LLE e, tambm, por SPE
(Barcel, 2000; Louch et al., 1992; Prosen & Kralj, 1999).

*
Extrado de Batista (2003) Exposio da gua subterrnea a pesticidas e nitratos em ecossistemas agrcolas do
Ribatejo e Oeste e da Beira Litoral. Diss. Dout., ISA, UTL, Lisboa, 464p.
A microextraco em fase slida , de facto, uma tcnica de extraco recente,
que foi primeiramente introduzida por Pawliszyn e colaboradores, nos finais da dcada
de 80-incio da dcada de 90 (Arthur et al., 1992; Arthur & Pawliszy, 1990; Belardi &
Pawliszy, 1989; Louch et al., 1992).
Na SPME recorre-se a uma fibra de slica fundida ("fused silica fiber") revestida
por uma fase estacionria uma fase polimrica. Estas fibras possuem um pequeno
dimetro, sendo instaladas, por convenincia e proteco, numa seringa modificada
(Hernandez et al., 2000; Louch et al., 1992; Urruty & Montury, 1998).
A extraco dos analitos realizada expondo a fibra revestida com a fase
polimrica directamente na amostra de gua ou no "headspace" sobre a amostra,
havendo uma partio do analito para a fase estacionria, onde fica adsorvido (Grote
et al., 1999; Prosen & Kralj, 1999). No entanto, na anlise de amostras aquosas, a
SPME tem sido geralmente efectuada por imerso directa da fibra na amostra
(Barcel, 2000).Os analitos extrados so, depois, desadsorvidos da fibra
termicamente, a temperaturas elevadas, no injector de um GC ou, no caso de LC,
expondo a fibra fase mvel lquida na qual so libertados (Grote et al., 1999; Mder
et al., 1999; Prosen & Kralj, 1999).
A tcnica apresenta elevada simplicidade, porque apenas requer a exposio da
fibra revestida amostra, durante um certo perodo de tempo, no qual ocorre a
adsoro dos analitos fase estacionria, qual se segue a sua injeco no
cromatgrafo para desadsoro dos pesticidas. De facto, como referido, a fibra
revestida com a fase polimrica est inserida numa seringa modificada que, para alm
de a proteger, simplifica a introduo da fibra no injector do GC (Hernandez et al.,
2000; Louch et al., 1992). Quando a fibra sujeita a temperaturas elevadas, a
afinidade dos analitos para a fibra diminui e eles so libertados, sendo que usualmente
a desadsoro obtida em minutos (Almeida et al., 1997; Barcel, 2000; Beltran et al.,
1998; Hernandez et al., 2000).

Como referido, a SPME apresenta vantagens relativamente aos mtodos
convencionais de extraco e preconcentrao de analitos de amostras de gua,
como a LLE e a SPE. Uma das principais vantagens consiste no facto de no requerer
o uso de solventes orgnicos, que so necessrios tanto na LLE como na SPE, facto
este desejvel tanto do ponto de vista toxicolgico, como ambiental, uma vez que este
tipo de resduos laboratoriais levantam grandes problemas, nomeadamente os
solventes clorados, de elevada toxicidade (Barcel, 2000; Hernandez et al., 2000;
Prosen & Kralj, 1999). Este aspecto est, ainda, associado a uma reduo de custos,
uma vez que os solventes orgnicos utilizados nas tcnicas convencionais tm
obrigatoriamente de apresentar uma elevada pureza e, por isso, tambm, um custo
elevado (Hernandez et al., 2000; Prosen & Kralj, 1999).
Por outro lado, a simplificao da fase de preparao da amostra, com a reduo
do seu tempo de execuo e menor exigncia de trabalho dos tcnicos de laboratrio,
relativemente LLE e SPE, tambm origina uma diminuio de custos (Hernandez et
al., 2000), realando-se, ainda, o facto da mesma fibra poder ser reutilizada
sucessivamente at 100 extraces (Beltran et al., 1998; Hernandez et al., 2000;
Prosen & Kralj, 1999).
Para alm da ausncia de uso de solventes orgnicos e da elevada simplicidade
da tcnica (com a extraco a processar-se num nico passo), este mtodo apresenta,
ainda, outras vantagens: sensvel e preciso; so suficientes pequenos volumes de
amostra de gua para extrair os analitos de interesse (geralmente 10mL), com
interesse do ponto de vista prtico, quer no transporte das amostras do campo para o
laboratrio, quer no seu armazenamento uma vez a chegadas; fcil de automatizar
e porttil (Almeida et al., 1997; Beltran et al., 1998; Hernandez et al., 2000; Prosen &
Kralj, 1999).

No entanto, esta tcnica requer optimizao relativamente a vrios parmetros,
tais como o tipo de fibra a usar, fora inica e pH da amostra, perodo de
extraco/adsoro, perodo e temperatura de desadsoro, que influenciam a
eficincia de extraco dos pesticidas da gua e a sua desadsoro no injector.

Dadas as vantagens apresentadas pela SPME, a sua aplicao na anlise de
vrios compostos e em vrias matrizes, nomeadamente de pesticidas em gua, tem
tido uma grande aceitao (Beltran et al., 1998; Grote et al., 1999; Hernandez et al.,
2000). Provavelmente a SPME vai continuar a ser um mtodo muito til e de rotina,
seguido de anlise por GC, que ir substituir outros mtodos de preparao das
amostras como a SPE (Barcel, 2000). Barcel (2000) adianta, ainda, que considera
um desafio para o futuro a combinao desta tcnica com imunofibras e/ou "molecular
imprints", associao esta que conduziria a uma opo selectiva na preparao das
amostras.

Em 2000, Batista (2003) procedeu optimizao de tcnicas de SPME para
anlise de diversos pesticidas, englobando 16 herbicidas (alacloro, atrazina, cianazina,
diclobenil, etofumesato, metolacloro, metribuzina, molinato, pendimetalina, prometrina,
propanil, propazina, simazina, terbutilazina, terbutrina e trifluralina), trs metabolitos de
herbicidas (desetilatrazina - DEA, desisopropilatrazina - DIA e 3,4-dicloroanilina - 3,4-
DCA) e seis insecticidas/ismeros (clorpirifos, dimetoato, e -endossulfo, lindano e
pirimicarbe). Neste estudo foram estudados/optimizados vrios parmetros:


Tipo de fibra: 85 mPoliacrilato e 65 m"Carbowax"/Divinilbenzeno;
Com ou sem adio de sal (NaCl) a 10% amostra/soluo padro;
Com ou sem correco do pH a pH=2;
Perodo de extraco-perfis de extraco com o tempo: 5 min, 15 min, 30 min,
45 min, 60 min, 120 min;
Perodo de desadsoro: 2,5 min, 5 min, 10 min.

Batista (2003) verificou que, para a quase totalidade dos pesticidas, a eficincia
de extraco, avaliada atravs da rea dos picos na anlise por GC-MS, foi superior
(at 90 vezes superior) com a fibra de 65 m CW/DVB relativamente fibra de
85 m PA, em todos os ensaios efectuados com ou sem adio de sal e com ou
sem correco de pH a pH=2 (Quadro 3.16).
Quadro 3.16 Comparao da eficincia da extraco por SPME com a fibra de 85m Poliacrilato
(PA) e com a fibra de 65 m " Carbowax" /Di vinilbenzeno (CW/DVB), com ou sem adio de sal
(10% NaCl) e com ou sem correco do pH a pH=2 das solues padro aquosas de 1,0 g/L,
sujeitas a extraco durante 60 min e com posterior quantificao por GC-MS com perodos de
desadsoro de 10 min (TD10) e 5 min (TD5) a 240C (Batista, 2003).
Pesticida S log pKb
(1)
Razo entre as reas dos picos (CW/DVB / PA)
(mg/L)
(1)
Kow
(2)
sem sal, pH=7 com sal, pH=7 com sal, pH=2
TD10 TD5 TD10 TD5 TD10 TD5
alacloro 240 3,09 --- 15,13 16,44 10,79 9,28 8,23 7,89
atrazina 33 2,5 12,32 19,31 23,26 18,28 18,53 73,50 69,31
cianazina 170 2,1 12,9 --- --- --- --- --- ---
clorpirifos 0,4 4,7 --- 1,49 1,53 0,82 0,77 1,06 1,04
DEA 670
(3)
1,5
(3)
--- --- --- --- --- ---
DIA 3200
(3)
1,1
(3)
--- --- --- --- --- ---
diclobenil 21,2 2,7 --- 6,08 7,30 5,48 5,04 5,36 5,34
dimetoato 39800 0,704 --- --- --- --- --- --- ---
-endossulfo 0,32
(2)
4,74 --- 1,56 2,00 0,93 0,78 1,11 0,90
-endossulfo 0,33
(2)
4,79 --- 1,83 1,37 1,75 1,47 1,23 1,23
etofumesato 50 2,7 --- 10,99 14,02 5,64 5,07 6,69 6,74
lindano 7 3,5 --- 4,27 4,31 3,00 2,55 2,80 2,85
metolacloro 530 2,9 --- 27,60 35,12 12,22 11,47 12,62 18,79
metribuzina 1220 1,6 13,00 22,37 44,84 40,45 35,17 40,19 51,07
pendimetalina 0,275 5,18 --- 1,34 1,63 1,08 1,22 1,13 1,14
pirimicarbe 2700 1,7 --- --- --- --- --- --- ---
prometrina 33 3,1 9,95 14,76 19,57 7,87 7,39 50,29 90,67
propazina 8,6 2,94
(4)
12,15 17,17 18,40 13,46 11,53 56,28 65,89
simazina 6,2 2,1 12,35 21,31 21,59 23,62 23,95 57,58 77,79
terbutilazina 8,5
(2)
3,21 12,0
(2)
11,86 14,82 7,89 7,83 44,11 42,12
terbutrina 22 3,65 9,7 10,31 13,69 4,45 3,81 42,50 32,86
trifluralina 0,3 4,83 --- 1,78 1,61 1,14 1,00 1,46 1,54
S - solibilidade na gua; log Kow - logaritmo do coeficiente de partio octanol-gua; pKb - constante de ionizao de
uma base.
(1) Hornsby et al. (1996); (2) Tomlin (2000); (3) Barcel & Hennion (1997); (4) EXTOXNET (2003)
DEA desetilatrazina; DIA desisopropilatrazina.

semelhana do que se verificou nos ensaios sem adio de sal, concluiu-se que
com adio de 10% de NaCl s solues padro analisadas, existiu uma tendncia de
aumento da eficincia de extraco com a fibra de 65 m CW/DVB, relativamente
fibra de 85 m PA, com a diminuio dos valores de log Kow dos pesticidas. De um
modo geral, quanto mais polares os pesticidas (menores os valores de log Kow) maior
foi o aumento de eficincia de extraco com a fibra de 65 m CW/DVB (Fig. 3.21)
(Batista, 2003).


y =205,6e
-1,0759x
R
2
=0,8995
y =189,07e
-1,0768x
R
2
=0,8884
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
log Kow
R
a
z

o

e
n
t
r
e

a

r
e
a

d
o
s

p
i
c
o
s
TD 10min TD 5min Exponencial (TD 10min) Exponencial (TD 5min)


Fig. 3.21 Comparao das eficincias de extraco obtidas com as fibras
de 85m Poliacrilato (PA) e de 65 m " Carbowax" /Divinilbenzeno
(CW/DVB) com 10% de NaCl e sem correco de pH vs log Kow dos
pesticidas em anlise, sendo a comparao das eficincias de extraco
avaliada com base na razo entre as reas dos picos obtidas por GC-MS
para a fibra de CW/DVB e para a fibra de PA, para um perodo de extraco
de 60 min e para perodos de desadsoro de 10 min (TD 10min) e 5 min
(TD 5min) a 240C (Batista, 2003).

Analisando os resultados observados para a fibra de 65 m
" Carbowax" /Divinilbenzeno quanto s condies da amostra com ou sem adio
de sal (10% NaCl) e com ou sem correco do pH a pH=2 (Quadro 3.17), concluiu-
se que (Batista, 2003):
a adio de sal soluo padro aquosa conduziu a uma maior eficincia de
extraco de vrios pesticidas, como a atrazina, DEA, DIA, metribuzina,
pirimicarbe, prometrina, propazina e simazina (razo entre as reas dos picos
correspondentes s solues padro aquosas com e sem sal igual ou superior
a 1,20, para os ensaios realizados com o perodo de desadsoro de 10, 5 e
2,5 min. Pelo contrrio, para outros pesticidas como o clorpirifos, e -
endossulfo, lindano, pendimetalina e trifluralina, observou-se uma menor
eficincia de extraco para as solues padro com 10% de NaCl (razo entre
as reas dos picos correspondentes s solues padro aquosas com sal e
sem sal inferior a 0,80, para os perodos de desadsoro de 10, 5 e 2,5 min).
comparativamente s solues padro aquosas sem adio de sal e sem
correco do pH, as solues padro com 10% de NaCl e com pH=2
evidenciaram melhores resultados para alguns pesticidas, como o alacloro,
atrazina, DEA, propazina e simazinao (razo entre as reas dos picos
correspondentes s solues padro aquosas com sal e a pH=2 e sem sal e a
pH=7 superior a 1,20, tanto para os ensaios realizados com o perodo de
desadsoro de 10 min, como de 5 min). Todavia, uma vez mais, os resultados
foram contraditrios, tendo-se verificado que outros pesticidas, como o
clorpirifos, - e -endossulfo, pendimetalina, pirimicarbe, prometrina,
terbutrina e trifluralina apresentaram menores eficincias de extraco para as
solues padro com 10% de NaCl e a pH=2 (razo entre as reas dos picos
correspondentes s solues padro aquosas com sal e a pH=2 e sem sal e a
pH=7 inferior a 0,80, tanto para o perodo de desadsoro de 10 min, como de
5 min).
relativamente s solues padro aquosas com 10% de NaCl e sem
correco do pH, as solues padro com 10% de NaCl e com pH=2
conduziram a uma maior eficincia de extraco para um menor nmero de
pesticidas, como o clorpirifos, lindano e trifluralina, com uma razo entre as
reas dos picos correspondentes s solues padro aquosas com pH=2 e
pH=7 superior a 1,20, tanto para os ensaios realizados com o perodo de
desadsoro de 10 min, como de 5 min. Pelo contrrio, foram vrios os
pesticidas que, com estas condies, apresentaram resultados inferiores a
pH=2 do que a pH=7, como a atrazina, DEA, DIA, metribuzina, pirimicarbe,
prometrina, propazina, simazina, terbutilazina e terbutrina, com razes entre as
reas dos picos correspondentes s solues padro aquosas com pH=2 e
pH=7, ambas com 10% de NaCl, menores ou iguais a 0,80, tanto para o
perodo de desadsoro de 10 min, como de 5 min.
Quadro 3.17 Comparao da eficincia da extraco por SPME com a fibra de 65 m
" Carbowax" /Divinilbenzeno, com ou sem adio de sal (10% NaCl) e com ou sem correco do pH
a pH=2 das solues padro aquosas de 1,0 g/L, sujeitas a extraco durante 60 min e com
posterior quantificao por GC-MS com perodos de desadsoro de 10 min (TD10), 5 min (TD5) e
2,5 min (TD2,5) a 240C (Batista, 2003).
Pesticida S log pKb
(1)
Razo entre as reas dos picos
(mg/L)
(1)
Kow
(2)
TD10 TD5 TD2,5
com
sal,
pH=7/
sem
sal,
pH=7
com
sal,
pH=2/
sem
sal,
pH=7
com
sal,
pH=2/
com
sal,
pH=7
com
sal,
pH=7/
sem
sal,
pH=7
com
sal,
pH=2/
sem
sal,
pH=7
com
sal,
pH=2/
com
sal,
pH=7
com
sal,
pH=7/
sem
sal,
pH=7
alacloro 240 3,09 --- 1,37 1,63 1,19 1,07 1,36 1,27 1,16
atrazina 33 2,5 12,32 1,89 1,37 0,73 1,81 1,32 0,73 1,28
cianazina 170 2,1 12,9 --- --- --- --- --- --- ---
clorpirifos 0,4 4,7 --- 0,43 0,63 1,45 0,40 0,50 1,26 0,78
DEA 670
(3)
1,5
(3)
2,68 1,74 0,65 2,13 1,38 0,65 1,56
DIA 3200
(3)
1,1
(3)
2,10 1,37 0,65 1,88 0,97 0,52 1,31
3,4-DCA 92-580
(4)
2,7
(4,5)
--- --- --- --- 1,01 0,01 0,01 ---
diclobenil 21,2 2,7 --- 1,06 1,13 1,06 0,89 0,93 1,05 0,87
dimetoato 39800 0,704 --- --- --- --- --- --- --- ---
-endossulfo 0,32
(2)
4,74 --- 0,50 0,65 1,31 0,39 0,44 1,13 0,73
-endossulfo 0,33
(2)
4,79 --- 0,72 0,72 1,00 0,69 0,68 0,98 0,79
etofumesato 50 2,7 --- 0,97 1,07 1,10 0,85 0,87 1,03 1,17
lindano 7 3,5 --- 0,77 0,98 1,27 0,68 0,94 1,38 0,68
metolacloro 530 2,9 --- 0,99 1,08 1,08 0,84 0,97 1,15 1,51
metribuzina 1220 1,6 13,00 1,83 1,45 0,79 1,37 1,10 0,80 1,42
molinato 970 2,88 --- --- --- --- 1,13 1,07 0,95 ---
pendimetalina 0,275 5,18 --- 0,62 0,79 1,27 0,62 0,70 1,12 0,76
pirimicarbe 2700 1,7 --- 2,14 0,03 0,02 1,64 0,02 0,01 1,39
prometrina 33 3,1 9,95 1,36 0,12 0,09 1,20 0,11 0,09 1,22
propanil 200 3,3 --- --- --- --- 1,14 1,11 0,97 ---
propazina 8,6 2,94
(6)
12,15 1,68 1,21 0,72 1,63 1,29 0,79 1,20
simazina 6,2 2,1 12,35 2,21 1,62 0,73 2,03 1,53 0,76 1,36
terbutilazina 8,5
(2)
3,21 12,0
(2)
1,39 1,04 0,75 1,26 0,88 0,70 1,19
terbutrina 22 3,65 9,7 0,94 0,08 0,08 0,81 0,06 0,07 1,32
trifluralina 0,3 4,83 --- 0,41 0,66 1,59 0,40 0,68 1,70 0,51
S - solubilidade na gua; log Kow - logaritmo do coeficiente de partio octanol-gua; pKb - constante de ionizao de
uma base.
(1) Hornsby et al. (1996); (2) Tomlin (2000); (3) Barcel & Hennion (1997); (4) Pichard et al. (2003); (5) CSTEE (2002);
(6) EXTOXNET (2003)
DEA desetilatrazina; DIA desisopropilatrazina

Relativamente ao molinato, propanil e seu metabolito 3,4-DCA foram feitos alguns
ensaios suplementares cujos resultados se apresentam na Fig. 3.18 (Batista, 2003).
Enquanto que para o molinato e o propanil, nos vrios ensaios realizados, no se
obtiveram resultados muito diferentes, para a 3,4-DCA verificou-se que com pH=2 a
eficincia de extraco foi muito inferior a qualquer dos ensaios sem correco do pH
(Quadro 3.17, Fig. 3.22).

0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
3,4-DCA molinato propanil

r
e
a

d
o

p
i
c
osemsal, pH7
comsal, pH7
semsal, pH2
comsal, pH2


Fig. 3.22 Extenso da extraco por SPME com a fibra de 65 m
" Carbowax" /Divinilbenzeno com posterior quantificao por GC-MS,
expressa em rea do pico, na anlise de solues padro aquosas de 3,4-
DCA, molinato e propanil a 1,0 g/L, com ou sem adio de sal (10% NaCl) e
com ou sem correco do pH a pH=2, sujeitas a extraco durante 60 min e
para um perodo de desadsoro de 5 min a 240C (Batista, 2003). (3,4-DCA
3,4-dicloroanilina)

Outro dos parmetros analisados por Batista (2003) foi o perodo de desadsoro,
tendo-se seleccionado para os ensaios posteriores um tempo de desadsoro de
5 min (a 240C) com base nos resultados obtidos nos ensaios efectuados.

Na anlise dos perfs de adsoro - influncia do perodo de extraco na
eficincia de extraco dos pesticidas da soluo padro aquosa pela fibra de 65 m
CW/DVB, verificou-se uma melhor extraco dos pesticidas com o aumento do tempo
de adsoro dos 5 at aos 120 min. No entanto, optou-se por seleccionar um tempo
de extraco de 60 min, por razes de natureza prtica relativas ao tempo de
execuo da anlise (Batista, 2003). De facto, este tempo de extraco foi
seleccionado, em termos de compromisso, tendo sido evidenciado por outros autores
(Ai, 1997; Almeida et al., 1997; Beltran et al., 1998; Hernandez et al., 2000) que
possvel trabalhar em condies de no-equilbrio quando as condies experimentais,
especialmente o perodo de adsoro-extraco, so mantidas constantes.

Os limites de deteco e as rectas de calibrao obtidas por Batista (2003)
recorrendo a extraco por SPME com a fibra 65 m "Carbowax"/Divinilbenzeno
com adio de sal (10% NaCl) so apresentados no Quadro 3.18.

Quadro 3.18 Tempos de reteno, limites de deteco e rectas de calibrao para SPME com a
fibra de 65 m " Carbowax" /Di vinilbenzeno (extraco durante 60 min, com agitao a 600rpm,
desadsoro durante 5 min, a 240C, sem ajuste de pH) com adio de sal (Batista, 2003).
Tempo de reteno Recta de calibrao Limite de deteco
(min) equao R2 (g/L)
alacloro 24,110 y =105552x +1985,2 0,9985 0,016
atrazina 19,343 y =168468x +2236,5 0,9975 0,006
cianazina --- --- --- ---
clorpirifos 26,646 y =83678x 1143,1 0,9998 0,020
DEA 16,933 y =13778x +349,85 0,9975 0,030
DIA 16,554 y =1011,9x +385,63 * 0,9991 0,071
3,4-DCA 12,868 y =73060x 1584,9 0,9980 0,015
diclobenil 11,559 y =168468x +2236,5 0,9976 0,012
dimetoato --- --- --- ---
-endossulfo 30,628 y =18722x +439,19 0,9978 0,042
-endossulfo 33,953 y =15258x +1092 0,9990 0,054
etofumesato 25,912 y =92220x +2136,6 0,9999 0,016
lindano 19,698 y =67357x +599,84 0,9999 0,018
metolacloro 26,460 y =176085x +3869,3 0,9995 0,011
metribuzina 23,623 y =41681x +36,529 0,9999 0,015
molinato 14,600 y =108103x +1828 0,9995 0,017
pendimetalina 28,504 y =97095x 1630,2 0,9991 0,014
pirimicarbe 22,150 y =60548x +571,63 0,9988 0,012
prometrina 24,977 y =198701x 2609,5 0,9971 0,007
propanil 23,353 y =59713x 2188,1 0,9986 0,021
propazina 19,566 y =84769x +1026,9 0,9988 0,007
simazina 19,062 y =24818x +73,944 0,9992 0,011
terbutilazina 20,151 y =128349x +1521,2 0,9994 0,007
terbutrina 25,731 y =212579x +2961,4 0,9964 0,019
trifluralina 17,030 y =42535x 363,17 0,9983 0,013
R
2
coeficiente de determinao obtido para a recta de calibrao;
x concentrao da soluo/amostra; y rea do pico correspondente ao pesticida em anlise/rea do pico do padro
interno;
DEA desetilatrazina; DIA desisopropilatrazina; 3,4-DCA 3,4-dicloroanilina.
* apenas para as solues padro entre 0,10 g/L e 1,0 g/L.

Com a adio de sal s solues padro de calibrao foi possvel determinar
rectas de calibrao para todos os pesticidas em anlise, excepo da cianazina e
do dimetoato, para os quais no se identificaram picos na anlise por GC-MS. Em
todos os casos, os coeficientes de determinao (R
2
) calculados foram elevados,
iguais ou superiores a 0,996.
Relativamente aos limites de deteco, observou-se que apenas os pesticidas e
metabolitos e -endossulfo, DEA e DIA apresentaram limites de deteco
superiores a 0,025 g/L, mas inferiores a 0,10 g/L (Quadro 3.18), evidenciando
melhores resultados que os observados com a fibra de 85 mPA (ver Quadro 3.19).

Nos estudos de preciso-repetibilidade verificou-se que todas as substncias,
excepo do e -endossulfo, DEA e DIA, apresentaram coeficientes de variao
sempre inferiores a 12,5% (critrio imposto na Directiva 98/83/CE). Os coeficientes de
variao obtidos para o e -endossulfo, DEA e DIA foram, respectivamente, de
12,8%, 13,5%, 13,1% e 16,4%.

Os limites de deteco e as rectas de calibrao obtidas para o mtodo de
extraco por SPME com a fibra 85m Poliacrilato so apresentados no
Quadro 3.19. Neste Quadro s se apresentam os pesticidas para os quais foi possvel
a identificao dos picos correspondentes na anlise por GC-MS e a determinao
das rectas de calibrao (com base em pelo menos quatro nveis de concentrao das
solues padro de quantificao) e/ou a determinao dos limites de deteco.
Sem a adio de sal s solues padro de calibrao foi possvel determinar
rectas de calibrao para o clorpirifos, diclobenil, e -endossulfo, etofumesato,
lindano, pendimetalina, prometrina, terbutilazina, terbutrina e trifluralina. No entanto,
com adio de sal s solues padro de calibrao foi possvel determinar rectas de
calibrao para um maior nmero de pesticidas: no s para os referidos
anteriormente, mas ainda para o alacloro, metolacloro e propazina. Em todos os
casos, obtiveram-se coeficientes de determinao (R
2
) elevados, iguais ou superiores
a 0,998.
Relativamente aos limites de deteco, e considerando os ensaios sem adio de
sal, observou-se que apenas os pesticidas clorpirifos, diclobenil, etofumesato, lindano,
pendimetalina e trifluralina apresentaram limites de deteco inferiores a 0,025 g/L.
Nos ensaios com adio de sal, os pesticidas que apresentaram limites de deteco
inferiores ao referido valor foram os mesmos que nos ensaios anteriores, excepo
do etofumesato.

Quadro 3.19 Tempos de reteno, limites de deteco e rectas de calibrao para SPME com a
fibra de 85m Poliacrilato (extraco durante 60 min, com agitao a 600rpm, desadsoro
durante 5 min, a 240C, sem ajuste de pH) sem e com adio de sal.
Pesticida Tempo
de
reteno
Sem sal Com sal
(min) recta de calibrao * limite de
deteco
recta de calibrao * limite de
deteco
equao R2 (g/L) equao R2 (g/L)
alacloro 23,992 --- --- 0,222 y=6682x+202 0,999 0,067
atrazina 19,152 --- --- 0,243 --- --- 0,120
clorpirifos 26,581 y=60869x-1608 0,999 0,012 y=26452x+4609 0,998 0,016
diclobenil 11,480 y=14616x+535 0,999 0,009 y=19875x+428 0,999 0,006
-endossulfo 30,624 y=8452x+405 0,999 0,050 y=5623x+1003 0,999 0,055
-endossulfo 33,970 y=11934x-624 0,999 0,051 y=7006x+676 0,999 0,065
etofumesato 25,829 y=10028x+264 0,999 0,021 y=22110x+1208 0,999 0,031
lindano 19,500 y=18501x+80 0,999 0,015 y=27303x+860 0,999 0,010
metolacloro 26,396 --- --- 0,213 y=8530x-509 0,999 0,073
pendimetalina 28,466 y=147374x-27845 0.998 0,018 y=48898x+758 0,999 0,021
prometrina 24,886 y=5118x-161 0.999 0,073 y=18247x-1614 0,999 0,034
propazina 19,379 --- --- 0,162 y=5021x-574 0,999 0,089
simazina 18,891 --- --- 0,261 --- --- 0,143
terbutilazina 19,953 y=4359x-176 0.999 0,086 y=11350x-449 0,999 0,059
terbutrina 25,655 y=8964x-778 0.999 0,082 y=25720x-2100 0,999 0,047
trifluralina 16,885 y=75587x-6636 0.998 0,016 y=22006x+1606 1,000 0,023
R
2
coeficiente de determinao obtido para a recta de calibrao;
x concentrao da soluo/amostra; y rea do pico correspondente ao pesticida em anlise/rea do pico do padro
interno;
* para os pesticidas para os quais foi possvel proceder, no mnimo, ao doseamento das solues padro entre
0,10 g/L e 1,0 g/L.

Para os pesticidas para os quais foi possvel determinar a preciso-repetibilidade
a 0,1 g/L (com limites de deteco inferiores a este valor), obtiveram-se coeficientes
de variao inferiores a 12,5% (critrio imposto na Directiva 98/83/CE), com ou sem
adio de sal. Procedeu-se, tambm, anlise da repetibilidade a 1,0 g/L para todos
os pesticidas que foi possvel analisar atravs deste mtodo. Sem adio de sal
soluo padro aquosa, verificou-se que todas as substncias, excepo da
metribuzina (coeficiente de variao de 18,2%), apresentaram coeficientes de variao
inferiores a 12,5%. Com adio de sal, o critrio imposto na referida Directiva foi
respeitado para todas as substncias analisadas por este mtodo.



c Mtodo analtico usado de SPME com doseamento por GC-MS

No Laboratrio de Ecotoxicologia da SAPI/DPPF, do ISA, procedeu-se ao
doseamento dos pesticidas clorfenvinfos, e -endossulfo, molinato, oxadiazo,
propanil e seu metabolito 3,4-dicloroanilina, recorrendo a um mtodo multi-resduos,
que permite reduzir o tempo de anlise e os custos.
Para todos os pesticidas em anlise foram adquiridos padres Pestanal

, da
Riedel-de-Han

(Seelze, Alemanha), e do Dr. Ehrenstorfer GmbH, da Ehrenstorfer


Quality (Augsburg, Alemanha), acompanhados de certificado de anlise e de
inspeco, garantindo a pureza dos padres, que para a maioria dos pesticidas foi
igual ou superior a 99,0%, excepo do clorfenvinfos (94,0%), -endossulfo
(97,0%), -endossulfo (98,5%), metolacloro (97,8%), molinato (98,5%), pendimetalina
(98,3%) e terbutrina (98,7%) (Quadro 3.20).

Quadro 3.20 Pureza dos padres adquiridos, garantida atravs de certificados de anlise e de
inspeco.
Pesticida Pureza (%) Pesticida Pureza (%)
alacloro 99,7 metolacloro 97,8
atrazina 99,2 metribuzina 99,8
cianazina 99,9 molinato 98,5
clorfenvinfos 94,0 oxadiazo 99,0
clorpirifos 99,0 pendimetalina 98,3
desetilatrazina (DEA) 99,9 pirimicarbe 99,5
desisopropilatrazina (DIA) 99,5 prometrina 99,7
diclobenil 99,0 propanil 99,5
3,4-dicloroanilina (DCA) 99,0 propazina 99,6
dimetoato 99,8 simazina 99,3
-endossulfo 97,0 terbutilazina 99,0
-endossulfo 98,5 terbutrina 98,7
etofumesato 99,5 trifluralina 99,0
lindano 99,9

Neste estudo, pretendeu-se avaliar a sensibilidade da tcnica de microextraco
em fase slida, aos pesticidas em anlise, relativamente a dois tipos diferentes de
revestimentos de fibras (poliacrilato de 85 m e carbowax/divinilbenzeno de 65 m) e
fora inica da matriz aquosa (sem e com adio de sal a 10%, p/v).




Para a extraco dos resduos de pesticidas das amostras de gua recorreu-
se ao seguinte material:
amostra: 10 mL de amostra de gua subterrnea;
reagentes:
cloreto de sdio para anlise ACS ISO, com um mnimo de pureza de
99,5% (Panreac, Barcelona, Espanha);
fibras para SPME:
"SPME Fiber Assembly 65 m Carbowax-Divinylbenzene for Manual Holder
Orange" (SUPELCO, Bellefonte, PA, EUA);
"SPME Fiber Assembly 85 m Polyacrylate Coating for Manual Holder
White" (SUPELCO, Bellefonte, PA, EUA);
equipamento:
balana analtica "Analytical balance AE 200" (METTLER, Greifensee,
Suia)
agitador magntico "IKAMAG

RET control-visc" (IKA

-LABORTECHNIK,
Staufen, Alemanha);
material de vidro:
copos de vidro de 10 mL;
tubos ("vials") de 4 mL;
outro material:
suporte para as fibras para SPME Manual - "SUPELCO Solid Phase
MicroExtraction Fiber Holder for Manual Use" (SUPELCO, Bellefonte, PA,
EUA);
suporte das amostras para SPME Manual "SPME Sampling Stand/Vial
Puck Sampling Stand with 4 mL Vial Puck" (SUPELCO, Bellefonte, PA,
EUA).

Antes da utilizao das fibras na extraco dos pesticidas, estas foram
condicionadas no injector do cromatgrafo gasoso, seguindo as recomendaes do
fabricante: a fibra de CW-DVB foi condicionada durante 30 min a 220C.

A extraco dos resduos de pesticidas das amostras de gua subterrnea por
SPME consistiu no seguinte procedimento:
Preparao da amostra:
adio vs. no adio de sal: pesou-se 1 g de NaCl e adicionou-se aos
10 mL de amostra de gua/soluo padro;
agitao da amostra, a uma velocidade de 600 r.p.m., para homogeneizao
da amostra;

Extraco (Fig. 3.23):
transferiu-se 4 mL da amostra de gua para o "vial";
colocou-se o "vial", com um "magnete", no agitador magntico (600 r.p.m.);
colocou-se a fibra no suporte para SPME, expondo-a amostra de gua
(em agitao), durante 60 min.

O equipamento utilizado no doseamento dos resduos de pesticidas foi um
cromatgrafo gasoso "Varian Chrompack CP-3800" acoplado a um espectrmetro de
massa "Saturn 2000 GC/MS", da Varian (Walnut Creek, CA, USA) (Fig. 3.24), com as
seguintes condies cromatogrficas:
Injector:"split/ split less", com abertura da vlvula aos 5 min;
Temperatura do injector: 240C;
Coluna: DB-5MS de 30m x 0,25mm "Low Bleed/MS", com 0,25m de
espessura de filme (J &W Scientific, Folsom, EUA);
Rampa de temperatura do forno: temperatura inicial a 50C (1min), rampa de
10C/min at 170C, rampa de 1C/min at 180C, rampa de 5C/min at 220C
(6min), rampa de 15C/min at 240C (4min);
Gs de arraste: Hlio BIP (GASIN, Perafita, Porto);
Fluxo do gs de arraste: 12 Psi;
Detector: "Ion Trap";
Modo de ionizao: por impacto electrnico (EI); espectro obtido a 70 eV, em
"full scan"de m/z 70 a m/z 350;
"Axial modulation voltage": 4,0;
"Electron multiplier voltage": 1850 V;
Temperatura do "Ion trap": 190C;
Temperatura da linha de transferncia: 230C;
Temperatura do "Manifold": 40C.





Fig. 3.23 Fase de extraco por SPME.


Fig. 3.24 - GC-MS utilizado para a desadsoro dos resduos de pesticidas das fibras
e para o seu doseamento, aps o processo de SPME.

Os compostos em anlise foram identificados por comparao dos seus tempos
de reteno e espectros de massa com os tempos de reteno e espectros de massa
de referncia obtidos para as solues padro sob as mesmas condies
cromatogrficas e de espectrometria de massa. Na identificao e quantificao dos
pesticidas foram considerados os principais fragmentos inicos (m/z, ou seja,
massa/carga), que se indicam no Quadro 3.21.
Quadro 3.21 Massa molar (MM) e principais ies (m/z) obtidos por GC-MS.
Pesticida Tempo de reteno (min) MM
(1)

(g/mol)
m/z dos principais ies
clorfenvinfos 29.264 359,6 267 +323
3,4-DCA 12.834 162,02
(3)
161 +163 +126
-endossulfo 30.777 406,91 159+195 +339
-endossulfo 34.190 406,91 337 +339 +341
molinato 14.601 187,32 98 +126
oxadiazo 32.417 345,2 175 +258
propanil 23.418 218,08 161 +163 +217
(1) Hornsby et al. (1996); (2) Livraria do GC-MS "NIST Mass Spectral Database" "MS Search v. 1.6"; (3) Pichard et al.
(2003); (4) Tomlin (2000);
DEA desetilatrazina; DIA desisopropilatrazina; 3,4-DCA 3,4-dicloroanilina
a negrito io mais abundante ("base peak");

O doseamento foi realizado com recurso a padro externo, com base na rea dos
picos obtidos para os pesticidas presentes nas amostras de gua e recorrendo a
rectas de calibrao, determinadas a partir de solues padro contendo a mistura dos
pesticidas em anlise, de 0,05 g/L, 0,10 g/L, 0,25 g/L, 0,50 g/L e 1 g/L. Estas
rectas foram obtidas por regresso linear, de modo a confrontar a rea do pico (y) e a
concentrao da soluo padro de calibrao injectada (x, g/L). Foi tambm
determinado o coeficiente de determinao (R
2
) para a recta obtida com base nas
solues padro injectadas. Foi, assim, possvel avaliar a linearidade do sistema, na
gama de concentraes considerada

Com este tipo de tcnica no se realizam os ensaios de recuperao tradicionais
das tcnicas de LLE e SPE, uma vez que a SPME consiste apenas numa fase de
extraco e que as rectas de calibrao so calculadas havendo tambm a extraco
das solues padro, nas mesmas condies utilizadas para as amostras. Deste
modo, considera-se que a eficincia de extraco para as amostras de gua a analisar
ser a mesma que se verifica para as solues padro.

O limite de deteco foi calculado com base na anlise de sete amostras de
gua ("Fastio") fortificadas a 0,05 g/L, procedendo-se determinao do valor 3.s,
sendo s o desvio padro dos resultados das sete repeties
c.1 Eficincia de extraco com a fibra poliacrilato de 85 m
**


Na Fig. 3.25 apresentam-se os resultados obtidos da eficincia de extraco de
uma soluo padro de 1 g/L, expressa em rea do pico, com a fibra poliacrilato (PA)
de 85 m, sem e aps modificao da matriz aquosa com sal a 10% (p/v).

0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
3
,
4
-
d
i
c
l
o
r
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a
n
i
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n
v
i
n
f
o
s

r
e
a

d
o

p
i
c
o
PA_1_cSal
PA_1_sSal

Fig. 3.25 Eficincia de extraco de uma soluo padro de 1 g/L, expressa em rea do pico,
com a fibra poliacrilato (PA) de 85 m, sem e com adio de sal a 10% (p/v).

Verificou-se que, para a fibra poliacrilato de 85 m, a extraco dos insecticidas
organoclorados, e -endossulfo, e do herbicida oxadiazo revelou-se superior sem
adio de sal, relativamente adio de sal. No entanto, para os outros pesticidas os
resultados foram melhores no caso de se proceder extraco com adio de sal.
A linearidade das curvas de calibrao obtidas para os diversos pesticidas
estudados, atravs da tcnica de microextraco em fase slida com a fibra
poliacrilato de 85 m, sem e com adio de sal a 10% (p/v), apresentada, atravs da
forma algbrica e coeficiente de correlao (r), no Quadro 3.22. Os limites de deteco
so tambm apresentados, no caso da modificao da matriz aquosa com sal a 10%
(p/v).


**
Extrado de Silva (2002) Tcnicas de microestraco em fase slida. Ensaios de optimizao na anlise de
resduos de pesticidas em gua.. Rel. Estag. Profiss. PRODEP, SAPI, DPPF, ISA, UTL, Lisboa, 19p.


Quadro 3.22 Limites de deteco (LD) e equaes de calibrao para microextraco em fase
slida com a fibra poliacrilato de 85 m, sem e com adio de sal a 10% (p/v).
Sem sal Sal 10% (p/v)
Pesticida / Grupo qumico
Eq. de calibrao r
LD
(g/L)
Eq. de calibrao r
Herbicidas
Anilinas
3,4-dicloroanilina* y=30490x+52 0.996 0.036 y=37148x+244 0.992
Propioanilidas
propanil y=68241x+8894 0.979 0.017 y=33687x+977 0.971
Tiocarbamatos
molinato y=14602x-766 0.994 0.043 y=113079x+1336 0.991
Oxadiazolonas
oxadiazo y=279410x-8375 0.991 0.016 y=178633x-14628 0.973
Insecticidas
Organoclorados
-endossulfo y=36588x-1888 0.998 0.039 y=25210x-1035 0.995
-endossulfo y=46244x-5789 0.983 0.100 y=28077x+34 0.985
Organofosforados
clorfenvinfos y=30490x+52 0.996 0.032 y=41252x-1777 0.956
* metabolito do propanil

O estudo do mtodo evidenciou curvas de calibrao lineares para uma gama de
concentrao compreendida entre 0.05 e 1 g/L, com coeficientes de correlao que
variaram para cada pesticida e vo desde 0.979 a 0.998, no caso da extraco sem
adio de sal. Os coeficientes de correlao obtidos por microextraco em fase
slida, com adio de sal a 10% (p/v), variaram entre 0.956 e 0.995 g/L, verificando-
se para o herbicida propanil o coeficiente de correlao mais baixo. Os limites de
deteco obtidos por microextraco em fase slida, com adio de sal a 10% (p/v),
variam entre 0.016 e 0.1 g/L.

c.2 - Eficincia de extraco com a fibra carbowax /divinilbenzeno de
65 m
**


Na Fig. 3.26 apresentam-se os resultados obtidos da eficincia de extraco de
uma soluo padro de 1 g/L, expressa em rea do pico, com a fibra

**
Extrado de Silva (2002) Tcnicas de microestraco em fase slida. Ensaios de optimizao na anlise de
resduos de pesticidas em gua.. Rel. Estag. Profiss. PRODEP, SAPI, DPPF, ISA, UTL, Lisboa, 19p.
carbowax/divinilbenzeno (CW) de 65 m, sem e aps modificao da matriz aquosa
com sal a 10% (p/v). Observaram-se melhores resultados sem adio de sal para os
insecticidas organoclorados, -endossulfo e -endossulfo. Com o aumento da fora
inica, verificou-se o aumento da quantidade dos restantes pesticidas extrados, o que
traduzir a esperada diminuio da sua solubilidade na matriz.

0
50000
100000
150000
200000
250000
3
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p
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c
o
CW_1_cSal
CW_1_sSal

Fig. 3.26 Eficincia da extraco de uma soluo padro de 1 g/L, expressa em rea do pico,
com a fibra carbowax/divinilbenzeno (CW) de 65 m, sem e com adio de sal a 10% (p/v).

Os limites de deteco e as equaes de calibrao obtidas para microextraco
em fase slida, neste caso com a fibra de 65 m carbowax/divinilbenzeno, e nas
mesmas condies de extraco que para a fibra de poliacrilato, so apresentados no
Quadro 3.23.
O mtodo linear pelo menos para as cinco ordens de grandeza avaliadas com
coeficientes de correlao normalmente igual ou superiores a 0.990, excepto para o
herbicida propanil e insecticida clorfenvinfos (extraco sem adio de sal), e
apresenta limites de deteco que variaram para cada pesticida e vo desde 0.019 a
0.040 g/L, no caso da extraco com adio de sal.







Quadro 3.23 Limites de deteco (LD) e equaes de calibrao para microextraco em fase
slida com a fibra carbowax/divinilbenzeno de 65 m, sem e com adio de sal a 10% (p/v).
Sem sal Sal 10% (p/v)
Pesticida / Grupo qumico
Eq. de calibrao r
LD
(g/L)
Eq. de calibrao r
Herbicidas
Anilinas
3,4-dicloroanilina* y=46444x+628 0.999 0.019 y=52184x+1261 0.993
Propioanilidas
propanil y=70959x-29 0.973 0.036 y=29394x+3082 0.987
Tiocarbamatos
molinato y=37371x-4876 0.990 0.022 y=52472x-1184 0.999
Oxadiazolonas
oxadiazo y=177948x-16095 0.991 0.027 y=55383x-4242 0.999
Insecticidas
Organoclorados
-endossulfo y=25890x-54 0.998 0.039 y=6796X-173 0.998
-endossulfo y=21166x-1093 0.996 0.040 y=8454x-105 0.999
Organofosforados
clorfenvinfos y=68410x-1915 0.981 0.034 y=29534x+327 0.998
* metabolito do propanil

c.3 - Eficincias de extraco - fibra poliacrilato de 85 m vs. fibra
carbowax /divinilbenzeno de 65 m
**


Na Fig. 3.27 resumem-se os resultados obtidos com as duas fibras estudadas para
a extraco de uma soluo padro de 1 g/L, sem e com adio de sal a 10% (p/v).
Os estudos de optimizao da tcnica de microextraco em fase slida com a
fibra poliacrilato de 85 m evidenciaram que esta fibra eficiente na extraco do
herbicida oxadiazo, do insecticida organofosforado, clorfenvinfos, e dos insecticidas
organoclorados, -endossulfo e -endossulfo. Contudo, a adio do adsorvente
divinilbenzeno num revestimento de carbowax, fortemente polar, aumenta a rea
disponvel do polmero, possibilitando a extraco de pequenas molculas polares, tais
como os herbicidas propanil e molinato, e o metabolito do propanil, 3,4-dicloroanilina.

**
Extrado de Silva (2002) Tcnicas de microestraco em fase slida. Ensaios de optimizao na anlise de
resduos de pesticidas em gua.. Rel. Estag. Profiss. PRODEP, SAPI, DPPF, ISA, UTL, Lisboa, 19p.
A adio de sal amostra antes da extraco altera a sua fora inica, reduzindo a
solubilidade de alguns dos analitos e, consequentemente, modificando o respectivo
coeficiente de partio entre o revestimento da fibra e a matriz da amostra. Todos os
pesticidas estudados, excepo dos insecticidas organoclorados, -endossulfo e -
endossulfo, e o herbicida oxadiazo, possuem elevados valores de solubilidade em
gua, pelo que a adio de sal favorece a adsoro destes pesticidas (de elevada
solubilidade) fibra.

0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
3
,
4
-
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CW_1_cSal CW_1_sSal PA_1_cSal PA_1_sSal

Fig. 3.27 Estudo comparativo entre as fibras poliacrilato de 85 m e carbowax/divinilbenzeno de
65 m para a soluo padro de 1 g/L, sem e com adio de sal a 10% (p/v).

Em relao repetibilidade do mtodo, revelou-se muito boa, com valores de
desvio padro relativo iguais ou inferiores a 4%, para as condies estudadas,
atribuindo este baixo valor ao mtodo possuir um nico passo e, por isso, as fontes de
erro aleatrias estarem unicamente associadas transferncia de massa.

Com base na anlise dos resultados obtidos nos ensaios de optimizao
do mtodo (Quadro 3.24) considerou-se mais adequada a adopo das seguintes
condies:
- utilizao da fibra de carbowax /divinilbenzeno de 65 m
- adio de sal amostra (10% NaCl, p/v)
que permitem a anlise de todos os pesticidas considerados (com limites de
deteco que variam entre 0,019 g/L e 0,040 g/L.
Todavia, para estes pesticidas tambm seria possvel recorrer fibra de
poliacrilato de 85 m, que para alguns pesticidas, em particular para o oxadiazo e
para o endossulfo conduz a maiores eficincias de extraco, sem adio de sal s
solues padro.
Quadro 3.24 Condies mais eficientes para a extraco por SPME dos pesticidas sujeitos a
anlise no Laboratrio de Ecotoxicologia do ISA, no mbito do Projecto AGRO 24, considerando
fibra poliacrilato de 85 m vs. fibra carbowax /divinilbenzeno de 65 m, adio de sal (10% NaCl,
p/v) vs. sem adio de sal s solues pado e o seu pH pH7 vs. pH2.
Pesticida Tipo de fibra
poliacrilato de 85 m
(1)
carbowax/divinilbenzeno de 65 m
s/ sal c/ sal s/ sal c/ sal
pH7 pH7 pH7
(1,2)
pH2
(2)
pH7
(1,2)
pH2
(2)

clorfenvinfos
(1)
X X X
3,4-DCA
(1,2)
X
-endossulfo
(1,2)
X
-endossulfo
(1,2)
X
molinato
(1,2)
X X
oxadiazo
(1)
X
propanil
(1,2)
X X X
Analisado por: (1) Silva (2001); (2) Batista (2003);
Condies mais eficientes para a extraco, de acordo com: X - Silva (2001); - Batista (2003).

3.6.2 - Extraco em fase slida (SPE) de resduos de pesticidas das
amostras de gua e doseamento por cromatografia lquida acoplada a
espectrometria de massa com electrospray ionization (LC-MS-ESI)

Paula VIANA & Pedro ANTUNES

a Introduo

Devido s propriedades fsico-qumicas de parte dos denominados novos
pesticidas, nomeadamente baixa volatilidade, serem termoinstveis e elevada
polaridade, verificaram-se dificuldades na identificao e confirmao por GC-MS.
A utilizao do sistema LC-MS (cromatografia lquida - espectrometria de massa)
possibilita, nestes casos, a obteno de bons resultados analticos qualitativos e
quantitativos usando como interface ESI (electrospray ionization) ideal para compostos
polares.
A maioria dos mtodos de cromatografia lquida usa, como detector, o UV
(ultravioleta), mas o detector de MS (espectrometria de massa) tem a vantagem de
possibilitar a confirmao destes pesticidas.
Para a extraco de resduos de pesticidas das amostras de gua recorreu-se
tcnica de extraco em fase slida (SPE).


b Material e Mtodos

b.1 Herbicidas cicloxidime e profoxidime

Foi implementado em rotina o mtodo de anlise para os herbicidas cicloxidime e
profoxidime. Este mtodo consistiu numa extraco em fase slida por cartuchos
OSIS seguido de anlise por LC-ESI-MS. Foram analisadas 291 amostras para estes
herbicidas.

b.1.1 Aspectos gerais

Tipo de amostra
Este mtodo aplica-se a guas superficiais, subterrneas, residuais, industriais e
municipais.

Princpio do mtodo
Os herbicidas cicloxidime e profoxidime so obtidos da matriz atravs de um
processo de extraco em fase slida (SPE), utilizando cartuchos OSIS. Estes
cartuchos de extraco so limpos e condicionados com diclorometano, metanol e
gua desmineralizada. O extracto final, em metanol concentrado a 0,5 ml. Os
analitos so identificados e quantificados por Cromatografia Lquida de Alta Resoluo
acoplado a um detector de massa com ionizao por electrospray (LC-ESI-MS,
negative mode).

Gama de aplicao
Este mtodo foi desenvolvido para a determinao de herbicidas. Os seguintes
analitos podem ser determinados por este mtodo: cicloxidime e profoxidime.
A gama de aplicao para 500 mL de amostra, de 30 ng/L a 400 ng/L.

Amostragem e conservao
As amostras devem ser recolhidas em frascos de vidro escuro de 1 L e
refrigeradas entre 4 a 10C durante o perodo de transporte e armazenamento. O pH
das amostras deve ser mantido entre 6 e 8.
O volume necessrio para cada determinao de 500 ml de amostra.
A extraco deve ser realizada num perodo mximo de 48 horas e a injeco deve
ser efectuada at 7 dias aps a extraco.


b.1.2 Equipamento e material

Equipamento
- Cromatgrafo Lquido de Alta Resoluo acoplado a um detector de massa com
ionizao por electrospray (LC-ESI-MS).
- Coluna de Octadecil Zorbax SB-C18 (4,6 150 mm e tamanho de poro de 5 m).
- Balana analtica de classe I.
- Estufa de secagem.
- Mufla
- Rampa de extraco para discos de 47 mm.
- Bomba de vcuo.
- Concentrador de amostras por corrente de azoto.

Material
- Bales volumtricos de 25 e 10 ml, classe A com certificado de conformidade H.
- Provetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Pipetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Funis.
- Tubos de concentrao (tipo Kuderna-Danish).
- Micro-seringas com capacidade varivel (entre 5 l e 2,5 ml).
- Vials com capacidade de 2 ml prprios para injector automtico.
- Filtros de 0,45 m.

b.1.3 Limpeza do material de vidro

Aps ser usado, o material de vidro deve ser passado com o ltimo solvente nele
utilizado. De seguida procede-se a uma lavagem com detergente comercial apropriado
e gua quente, sendo os tubos de concentrao lavados em mquina. Por ltimo, o
material de vidro deve ser seco numa estufa a 60C. O material no volumtrico
descontaminado numa mufla durante cerca de 15 minutos temperatura de 400C
(procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002).

b.1.4 Reagentes

- Metanol (para HPLC) e diclorometano (p.a).
- Azoto N50 de elevado grau de pureza analtico a 99,999%.

Padres dos herbicidas cicloxidime e profoxidime
Todos os padres destes herbicidas devem apresentar um grau de pureza superior
a 99% e de preferncia serem certificados.
As solues padro so preparadas pesando rigorosamente uma determinada
massa de padro puro, esta dissolvida em metanol num balo volumtrico de 10 ml.
As solues padro devem ser guardadas a 4C, protegidas da luz e verificada a
perda de solvente, atravs de pesagem.

b.1.5 Tcnica

Extraco em fase slida
Medir numa proveta 500 ml de amostra e verificar com fita de pH se este se
encontra entre o 6 e 8. Colocar em suporte adequado um cartucho OSIS. Lavar o
cartucho com 1 ml de diclorometano. Usando o vcuo passar cerca de metade do
solvente pelo cartucho e deix-lo ensopar durante cerca de um minuto. Usar o vcuo
para fazer passar o restante diclorometano e deixar secar o cartucho.
Condicionar o cartucho atravs da adio de 1 ml de metanol fazendo passar
cerca de metade usando o vcuo. Deixar ensopar o cartucho durante um minuto e
com o uso do vcuo fazer passar quase todo o metanol reminescente, deixando
apenas 2 a 3 mm na superfcie do cartucho. Adicionar 1 ml de uma gua
desmineraliza ao cartucho e iniciar o vcuo de modo a eliminar o metanol, deixando
apenas 3 a 5 mm de gua na superfcie do cartucho. Adicionar a amostra e iniciar o
vcuo. Fazer passar toda a amostra atravs do cartucho to depressa quanto o vcuo
o permita.
Colocar um frasco de vidro de tamanho apropriado para recolher o extracto.
Adicionar 5 ml de metanol (em duas alquotas de 2,5 ml) para eluir os herbicidas
cicloxidime e profoxidime do cartucho. Utilizar para esse efeito uma pipeta com ponta
de teflon, lavando bem as paredes do reservatrio. Deixar passar cerca de um tero
do metanol pelo cartucho e deixar ficar o restante a pingar sob aco da gravidade at
todo o metanol ter passado.
Evaporar sob corrente de azoto o extracto obtido at 0,5 ml.

Preparao das curvas de calibrao
A partir das solues padro, preparar por diluio, uma soluo padro primria
combinada em metanol. Preparar as solues de trabalho em metanol, de modo que
as concentraes caiam dentro do intervalo de linearidade do detector e das
concentraes esperadas para as amostras a analisar.


Cromatografia lquida de alta resoluo (LC-ESI-MS)
As amostras devem ser transferidas dos tubos de concentrao para vials de 2 ml
prprios para injeco automtica no aparelho HP1100 Series, filtrando-as (quando
necessrio) atravs de filtros de 0,45 m resistentes a solventes orgnicos.
A anlise por LC-ESI-MS deve contemplar: uma coluna de Octadecil Zorbax SB-
C18; a fase mvel constituda por metanol e gua, devendo as condies de
gradiente serem testadas de modo a obter-se uma boa separao dos herbicidas a
analisar. A escolha das razes m/z para cada analito basear-se- na sua intensidade,
optimizando deste modo a deteco dos analitos.

Este mtodo apresenta como vantagens:

- Tempo de anlise relativamente rpido (cerca de 30 minutos).
- Boa separao dos analitos.
- Alta sensibilidade ao usar-se um detector de massa (em modo SIM, single
ion monitoring).

b.1.6 Ensaios em branco

Realizar ensaios em branco, utilizando todo o material de vidro e solventes
envolvidos no processo analtico. Seguir o mesmo procedimento que nas amostras.
Avaliar o grau de contaminao do material, dos solventes e do laboratrio. Ver
procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002.

b.1.7 Tratamento dos resultados de LC-ESI-MS

Identificar os herbicidas cicloxidime e profoxidime pelos tempos de reteno e
pelas relaes m/z de cada um. O Clculo das concentraes finais de cada analito na
amostra feito recorrendo curva de calibrao e ao factor de diluio da amostra.

b.1.8 Preciso

A preciso deste mtodo testada com ensaios de reprodutibilidade, durante
algumas semanas.



b.1.9 Validao do mtodo

Neste mtodo a eficincia do processo de extraco tem de ser determinada para
cada composto atravs de ensaios de recuperao para os vrios nveis de
concentrao, os quais devem abranger a gama de concentrao das curvas de
calibrao. Recalibrar o equipamento sempre que se realizar anlises de amostras.
Determinar a repetibilidade do mtodo.
Calcular os limites de deteco e quantificao. Utilizar padres de verificao
(quando no for possvel o uso de materiais de referncia certificados como padro de
controlo) e construir cartas de controlo. Dever ser injectado um padro de controlo
por cada srie de 20 amostras. Verificar sempre que se preparam novas curvas de
calibrao se o declive se mantm (o critrio de aceitao para o declive das curvas
de calibrao dever sempre ter R >0,99). Participar em ensaios de intercalibrao de
modo a testar a eficincia de todo o processo de anlise (as percentagerns de
recuperao devem ser superiores a 75% para todos os analitos em estudo).
Tanto o cicloxidime como o profoxidime, na presena de solventes polares como a
gua e o metanol, existem sob duas formas isomricas, o E-oxime e o Z-oxime. Este
facto pode ser comprovado atravs dos cromatogramas dos padres, onde se verifica
que o cicloxidime e o profoxidime apresentam dois picos com a mesma massa mas
com tempos de reteno diferentes.

Analito Fragmento de quantificao Fragmento de identificao
cicloxidime 324 325
profoxidime 464 466

b.1.10 Recuperaes e limites de deteco do mtodo

Em relao ao cicloxidime e profoxidime, a metodologia analtica utiliza 500 ml de
amostra e consiste numa extraco em fase slida com cartuchos OSIS. Para a
eluio deste analitos utiliza-se o metanol (duas tomas - 2 x 2,5 ml). A identificao e
quantificao dos analitos feita por cromatografia, para tal, utiliza-se um
cromatgrafo lquido com ionizao por electrospray e deteco por massa (LC-ESI-
MS). Foram realizados vrios ensaios de recuperao de amostras fortificadas com
diferentes concentraes. Na tabela seguinte apresentam-se os resultados obtidos
para estes ensaios.


Analito LD
ng/l
Recuperao
E 1 (%)
Recuperao
E 2 (%)
Recuperao
E 3 (%)
Recuperao
E 4 (%)
Recuperao
Mdia (%)
cicloxidime <14 86 83 89 79 84
profoxidime <8 80 82 83 94 85

Para determinar os limites de deteco procedeu-se a 10 injeces do padro
mais baixo, correspondente ao 1 padro da curva de calibrao e determinou-se o
desvio padro associado a estes ensaios. Depois de calculado o desvio padro,
multiplica-se o valor obtido por um factor k (assume-se que k=3,27). O valor obtido
corresponde ao limite de deteco para o analito em estudo. Em termos matemticos:
LD =SD . 3,27

b.2 Herbicidas MCPA e triclorpir (herbicidas cidos)

Para o MCPA e triclorpir, do grupo dos herbicidas cidos, foi implementado em rotina
um mtodo que se baseia numa extraco em fase slida por discos (SDB-XC)
seguido de anlise por LC-ESI-MS. Foram analisadas 221 amostras para o MCPA e
70 para o triclorpir.

b.2.1 Aspectos gerais

Tipo de amostra
Este mtodo aplica-se a guas superficiais, subterrneas, residuais, industriais e
municipais.

Princpio do mtodo
Os herbicidas cidos so dos pesticidas mais utilizados. Os herbicidas cidos so
obtidos da matriz atravs de um processo de extraco em fase slida (SPE),
utilizando discos de benzenodivinilestireno (SDB-XC). Estes discos de extraco so
limpos e condicionados com diclorometano, metanol e uma soluo aquosa de cido
frmico (2%). O extracto final, em metanol concentrado a 0,3 ml e adiciona-se uma
soluo aquosa de cido frmico (2%) at perfazer 1 ml. Os analitos so identificados
e quantificados por Cromatografia Lquida de Alta Resoluo acoplado a um detector
de massa com ionizao por electrospray (LC-ESI-MS, negative mode).



Gama de aplicao
Este mtodo foi desenvolvido para a determinao de herbicidas cidos. Os
seguintes analitos podem ser determinados por este mtodo: bentazona, 2,4-D,
MCPA, diclorprope, 2,4,5-T e MCPP.
A gama de aplicao para 500 mL de amostra, de 60 ng/L a 400 ng/L.

Amostragem e conservao
As amostras devem ser recolhidas em frascos de vidro escuro de 1 L e
refrigeradas entre 4 a 10C durante o perodo de transporte e armazenamento. O pH
das amostras deve ser mantido entre 1 e 2. Para esse efeito deve ser adicionado
HNO
3
ou HCl.
O volume necessrio para cada determinao de 500 ml de amostra.
A extraco deve ser realizada num perodo mximo de 48 horas e a injeco deve
ser efectuada at 7 dias aps a extraco.

b.2.2 Equipamento e material

Equipamento
- Cromatgrafo Lquido de Alta Resoluo acoplado a um detector de massa com
ionizao por electrospray (LC-ESI-MS).
- Coluna de Hypersil (2,1 100 mm e tamanho de poro de 5 m).
- Balana analtica de classe I.
- Estufa de secagem.
- Mufla
- Rampa de extraco para discos de 47 mm.
- Bomba de vcuo.
- Concentrador de amostras por corrente de azoto.

Material
- Bales volumtricos de 25 e 10 ml, classe A com certificado de conformidade H.
- Provetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Pipetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Funis.
- Tubos de concentrao (tipo Kuderna-Danish).
- Micro-seringas com capacidade varivel (entre 5 l e 2,5 ml).
- Vials com capacidade de 2 ml prprios para injector automtico.
- Filtros de 0,45 m.

b.2.3 Limpeza do material de vidro

Aps ser usado, o material de vidro deve ser passado com o ltimo solvente nele
utilizado. De seguida procede-se a uma lavagem com detergente comercial para
laboratrio e gua quente, sendo os tubos de concentrao lavados em mquina. Por
ltimo, o material de vidro deve ser seco numa estufa a 60C. O material no
volumtrico descontaminado numa mufla durante cerca de 15 minutos temperatura
de 400C (procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002).

b.2.4 Reagentes

- Metanol (para HPLC), diclorometano (p.a) e cido frmico (p.a).
- Azoto N50 de elevado grau de pureza analtico (99,999%).

Padres de herbicidas cidos
Todos os padres dos vrios herbicidas devem apresentar um grau de pureza
superior a 99% e de preferncia serem certificados.
As solues padro so preparadas pesando rigorosamente uma determinada
massa de padro puro, sendo esta dissolvida em metanol num balo volumtrico de
10 ml.
As solues padro devem ser guardadas a 4C, protegidas da luz e verificada a
perda de solvente, atravs de pesagem.

b.2.5 Tcnica

Extraco em fase slida
Medir numa proveta 500 ml de amostra e verificar com fita de pH se este se
encontra entre o 1 e 2. Colocar em suporte adequado um disco de SDB-XC. Lavar o
disco com 5 ml de diclorometano. Usar o vcuo para passar cerca de metade do
solvente pelo disco e deix-lo ensopar durante cerca de um minuto. Usar novamente o
vcuo para fazer passar o restante diclorometano e deixar secar o disco.
Condicionar o disco atravs da adio de 5 ml de metanol fazendo passar cerca de
metade usando o vcuo. Deixar ensopar o disco durante um minuto e com o uso do
vcuo fazer passar quase todo o metanol reminescente, deixando apenas 3 a 5 mm na
superfcie do disco. Adicionar 5 ml de uma soluo aquosa de cido frmico (2%) ao
disco e iniciar o vcuo de modo a eliminar o metanol, deixando apenas 3 a 5 mm da
soluo cida na superfcie do disco. Adicionar a amostra e iniciar o vcuo. Fazer
passar toda a amostra atravs do disco to depressa quanto o vcuo o permita.
Remover o sistema de filtrao do suporte metlico e colocar um frasco de vidro de
tamanho apropriado para recolher o extracto. Adicionar 10 ml de metanol (em duas
alquotas de 5 ml) para eluir herbicidas cidos do disco. Utilizando para esse efeito
uma pipeta com ponta de teflon, lavando bem as paredes do reservatrio. Deixar
passar cerca de um tero do metanol pelo disco e deixar ficar o restante a gotejar sob
aco da gravidade at todo o metanol ter passado.
Evaporar sob corrente de azoto o extracto obtido at 0,3 ml. Adicionar uma
soluo aquosa de cido frmico (2%) at perfazer o volume final de 1 ml.

Preparao das curvas de calibrao
A partir das solues padro me, preparar por diluio, uma soluo padro
intermdia de trabalho combinada em soluo aquosa de cido frmico (2%). Preparar
as solues de trabalho com cido frmico (2%) e de modo a que as concentraes
caiam dentro do intervalo de linearidade do detector e das concentraes esperadas
nas amostras a analisar.

Cromatografia lquida de alta resoluo (LC-ESI-MS)
As amostras devem ser transferidas dos tubos de concentrao para vials de 2 ml
prprios para injeco automtica no aparelho HP1100 Series, filtrando-as (quando
necessrio) atravs de filtros de 0,45 m resistentes a solventes orgnicos.
A anlise por LC-ESI-MS deve contemplar: uma coluna de Hypersil; a fase mvel
constituda por metanol e uma soluo aquosa de cido frmico (2%), devendo as
condies de gradiente serem testadas de modo a obter-se uma boa separao dos
herbicidas cidos a analisar. A escolha das razes m/z para cada analito basear-se-
na sua intensidade, optimizando deste modo a deteco dos analitos.

Este mtodo apresenta como vantagens:

- Tempo de anlise relativamente rpido (cerca de 16 minutos).
- Boa separao dos analitos.
- Alta sensibilidade ao usar-se um detector de massa (em modo SIM, single
ion monitoring).





b.2.6 Ensaios em branco

Realizar ensaios em branco, utilizando todo o material de vidro e solventes
envolvidos no processo analtico. Seguir o mesmo procedimento que para as
amostras. Avaliar o grau de contaminao do material, dos solventes e do laboratrio.
Ver procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002.

b.2.7 Tratamento dos resultados de LC-ESI-MS

Identificar os herbicidas cidos pelos tempos de reteno e pelas relaes m/z de
cada um. O Clculo das concentraes finais de cada analito na amostra executado
recorrendo curva de calibrao e ao factor de diluio da amostra.

b.2.8 Preciso

A preciso deste mtodo testada com ensaios de reprodutibilidade, durante
algumas semanas.

b.2.9 Validao do mtodo

Neste mtodo a eficincia do processo de extraco tem de ser determinada para
cada composto atravs de ensaios de recuperao para os vrios nveis de
concentrao, os quais, devem abranger a gama de concentrao das curvas de
calibrao. Recalibrar o equipamento sempre que se realizar anlises de amostras.
Determinar a repetibilidade do mtodo. Calcular os limites de deteco e
quantificao.
Utilizar padres de verificao (quando no for possvel o uso de materiais de
referncia certificados como padro de controlo) e construir cartas de controlo. Dever
ser injectado um padro de controlo por cada srie de 20 amostras.
Verificar sempre que se preparam novas curvas de calibrao se o declive se
mantm (o critrio de aceitao para o declive das curvas de calibrao dever
sempre abranger um R >0,99).
Participar em ensaios de intercalibrao de modo a testar a eficincia de todo o
procedimento (as percentagerns de recuperao devem ser superiores a 75% para
todos os analitos em estudo).



Analito Fragmento de quantificao Fragmento de identificao
MCPA 199 201
triclorpir 196 254

b.2.10 Recuperaes e limites de deteco do mtodo

Em relao ao MCPA e ao triclorpir a extraco e a anlise efectua-se do
mesmo modo que para os restantes elementos da famlia dos herbicidas cidos. A
metodologia utiliza 500 ml de amostra e consiste numa extraco em fase slida com
discos de SDB-XC. Utiliza-se o metanol para a eluio dos analitos (duas tomas - 2 x 5
ml). A identificao e quantificao feita por cromatografia, para tal utiliza-se um
cromatgrafo lquido com ionizao por electrospray e deteco por massa (LC-ESI-
MS). Foram realizados vrios ensaios de recuperao de amostras fortificadas com
diferentes concentraes. Na tabela seguinte apresentam-se os resultados obtidos
para estes ensaios.

Analito LD
ng/l
Recuperao
E 1 (%)
Recuperao
E 2 (%)
Recuperao
E 3 (%)
Recuperao
E 4 (%)
Recuperao
E 5 (%)
Recuperao
Mdia (%)
MCPA <6 72 89 78 100 82 84
triclorpir <41 84 81 80 79 77 80

Para determinar os limites de deteco procedeu-se a 10 injeces do padro
mais baixo, correspondente ao 1 padro da curva de calibrao e determinou-se o
desvio padro associado a estes ensaios. Depois de calculado o desvio padro,
multiplica-se o valor obtido por um factor k (assume-se que k=3,27). O valor obtido
corresponde ao limite de deteco para o analito em estudo. Em termos matemticos:
LD =SD . 3,27

c Insecticida imidaclopride

Para o imidaclopride o mtodo implementado consiste numa extraco em fase
slida com discos (SDB-XC) seguido de anlise por LC-ESI-MS. Foram analisadas 10
amostras.





c.1 Aspectos gerais

c.1.1 Tipo de amostra

Este mtodo aplica-se a guas superficiais, subterrneas, residuais, industriais e
municipais.

c.1.2 Princpio do mtodo

Este analito obtido da matriz atravs de um processo de extraco em fase
slida (SPE), utilizando discos de benzenodivinilestireno (SDB-XC). Estes discos de
extraco so limpos e condicionados com diclorometano, metanol e gua
desmineralizada. O extracto final, em acetonitrilo concentrado a 0,5 ml. Os analitos
so identificados e quantificados por Cromatografia Lquida de Alta Resoluo
acoplado a um detector de massa com ionizao por electrospray (LC-ESI-MS,
negative mode).

c.1.3 Gama de aplicao

Este mtodo foi desenvolvido para a determinao do imidaclopride e a gama de
aplicao para 500 ml de amostra, de 100 ng/L a 600 ng/L.

c.1.4 Amostragem e conservao

As amostras devem ser recolhidas em frascos de vidro escuro de 1 L e
refrigeradas entre 4 a 10C durante o perodo de transporte e armazenamento. O pH
das amostras deve ser mantido entre o 6 e 8.
O volume necessrio para cada determinao de 500 ml de amostra.
A extraco deve ser realizada num perodo mximo de 48 horas e a injeco
deve ser efectuada at 7 dias aps a extraco.

c.2 Equipamento e material

c.2.1 Equipamento

- Cromatgrafo Lquido de Alta Resoluo acoplado a um detector de massa com
ionizao por electrospray (LC-ESI-MS).
- Coluna de Octadecil Zorbax SB-C18 (4,6 150 mm e tamanho de poro de 5 m).
- Balana analtica de classe I.
- Estufa de secagem.
- Mufla
- Rampa de extraco para discos de 47 mm.
- Bomba de vcuo.
- Concentrador de amostras por corrente de azoto.

c.2.2 Material

- Bales volumtricos de 25 e 10 ml, classe A com certificado de conformidade H.
- Provetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Pipetas graduadas de classe A com certificado de conformidade H.
- Funis.
- Tubos de concentrao (tipo Kuderna-Danish).
- Micro-seringas com capacidade varivel (entre 5 l e 2,5 ml).
- Vials com capacidade de 2 ml prprios para injector automtico.
- Filtros de 0,45 m.

c.3 Limpeza do material de vidro

Aps ser usado, o material de vidro deve ser passado com o ltimo solvente nele
utilizado. De seguida procede-se a uma lavagem com detergente comercial apropriado
e gua quente, sendo os tubos de concentrao lavados em mquina. Por ltimo, o
material de vidro deve ser seco numa estufa a 60C. O material no volumtrico
descontaminado numa mufla durante cerca de 15 minutos temperatura de 400C
(procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002).

c.4 Reagentes

- Metanol (para HPLC), acetonitrilo (para HPLC) e diclorometano (p.a).
- Azoto N50 de elevado grau de pureza analtico (99,999%).

c.4.1 Padres do imidaclopride

Todos os padres dos vrios analitos devem apresentar um grau de pureza
superior a 99% e de preferncia serem certificados.
As solues padro so preparadas pesando rigorosamente uma determinada
massa de padro puro, sendo esta dissolvida em metanol num balo volumtrico de
10 ml.
As solues padro devem ser guardadas a 4C, protegidas da luz e verificada a
perda de solvente, atravs de pesagem.

c.5 Tcnica

c.5.1 Extraco em fase slida

Medir numa proveta 500 ml de amostra e verificar com fita de pH se este se
encontra entre o 6 e 8. Colocar em suporte adequado um disco de SDB-XC. Lavar o
disco com 5 ml de diclorometano. Usar o vcuo passar cerca de metade do solvente
pelo disco e deix-lo ensopar durante cerca de um minuto. Usar novamente o vcuo
para fazer passar o restante diclorometano e deixar secar o disco.
Condicionar o disco atravs da adio de 5 ml de metanol fazendo passar cerca de
metade do volume usando o vcuo. Deixar ensopar o disco durante um minuto e com
o uso do vcuo fazer passar quase todo o metanol reminescente, deixando apenas 3 a
5 mm na superfcie do disco. Adicionar 5 ml de gua desmineralizada ao disco e iniciar
o vcuo de modo a eliminar o metanol, deixando apenas 3 a 5 mm de gua na
superfcie do disco. Adicionar a amostra e iniciar o vcuo. Fazer passar toda a amostra
atravs do disco to depressa quanto o vcuo o permita.
Remover o sistema de filtrao do suporte metlico e colocar um frasco de vidro de
tamanho apropriado para recolher o extracto. Adicionar 10 ml de acetonitrilo (em duas
alquotas de 5 ml) para eluir o imidaclopride do disco. Utilizar para esse efeito uma
pipeta com ponta de teflon, lavando bem as paredes do reservatrio. Deixar passar
cerca de um tero do acetonitrilo pelo disco e deixar ficar o restante a gotejar sob
aco da gravidade at todo o acetonitrilo ter passado.
Evaporar sob corrente de azoto o extracto obtido at 0,5 ml.

c.5.2 Preparao das curvas de calibrao

A partir das solues padro, preparar por diluio, uma soluo padro primria
combinada em acetonitrilo. Preparar as solues de trabalho em acetonitrilo, de modo
a que as concentraes caiam dentro do intervalo de linearidade do detector e das
concentraes esperadas das amostras a analisar.


c.5.3 Cromatografia lquida de alta resoluo (LC-ESI-MS)

As amostras devem ser transferidas dos tubos de concentrao para vials de 2 ml
prprios para injeco automtica no aparelho HP1100 Series, filtrando-as (quando
necessrio) atravs de filtros de 0,45 m resistentes a solventes orgnicos.
A anlise por LC-ESI-MS deve contemplar: uma coluna de octadecil Zorbax SB-
C18; a fase mvel constituda por acetonitrilo e gua, devendo as condies de
gradiente serem testadas de modo a obter-se uma boa separao das substncias a
analisar. A escolha das razes m/z para cada analito basear-se- na sua intensidade,
optimizando deste modo a deteco dos analitos.

Este mtodo apresenta como vantagens:

- Tempo de anlise relativamente rpido (cerca de 6 minutos).
- Alta sensibilidade ao usar-se um detector de massa (em modo SIM, single
ion monitoring).

c.6 Ensaios em branco

Realizar ensaios em branco, utilizando todo o material de vidro e solventes
envolvidos no processo analtico. Seguir o mesmo procedimento para as amostras.
Avaliar o grau de contaminao do material, dos solventes e do laboratrio. Ver
procedimento 3.013.LAB, edio 1, reviso 3 de 16/04/2002.

c.7 Tratamento dos resultados de LC-ESI-MS

Identificar os analitos pelos tempos de reteno e pelas relaes m/z de cada um.
O Clculo das concentraes finais de cada analito na amostra feito recorrendo
curva de calibrao e ao factor de diluio da amostra.

c.8 Preciso

A preciso deste mtodo testada com ensaios de reprodutibilidade, durante
algumas semanas.



c.9 Validao do mtodo

Neste mtodo a eficincia do processo de extraco tem de ser determinada para
o analito atravs de ensaios de recuperao para os vrios nveis de concentrao, os
quais, devem abranger a gama de concentrao das curvas de calibrao. Recalibrar
o equipamento sempre que se realizar anlises de amostras.
Determinar a repetibilidade do mtodo. Calcular os limites de deteco e
quantificao. Utilizar padres de verificao (quando no for possvel o uso de
materiais de referncia certificados como padro de controlo) e construir cartas de
controlo. Dever ser injectado um padro de controlo por cada srie de 20 amostras.
Verificar sempre que se prepara novas curvas de calibrao se o declive se
mantm (o critrio de aceitao para o declive das curvas de calibrao dever
sempre ser R >0,99).

Analito Fragmento de quantificao Fragmento de identificao
imidaclopride 254 256

c.10 Recuperaes e limites de deteco do mtodo

A tcnica analtica para a determinao do imidaclopride utiliza 500 ml de
amostra e consiste numa extraco em fase slida com discos de C18. Usa-se o
acetonitrilo para a eluio deste analito (duas tomas - 2 x 5 ml). A identificao e
quantificao feita por cromatografia, para tal, utiliza-se um cromatgrafo lquido com
ionizao por electrospray e deteco por massa (LC-ESI-MS). Foram realizados
vrios ensaios de recuperao de amostras fortificadas com diferentes concentraes.
Na tabela seguinte apresentam-se os resultados obtidos para estes ensaios.

Analito LD
ng/l
Recuperao
E 1 (%)
Recuperao
E 2 (%)
Recuperao
E 3 (%)
Recuperao
E 4 (%)
Recuperao
E 5 (%)
Recuperao
Mdia (%)
imidaclopride <25 89 87 82 89 79 85

Para determinar os limites de deteco procedeu-se a 10 injeces do padro
mais baixo, correspondente ao 1 padro da curva de calibrao e determinou-se o
desvio padro associado a estes ensaios. Depois de calculado o desvio padro,
multiplica-se o valor obtido por um factor k (assume-se que k=3,27). O valor obtido
corresponde ao limite de deteco para o analito em estudo. Em termos matemticos:
LD =SD . 3,27

d Insecticida tiametoxame

Relativamente ao insecticida tiametoxame, foi igualmente desenvolvido um mtodo
analtico cujos resultados no foram os esperados.

d.1 Ensaios de recuperao

Este insecticida muito polar pelo que o mtodo de extraco usado para este tipo
de molcula no conseguiu obter recuperaes aceitveis.
Foram realizados os seguintes ensaios:
- 3 ensaios com discos de C18:
utilizao dos seguintes solventes para a eluio de um volume de 500 mL
fortificado com 500 uL de um padro de 200ug/L:
10 mL de metanol
10 mL de acetonitrilo
10 mL de diclorometano
Os resultados obtidos para as recuperaes foram da ordem dos 10%.

Foram realizados mais 3 ensaios com discos mais polares os SDB-XC:
A fortificao foi a mesma assim como os solventes usados.
Os resultados obtidos para as recuperaes foram da ordem dos 20 %.

Para os ltimos ensaios realizados, utilizaram-se os 2 discos (C18 e SDB-XC) para
500 mL de volume de amostra fortificada com 500 uL de padro de 200 ug/L e usou-se
para a eluio os seguintes gradientes de solventes:
10 mL de acetonitrilo +5 mL de metanol
10 mL de acetonitrilo +5 mL de diclorometano
Para este caso as recuperaes foram da ordem dos 20%.

Finalmente, realizaram-se mais 3 ensaios com o objectivo de averiguar a influncia
do pH na extraco, para tal foram usados discos de SDB-XC e conduzidas trs
extraces de 500 ml de amostra fortificada com 500 ml de um padro contendo 200
ug/L em tiametoxame. Procedeu-se a trs extraces de amostras com diferentes pH:
- 500 mL de amostra fortificada com 500 uL de um padro de 200 ug/L em
tiametoxame com pH =2 ajustado com H
3
PO
4
(85%), eluio com 10 mL
de metanol +5 mL de acetonitrilo.
- 500 mL de amostra fortificada com 500 uL de um padro de 200 ug/L em
tiametoxame com pH =7, eluio com 10 mL de diclorometano.
- 500 mL de amostra fortificada com 500 uL de um padro de 200 ug/L em
tiametoxame com pH =12 ajustado com NaOH (6 M), eluio com 10 mL
de metanol +5 mL de acetonitrilo.

Os valores de recuperao para os primeiros dois ensaios foram da ordem dos 10
% enquanto que no ltimo ensaio verificou-se a obteno de um pico do mesmo
fragmento do tiametoxame mas com um tempo de reteno diferente no se podendo
desta forma confirmar que seja o tiametoxame (provavelmente ser o tiametoxame
hidrolizado).