BioPhotometer Bedienungsanleitung Operating Manual Mode d'emploi Istruzioni d'impiego Manual de Instrucciones

Bedienungsanleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Operating Manual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Mode demploi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Istruzioni d'impiego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 Manual de Instrucciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 EG-Konformittserklrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 EG Conformity Declaration Dclaration de conformit Dichiarazione di conformit CE Declaracin de conformidad CEE

Nachdruck und Vervielfltigung auch auszugsweise nur mit Genehmigung. No part of this publication may be reproduced without the prior permission of the copyright owner. Toute reproduction, complte ou partielle et quel que soit le prod est interdiete, sauf autorisation expresse de notre part Ristampa e riproduzione anche di estratti solo con autorizzazione. Reimpresin y copia incluso parciales slo con autorizacin. Copyright 2000 by Eppendorf AG, Hamburg

B 6131 900.102-06/1002

Inhaltsverzeichnis

1 2 3 4 4.1 4.2 4.3 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 6.1 6.2 6.3 6.4 7 8 9 10 11 12 12.1 12.2 12.3 12.4 13

berblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Technische Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Sicherheitsmanahmen und Gefahrenhinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Installation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 BioPhotometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Drucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Kvetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Bedienung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tastatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung von Nukleinsuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung von Proteinen direkt photometrisch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung von Proteinen nach Reagenzzugabe (Bradford, BCA, Lowry) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung von OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messung von verdnnten Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ndern der Probennummer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Programmierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Programmierablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Parameterbersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Erluterung der Parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ab Werk programmierte Werte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 11 13 15 17 20 21 22 23 23 25 26 28

Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Fehlermeldungen, Ergebniskennzeichnungen und Hilfetexte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Reinigung und Wartung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Kurzanleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Bestellinformationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nukleinsuren (dsDNA, ssDNA, RNA, Oligo). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Protein direkt photometrisch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Protein mit Reagenzzugabe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 40 41 42 43

berprfung des Photometers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 Konformittsbescheinigung fr BioPhotometer 6131. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

1 berblick

8 2 7

3 1 2 3 4

5 5 6 7 8 Taste Dilution (Verdnnung) Taste Conversion (Umrechnung) Messtasten Kvettenschacht

Gerteanzeige 9 Methodentasten Taste Function (Gertefunktionen) Taste Parameter (Programmiertaste)

Netzschalter, Netz- und Druckeranschluss benden sich auf der Gerterckseite (siehe Kapitel 4 "Installation"). Das BioPhotometer von Eppendorf dient der schnellen, einfachen und komfortablen Messung der wichtigsten Methoden im molekularbiologischen und biochemischen Forschungslabor. Kvetten In den Kvettenschacht knnen handelsbliche Rechteckkvetten aus Glas oder Kunststoff, die bei den jeweiligen Messwellenlngen optisch durchlssig sind, eingesetzt werden. Mit der UVette von Eppendorf knnen Sie erstmals auch Nukleinsuren in einer Kunststoffkvette messen. Die Hhe des Messfensters (8,5 mm)s sowie die Gesamthhe (min. 36 mm) sind bei der Auswahl der Kvetten zu beachten (siehe Kap. 10 "Kurzanleitung"). Um korrekte und przise Ergebnisse zu erhalten, ist es erforderlich, dass die Kvetten sehr sauber sind und die Messssigkeit partikelfrei ist. Zum Schutz des Kvettenschachtes vor Staub bei Nichtgebrauch wird ein Verschluss mitgeliefert.

1 berblick

Methoden

Zwlf Methoden sind ab Werk vorprogrammiert und werden auf Tastendruck aufgerufen: Nukleinsuren dsDNA ssDNA RNA Oligo Proteine Protein Bradford Bradford micro Lowry Lowry micro BCA BCA micro Bakteriendichte OD 600 doppelstrngige DNA einzelstrngige DNA RNA Oligonukleotide direkte photometrische Messung Bradford-Methode Bradford-Methode, niedriger Konzentrationsbereich Lowry-Methode Lowry-Methode, niedriger Konzentrationsbereich BCA-Methode BCA-Methode, niedriger Konzentrationsbereich Trbungsmessung

Methodenprogramm

Fr jede Methode ist ein zugehriges Programm, in dem Parameter wie Konzentrationseinheiten und Art der Auswertung festgelegt sind, ab Werk gespeichert. Die Methodenprogramme knnen jederzeit nach Aufruf der Taste Parameter gendert werden. Bevor Sie das erste Mal eine Methode benutzen, sollten Sie das entsprechende Methodenprogramm aufrufen und wenn erforderlich an Ihre Erfordernisse anpassen. Fr Methoden, die mit einer Standardreihe ausgewertet werden, sollten beispielsweise die Anzahl und die Sollkonzentrationen der Standards angepasst werden. Zur Messung wird die gewnschte Methode mit der zugehrigen Methodentaste aufgerufen. Fr die Methoden Bradford, Lowry und BCA gilt eine Besonderheit: Fr jede dieser Methoden knnen jeweils zwei verschiedene Auswertebereiche programmiert werden. Zwischen den beiden Methodenprogrammen (z. B. "BCA" und "BCA micro") wird durch wiederholtes Drcken der Methodentaste hin- und hergeschaltet. Die Messung wird durch eine der drei ovalen Messtasten gestartet. Das Gert ist nach Einschalten sofort messbereit. Welche der drei Messtasten jeweils fr eine Messung freigegeben ist, sehen Sie im unteren Teil der Gerteanzeige (Beschreibung des Messablaufs siehe Kapitel 5 "Bedienung").

Messung

Auswertung

Zur automatischen Auswertung der Messung werden methodenspezisch programmierte Auswerteverfahren (Faktor, Kalibration, Warburg-Formel oder auch direkte Extinktionsausgabe) benutzt. Neben den berechneten Ergebnissen werden die Extinktionen und fr Nukleinsuren die gngigen Extinktionsquotienten auf einen Blick angezeigt. Auch Probenverdnnungen knnen in die Auswertung einbezogen werden (Taste Dilution ). ber die Taste Conversion knnen fr Nukleinsuren die berechneten Massenkonzentrationen in molare Konzentrationen umgerechnet werden. Weiterhin kann ber diese Taste die gesamte Probenmenge ("Ausbeute") im Probenvorratsgef berechnet werden.

Ergebnisausgabe

Die Ergebnisse werden ber die Gerteanzeige und ber den Drucker (sofern angeschlossen) ausgegeben. Fr die Auswertung der Ergebnisse ber ein Tabellenkalkulationsprogramm an Ihrem Computer ist ein Datentransfer-Programm bei Eppendorf erhltlich (vgl. Kapitel 11 "Bestellinformationen"). Proben- und Kalibrationsergebnisse werden gespeichert; die gespeicherten Daten knnen ber die Taste Function abgerufen werden.

2 Technische Daten

Photometer Optisches System: Strahlungsquelle: Spektrale Zerlegung: Messwellenlngen: Wellenlngenwahl: Spektrale Bandbreite: Systematische Messabweichung der Wellenlnge: Photometrischer Messbereich:

Absorption-Einstrahlphotometer mit Referenzstrahl und mehreren festen Wellenlngen Xenon-Blitzlampe Holographisches Konkavgitter Xe 230, 260, 280, 320, 562, 595 nm Methodenabhngig, programmgesteuert 5 nm bei 230 bis 320 nm 7 nm bei 562 bis 595 nm 1 nm bei 230 bis 280 nm 2 nm bei 320 bis 595 nm Quarzglaskvette: 0,000 bis 3,000 E UVette (Eppendorf): 2,5 E bei 230 nm 2,6 E bei 260 nm 2,8 E bei 280 nm 2,9 E bei 320 nm 0,002 E bei 0 E 0,005 E bei 1 E 1 % bei 1 E 0,001 E < 0,05 % Silicium-Photodioden

Zufllige Messabweichung des Photometers: Systematische Messabweichung des Photometers: Ablesegenauigkeit: Falschlichtanteil: Strahlungsempfnger: Messablufe Messverfahren: Methodenabhngige Auswertung:

Endpunkt gegen Leerwert Extinktion Konzentration ber Faktor Konzentration ber Warburg-Formel Konzentration ber Kalibration mit 1 bis 10 Standards Einpunktkalibration (1 Standard) Lineare Regression (2 bis 10 Standards) Nichtlineare Regression (Polynom 3. Grades; 4 bzw. 5 bis 10 Standards, siehe Kapitel 12 Auswertung) 1x-, 2x- oder 3x-Bestimmung Fr Nukleinsuren: Ratio 260/280 Ratio 260/230 Molare Konzentration Gesamtausbeute

Speicher Methodenspeicher: Kalibrationsspeicher: Ergebnisspeicher:

12 vorprogrammierte nderbare Methodenprogramme Fr alle Kalibrationsverfahren Fr 100 Ergebnisse mit Extinktions- und Ratio-Werten, Proben-Nummer, Probenverdnnung, Datum und Uhrzeit (Kalender bis 2090)
5

2 Technische Daten

Bedienung Kvettenmaterial: dsDNA, ssDNA, RNA, Oligo, Protein: Quarzglas oder Kunststoff (UVette von Eppendorf) OD 600, Bradford, Lowry, BCA: Glas oder Kunststoff 12,5 mm x 12,5 mm, untemperiert Min. 36 mm 8,5 mm Breite: 1 mm Hhe: 1,5 mm 19 Folientasten Beleuchtete Graphikanzeige 33 mm x 60 mm Deutsch, Englisch, Franzsisch ber Anzeige und Drucker Extinktion, Konzentration, Ratio

Kvettenschacht: Gesamthhe der Kvetten: Hhe des Lichtstrahls in der Kvette: Lichtbndel in der Kvette: Tastatur: Anzeige: Bedienerfhrung: Ergebnisausgabe:

Allgemeine Daten Spannungsversorgung: berspannungskategorie: Verschmutzungsgrad: Leistungsaufnahme / Leistungsabgabe: Stromaufnahme: Zulssige Netzunterbrechung: Sicherungen: Umgebungsbedingungen:

100 bis 240 V 10 %; 50 bis 60 Hz 5 % II (IEC 61010-1) 2 (IEC 664) Ca. 20 W im Betrieb, ca. 10 W im Standby < 0,3 A Ca. 10 ms bei 90 V Ca. 200 ms bei 220 V T 1 A / 250 V, 5 mm x 20 mm (2 Stck) 15 bis 35 C bei denierter Przision und Richtigkeit 25 bis 70 C auer Betrieb, Lagerung 15 bis 70 % relative Feuchte Nicht tropenfest Vor direktem Sonnenlicht schtzen RS 232 C, seriell Der anzuschlieende Drucker muss den Bestimmungen EN 60950 bzw. UL 1950 entsprechen. Gem VDE, CE, IEC 1010-1 Breite: 20 cm Tiefe: 32 cm Hhe: 10 cm 3 kg (verpackt: 29 cm) (verpackt: 43 cm) (verpackt: 20 cm) (verpackt: 4,8 kg)

Druckeranschluss:

Normen und Vorschriften: Abmessungen:

Gewicht:

Technische nderungen vorbehalten!

3 Sicherheitsmanahmen und Gefahrenhinweise

Vor Gebrauch des BioPhotometers machen Sie sich bitte mit der Bedienungsanleitung vollstndig vertraut. Fr das sichere Arbeiten mit dem Gert mssen die folgenden Punkte unbedingt beachtet werden: Technische Sicherheit Gert nicht ffnen. Flssigkeiten drfen nicht in das Gert gelangen. Vor Wartungsarbeiten oder Sicherungswechsel den Netzstecker ziehen. Lebensgefhrliche elektrische Spannungen im Inneren des Gerts. Das Gert darf nicht in explosionsgefhrdeten Rumen betrieben werden. Gert nicht benutzen, wenn es Schden aufweist, insbesondere, wenn das Netzkabel beschdigt ist. Reparaturen drfen nur vom Service der Eppendorf AG und autorisierten Vetragspartnern durchgefhrt werden. Das Gert muss an eine Steckdose mit Schutzleiter angeschlossen werden. Bei nicht bestimmungsgemem Gebrauch des Gerts kann die Schutzfunktion des Gerts beeintrchtigt sein. Umgang mit biologischem und chemischem Material Reagenzien und Verdnnungspuffer knnen Vertzungen und andere Gesundheitsschdigungen verursachen. Proben (Nukleinsuren, Proteine, Bakterienkulturen) knnen infektis sein oder andere Gesundheitsschdigungen verursachen. Bei der Probenvorbereitung, beim Messvorgang sowie bei der Reinigung oder Wartung des Gerts die im Labor erlassenen Schutzvorschriften (z. B. Schutzkleidung, Handschuhe, Desinfektion) fr den Umgang mit Probenmaterial beachten. Messlsungen und zur Reinigung und Desinfektion benutzte Materialien entsprechend den im Labor erlassenen Vorschriften entsorgen.

4 Installation

Lieferumfang

BioPhotometer Netzkabel fr BioPhotometer Bedienungsanleitung mit Kurzanleitung Kvettenschacht-Verschluss

4.1 BioPhotometer
Gert anschlieen Platzbedarf: Netzanschluss: Breite: 40 cm Tiefe: 50 cm Schutzkontaktsteckdose

Netzstecker des Gerts in Schutzkontaktsteckdose stecken. Einstellung der Spannung ist in dem Spannungsbereich, der in den Technischen Daten angegeben ist, nicht erforderlich, da sich das Gert in diesem Spannungsbereich selbst einstellt. Umgebungsbedingungen: siehe Technische Daten

Schutzfolie von der Gerteanzeige abziehen.

1 2

1 Netzschalter 2 Sicherungshalter 3 Netzanschluss

4 Serieller Druckeranschluss (RS 232 C)

4 Installation

4.2 Drucker
Drucker DPU 414 An die serielle Schnittstelle RS 232 C des BioPhotometers kann der Eppendorf Thermodrucker DPU 414 angeschlossen werden. (Drucker und Druckerkabel, siehe Kapitel 11 "Bestellinformationen"). Druckerkabel in die Druckeranschlussbuchse des BioPhotometers (siehe Abbildung) stecken und Sicherungsschrauben des Steckers festdrehen. Druckerkabel mit dem Drucker verbinden und Sicherungsschrauben des Steckers festdrehen. Mit Netzanschlusskabel 115 V oder 230 V an die Stromversorgung anschlieen. Druckerfunktion einstellen BioPhotometer In der Funktionsliste die Funktion "Drucker DPU 414" anwhlen und besttigen. Drucker DPU 414 Druckereinstellungen kontrollieren und ggf. fr den Gebrauch mit dem BioPhotometer einstellen, wie im Druckerbeilageblatt beschrieben. Druckereinstellungen fr die Arbeit mit dem BioPhotometer: Dip SW-1 1 (OFF) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (ON) : 6 (OFF) : 7 (ON) : 8 (ON) : Input = Serial Printing Speed = High Auto Loading = ON Auto LF = OFF Setting Command = Enable Printing Density = 100 %

Dip SW-2 Einstellungen durch den Anwender sind fr die Gruppe "Dip SW-2" nicht relevant, da das BioPhotometer diese Einstellungen in Abhngigkeit von der ausgewhlten Sprachversion automatisch vornimmt. Dip SW-3 1 (ON) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (OFF) : 6 (ON) : 7 (ON) : 8 (ON) : Data Length = 8 bits Parity Settings = No Parity Conditions = Odd Busy Control = XON/XOFF Baud Rate Select =9600 bps

4 Installation

Anderer Drucker

An die serielle Schnittstelle des BioPhotometers knnen auer dem DPU 414 auch andere serielle Drucker oder ber Adapterkabel parallele Drucker angeschlossen werden. BioPhotometer In der Funktionsliste die Funktion "Drucker seriell" anwhlen und besttigen. Drucker Anforderungen an den seriellen Drucker: Busy Control Baud Rate(ON) Data Bit Length Parity Permission Parity Conditions : : : : : XON/XOFF 9600 bps 8 bits Without Odd

Parallele Drucker knnen mit einem Adapterkabel angeschlossen werden, das die obigen Anforderungen erfllt.

4.3 Kvetten
In die Kvettenaufnahme knnen handelsbliche Rechteckkvetten eingesetzt werden, bei denen die Hhe des Messfensters bei 8,5 mm ber dem Kvettenboden und die Gesamthhe der Kvette bei mindestens 36 mm liegt (siehe Grak in der Kurzanleitung). Die Abmessungen des Lichtbndels in der Kvette sind 1,0 mm Breite und 1,5 mm Hhe. Zur Messung knnen Glas- oder Kunststoffkvetten eingesetzt werden, sofern sie bei der jeweiligen Messwellenlnge optisch durchlssig sind. Eppendorf bietet mit der UVette eine Kunststoffkvette an, die bei Wellenlngen bis zu 220 nm herunter transparent ist und damit auch fr die Messung von Nukleinsuren geeignet ist.

10

5 Bedienung

5.1 Tastatur
Photometer

Standard 7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford 0 Sample No. 8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

Function

9 RNA 6 Oligo 3 BCA Blank Sample

Conversion

Clear

Parameter

Dilution

Enter

7 dsDNA

Aufruf der Methode "doppelstrngige DNA" Eingabe der Ziffer 7

8 ssDNA

Aufruf der Methode "einzelstrngige DNA" Eingabe der Ziffer 8

9 RNA

Aufruf der Methode "RNA" Eingabe der Ziffer 9

6 Oligo

Aufruf der Methode "Oligonukleotide" Eingabe der Ziffer 6

4 Protein

Aufruf der Methode "Protein (direkte photometrische Messung)" Eingabe der Ziffer 4

1 Bradford

Aufruf der Methoden "Bradford" und "Bradford micro" Wechsel zwischen den Methoden "Bradford" und "Bradford micro" Eingabe der Ziffer 1 Aufruf der Methoden "Lowry" und "Lowry micro" Wechsel zwischen den Methoden "Lowry" und "Lowry micro" Eingabe der Ziffer 2

2 Lowry

11

5 Bedienung

3 BCA

Aufruf der Methoden "BCA" und "BCA micro" Wechsel zwischen den Methoden "BCA" und "BCA micro" Eingabe der Ziffer 3 Aufruf der Methode "OD 600 (Messung der Bakteriendichte)" Eingabe der Ziffer 5

5 OD 600

Parameter

Aufruf der Programmierebene Verlassen der Programmierebene

Function

Aufruf der Funktionsebene Verlassen der Funktionsebene Eingabe des Punktes ndern der Probennummer Eingabe der Ziffer 0

0 Sample No.

Dilution

Eingabe einer Verdnnung Bewegung des Cursors in die nchste Zeile (z. B. in der Parameter- oder Funktionsliste)

Conversion

Berechnen von molarer Konzentration und Gesamtmenge der Probe ("Ausbeute") Bewegung des Cursors in die vorhergehende Zeile (z. B. in der Parameter- oder Funktionsliste)

Clear

Lschung von Eingaben

Enter

Besttigung von Eingaben

Standard

Messung eines Standards

Blank

Messung eines Leerwertes

Sample

Messung einer Probe

12

5 Bedienung

5.2 Messung von Nukleinsuren

Die Beschreibung gilt fr die Methoden dsDNA ssDNA RNA Oligo

Methode aufrufen

7 dsDNA

dsDNA M E T H O D E N FA K TO R : 1 E 260 = 5 0 . 0 g/mL

Blank

oder

Sample

Auswertung Bei Gerteauslieferung sind fr die Nukleinsuremethoden blicherweise benutzte Faktoren fr die Umrechnung von Extinktion in Konzentration (in diesem Beispiel: 50) gespeichert. Die Faktoren knnen ber die Taste Parameter gendert werden (vgl. Kapitel Programmierung). Die Zahl der Nachkommastellen des einprogrammierten Faktors legt die Zahl der Nachkommastellen des Ergebnisses fest. Wird eine andere Konzentrationseinheit als g/mL gewhlt (z. B. g/ L), rechnet das BioPhotometer den Faktor intern um, um das korrekte Ergebnis auszugeben. Messlsungen mit geringeren Extinktionen als ca. 0,02 bis 0,03 E260 (entspricht einer DNA-Konzentration von ca. 1,0 bis 1,5 g/mL) sollten nicht eingesetzt werden, da bei diesen geringen Extinktionen der Einuss von Strungen wie kleinen Partikeln, Mikroblasen oder Trbungen auf das Messergebnis sehr gro ist und hug zu unzuverlssigen Ergebnissen fhrt. Messablauf Leerwertmessungen bleiben bis Datumswechsel gespeichert. Wurde bereits ein Leerwert am selben Tag gemessen, bietet das BioPhotometer daher nach Methodenaufruf in der letzten Zeile eine erneute Leerwertmessung oder aber direkt eine Probenmessung an. Wurde noch kein Leerwert gemessen, wird zunchst nur eine Leerwertmessung angeboten.
dsDNA BLANK E

Leerwert messen

Blank

0.000
Blank

oder

Sample

13

5 Bedienung

Probe messen

Sample

dsDNA

P RO B E 0 0 1 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 E 230 E260 E 280 E 320

70.0
1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Ergebnisanzeige Zustzlich zum Konzentrationsergebnis und der Extinktion bei der Messwellenlnge 260 nm werden als Anhaltspunkt fr die Reinheit der gemessenen Nukleinsureprobe die Extinktionen bei 3 weiteren Wellenlngen (230, 280 und 320 nm) sowie die Quotienten E 260/E 280 und E260/E 230 angezeigt. Die Extinktion bei 320 nm sollte bei reinen Proben nahe Null liegen. Trbe Messlsungen zeigen bei allen Messwellenlngen erhhte Extinktionen, die auch das Messergebnis verflschen knnen. In solchen Fllen kann durch Einschalten des Parameters "Korr. mit E320" (Kap. 6.3. "Erluterung der Parameter") der Einuss auf das Messergebnis teilweise korrigiert werden. Nchste Probe messen Probenverdnnung Zur Messung der nchsten Probe drcken Sie erneut die Taste Sample . Die Verdnnung der Probe in der Messkvette kann ber die Taste Dilution vor Beginn der Messung eingegeben und anschlieend vom Gert bei der Ergebnisberechnung bercksichtigt werden (vgl. Abschnitt "Messen von verdnnten Proben"). Das zuletzt gemessene Konzentrationsergebnis kann in molare Konzentrationen und / oder in Nukleinsuremengen (Masseneinheit oder Moleinheit) umgerechnet werden:
BERECH. MENGE: G E S A M T P RO B E L B E R E C H . M O L A R I T T: B A S E N PA A R E MOL.MASSE kDa

Taste Conversion

Conversion

Eingabe "GESAMT PROBE" Der eingegebene Wert wird mit der gemessenen Konzentration umgerechnet. Als Ergebnis wird die in der Probe vorhandene Nukleinsuremenge ausgegeben. Eingabe "BASENPAARE" bzw. "MOL.MASSE" Eine Eingabe in einer der beiden Zeilen ist ausreichend. Mit dem eingegebenen Wert und der gemessenen Konzentration wird die molare Konzentration errechnet. Nicht gewnschte Eingabefelder werden mit sprungen.
Enter

ber-

14

5 Bedienung

1 Bradford 4 Protein 0 Sample No. Enter

3 BCA 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

Anzeige nach Eingabe von "140 L Probevolumen" und "300 Basenpaaren":

dsDNA P RO B E 0 0 1 g/mL

70.0

353.5 pmol/mL 9.8 g 49.5 pmol

Enter

Die molare Konzentrationseinheit (hier: "pmol/mL") ist vorprogrammiert, kann aber ber die Taste Parameter ausgewhlt und gendert werden.

5.3 Messung von Proteinen direkt photometrisch

Methode aufrufen
4 Protein
P ROT E I N EXTINKTION

Blank

oder

Sample

Auswertung Bei Auslieferung ist fr die Methode "Protein" der Auswertemodus "Extinktion" gespeichert, d. h., es werden nur die direkt gemessenen Extinktionen ausgegeben. ber die Taste Parameter knnen als weitere Auswertemethoden Berechnungen ber Faktor Standard (Einpunktkalibration) Warburg-Formel programmiert werden (vgl. Kapitel 6 "Programmierung"). Die Zahl der Nachkommastellen des einprogrammierten Faktors bzw. der einprogrammierten Sollkonzentration des Standards legt die Zahl der Nachkommastellen des Ergebnisses fest. Bei der Programmierung des Faktors muss bercksichtigt werden, dass der Faktor an die Auswahl der Konzentrationseinheit angepasst werden muss. Messlsungen mit geringeren Extinktionen als ca. 0,02 bis 0,03 E280 sollten nicht eingesetzt werden, da bei diesen geringen Extinktionen der Einuss von Strungen wie kleinen Partikeln, Mikroblasen oder Trbungen auf das Messergebnis sehr gro ist und hug zu unzuverlssigen Ergebnissen fhrt.

15

5 Bedienung

Messablauf Das folgende Beispiel zeigt den Messablauf mit dem Auswertemodus "Extinktion". Zum Messablauf bei Auswertung ber Standard (Einpunktkalibration) vgl. Abschnitt "Messung von Proteinen nach Reagenzzugabe". Leerwertmessungen bleiben bis Datumswechsel gespeichert (Erluterung vgl. Abschnitt "Messen von Nukleinsuren").

Leerwert messen

Blank

P ROT E I N

BLANK E

0.000
Blank

oder

Sample

Probe messen

Sample

P ROT E I N

P RO B E 0 0 1 E 0 . 2 4 5 E260 0 . 4 3 0 E 280 0 . 0 0 2 E 320

0.430

Ergebnisanzeige Zustzlich zum Konzentrationsergebnis und der Extinktion bei der Messwellenlnge 280 nm werden E260 und E320 als Anhaltspunkt fr die Reinheit der gemessenen Proben angezeigt. Die Extinktion bei 320 nm sollte bei reinen Proben nahe Null liegen. Trbe Messlsungen zeigen bei allen Messwellenlngen erhhte Extinktionen, die auch das Messergebnis verflschen knnen. In solchen Fllen kann durch Einschalten des Parameters "Korr. mit E320" (Kap. 6.3 "Erluterung der Parameter") der Einuss auf das Messergebnis teilweise korrigiert werden. Nchste Probe messen Probenverdnnung Zur Messung der nchsten Probe drcken Sie erneut die Taste Sample . Die Verdnnung der Probe in der Messkvette kann ber die Taste Dilution vor Beginn der Messung eingegeben und anschlieend vom Gert bei der Ergebnisberechnung bercksichtigt werden (vgl. Abschnitt "Messen von verdnnten Proben").

16

5 Bedienung

5.4 Messung von Proteinen nach Reagenzzugabe (Bradford, BCA, Lowry)

Methode aufrufen
1 Bradford
K A L I B R AT I O N S B E R E I C H XXX XXX g/mL BRADFORD

Blank

oder

Standard

Wurde zu einem frheren Zeitpunkt bereits eine gltige und damit vom Gert gespeicherte Kalibration durchgefhrt, erscheinen Datum und Uhrzeit der gespeicherten Kalibration. In diesem Fall kann nach der Leerwertmessung entweder zunchst neu kalibriert werden oder aber direkt mit Probenmessungen begonnen und mit der frher gespeicherten Kalibration ausgewertet werden. Mikromethoden Fr die Methoden Bradford, Lowry und BCA gilt eine Besonderheit: Fr jede dieser Methoden knnen jeweils zwei verschiedene Konzentrationsbereiche programmiert werden. Zwischen den beiden Methoden (z. B. "BCA" und "BCA micro") wird durch wiederholtes Drcken der Methodentaste hin- und hergeschaltet. Auswertung Bei Auslieferung ist fr die Methoden Bradford, Lowry und BCA sowie fr die zugehrigen Mikromethoden als Auswertemodus ein Kalibrationsverfahren ber Mehrpunktkalibration und Berechnung einer Kalibrationskurve mittels nichtlinearer Regression gespeichert. ber die Taste Parameter knnen alternativ andere Auswertemethoden programmiert werden (vgl. Kapitel 6 "Programmierung"): Faktor (Berechnung von Konzentrationswerten mittels Faktor). Extinktion (gemessene Werte werden ohne weitere Auswertung nur als Extinktionswerte ausgegeben). Bei dem ab Werk vorprogrammierten Auswerteverfahren ber Standard knnen folgende Parameter gendert werden werden (vgl. Kapitel 6 "Programmierung"): Zahl der Standards (1 bis 10). Anzahl der Mehrfachmessungen pro Standard (1 bis 3). Auswerteverfahren bei Mehrpunktkalibration (lineare oder nichtlineare Kalibration). Sollkonzentrationen der Standards. Die Zahl der Nachkommastellen des einprogrammierten Faktors bzw. der einprogrammierten Sollkonzentration des ersten Standards legt die Zahl der Nachkommastellen des Ergebnisses fest. Soll ber Faktor ausgewertet werden, muss bei der Programmierung bercksichtigt werden, dass der Faktor an die Auswahl der Konzentrationseinheit angepasst werden muss.

17

5 Bedienung

Messablauf Leerwertmessungen bleiben bis Datumswechsel gespeichert (Erluterung vgl. Abschnitt "Messen von Nukleinsuren"). Standardmessungen bleiben unbegrenzt solange gespeichert, bis sie durch neue Standardmessungen berschrieben werden. Zur Auswertung von Probenmessungen wird jeweils die zuletzt gespeicherte Kalibration herangezogen. Im folgenden Beispiel wurde fr die Methode Bradford als Auswerteverfahren Mehrpunktkalibration mit 5 Standards in Doppelbestimmung und Kalibrationsberechnung ber nichtlineare Regression programmiert:
BRADFORD BLANK E

Leerwert messen

Blank

0.000
Blank

oder Sample

Standard

Standards messen

Standard

BRADFORD

STD 11 XXXX g/mL E

Standard 1 / 1. Messung

X.XXX
NCHSTER :

STD 12 XXXX g/mL

In den ersten beiden Zeilen der Anzeige ist der soeben gemessene Standard, in den letzten beiden Zeilen der als nchster zu messende Standard mit Sollkonzentration benannt.
BRADFORD STD 12 XXXX g/mL E

Standard

Standard 1 / 2. Messung

X.XXX
NCHSTER :

STD 21 XXXX g/mL

Gerteanzeige nach Abschluss aller Standardmessungen:

18

5 Bedienung

BRADFORD

STD 52 XXXX g/mL E

X.XXX
VK: 2.8%

K A L I B R AT I O N G E S P E I C H E RT

Der VK (Variationskoefzient) ist ein Ma fr die Streuung der Standardwerte um die Regressionskurve. Ist der VK kleiner als 10 %, wird die Kalibration automatisch gespeichert. Ist der VK grer als 10 %, erscheint die Frage "SPEICHERN? ENT/CLR" und Sie knnen die berechnete Kalibration akzeptieren oder lschen. Probenmessungen werden mit der jeweils letzten gltigen Kalibration ausgewertet.
BRADFORD P RO B E 0 0 1 g/mL X . X X X E5 9 5

Probe messen

Sample

X.XXX

Ergebnisanzeige Zustzlich zum Konzentrationsergebnis wird die Extinktion bei der Messwellenlnge (fr Bradford: 595 nm) angezeigt. Nchste Probe messen Probenverdnnung Zur Messung der nchsten Probe drcken Sie erneut die Taste Sample . Die Verdnnung der Probe in der Messkvette kann ber die Taste vor Beginn der Messung eingegeben und anschlieend vom Dilution Gert bei der Ergebnisberechnung bercksichtigt werden (vgl. Abschnitt "Messen von verdnnten Proben").

19

5 Bedienung

5.5 Messung von OD 600

Methode aufrufen
5 OD 600
OD600

Blank

oder

Sample

Messablauf Leerwertmessungen bleiben bis Datumswechsel gespeichert (Erluterung vgl. Abschnitt "Messen von Nukleinsuren").
OD600 BLANK E

Leerwert messen

Blank

0.000
Blank

oder

Sample

Probe messen

Sample

OD600

P RO B E 0 0 1 E

0.430

Nchste Probe messen Probenverdnnung

Zur Messung der nchsten Probe drcken Sie erneut die Taste Sample . Die Verdnnung der Probe in der Messkvette kann ber die Taste Dilution vor Beginn der Messung eingegeben und anschlieend vom Gert bei der Ergebnisberechnung bercksichtigt werden (vgl. Abschnitt "Messen von verdnnten Proben"). Die OD 600-Messung ist eine Streulichtmessung; das Ergebnis ist daher stark abhngig von der Geometrie des Lichtwegs, die sich bei Photometern verschiedener Hersteller unterscheiden kann.

20

5 Bedienung

5.6 Messung von verdnnten Proben

Probenverdnnungen knnen vor der Messung ber die Taste Dilution eingegeben werden. Bei der Ergebnisberechnung und -ausgabe wird dann der Verdnnungsfaktor automatisch bercksichtigt. Im folgenden Beispiel wurde bereits ein Leerwert gemessen:
dsDNA BLANK E

0.000
Blank

oder

Sample

Verdnnung eingeben

dsDNA

P RO B E 0 0 1

Dilution
P RO B E + D I L U E N T + L

2 Lowry 0 Sample No. Enter

1 Bradford 8 ssDNA 0 Sample No. Enter

dsDNA

P RO B E 0 0 1

2 0 + 1 8 0 L

Blank

oder

Sample

Verdnnte Probe messen

Sample

dsDNA

P RO B E 0 0 1 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 E 230 E 260 E 280 E 320

70 0.0
2 0 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Im Ergebnis wurde die Probenverdnnung mit bercksichtigt. Der eingegebene Verdnnungsfaktor bleibt solange auch fr die Berechnung von weiteren Probenergebnissen gespeichert, bis er berschrieben wird. Verdnnungseingabe lschen Zur Lschung des Verdnnungsfaktors wird die Taste Dilution erneut gedrckt, und anschlieend werden die Werte fr "Sample" und "Diluent" mit der Taste Clear gelscht oder mit "Null" berschrieben.

21

5 Bedienung

5.7 ndern der Probennummer

In der Gerteanzeige wird oben rechts bei Probenmessungen die laufende Nummer der Probe angezeigt. Die Probennummer wird fr jede Methode separat fortlaufend gezhlt und bei Datumwechsel wieder auf "1" gesetzt. Die Probennummer kann auf Wunsch zum Beispiel bei Wiederholungsmessungen gendert werden:
dsDNA P RO B E 0 0 5 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 E 230 E 260 E 280 E 320

70 .0
2 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Probennummer ndern

0 Sample No.

dsDNA

P RO B E 0 0 5

3 BCA

dsDNA

P RO B E 0 0 3

Enter

Blank

oder

Sample

Fr die nchste zu messende Probe wurde die Probennummer auf "3" gesetzt. Weitere Proben werden ab der neu eingegeben Nummer fortlaufend gezhlt.

22

6 Programmierung

6.1 Programmierablauf
Fr jede Methode sind Parameter wie die Art der Auswertung oder die Konzentrationseinheit gespeichert. Die ab Werk gespeicherten Methodenprogramme knnen ber die Taste Parameter gendert werden.
OLIGO M E T H O D E N FA K TO R : 1 E 260 = 3 0 . 0 g/mL

Methode aufrufen

6 Oligo

Blank

oder

Sample

Parameterliste aufrufen

OLIGO

SEITE 13 30.0 AU S * EIN

Parameter
FA K TO R KO R R . M I T E 3 2 0 . . . . . . . . . . . .

Fr die verschiedenen Methoden gibt es unterschiedliche Listen von Parametern, die gendert werden knnen (bersicht siehe nchster Abschnitt). Die Parameter fr die Methode "Oligo" erstrecken sich ber 3 Seiten der Gerteanzeige. Beispiel: ndern des Faktors Zahleneingaben werden durch Faktor eingeben und speichern
2 Lowry 0 Sample No. Function 0 Sample No. Enter
OLIGO FA K TO R KO R R . M I T E 3 2 0 . . . . . . . . . . . . SEITE 13 20.0 AU S * EIN

Enter

gespeichert:

Nach Speicherung des Faktors ist der Cursor zum nchsten Parameter-Auswahlblock ("Korrektur mit E320") gesprungen.

23

6 Programmierung

Beispiel: ndern der Einheit Auswahlparameter werden mit den Cursortasten angewhlt und mit Enter besttigt, die jeweils gespeicherte Einstellung ist mit einem "* " markiert: Gewnschten Parameter anwhlen
OLIGO SEITE 23 g/mL * ng/ L g/ L pmol/ L * mol/L

Dilution

EINHEIT . . . . . . . . . . . . . . . . . M. EINHEIT . . . . . . . . . .

Parameter speichern

OLIGO

SEITE 23 g/mL ng/ L g/ L * pmol/ L * mol/L

Enter
EINHEIT . . . . . . . . . . . . . . . . . M. EINHEIT . . . . . . . . . .

L" ist Nach Speicherung der Konzentrationseinheit "g/ der Cursor zum nchsten Auswahlblock ("molare Einheit") gesprungen. Parameterebene verlassen Zum Verlassen der Parameterebene knnen Sie entweder die Zeile "PARAMETER ENDE" anwhlen und Enter drcken oder aus jeder beliebigen Parameterzeile die Taste Parameter drcken.
OLIGO

Parameter
M E T H O D E N FA K TO R : 1 E 260 = 2 0 . 0 g/mL

Blank

oder

Sample

24

6 Programmierung

6.2 Parameterbersicht
dsDNA ssDNA RNA Oligo Protein Bradford Brad.micro Lowry Low.micro BCA BCA micro OD 600

Berechnung

(Anmerkung 1)

(Anmerkung 1)

Extinktion Extinktion Standard Standard Faktor Faktor Warburg-Formel aus ein mg/mL g/mL mg/mL g/mL g

(Anmerkung 1)

Korr. mit E320 Einheit

aus ein g/mL ng/ L g/ L L pmol/ mol/L pmol/mL 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

aus ein g/mL ng/ L g/ L pmol/ L mol/L 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

(Anmerkung 2)

Molare Einheit

Kvette

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

(Nur bei Auswerteverfahren "Faktor":) Faktor Zahleneingabe Zahleneingabe Zahleneingabe Zahleneingabe Zahleneingabe

(Nur bei Auswerteverfahren "Standard":) Std. Anzahl Std. Messung (Anmerkung 3) 1x 2x 3x Zahleneingabe 1x 2x 3x linear nicht linear Zahleneingabe Zahleneingabe

Regression (Anmerkung 4) Standard

Anmerkung 1: Keine Auswahl; Auswerteverfahren "Faktor" fest programmiert. Anmerkung 2: Keine Auswahl; Einheit "Extinktion" fest programmiert. Anmerkung 3: Keine Auswahl; Anzahl der Standards "1" fest programmiert. Anmerkung 4: Auswahlmglichkeit nur, wenn fr den Parameter "Std. Anzahl" mindestens "4" (bzw. bei Einfachbestimmung des Standards mindestens "5") eingegeben wurde.

25

6 Programmierung

6.3 Erluterung der Parameter

Parameter sind als Auswahlparameter oder als Parameter fr Zahleneingaben deniert. Bei Auswahlparametern sind die programmierbaren Alternativen methodenabhngig (siehe bersicht im vorhergehenden Abschnitt). Parameter Berechnung Eingaben Auswahl Erluterung Auswahl aus den Auswertungsverfahren Extinktion, Faktor, Standard und Warburg-Formel. Bei Auswertung ber Warburg-Formel wird der Messwert fr E260 in der Ergebnisanzeige und im Ergebnisausdruck mit einem " " gekennzeichnet. (Nur wenn als Berechnungsverfahren "Faktor" gewhlt wurde:) Eingabe eines Faktors; die Zahl der Nachkommastellen bestimmt die Zahl der Nachkommastellen des Ergebnisses. (Nur fr Nukleinsuremethoden und Protein direkt photometrisch:) Auswahl aus "Korr. mit E320 aus" und "Korr. mit E320 ein"; "Korr. ein" bedeutet: von den Extinktionsergebnissen bei 260, 280 und 230 nm wird die bei 320 nm gemessene Extinktion abgezogen; Anwendung z. B. als Trbungskorrektur. Bei eingeschalteter Korrektur wird der Messwert fr E320 in der Ergebnisanzeige und im Ergebnisausdruck mit einem " " gekennzeichnet. Auswahl aus vorgegebenen Konzentrationseinheiten ist methodenabhngig. Auswahl ist methodenabhngig (nur fr Nukleinsuremethoden); wird bentigt fr Umrechnung von Konzentrationen in molare Konzentrationen (Taste Conversion ). Auswahl aus den Schichtdicken 10, 5 , 2 und 1 mm; das Ergebnis wird immer auf eine Schichtdicke von 10 mm umgerechnet (vgl. Kapitel 12 "Auswertung").

Faktor

Zahleneingabe (5stellig)

Korr. mit E320

Auswahl

Einheit

Auswahl

M. Einheit (Molare Einheit)

Auswahl

Kvette

Auswahl

26

6 Programmierung

Die folgenden Parameter werden nur angeboten, wenn als Berechnungsverfahren "Standard" programmiert wurde: Parameter Std. Anzahl Eingaben Zahleneingabe ("1" bis "10") Auswahl Erluterung Zahl der unterschiedlichen Standards.

Std. Messung

Auswahl aus "1x", "2x", "3x" Wiederholungsmessung jedes Standards; aus den Wiederholungsmessungen wird fr die weitere Berechnung jeweils ein Mittelwert gebildet. (Nur bei Standardanzahl von mindestens 4 bzw. bei Einfachbestimmung der Standards von mindestens 5:) Auswahl aus den Berechnungsverfahren lineare und nichtlineare Regression. Bei Standardanzahl von mehr als 1 und weniger als 4 bzw. 5 wird immer ber lineare Regression ausgewertet (siehe Kapitel 12 "Auswertung". Sollwerteingabe der Standardkonzentrationen; die Zahl der Nachkommastellen der Sollkonzentration fr den ersten Standard bestimmt die Zahl der Nachkommastellen des Ergebnisses.

Regression

Auswahl

Std. 1 bis Std. 10

Zahleneingabe (5stellig)

27

6 Programmierung

28

6.4 Ab Werk programmierte Werte

RNA Standard - - - - - 1) 6 1x g/mL 100 250 500 750 1000 1500 1.00 2.5 5 10 15 25 g/mL 6 1x 8 1x g/mL Standard - - - - - 1) Oligo Protein Bradford Bradford micro Standard - - - - - 1) 6 1x g/mL 1.00 2.5 5 10 15 25 5 1x g/mL 0.50 2 5 10 20 Lowry Lowry micro Standard - - - - - 1) BCA BCA OD 600 micro Standard - - - - - 1) 1.000

dsDNA

ssDNA

50.0 aus

37.0 aus

40.0 aus

30.0 aus

Extinktion Standard - - - - - 1) - - - - - 1) aus 6 2) 1x 1x g/mL 100 250 500 750 1000 1500

nicht linear nicht linear nicht linear nicht linear nicht linear nicht linear

Berechnung Faktor Korr. mit E320 Std. Anzahl Std. Messung Regression Einheit Molare Einheit Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 Standard 6 Standard 7 Standard 8 Kvette 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 25 125 250 500 750 1000 1500 2000 10 mm

g/mL pmol/mL

3) g/mL g/mL g/ L g/mL pmol/mL pmol/mL pmol/ L - - - - - 4)

10 mm

10 mm

10 mm

10 mm

Anmerkungen: 1) 2) 3) 4)

Bei Berechnung "Faktor": Eingabe durch Anwender erforderlich Bei Berechnung "Standard" Bei Berechnung "Standard" oder "Faktor" Bei Berechnung "Standard": Eingabe durch Anwender erforderlich

7 Funktionen

Funktionsliste Funktion Ergebnisse anzeigen Eingaben Aufruf mit

Enter

Erluterung Anzeige der letzten 100 Ergebnisse (das zuletzt gemessene Ergebnis wird zuerst angezeigt);
Conversion Enter Dilution

: Auswahl der Ergebnisse Ausdruck des gerade angezeigten Ergebnisses Zurck in die Funktionsliste

: :

Function

Kalibrationsreport

Aufruf mit

Enter

Ausdruck der gespeicherten Kalibrationen;

Conversion Enter Function Dilution

: Auswahl der Methode Ausdruck des Kalibrationsreports Zurck in die Funktionsliste Speichern Speichern

: : : :

Datum Uhrzeit Gespeicherte Ext.

Zahleneingaben Zahleneingaben Aufruf mit

Enter

Enter

Enter

Ausdruck der zuletzt gemessenen Extinktionen (max. 100 Messungen). Fr die Werte der zuletzt gemessenen Methode werden Mittelwert, Standardabweichung und VK berechnet und ausgedruckt. Messung und Przisionsberechnung von 10 aufeinanderfolgenden Messwerten einer Probe. Fr die Auswertung wird das Methodenprogramm der zuletzt aufgerufenen Methode benutzt. Prfung der photometrischen Richtigkeit und der Wellenlngenrichtigkeit (vgl. Kapitel 13 "berprfung des Photometers"). Anwahl der Sprachversion; "English" und "U.S.English" unterscheiden sich durch das Format des Datums.

Przisionsmessung

Aufruf mit

Enter

Photometertest

Aufruf mit

Enter

Sprache Deutsch Language English Language U.S.English langue franaise Drucker DPU 414 Drucker seriell

Auswahl

Auswahl

DPU 414: Anschluss des Eppendorf Thermodruckers DPU 414 (siehe Kapitel 4.2 "Drucker"). seriell: Anschluss eines anderen Druckers (siehe Kapitel 4.2 "Drucker"). Funktion ist nur fr den Service zugnglich.

Service

29

7 Funktionen

Beispiel: ndern der Sprachversion Funktionsliste aufrufen

Function
FUNKTION SEITE 14

ERGEBNISSE ANZEIGEN K A L I B R AT I O N S R E P O RT DAT U M UHRZEIT 27.06.1998 20:44

Gewnschte Funktion anwhlen

FUNKTION

SEITE 34

Dilution

S P R AC H E D E U T S C H * L A N G UAG E E N G L I S H L A N G UAG E U. S. E N G L l a n g u e franaise

Funktion speichern

FUNCTION

PAG E 4 4 *

Enter
PRINTER DPU 414 PRINTER SERIAL S E RV I C E FUNCTION EXIT

Zum Verlassen der Funktionsebene knnen Sie entweder die Zeile "FUNCTION EXIT" anwhlen und Enter drcken oder aus jeder beliebigen Zeile der Funktionsliste die Taste Function drcken. Danach kehrt das BioPhotometer in die zuletzt aufgerufene Methode zurck. Funktionsebene verlassen
Function
OLIGO P RO G R A M M E D FAC TO R : g/mL 1 A 260 = 2 0 . 0

Blank

or

Sample

30

8 Fehlermeldungen, Ergebniskennzeichnungen und Hilfetexte

Ergebniskennzeichnungen
Kennzeichnung 1.586 E260 Erluterung Markierung von E260 in der Anzeige oder im Ausdruck (nur bei der Methode "Protein direkt"): Die Messung wurde ber die Warburg-Formel ausgewertet. Markierung von E320 in der Anzeige oder im Ausdruck (nur bei der Methode "Protein direkt" und bei Nukleinsuremethoden): Die Extinktionen bei 260, 280 und 230 nm werden mit der Extinktion bei 320 nm korrigiert (siehe Kapitel 6 "Programmierung").

0.015 E320

Fehlertexte bei der Ergebnisanzeige

Fehlertext +++++ Erluterung / Ursache Die gemessene Extinktion liegt ber 3.0 E. Behebung Probe verdnnen. Kvette prfen (Lichtweghhe 8,5 mm). Kvettenschacht reinigen (siehe Kapitel 9). Kvette richtig herum einsetzen (Messfenster in Richtung des Lichtweges). Kvette aus Material benutzen, das fr die Messwellenlngen optisch durchlssig ist, z. B. Quarzglas oder UVette von Eppendorf fr Nukleinsuremessungen. ! ! ! ! ! Berechneter Wert nicht darstellbar (zu hoher Wert). (Anstelle eines Wertes fr die Ratio:) Ratio kann nicht berechnet werden, da einer der fr die Berechnung der Ratio herangezogenen Extinktionswerte 0 E oder > 3.0 E betrgt. Parameter prfen (Faktor zu gro?) Messung wiederholen, evt. mit verdnnter Probe.

31

8 Fehlermeldungen, Ergebniskennzeichnungen und Hilfetexte

Fehlertexte im Messablauf
Fehlertext Zuerst Blank messen Erluterung / Ursache Fr die angewhlte Methode wurde noch kein Leerwert gemessen. Fr die angewhlte Methode gibt es noch keine gltige Kalibration. Behebung Leerwert messen.

Zuerst Standard messen

Standards messen. Andere Auswertung (Festfaktor oder direkte Extinktionsmessung) programmieren. Messung wiederholen, evt. mit verdnnter Probe.

auerhalb der Kalibration

(Nur bei Auswertung ber nichtlineare Regression:) Das Probenergebnis liegt auerhalb des Kalibrationsbereichs. Unterschiedliche Fehler im Messmodul.

Messmodul Fehler 1 Messmodul Fehler 2 Messmodul Fehler 3

Service benachrichtigen.

Fehlertexte im Kalibrationsablauf
Fehlertext Keine STD-Methode Erluterung / Ursache Die Messtaste Standard wurde gedrckt, obwohl fr die aufgerufene Methode als Auswerteverfahren nicht "Standard" programmiert wurde. Behebung Methoden ohne Standardanforderung neu messen. Auswerteverfahren "Standard" programmieren. Standard noch einmal messen, evt. vorher neu ansetzen. Standards berprfen und nochmals in richtiger Reihenfolge (aufsteigende Konzentration) messen. Standards berprfen und nochmals in richtiger Reihenfolge (aufsteigende Konzentration) messen.

Gemessene Werte nicht plausibel Gemessene Werte nicht monoton

(Bei Einpunktkalibration:) Gemessene Extinktion ist 0 E. (Bei Mehrpunktkalibration:) Die gemessenen Werte ergeben keine monoton steigende oder fallende Folge. (Bei nichtlinearer Regression:) Die berechnete Kurve ist nicht monoton.

Kalibrationskurve ist nicht monoton

VK ist grer als 10 %

(Nach Abschluss von Standardmessungen:) Kalibrationsergebnis berprfen. Die Streuung der Messwerte um die beEnter : Kalibration speichern. rechnete Kalibrationsgerade oder -kurve Clear : Kalibration abbrechen, ist erheblich (vergleiche Kapitel 12 "Auswertung". anschlieend neu kalibrieren oder gespeicherte Kalibration benutzen.

32

8 Fehlermeldungen, Ergebniskennzeichnungen und Hilfetexte

Fehlertexte im Programmierablauf
Fehlertext Methodenparameter fehlerhaft, bitte berprfen Standards aufsteigend programmieren Erluterung / Ursache Methodenparameter wurden nicht korrekt eingegeben. Behebung Parameter berprfen und ggf. neu eingeben.

(Bei Mehrpunktkalibration:) Standard-Sollwerte wurden nicht in aufsteigender Reihenfolge programmiert.

Programmierung berprfen und Sollwerte in aufsteigender Folge eingeben.

Sonstige Fehlertexte
Fehlertext Ungltige Eingabe Erluterung / Ursache Behebung

(Bei Eingabe einer laufenden Probennum- Eingabe der Nummer in den genann0 mer ber die Taste Sample ) ten Grenzen wiederholen. No. Eine Nummer auerhalb der Grenzen von 1 bis 999 wurde eingegeben.

Hilfetexte
Hilfetext Standard bitte programmieren Erluterung / Ursache Behebung

(In der Anzeige nach Methodenaufruf:) Sollkonzentrationen fr die Fr die Methode wurden zwar als AuswerteStandards programmieren verfahren "Standard", aber bisher keine Soll(Taste Parameter ). konzentrationen fr die Standards Anderes Auswerteverfahren ohne programmiert. Standard programmieren. (In der Anzeige nach Methodenaufruf:) Wert fr den Faktor programmieFr die Methode wurde zwar als Auswerteren (Taste Parameter ). verfahren "Faktor", aber bisher kein Zahlen Anderes Auswerteverfahren prowert fr den Faktor programmmiert. grammieren.

Faktor bitte programmieren

33

9 Reinigung und Wartung

Photometer

Vor Wartungsarbeiten oder Sicherungswechsel den Netzstecker ziehen. Lebensgefhrliche elektrische Spannungen im Inneren des Gerts. Das gesamte Gert mit einem leicht feuchten Tuch und mildem Reinigungsmittel abwischen. Zur Desinfektion mit einem leicht feuchten Tuch und 70 %-igen Ethanol / Wassergemisch abwischen. Flssigkeiten drfen nicht in das Gert gelangen.

Kvettenschacht

Den Kvettenschacht nur mit einem feuchten Wattestbchen, nicht mit greren Flssigkeitsmengen (z. B. Spritzasche) reinigen. Wenn das Gert nicht benutzt wird, den Kvettenschacht mit dem mitgelieferten Verschluss vor Staub schtzen. Staub oder Rckstnde von Messlsungen im optischen Lichtweg knnen Falschmessungen verursachen.

Sicherungswechsel Netzstecker ziehen. Oberhalb des Netzanschlusses bendet sich der Sicherungshalter (siehe Bild in Kapitel 4.1.). Die Position des Halters wird durch einen kleinen federnden Rasthebel am unteren Teil des Halters gesichert. Rasthebel nach oben drcken und Halter herausziehen. Sicherungen wechseln (Spezikation siehe Kapitel 2 Technische Daten). Halter wieder in die Aufnahme hineinschieben, bis der Rasthebel einrastet. Netzstecker anschlieen.

34

10 Kurzanleitung

Vorbereitung
Das Gert ist sofort nach dem Einschalten messbereit.

Methoden

7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford

8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

9 RNA 6 Oligo 3 BCA

7 dsDNA

8 ssDNA

9 RNA 6 Oligo

dsDNA ssDNA RNA Oligo Direkte Messung der Nukleinsuren bei 260 nm. Quotienten E 260/E 280 und E260/E 230. Wahlweise Korrektur der Extinktionswerte durch E320. Messung mit Quarzglaskvette oder UVette von Eppendorf. OD 600 Direkte Messung der Dichte von Bakteriensuspensionen bei 600 nm (Trbungsmessung). Messung mit Glas- oder Kunststoffkvette. Protein Direkte Messung von Protein bei 280 nm. Direkte Messung der Extinktion oder Auswertung ber Faktor, Standard oder Warburg-Formel. Wahlweise Korrektur der Extinktionswerte durch E320. Messung mit Quarzglaskvette oder UVette von Eppendorf.

5 OD 600

4 Protein

1 Bradford

2 Lowry

3 BCA

Bradford Lowry BCA Bradford micro Lowry micro BCA micro Messung von Protein mit Bradford-, Lowry- oder BCA-Reagenz. Direkte Messung der Extinktion oder Auswertung ber Faktor oder Kalibration (Einpunktkalibration, lineare Regression oder nichtlineare Regression). Zahl und Sollwerte der Kalibratoren programmierbar. Die Protein-Methoden stehen auch im Mikromastab zur Verfgung (Methodentaste 2x drcken). Messung mit Glas- oder Kunststoffkvette.

Kvetten
Grundche 12,5 mm x 12,5 mm Min. Gesamthhe 36 mm

UVette

Ultramikro

Halbmikro

Makro

Absaug

Min. Fllhhe Lichtstrahl Max. Bodendicke Min. Volumen

10 mm 8,5 mm 7 mm 0 mm 50 L 70 L 400 L 1000 L 300 L

35

10 Kurzanleitung

Programmierung
Die ab Werk gespeicherten Methodenprogramme knnen gendert werden. Beispiel: Programmierungen der Einheit "g/mL" und eines Auswerteverfahrens ber Standard (500g/mL) fr die Methode Protein.
P ROT E I N EXTINKTION

Protein-Methode whlen

4 Protein
Blank P ROT E I N BERECHNUNG oder Sample SEITE 13 STD FA K TO R EXTINKTION WA R B U R G *

Programmierung beginnen

Parameter

P ROT E I N

SEITE 13 STD FA K TO R EXTINKTION WA R B U R G *

Kalibration mit Standard (STD) anwhlen

BERECHNUNG

Dilution

oder

Conversion

P ROT E I N

SEITE 24 AU S * EIN 1 x * 2 x 3 x SEITE 34 mg/mL * g/mL mg/mL

KO R R . M I T E 3 2 0

und besttigen
(Die Anzeige springt nach Besttigung zum nchsten Auswahlblock)

Enter
STD MESSUNG

P ROT E I N EINHEIT

Die Einheit g/mL anwhlen

Dilution

oder

Conversion

STD

- - - - -

P ROT E I N EINHEIT

SEITE 34 mg/mL g/mL * - - - - g/mL

und besttigen

Enter
STD

P ROT E I N KVETTE

SEITE 44 10 5 2 1 mm mm mm mm *

Standard-Konzentration eingeben und besttigen

(Die Anzeige springt nach Besttigung zum nchsten Auswahlblock)

5 OD 600

Sample No. Sample No. Enter

PA R A M E T E R E N D E

Programmierung beenden
36

Parameter

10 Kurzanleitung

Messablauf dsDNA
dsDNA M E T H O D E N FA K TO R 1 E260 = 50.0 g/mL

dsDNA-Methode whlen

7 dsDNA

Blank

oder

Sample

dsDNA

BLANK E

Leerwert messen

Blank

0.000
Blank

oder

Sample

Wenn die Probe verdnnt ist: Beispiel: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

dsDNA

P RO B E 0 0 1

20+200 L

Enter
Blank oder Sample

dsDNA

P RO B E 0 0 1 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 E230 E260 E280 E320

563.20
Probe messen
Sample
1.97 2.03 20+200 L
260/ 280 260/ 230

Wenn das Ergebnis der Probe umgerechnet werden soll:

1 Conversion Enter
B E R E C H . M O L A R I T T: B A S E N PA A R E 300 MOL.MASSE 198 kDa

Bradford

4 Protein

0 Sample No.
BERECH. MENGE: G E S A M T P RO B E 140 L

3 BCA Enter

0 Sample No.

0 Sample No.

dsDNA

P RO B E 0 0 1 g/mL

563.20
Enter

20+200 L 79 g 2843 pmol/mL 398 pmol

dsDNA

P RO B E 0 0 2 g/mL 0.689 0.788 0.623 0.003 E230 E260 E280 E320

Nchste Probe messen

249.70
Sample
1.85 2.19 20+200 L
260/ 280 260/ 230

37

10 Kurzanleitung

Messablauf Bradford
BRADFORD K A L I B R AT I O N S B E R E I C H 100 2000 g/mL

Bradford-Methode whlen

1 Bradford

Blank

oder

Standard

Wenn die Mikromethode gewhlt werden soll:

1 Bradford

B R A D. m i c r o K A L I B R AT I O N S B E R E I C H 1.0 20.0 g/mL

Blank

oder

Standard BRADFORD BLANK E

Leerwert messen

Blank

0.000
Blank

oder Sample

Standard

BRADFORD

STD 1 100 g/mL E

Ersten Standard messen

Standard

0.048
NCHSTER:

STD 2 200g/mL STD 6 2000 g/mL E

BRADFORD

Letzten Standard messen

Standard

1.325

Wenn die Probe verdnnt ist: Beispiel: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

VK: 2.8 % K A L I B R AT. G E S P E I C H E RT BRADFORD P RO B E 0 0 1

20+200 L oder Sample

Enter

Blank

Standard

BRADFORD

P RO B E 0 0 1 g/mL 0.352 E595

Probe messen

368
Sample
20+200 L

BRADFORD

P RO B E 0 0 2 g/mL 0.525 E595

Nchste Probe messen

552
Sample
20+200 L

38

11 Bestellinformationen

Bestell-Nr. 6131 000.012 6131 810.006 6131 928.007 Photometer BioPhotometer (230 V; 50/60 Hz; Netzstecker Europa) (weitere Netzanschluss-Varianten erhltlich) BioPhotometer Software-Paket fr Online-Datenbertragung am PC Sekundr-UV-VIS-Filter, Testltersatz, zur berprfung des BioPhotometers Drucker Thermodrucker DPU 414, incl. Netzteil 230 V und Druckerkabel Thermopapier (5 Rollen) Converterkabel, Typ 2029, Verbindungskabel fr den Anschluss eines parallelen Druckers UVette (Kunststoff-Einmalkvette fr UV / VIS, 220 bis 1 600 nm) UVette, 80 Stck, einzeln verpackt Kvettenstnder fr 16 Kvetten

6131 011.006 0013 021.566 6131 071.009

0030 106.300 4308 078.006

39

12 Auswertung

12.1 Nukleinsuren (dsDNA, ssDNA, RNA, Oligo)

Auswertung ber Faktor C = E260 x F C = berechnete Konzentration E260 = gemessene Extinktion bei 260 nm F = Faktor (methodenspezische Programmierung ber Taste

Parameter

Besonderheit bei den Nukleinsuremethoden: Der programmierte Faktor bezieht sich immer auf die Konzentrationseinheit "g/mL". Wird die Konzentrationseinheit " g/ L" gewhlt, wird der Faktor intern umgerechnet: F = F / 1000 F = umgerechneter Faktor; wird fr die Berechnung der Konzentration benutzt.

Probenverdnnung CDil, korr = C x (VP + VDil) / V P CDil, korr = mit Verdnnungsfaktor umgerechnetes Ergebnis VP = Volumen der Probe in der Messlsung (Eingabe ber Taste Dilution ) VDil = Volumen des Diluents in der Messlsung (Eingabe ber Taste Dilution ) Schichtdicke der Kvette Anwendung: Benutzung von Kvetten mit Schichtdicke 1, 2 oder 5 mm. Die Schichtdicke der Kvette wird methodenspezisch ber die Taste EKv, korr = E x 2 (bei Schichtdicke 5 mm) EKv, korr = E x 5 (bei Schichtdicke 2 mm) EKv, korr = E x 10 (bei Schichtdicke 1 mm) EKv, korr = auf Schichtdicke 10 mm umgerechnete Extinktion Korrektur E320 Anwendung: Partielle Korrektur von Verflschungen der Extinktion durch Trbungen in der Messlsung. Das Auswerteverfahren mit bzw. ohne Korrektur E320 wird methodenspezisch ber die Taste miert. Ex, korr = Ex - E320 Ex, korr = rechnerisch korrigierte Extinktion bei der Wellenlnge 230, 260 und 280 nm Ex = gemessene Extinktion bei der Wellenlnge 230, 260 und 280 nm E320 = gemessene Extinktion bei der Wellenlnge 320 nm Die korrigierte Extinktion wird fr die weitere Ergebnisberechnung benutzt.
Parameter Parameter

programmiert.

program-

Taste Conversion: Berechnung der Menge Anwendung: Berechnung der Nukleinsuremenge im gesamten Probenvolumen M = C x VP, ges

M = berechnete Gesamtmenge an Nukleinsure im Probengef C = berechnete Konzentration VP, ges = Volumen der Probe im Probengef (Eingabe ber Taste Conversion )

40

12 Auswertung

Taste Conversion: Berechnung der molaren Konzentration Anwendung: Berechnung der molaren Konzentration aus Massenkonzentration und relativer Molmasse. Die Molmasse wird entweder direkt eingegeben oder vom Gert aus der eingegeben Zahl von Basen bzw. Basenpaaren pro Molekl berechnet. CMol = C / N CMol = molare Konzentration (berechnet) N = relative Molmasse in kDa (Eingabe ber Taste )

Conversion

Falls anstelle der relativen Molmasse die Zahl der Basen bzw. Basenpaare pro Molekl eingegeben wurde, wird N aus der Zahl der Basen (-paare) berechnet: dsDNA: N = bp x 2 x 330 x 10-3 ssDNA, RNA, Oligo: N = b x 330 x 10-3 N = berechnete relative Molmasse in kDa bp = eingegebene Zahl der Basenpaare pro Molekl (dsDNA) b = eingegebene Zahl der Basen pro Molekl (ssDNA, RNA, Oligo) Die Einheit fr die molare Konzentration wird ber die Taste
Parameter

methodenspezisch programmiert.

12.2 Protein direkt photometrisch

Auswahl fr die Ergebnisausgabe: Extinktion Berechnung der Konzentration ber Faktor Berechnung der Konzentration ber Einpunktkalibration Berechnung der Konzentration ber Warburg-Formel

Berechnung der Konzentration ber Faktor Siehe Abschnitt 12.1; Messwellenlnge: 280 nm Bei der Eingabe des Faktors ber die Taste tigt werden.
Parameter

muss die programmierte Konzentrationseinheit bercksich-

Berechnung der Konzentration ber Standard (Einpunktkalibration) F = CS / E S F = berechneter Faktor CS = Sollkonzentration des Standards (methodenspezische Programmierung ber Taste ES = gemessene Extinktion des Standards

Parameter

Wurde fr den Standard Mehrfachmessung (2x, 3x) programmiert, erfolgt die Auswertung aus den gemessenen Extinktionen unter Einbeziehung des Nullwerts ber lineare Regression. Nach Berechnung der Regression wird ein VK-Wert (Variations-Koefzient in "%") als Ma fr die Streuung der Messwerte gebildet. Ist der VK-Wert grer als 10 %, wird er angezeigt. In diesem Fall wird die Kalibration erst nach Besttigung gespeichert (siehe Abschnitt 12.3). Die Berechnung der Probenkonzentration erfolgt mit dem berechneten Faktor: C = E280 x F

Berechnung der Konzentration ber Warburg-Formel C = 1.55 x E280 0.76 x E260 fr Konzentrationseinheit "mg/mL" C = (1.55 x E280 0.76 x E260) x 1000 fr Konzentrationseinheit "g/mL"

41

12 Auswertung

Probenverdnnung, Schichtdicke der Kvette und Korrektur E320 Siehe Abschnitt 12.1.

12.3 Protein mit Reagenzzugabe

Methoden: Bradford, Bradford micro, BCA, BCA micro, Lowry, Lowry micro Auswahl fr die Ergebnisausgabe: Extinktion Berechnung der Konzentration ber Faktor Berechnung der Konzentration ber Standard Auswahl der Auswerteverfahren ber Standard: Einpunktkalibration Mehrpunktkalibration (Standardgerade) Mehrpunktkalibration (Standardkurve) Berechnung der Konzentration ber Faktor und Berechnung der Konzentration ber Standard (Einpunktkalibration) Siehe Abschnitt 12.2; Messwellenlnge: 595 nm (Bradford; Lowry) bzw. 562 nm (BCA) Berechnung der Konzentration ber Standard (Mehrpunktkalibration; Kalibrationsgerade) Aus 2 bis 10 Standards, die in Einzel-, Doppel- oder Dreifachbestimmung gemessen werden, wird eine Kalibrationsgerade (Konzentration als Funktion der Extinktion) berechnet. Die Geradengleichung wird ber lineare Regression berechnet. C = ao + a1E a1 = Steigung der Kalibrationsgeraden (Faktor) ao = Schnittpunkt der Kalibrationsgeraden mit der Konzentrationsachse (Konzentration einer Probe mit der Extinktion "0" [Offset]) Nach Berechnung einer Kalibration wird vom Gert der "VK"-Wert (Variationskoefzient in "%") berechnet (Ausnahme: Zweipunktkalibration mit Einfachbestimmung der beiden Standards). Der VK-Wert ist ein Ma fr die Streuung der Messwerte um die berechnete Kalibrationsgerade herum. Liegt der Wert hher als 10 %, wird die Kalibration nicht automatisch, sondern erst nach Besttigung durch den Anwender gespeichert. Bei mehr als 2 Standards wird der VK-Wert immer (auch bei einem Wert < 10 %) angezeigt. ber die Taste Function knnen die berechneten Parameter ("ao" und "a1") der gespeicherten Kalibrationsgerade ausgedruckt werden. Berechnung der Konzentration ber Standard (Mehrpunktkalibration; Kalibrationskurve) Aus 5 bis 10 Standards, die in Einzelbestimmung bzw. aus 4 bis 10 Standards, die in Doppel- oder Dreifachbestimmung gemessen werden, wird eine Kalibrationskurve (Konzentration als Funktion der Extinktion) berechnet. Die nichtlineare Regression wird ber ein Polynom 3. Grades berechnet. C = ao + a1E + a2E2 + a3E3 + . . . a = Koefzienten (Die Koefzienten werden mit der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt)

VK-Wert: siehe oben (lineare Regression) ber die Taste werden.

Function

knnen die berechneten Parameter der gespeicherten Kalibrationsgerade ausgedruckt

42

12 Auswertung

Probenverdnnung und Schichtdicke der Kvette Siehe Abschnitt 12.1.

12.4 OD 600
Die gemessenen Werte werden als bei der Wellenlnge 595 nm gemessene Extinktionswerte ausgegeben.

Probenverdnnung und Schichtdicke der Kvette Siehe Abschnitt 12.1.

43

13 berprfung des Photometers

Zur berprfung der photometrischen Richtigkeit und der Wellenlngenrichtigkeit wird von Eppendorf ein Filtersatz (Sekundr-UV-VIS-Filter) angeboten. Der Satz enthlt drei Filter ("Sample A1", "Sample A2" und "Sample A3") zur berprfung der photometrischen Richtigkeit und zwei Filter ("Sample 260 nm" und "Sample 280 nm") zur berprfung der Wellenlngenrichtigkeit. Die Extinktionen der Filter werden gegen ein Leerwertlter ("Blank A0") gemessen. Zur Messung werden Leerwertlter und "Probenlter " (Prflter) wie Kvetten in den Kvettenhalter eingesetzt. Dabei muss der Aufkleber mit der Filterbezeichnung zum Anwender hin zeigen. Die fr die Prflter gemessenen Extinktionswerte werden gegen den zulssigen Wertebereich verglichen. Die Grenzwerte fr den zulssigen Bereich sind fr die einzelnen Filter in einer Tabelle im Deckel des Filterkastens abgedruckt (siehe in der Abbildung: "X.XXX X.XXX A").

BioPhotometer
Secondary / Sekundr - UV - VIS - Filter Limits Grenzwerte 6131 Filter Type 914XXX Blank A0 measured against Blank A0 at approx. 20 C gemessen gegen Blank A0 bei ca. 20 C 921XXX Sample A1 922XXX Sample A2 Photometric accuracy Photometrische Richtigkeit 230nm 260nm 280nm 320nm 562nm 595nm 230nm to/bis 595nm 0.000 A 3.0 % 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 923XXX Sample A3

Function: PHOTOMETERTEST Order No./Best.Nr.: 6131 928.007 traceable to NIST rckfhrbar auf NIST 916XXX Sample 260 nm 917XXX Sample 280 nm

Wavelength accuracy Wellenlngenrichtigkeit

0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A Photometric precision Photometrische Przision 1.0 % 1.5 %

empty X.XXX - X.XXX A

___________________________ Date Datum Signature Unterschrift

Please protect against dust, heat and liquid The limits are valid for max. 2 years Bitte vor Staub, Hitze und Flssigkeiten schtzen Die Grenzwerte gelten fr max. 2 Jahre ab Datum.

eppendorf

Abb.: Deckel des Filterkastens (Innenseite)

44

13 berprfung des Photometers

Prfablauf Prfung bei ca. 20 C durchfhren. Filter nur kurzfristig dem Filterkasten entnehmen und vor Verschmutzung oder Beschdigung der Filteroberchen schtzen. Filter vor Staub, Hitze, Flssigkeit und aggressiven Dmpfen schtzen. Filter immer so einsetzen, dass der Aufkleber mit der Filterbezeichnung zum Anwender hin zeigt. Funktion "Photometertest" aufrufen. Diese Funktion ist in Gerten mit der Software-Version ab V 1.20 enthalten. Fr den Gebrauch der Prflter mit lterer Software-Version wenden Sie sich bitte an Eppendorf. Prflter anwhlen "A1", "A2" oder "A3" fr die Messung der photometrischen Richtigkeit bei 230, 260, 280, 320, 562 und 595 nm. "A260" oder "A280" fr die Messung der Wellenlngenrichtigkeit bei 260 bzw. 280 nm. Den Anweisungen im Display des Photometers fr die Messung von "Blank" und "Probe" folgen. Das Gert fhrt 10 Messzyklen durch und druckt danach die Mittelwerte fr die Extinktionen bei den jeweiligen Wellenlngen aus. Extinktionswerte mit dem zulssigen Wertebereich vergleichen. Zustzlich zu Informationen ber die Richtigkeit enthlt der Ausdruck Informationen ber die Przision: Aus den jeweils 10 Messungen pro Filter und Wellenlnge werden jeweils Standardabweichung und VK berechnet. Sollten die gemessenen Extinktionswerte nicht mit dem zulssigen Wertebereich bereinstimmen, wenden Sie sich bitte an den Service von Eppendorf. Die Filter sollten nach 2 Jahren von Eppendorf neu kalibriert werden.

45

Konformittsbescheinigung fr BioPhotometer 6131 gem Anlage 15 zur Eichordnung Messtechnische Beschreibung Art: Typ: Hersteller / Vertreiber: Gebrauchsanweisung: 1. Messsystem Strahlengang: Strahler: Spektralapparat: Strahlungsempfnger: Kvette: Kvettentypen: Einstrahl-Photometer mit Referenzstrahl und festen Wellenlngen BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Hamburg Bedienungsanleitung

Lampe > Blende > Linse > Blende > Kvette > Blende > Beugungsgitter > Blenden > Fotodioden Xenon-Blitz-Lampe Kontinuum-Spektralbereich 220 bis 2000 nm Gitter-Polychromator Silizium-Fotodioden Spektralbereich 200 bis 1100 nm Quarzglas, Optisches Spezialglas oder Kunststoff, je nach Messwellenlnge 10 mm Makro mind. Vol.1000 l 10 mm Halbmikro mind. Vol. 400 l 10 mm Absaug mind. Vol. 300 l 10 mm Ultramikro mind. Vol. 70 l nicht vorhanden Beleuchtete, grasche LCD 33 x 66 mm2 Extinktion, Massenkonzentration, molare Konzentration

Kvettentemperierung: Messwertanzeige: Angezeigte Messgren: 2. Messverfahren Bestimmung des Kvettenleerwertes: Konzentrationsbestimmung: Vergleichsmessung an Referenzmaterial:

Wellenlngenabhngiger Einzelmesswert der jeweiligen Kvette Lambert-Beer-Bourguer Gesetz berprfung mit kalibrierten Sekundrstandards

3. Messbereich des spektralen Absorptionsmaes Bereich: 0,000 bis 3,000 E Auerhalb dieses Messbereiches und bei anderen als den folgenden Nenngebrauchs bedingungen knnen die aufgefhrten Fehlergrenzen berschritten werden. 4. Nenngebrauchsbedingungen Kvettenleerwert: Messwellenlngen: Anwrmzeit: Betriebsspannung: Umgebungstemperatur: Relative Luftfeuchte:

Abhngig von der verwendeten Kvette Xenon 230, 260, 280, 320, 562, 595 nm keine 100 bis 240 V 10 %, 50 bis 60 Hz 5 % 15 bis 35 C 15 bis 70 %

5. Fehlergrenzen und andere Grenzwerte Relative photometrische Unsicherheit des spektralen Absorptionsmaes bei allen Messwellenlngen fr eine Einzelmessung: 1,5 % bei 1 E Relative photometrische Kurzzeit-Standardabweichung: 0,5 % bei 1 E Systematische Messabweichung der Wellenlnge: 1 nm bei 230 bis 280 nm, 2 nm bei 320 bis 595 nm Spektrale Halbwertbreite: 5 nm bei 230 bis 320 nm, 7 nm bei 562 und 595 nm Integraler Fehlstrahlungsanteil: 0,03 % bei 260 nm mit GG 375-3 (Schott) Datum: 25.09.2000 Eppendorf AG Qualitt und Normen 46

Contents

1 2 3 4 4.1 4.2 4.3 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 6.1 6.2 6.3 6.4 7 8 9 10 11 12 12.1 12.2 12.3 12.4 13

Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Technical data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Safety precautions and prevention of damage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 Installation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . BioPhotometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Printer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cuvettes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Operation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Keypad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Measuring nucleic acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Direct photometric measurement of protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Measuring proteins with reagent (Bradford, BCA, Lowry) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Measuring OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Measuring diluted samples. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Changing the sample number. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Programming . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Programming procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Overview of parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Explanation of parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Factory-set programmed values . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 54 55 56 57 57 59 61 63 66 67 68 69 69 71 72 74

Functions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Error messages, result agging and help texts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Maintenance and cleaning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 Short instructions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 Ordering information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Calculation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nucleic acids (dsDNA, ssDNA, RNA, oligo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Direct photometric determination of protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Protein with addition of reagent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 86 87 88 89

Testing the photometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Conformity Declaration for BioPhotometer 6131. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

47

1 Overview

8 2 7

3 1 2 3 4

5 5 6 7 8 Dilution key Conversion key Measuring keys Cuvette shaft

Device display 9 method keys Function key (device functions) Parameter key (programming key)

The main power key, main power connection and printer connection are located on the rear of the device (see Section 4, "Installation"). The BioPhotometer from Eppendorf is used for rapid, simple and convenient measurement of the most common methods in research labs in the elds of molecular biology and biochemistry. Cuvettes Standard rectangular cuvettes made of glass or plastic that transmit light at every measuring wavelength may be inserted into the cuvette shaft. Using the UVette from Eppendorf, it is now possible to measure nucleic acids in a plastic cuvette. The height of the measuring window (8.5 mm), as well as the total height (min. 36 mm) must be taken into consideration when the cuvettes are selected (see chap. 10 "Short instruction"). To ensure correct, precise results, please ensure that the cuvettes are clean and that the measuring solution is particle-free. A seal is included with the device to protect the cuvette shaft from dust when not in use.

49

1 Overview

Methods

There are twelve preprogrammed factory-set methods which can be called up at the push of a button: Nucleic acids dsDNA ssDNA RNA Oligo Proteins Protein Bradford Bradford micro Lowry Lowry micro BCA BCA micro Bacteria density OD 600 Double-stranded DNA Single-stranded DNA RNA Oligonucleotides Direct photometric measurement Bradford method Bradford method, low concentration range Lowry method Lowry method, low concentration range BCA method BCA method, low concentration range Turbidity measurement

Method

Each method has an accompanying, factory-set program that contains different parameters, such as units of concentration and type of calculation. The method programs can be changed at any time using the Parameter key. Before using a method for the rst time, call up the corresponding method program and if necessary adapt it to suit your requirements. For methods which are to be calculated using calibration by standard measurements, the number and nominal concentrations of the standards must be adapted. For measurement purposes, the desired method should be called up using the appropriate measuring key. The Bradford, Lowry and BCA methods have the same special feature: For each of these methods, two different calculation ranges may be programmed. It is possible to toggle between the two method programs (e.g. "BCA" and "BCA micro") by pressing the method key repeatedly. Pressing one of the three oval measuring keys starts the measurement. The device is ready to measure immediately after being switched on. An indication as to which of the three measuring keys should be used for a measurement can be found in the lower part of the device display (Details on the measuring process can be found in Section 5, "Operation").

Measurement

Calculation

It is possible to calculate the result automatically using method-specic programmed calculation modes (factor, calibration, Warburg formula or direct absorbance output). In addition to the calculated results, the absorbances and (for nucleic acids) the common absorbance ratios appear in the display. Sample dilutions can also be included in the calculation process ( Dilution key). The calculated mass concentrations for nucleic acids can be converted into molar concentrations by pressing the Conversion key. This key can also be used to calculate the total sample quantity ("yield") in the sample vessel.

Results printout

The results appear in the device display and can be printed out (if the printer is connected). A data transfer program is available from Eppendorf for evaluating your results on a computer using a calculation program (see Sec. 11, "Ordering information"). Sample results and calibration results are stored; this data can be called up by pressing the Function key.

50

2 Technical data

Photometer Optical system: Irradiation source: Spectral dispersion: Measuring wavelengths: Wavelength selection: Spectral bandwidth: Wavelength systematic error: Photometric measuring range:

Absorption single-beam photometer with reference beam and several xed wavelengths Xenon ash lamp Holographic concave grating Xe 230, 260, 280, 320, 562, 595 nm Method-dependent, program-controlled 5 nm at 230 to 320 nm 7 nm at 562 to 595 nm 1 nm at 230 to 280 nm 2 nm at 320 to 595 nm Quartz glass cuvette: 0.000 to 3.000 A UVette (Eppendorf): 2.5 A at 230 nm 2.6 A at 260 nm 2.8 A at 280 nm 2.9 A at 320 nm 0.002 A at 0 A 0.005 A at 1 A 1 % at 1 A 0.001 A < 0.05 % Silicium photo diodes

Photometric random error: Photometric systematic error: Accuracy of reading: Stray-light proportion: Radiation detector: Measuring procedures Measuring procedure: Method-dependent calculation:

End-point against blank Absorbance Concentration via factor Concentration via Warburg formula Concentration via calibration with 1 to 10 standards One-point calibration (1 standard) Linear regression (2 to 10 standards) Non-linear regression (3rd degree polynomer; 4 or 5 to 10 standards; see Section 12, "Calculation") 1 x, 2 x or 3 x determination For nucleic acids: Ratio 260/280 Ratio 260/230 Molar concentration Total yield

Memory Method memory: Calibration memory: Results memory:

12 preprogrammed, modiable method programs For all calibration procedures For 100 results with absorbance and ratio values, sample number, sample dilution, date and time (calendar up to 2090)

51

2 Technical data

Operation Cuvette material:

dsDNA, ssDNA, RNA, Oligo, Protein: Quartz glass or plastic (UVette from Eppendorf) OD 600, Bradford, Lowry, BCA: Glass or plastic 12.5 mm x 12.5 mm, not temperature-controlled Min. 36 mm 8.5 mm Width: 1 mm Height: 1.5 mm 19 foil keys Illuminated graphic display, 33 mm x 60 mm English, French, German Via display and printer Absorbance, concentration, ratio

Cuvette shaft: Overall height of cuvettes: Height of light beams in the cuvette: Light bundle in the cuvette: Keypad: Display: User guidance: Results output:

General data Supply voltage: Overvoltage category: Pollution degree: Power requirement / power output: Current consumption: Permitted mains interruption: Fuses: Ambient conditions:

100 to 240 V 10 %; 50 to 60 Hz 5 % II (IEC 61010-1) 2 (IEC 664) Approx. 20 W in operation, approx. 10 W in Standby mode < 0.3 A Approx. 10 ms at 90 V Approx. 200 ms at 220 V T 1 A / 250 V, 5 mm x 20 mm (2 pcs.) 15 to 35 C with dened precision and accuracy 25 to 70 C when not in operation or when stored 15 to 70 % relative humidity Cannot be used in tropical climate Keep out of direct sunlight RS-232 C, serial The printer that is connected must comply with the requirements of EN 60950 or UL 1950. Complies with VDE, CE, IEC 1010-1 Width: 20 cm Depth: 32 cm Height: 10 cm 3 kg (packaged: 29 cm) (packaged: 43 cm) (packaged: 20 cm) (packaged: 4,8 kg)

Printer connection:

Standards and regulations: Dimensions:

Weight:

Technical specications subject to change.

52

3 Safety precautions and prevention of damage

Before using the Biophotometer please familiarize yourself completely with the operating instructions. The following points must be followed exactly to enable safe work with the device: Technical safety Do not open the device. Do not allow any liquid to enter into the device. Disconnect the device from the mains supply before carrying out maintenance work or changing the fuses. The inside of the device is a high-voltage area. Danger! Do not operate the device in a hazardous location or potentially explosive environment. Do not use the device if it is damaged, especially if the main power cable is in any way damaged or defective. Repairs may only be carried out by the service technicians from Eppendorf AG and by authorized contractual partners. The device must be connected to a power outlet that has a protective ground connection. If the equipment is used in a manner not specied by the manufacturer, the protection provided by the equipment may be impaired. Handling biological and chemical material Reagents and dilution buffers can cause cauterization and other damage to health. Samples (nucleic acids, proteins, bacteria cultures) can be infectious and cause serious damage to health. During sample preparation, measuring procedures and maintenance and cleaning work, observe all local laboratory safety precautions (e.g. wear protective clothing and gloves, use of disinfectant) regarding the handling of sample material. Dispose of measuring solutions and cleaning and disinfectant materials in accordance with the relevant local laboratory regulations.

53

4 Installation

Delivery package

BioPhotometer Mains cable for BioPhotometer Operating manual, incl. short instructions Seal for cuvette shaft

4.1 BioPhotometer
Connect up device Space required: Power connection: Width: Depth: 40 cm 50 cm

Safety socket

Insert the mains plug of the device into the safety socket. It is not necessary to set voltage of the device within the voltage range specied in "Technical data" because the voltage is set automatically within this range. Ambient conditions: see "Technical data".

Remove the protective foil from the device display.

1 2

1 Mains switch 2 Fuse holder 3 Mains connection

4 Printer connection, serial (RS-232 C)

54

4 Installation

4.2 Printer
Printer DPU 414 The Eppendorf Thermal Printer DPU 414 can be connected to the serial interface RS-232 C of the BioPhotometer (see Section 11, "Ordering information"). Insert the printer cable into the printer connection socket of the BioPhotometer (see photo) and tighten the safety screws on the plug to secure. Connect the printer cable to the printer and tighten the safety screws on the plug to secure. Connect up to the power supply using a 115 V or 230 V mains cable. Setting the printer function BioPhotometer Select the function "Printer DPU 414" in the function list, and conrm. Printer DPU 414 Check the printer settings. If necessary, set the printer for use with the BioPhotometer, as described in the printer supplement. Printer settings for working with the BioPhotometer: Dip SW-1 1 (OFF) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (ON) : 6 (OFF) : 7 (ON) : 8 (ON) : Input = Serial Printing Speed = High Auto Loading = ON Auto LF = OFF Setting Command = Enable Printing Density = 100 %

Dip SW-2 Settings made by the user are not relevant for the group "Dip SW-2" because the BioPhotometer assumes these settings automatically in accordance with the language version selected. Dip SW-3 1 (ON) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (OFF) : 6 (ON) : 7 (ON) : 8 (ON) : Data Length = 8 bits Parity Settings = No Parity Conditions = Odd Busy Control = XON/XOFF Baud Rate Select =9600 bps

55

4 Installation

Other printers

In addition to the DPU 414, it is also possible to connect other serial printers to the serial interface of the BioPhotometer. With the aid of an adapter cable, parallel printers can also be connected. BioPhotometer Select the function "Printer serial" in the functions list, and conrm. Printer Requirements for the serial printer: Busy Control Baud Rate(ON) Data Bit Length Parity Permission Parity Conditions : : : : : XON/XOFF 9600 bps 8 bits Without Odd

Parallel printers can be connected using an adapter cable which fullls the above requirements.

4.3 Cuvettes
Commercially available rectangular cuvettes may be used in the cuvette shaft. When the height of the measuring window is 8.5 mm above the cuvette base and the overall height of the cuvette is at least 36 mm (see the graphics in "Short instructions"). The light bundle in the cuvette is 1.0 mm wide and 1.5 mm high. For measurements, cuvettes made of glass or plastic may be used on condition that they are transparent at the respective measuring wavelength. The UVette from Eppendorf is a plastic cuvette which is transparent at wavelengths as low as 220 nm, which means that it is also suitable for nucleic acid measurement.

56

5 Operation

5.1 Keypad
Photometer

Standard 7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford 0 Sample No. 8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

Function

9 RNA 6 Oligo 3 BCA Blank Sample

Conversion

Clear

Parameter

Dilution

Enter

7 dsDNA

To call up the "Double-stranded DNA" method. To enter gure 7.

8 ssDNA

To call up the "Single-stranded DNA" method. To enter gure 8.

9 RNA

To call up the "RNA" method. To enter gure 9.

6 Oligo

To call up the "Oligonucleotide" method. To enter gure 6.

4 Protein

To call up the "Protein (direct photometric measurement)" method. To enter gure 4.

1 Bradford

To call up the "Bradford" and "Bradford micro" methods. To switch between the "Bradford" and "Bradford micro" methods. To enter gure 1. To call up the "Lowry" and "Lowry micro" methods. To switch between the "Lowry" and "Lowry micro" methods. To enter gure 2.

2 Lowry

57

5 Operation

3 BCA

To call up the "BCA" and "BCA micro" methods. To switch between the "BCA" and "BCA micro" methods. To enter gure 3. To call up the "OD 600 (measuring the bacteria density)" method. To enter gure 5.

5 OD 600

Parameter

To call up the programming level. To exit the programming level.

Function

To call up the function level. To exit the function level. To enter a point. To change the sample number. To enter gure 0.

0 Sample No.

Dilution

To enter the dilution. To move the cursor to the next line. (e.g. in the parameter list or function list).

Conversion

To calculate the molar concentration and the total amount of sample ("yield"). To move the cursor to the previous line. (e.g. in the parameter list or function list).

Clear

To delete entries.

Enter

To conrm entries.

Standard

To measure a standard.

Blank

To measure a blank.

Sample

To measure a sample.

58

5 Operation

5.2 Measuring nucleic acids

This description is valid for the following methods: dsDNA ssDNA RNA Oligo

Call up method

7 dsDNA

dsDNA P RO G R A M M E D FAC TO R : 1 A 260 = 5 0 . 0 g/mL

Blank

or

Sample

Calculation The factory-set factors are those which are normally used with nucleic-acid methods for the conversion of UV absorbance into concentration (in this example: 50). The factors can be changed using the Parameter key (see "Programming"). The number of decimal places of the result is determined by the number of decimal places of the programmed factor. If a unit of concentration other than g/mL is selected (e.g. g/ L), the BioPhotometer converts the factor internally in order to produce the correct result. Measuring solutions with absorbances lower than app. 0.02 to 0.03 A260 (corresponds to a DNA concentration of app. 1.0 ) should not be used. This is because with such to 1.5 g / m L low absorbance, disturbances such as small particles, microbubbles or turbidity have a great deal of inuence upon the measuring result and often lead to unreliable results. Measuring procedure Blank measurements remain stored until the date changes. If a blank has already been measured on the same day, the BioPhotometer offers the following in the last line of the display after method call-up: To measure a new blank or To measure a sample directly and to use the stored blank. If no blank has been measured on the same day, the instrument will only allow blank measurement.
dsDNA BLANK A

Measure blank

Blank

0.000
Blank

or

Sample

59

5 Operation

Measure sample

Sample

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A260 A 280 A 320

70.0
1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Results display As an indication of the purity of the nucleic acid sample which has been measured, the absorbance at 230, 280 and 320 nm as well as the ratios A260/A 280 and A260/A 230 are displayed in addition to the concentration result and the absorbance at a wavelength of 260 nm. With pure samples, the absorbance at 320 nm should be approximately zero. Turbid measuring solutions show increased absorbances for all wavelengths. These can adulterate the results. In such cases the inuence on the result can be partially corrected by switching on the "Corr. with A320" parameter. (Chapter 6.3 "Explanation of parameters") Measure next sample Sample dilution To measure the next sample, press the
Sample

key again.

The sample dilution in the measuring cuvette can be entered using the Dilution key before the measurement starts and is included automatically in the result calculation (see "Measuring diluted samples"). The most-recently measured concentration result can be converted into molar concentrations and/or into nucleic acid quantities (unit of mass or unit of mol):
C A L C. A M O U N T: TOTA L S A M P L E L C A L C. M O L A R I T Y: B A S E PA I R S MOL.MASS kDa

Conversion key

Conversion

Entering "TOTAL SAMPLE" The value entered is converted using the concentration measured. The result shown is the quantity of nucleic acid present in the sample. Entering "BASE PAIRS" or "MOL.MASS" It is sufcient to make an entry in only one of the two lines. The molar concentration is calculated using the value entered and the concentration measured. Input elds can be skipped using the
Enter

key.

60

5 Operation

1 Bradford 4 Protein 0 Sample No. Enter

3 BCA 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

Display after entry of "140 L sample volume" and "300 base pairs":
dsDNA SAMPLE 001 g/mL

70.0

353.5 pmol/mL 9.8 g 49.5 pmol

Enter

The molar unit of concentration (here: "pmol/mL") is preprogrammed, but can be selected and changed using the key. Parameter

5.3 Direct photometric measurement of protein

Call up method
4 Protein
P ROT E I N ABSORBANCE

Blank

or

Sample

Calculation For the "protein" method, the "absorbance" calculation mode is stored, i.e. only the absorbances which are measured directly appear in the display. Calculations via the following calculation procedures can be programmed using the Parameter key (see Section 6 "Programming"): Factor Standard (One-point calibration) Warburg formula The number of decimal places of the preprogrammed factor or the preprogrammed nominal concentration of the standard determines the number of decimal places in the result. When programming the factor, please ensure that the factor is adapted in line with the unit of concentration selected. Measuring solutions with absorbances lower than app. 0.02 to 0.03 A280 corresponds to a DNA concentration of app. 1.0 to 1.5 g / m Lshould not be used. This is because with such low absorbances, disturbances such as small particles, microbubbles or turbidity have a great deal of inuence upon the measuring result and often lead to unreliable results.

61

5 Operation

Measuring procedure The following example shows the measuring procedure for the "Absorbance" calculation mode. For details of the measuring procedure via standard (one-point calibration), please refer to "Measuring proteins with reagent". Blank measurements remain stored until the date changes (For further details, please refer to "Measuring nucleic acids"). Measure blank
P ROT E I N BLANK A

Blank

0.000
Blank

or

Sample

Measure sample

Sample

P ROT E I N

SAMPLE 001 A 0 . 2 4 5 A260 0 . 4 3 0 A 280 0 . 0 0 2 A 320

0.430

Results display In addition to the concentration result and the absorbance at the measuring wavelength of 280 nm, A260 and A320 appear in the display as an indication of the purity of the sample. The absorbance at 320 nm should be approximately zero. Turbid measuring solutions show increased absorbances for all wavelengths. These can adulterate the results. In such cases the inuence on the result can be partially corrected by switching on the "Corr. with A320" parameter. (Chapter 6.3 "Explanation of parameters") Measure next sample Sample dilution To measure the next sample, press the
Sample

key again.

Sample dilution in the measuring cuvette can be entered using the Dilution key before the measurement begins and is then included automatically in the following calculation of sample concentrations (see "Measuring diluted samples").

62

5 Operation

5.4 Measuring proteins with reagent (Bradford, BCA, Lowry)

Call up method
1 Bradford
C A L I B R AT I O N R A N G E XXX XXX g/mL BRADFORD

Blank

or

Standard

If a valid calibration (which is then stored by the device) has already been performed, the date and time of the stored calibration appear. In this case, the method can be recalibrated after blank measurement or the sample measurements may begin directly and can then be calculated using the previously stored calibration. Micro methods The Bradford, Lowry and BCA methods have a special feature: Two different concentration ranges may be programmed for each of these methods. It is possible to toggle between the two methods (e.g. "BCA" and "BCA micro") by pressing the method key repeatedly. Calculation For the Bradford, Lowry and BCA methods, the device contains a factory-set calibration procedure via multiple-point calibration and calculation of a calibration curve via non-linear regression. Other calculation methods may be programmed using the Parameter key (see Section 6 "Programming"): Factor (calculation of concentration values via factor). Absorbance (the measured values appear as absorbance values with no further calculation). The following parameters may be changed for the factory-set calculation procedure via standard (see "Programming"). Number of standards (1 to 10). Number of multiple measurements per standard (1 to 3). Calculation procedure for multiple-point calibration (linear or non-linear calibration). Nominal concentrations of the standards. The number of decimal places of the preprogrammed factor or the preprogrammed nominal concentration of the standard determines the number of decimal places in the result. In the case of calculation via factor, please ensure that the factor is adapted in line with the unit of concentration selected.

63

5 Operation

Measuring procedure Blank measurements remain stored until the date changes (For further details, see "Measuring nucleic acids"). Standard measurements remain stored until they are overwritten with new standard measurements. For the calculation of sample measurements, the most-recently stored calibration is used. In the following example, multiple-point calibration with 5 standards in double determination and calibration calculation via non-linear regression was programmed as a calculation procedure for the Bradford method:
BRADFORD BLANK A

Measure blank

Blank

0.000
Blank

or Sample

Standard

Measure standards

Standard

BRADFORD

STD 11 XXXX g/mL A

X.XXX
N E X T:

Standard 1 / rst measurement

STD 12 XXXX g/mL

The rst two lines of the display contain the standard that has just been measured. The last two lines of the display contain the next standard which is to be measured, with the nominal concentration.
BRADFORD STD 12 XXXX g/mL A

Standard

X.XXX
N E X T:

Standard 1 / second measurement

STD 21 XXXX g/mL

Device display following all standard measurements:

64

5 Operation

BRADFORD

STD 52 XXXX g/mL A

X.XXX
C V: 2 . 8 %

C A L I B R AT I O N S TO R E D

The CV (coefcient of variation) is a measure of the scattering of standard values around the regression curve. If the CV is smaller than 10 %, the calibration is stored automatically. If the CV is greater than 10 %, the question "STORE? ENT/CLR" appears, and you may then accept or delete the calculated calibration. Sample measurements are calculated using the most-recent valid calibration.
BRADFORD SAMPLE 001 g/mL X . X X X A5 9 5

Measure sample

Sample

X.XXX

Results display In addition to the concentration result, the absorbance at the respective wavelength (for Bradford: 595 nm) appears in the display. Measure next sample Sample dilution To measure the next sample, press the
Sample

key again.

Sample dilution in the measuring cuvette can be entered using the key before the measurement begins and is then included Dilution automatically in the result calculation (see "Measuring diluted samples").

65

5 Operation

5.5 Measuring OD 600

Select method
5 OD 600
OD600

Blank

or

Sample

Measuring procedure Blank measurements remain stored until the date changes (for further details, see "Measuring nucleic acids").
OD600 BLANK A

Measure blank

Blank

0.000
Blank

or

Sample

Measure sample

Sample

OD600

SAMPLE 001 A

0.430

Measure next sample Sample dilution

To measure the next sample, press the

Sample

key again.

Sample dilution in the measuring cuvette can be entered using the Dilution key before the measurement begins and is then included automatically in the result calculation (see "Measuring diluted samples"). The OD 600 measurement is a stray-light measurement; the result is therefore heavily dependent on the geometry of the light path, which may vary between photometers from different manufacturers.

66

5 Operation

5.6 Measuring diluted samples

Sample dilutions may be entered using the Dilution key before the measurement begins. When the result is calculated and displayed, the dilution factor is included automatically. In the following example, a blank has already been measured:
dsDNA BLANK A

0.000
Blank

or

Sample

Enter dilution

dsDNA

SAMPLE 001

Dilution
SAMPLE+DILUENT + L

2 Lowry 0 Sample No. Enter

1 Bradford 8 ssDNA 0 Sample No. Enter

dsDNA

SAMPLE 001

2 0 + 1 8 0 L

Blank

or

Sample

Measure diluted sample

Sample

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A 260 A 280 A 320

70 0.0
2 0 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

The sample dilution is included in the result. The dilution factor entered remains stored for the calculation of further sample results until it is overwritten. Deleting dilution entry To delete the dilution factor, press the Dilution key again. The values for "Sample" and "Diluent" are then deleted using the Clear key or are overwritten with "zero".

67

5 Operation

5.7 Changing the sample number

During sample measurements, the serial number of the sample appears in the top right of the display. The sample number is counted separately for each method and is reset to "1" when the date changes. The sample number can be changed as desired (e.g. for repeat measurements):
dsDNA SAMPLE 005 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A 260 A 280 A 320

70 .0
2 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Change sample number

0 Sample No.

dsDNA

SAMPLE 005

3 BCA

dsDNA

SAMPLE 003

Enter

Blank

or

Sample

For the next sample to be measured, the sample number was set to "3". Additional samples are counted serially from the newly-entered number onwards.

68

6 Programming

6.1 Programming procedure

For each method, parameters such as the type of calculation or the unit of concentration are stored. The factory-set method programs can be changed using the Parameter key.
OLIGO P RO G R A M M E D FAC TO R : 1 A 260 = 3 0 . 0 g/mL

Call up method

6 Oligo

Blank

or

Sample

Call up parameter list

OLIGO

PAG E 1 3 30.0 OFF * ON

Parameter
FAC TO R C O R R . W I T H A 320 . . . . . . . . . . . .

There are different parameter lists for the various different methods, all of which can be modied (see Section 6.2 for overview). The parameters for the "Oligo" methods extend across three pages of the device display. Example: Changing the factor Any numbers that are entered are stored by pressing Enter factor and store
2 Lowry 0 Sample No. Function 0 Sample No. Enter
OLIGO FAC TO R C O R R . W I T H A 320 . . . . . . . . . . . . PAG E 1 3 20.0 OFF * ON

Enter

After the factor has been stored, the cursor moves to the next parameter-selection block ("Correction with A320").

69

6 Programming

Example: Changing the unit Selection parameters are selected using the cursor keys and conrmed by pressing Enter . The stored setting is marked with an asterisk (*): Select parameter
OLIGO PAG E 2 3 g/mL * ng/ L g/ L pmol/ L * mol/L

Dilution

UNIT . . . . . . . . . . . . . . . . . M. UNIT . . . . . . . . . .

Store parameter

OLIGO

PAG E 2 3 g/mL ng/ L g/ L * pmol/ L * mol/L

Enter
UNIT . . . . . . . . . . . . . . . . . M. UNIT . . . . . . . . . .

After the unit of concentration"g/ L" has been stored, the cursor moves to the next selection block ("molar unit"). Exit parameter level To exit the parameter level, select the line "PARAMETER END" and press Enter . Alternatively, press the Parameter key from any parameter line.
OLIGO

Parameter
P RO G R A M M E D FAC TO R : 1 A 260 = 2 0 . 0 g/mL

Blank

or

Sample

70

6 Programming

6.2 Overview of parameters

dsDNA ssDNA RNA Oligo Protein Bradford Brad.micro Lowry Low.micro BCA BCA micro Absorbance Standard Factor OD 600

Calculation

(Point 1)

(Point 1)

Absorbance Standard Factor Warburg formula Off On mg/mL g/mL

(Point 1)

Correction with A320 Unit

Off On g/mL ng/ L g/ L L pmol/ mol/L pmol/mL 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

Off On g/mL ng/ L g/ L pmol/ L mol/L 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

mg/mL g/mL g

(Point 2)

Molar unit

Cuvette

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

(For "Factor" calculation only:) Factor Entry of numbers Entry of numbers Entry of numbers Entry of numbers Entry of numbers

(For "Standard" calculation only:) No. of standards Std. measurement Regression (Point 4) Standard Entry of numbers (Point 3) 1x 2x 3x Entry of numbers 1x 2x 3x Linear Non-linear Entry of numbers

Point 1: Point 2: Point 3: Point 4:

No selection possible; "Factor" calculation is preprogrammed. No selection possible; the unit "Absorbance" is preprogrammed. No selection possible; the number of standards "1" is preprogrammed. Selection possible only if at least "4" (or, for the single determination of the standard, at least "5") has been entered for the "Std. number" parameter.

71

6 Programming

6.3 Explanation of parameters

Parameters are dened as selection parameters or as parameters for entering numbers. In the case of selection parameters, the programmable alternatives are method-dependent (see overview in previous section). Parameter Calculation Entries Selection Explanation Selection of calculation procedures: Absorbance, Factor, Standard and Warburg formula. In the case of calculation using the Warburg formula, the measured value for A260 is marked in the results display and on the results printout with a " ". (Only when the calculation process "Factor" has been selected) Entering a factor; the number of decimal places determines the number of decimal places in the result. (Only for nucleic acid methods and for the direct photometric determination of protein) Selection from "Corr. with A320 off" and "Corr. with A320 on"; "Corr. on" means: the absorbance measured at 320 nm is subtracted from the absorbance results at 260, 280 and 230 nm. Example of application: Correction of turbidity in the sample. When the correction function is switched on, the measuring value for A320 is marked with a " " in the results display and on the results printout. The selection from preprogrammed concentration units is method-dependent. Selection is method-dependent (for nucleic acid measurements only); is required for the conversion of the concentration into molar concentrations ( Conversion key). Selection from 10 mm, 5 mm, 2 mm and 1 mm optical path length; the result is converted for an optical path length of 10 mm (see Section 12 "Calculation").

Factor

Entry of numbers (ve-gure)

Corr. with A320

Selection

Unit

Selection

M. unit (molar unit)

Selection

Cuvette

Selection

72

6 Programming

The following parameters are offered only when the "Standard" calculation procedure has been programmed: Parameter Std. number Entries Entry of numbers ("1" to "10") Selection Explanation Number of different standards.

Std. measurement

Selection from "1x", "2x", "3x" repeat measurement of each standard; a mean value is formed for the further calculation using the repeat measurements. (Only for standard number of at least 4 (for single determination of standards: 5)) Selection from the calculation procedure linear and non-linear regression. For a number of standards greater than 1 and lower than 4 (or 5 respectively), calculation always takes place via linear regression (See Section 12, "Calculation"). Entry of nominal values of standard concentrations; the number of decimal places of the nominal concentration for the rst standard determines the number of decimal places in the result.

Regression

Selection

Std. 1 to Std. 10

Entry of numbers (ve-gure)

73

6 Programming

74

6.4 Factory-set programmed values

RNA
Absorbance Standard

dsDNA

ssDNA

Oligo

Protein

Bradford

Lowry

BCA

50.0 off 1x2)

non-linear
3) g/mL

37.0 off 6 1x g/mL 100 250 500 750 1000 1500 1.00 2.5 5 10 15 25 100 250 500 750 1000 1500 1.00 2.5 5 10 15 25 g/mL g/mL g/mL 6 1x 6 1x 6 1x 8 1x g/mL

40.0 off

30.0 off

- - - - - 1) off

- - - - - 1)

Bradford micro Standard - - - - - 1) Standard - - - - - 1) Standard - - - - - 1) 5 1x g/mL 0.50 2 5 10 20

Lowry micro Standard - - - - - 1)

BCA OD 600 micro Standard - - - - - 1) 1.000

non-linear non-linear non-linear non-linear non-linear

g/mL pmol/mL - - - - - 4)

Calculation Factor Corr. with A320 Std. number Std. measurmnt. Regression Unit Molar unit Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 Standard 6 Standard 7 Standard 8 Cuvette 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 25 125 250 500 750 1000 1500 2000 10 mm

g/mL g/mL g/ L pmol/mL pmol/mL pmol/ L

10 mm

10 mm

10 mm

10 mm

Notes:

1) 2) 3) 4)

With"Factor" calculation: Input required from user With "Standard" calculation With "Standard" or "Factor" calculation With "Standard" calculation: Input required from user

7 Functions

Functions list Function Display results Entries Call up using

Enter

Explanation . Display of the last 100 results (The most-recent result appears rst):
Conversion Enter Dilution

: To select the results. To print out the results that have just been displayed. To return to the functions list.

: :

Function

Calibration report

Call up using

Enter

Printout of the calibrations stored;

Conversion Enter Function Dilution

: To select the method. To print out the calibration report. To return to the functions list. To store. To store.

: : : :

Date Time Stored absorbance

Entry of gures Entry of gures Call up using

Enter

Enter

Enter

To print out the most-recently measured absorbances (max. 100 measurements). Mean value, standard deviation and CV are calculated and printed out for the values of the most-recently measured method. To perform measurement and precision calculation of ten consecutive measuring values of one sample. For evaluation purposes, the method program of the mostrecently selected method method is used. To check the photometric accuracy and the wavelength accuracy (see Sec. 13, "Testing the photometer"). Selection of language version; Please note that "English" and "U.S.English" differ due to the format of the date.

Precision measurement

Call up using

Enter

Photometer test

Call up using

Enter

Sprache Deutsch Language English Language U.S.English langue franaise Printer DPU 414 Printer serial

Selection

Selection

DPU 414: To connect the Eppendorf thermal printer DPU 414 (see Section 4.2, "Printer"). serial: To connect another printer (see Section 4.2, "Printer"). Function is accessible to service technicians only.

Service

75

7 Functions

Example: Changing the language version Call up functions list

Function
FUNKTION SEITE 14

ERGEBNISSE ANZEIGEN K A L I B R AT I O N S R E P O RT DAT U M UHRZEIT 27.06.1998 20:44

Select desired function

FUNKTION

SEITE 34

Dilution

S P R AC H E D E U T S C H * L A N G UAG E E N G L I S H L A N G UAG E U. S. E N G L l a n g u e franaise

Store function

FUNCTION

PAG E 4 4 *

Enter
PRINTER DPU 414 PRINTER SERIAL S E RV I C E FUNCTION EXIT

To exit the function level, either select the line "FUNCTION EXIT" and press Enter or press the Function key from any line of the functions list. The BioPhotometer then returns to the last method selected. Exit function level
Function
OLIGO P RO G R A M M E D FAC TO R : 1 A 260 = 2 0 . 0 g/mL

Blank

or

Sample

76

8 8 Error Error messages, messages, result result agging agging and help and texts help texts

Result agging
Flagging 1.586 A260 Explanation Flagging of A260 in the display or on the printout (for method "Protein direct" only): The method was calculated using the Warburg formula. Flagging of A320 in the display or on the printout (for method "Protein direct" and for nucleic acid methods only): The absorbances at 260, 280 and 230 nm are corrected with the absorbance at 320 nm (see Section 6, "Programming").

0.015 A320

Error texts in the results display

Error text +++++ Explanation / Cause The absorbance measured is greater than 3.0 A. Solution Dilute the sample. Check the cuvette (height of light path must be 8.5 mm). Clean the cuvette shaft (see Section 9). Insert the cuvette correctly (the measuring window must be facing the light path). Use a cuvette made of material that transmits light at the measuring wavelengths used (e.g. quartz glass or UVette from Eppendorf for nucleic acid measurement). ! ! ! ! ! The calculated result cannot be displayed (value too high). Check the parameter (Is the factor too high?).

(Instead of a value for the ratio:) Repeat the measurement Ratio cannot be calculated because one of (dilute sample if necessary). the absorbance values used for calculating the ratio is 0 A or > 3.0 A.

77

8 Error messages, result agging and help texts

Error texts in measuring procedure

Error text Measure blank rst Explanation / Cause No blank has been measured for the method selected. No valid calibration for the method selected. Solution Measure the blank.

Measure standard rst

Measure standards. Program a different calculation (xed factor or direct absorbance measurement). Repeat the measurement (dilute sample if necessary).

not within calibration

(For calculation via non-linear regression only:) The sample result is not within the calibration range. Different errors in measurement module.

Measurement module Error 1 Measurement module Error 2 Measurement module Error 3

Contact Service.

Error texts in calibration procedure

Error text No STD method Explanation / Cause The Standard measuring key was pressed although "Standard" was not programmed as a procedure for the method selected. Solution Re-measure the methods without standard request. Program the "standard" calculation. Re-measure standard. (Prepare again if necessary). Check standards and re-measure in the correct sequence (ascending concentration). Check standards and re-measure in the correct sequence (ascending concentration).

Measured values not plausible Measured values not monotonous

(For one-point calibration:) Absorbance measured is 0 A. (For multiple-point calibration:) The measured values do not produce monotonously rising or falling sequences. (For non-linear regression:) The calculated curve is not monotonous.

Calibration curve is not monotonous

78

8 Error messages, result agging and help texts

Error text CV greater than 10 %

Explanation / Cause (Following standard measurements:) The scattering of the measured values around the calculated calibration line or curve is very large (see Section 12, "Calculation").

Solution Check calibration result.

Enter

: Store calibration.

: Abort calibration. Recalibrate or use the calibration stored.

Clear

Error texts in programming procedure

Error text Method parameter incorrect. Please check Please program standards ascending Explanation / Cause Method parameters incorrectly entered. Solution Check parameters and re-enter them if necessary. Check programming and enter nominal values in ascending order.

(For multiple-point calibration:) Standard nominal values have not been programmed in ascending order.

Other error texts

Error text Entry invalid Explanation / Cause Solution

(When a serial sample number is entered Enter a number within the specied 0 via the Sample key:) range. No. A number outside of the range 1 to 999 has been entered.

Help texts
Error text Please program standard Explanation / Cause (In the display after method selection:) For the method selected, the calculation "Standard" has been programmed; but the nominal concentrations for the standards have not yet been programmed. Solution Program nominal concentrations for the standards ( Parameter key). Program another calculation without standards. Program the value for the factor ( Parameter key). Program another calculation.

Please program factor

(In the display after method selection:) For the method selected, the calculation "Factor" has been programmed; but the value for the factor has not yet been programmed.

79

9 Maintenance and cleaning

Photometer

Disconnect the device from the main power source before carrying out maintenance work or to change the fuses. The inside of the device is a high-voltage area. Danger! Wipe the entire device using a moist cloth and a mild cleaning agent. Disinfect the device using a lightly moistened cloth and a 70 % ethanol/water mixture. Do not allow any liquid to enter the device.

Cuvette shaft

Clean the cuvette shaft using a moist cotton swab only. Do not use large quantities of liquid (e.g. spray bottles). When the device is not being used, protect the cuvette shaft from dust using the seal provided. Dust or residue from the measuring solutions in the optical light path can cause inaccurate measurements.

Changing the fuses Disconnect the device from the mains supply. The fuse holder is located above the mains connection (see picture in Sec. 4.1). The holder is held in position by a small elastic stop lever on its underside. Push the stop lever upwards and pull out the holder. Change the fuses (for specications, see Sec. 2, Technical data ). Press the holder into the attachment until the stop lever clicks into place. Plug the device into the mains supply.

80

10 Short instructions

Preparation
The BioPhotometer is ready to measure immediately after being switched on.

Methods

7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford

8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

9 RNA 6 Oligo 3 BCA

7 dsDNA

8 ssDNA

9 RNA 6 Oligo

dsDNA ssDNA RNA Oligo Direct measurement of the nucleic acids at 260 nm. Ratios A260/A 280 and A260/A 230. Optional correction of absorbance values via A320. Measurement using quartz-glass cuvette or UVette from Eppendorf. OD 600 Direct measurement of the density of bacteria suspensions at 600 nm (turbidity measurement). Measurement using glass cuvette or plastic cuvette. Protein Direct measurement of protein at 280 nm. Direct measurement of the absorbance, or calculation via factor, standard or Warburg formula. Optional correction of absorbance values via A320. Measurement using quartz-glass cuvette or UVette from Eppendorf.

5 OD 600

4 Protein

1 Bradford

2 Lowry

3 BCA

Bradford Lowry BCA Bradford micro Lowry micro BCA micro Measurement of protein using Bradford-, Lowry- or BCA reagent. Direct measurement of the absorbance, or calculation via factor or calibration (single-point calibration, linear regression or non-linear regression). Number and nominal values of the calibrators are programmable. The protein methods are also available on a micro-scale (Press the Method key twice). Measurement using glass cuvette or plastic cuvette.

Cuvettes
Basic area 12.5 mm x 12.5 mm Min. overall height 36 mm

UVette

Ultra-micro

Semi-micro

Macro

Suction

Min. lling level Light path Max. height of base Min. volume

10 mm 8.5 mm 7 mm 0 mm 50 L 70 L 400 L 1000 L 300 L

81

10 Short instructions

Programming
The factory-set method programs may be changed as required. Example: Programming of the unit "g/mL" and of calculation via standard (500g/mL) for the Protein method.
P ROT E I N ABSORBANCE

Select Protein method

4 Protein
Blank P ROT E I N C A L C U L AT I O N or Sample PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R B U R G *

Begin programming

Parameter

P ROT E I N

PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R B U R G *

Select calibration with standard (STD)

C A L C U L AT I O N

Dilution

or

Conversion

P ROT E I N

PAG E 2 4 OFF * ON

CORR.WITH A320

Conrm
(After conrmation, the display moves to the next selection block)

Enter

STD MEASUREMENT 1 x * 2 x 3 x P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL * g/mL - - - mg/mL

Select the unit g/mL

Dilution

or

Conversion

STD

P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL g/mL * - - - - g/mL

Conrm

Enter
STD

P ROT E I N CUVETTE

PAG E 4 4 10 5 2 1 mm mm mm mm *

Enter standard concentration and conrm

(After conrmation, the display moves to the next selection block)

5 OD 600

Sample No. Sample No. Enter

PA R A M E T E R E N D

End programming
82

Parameter

10 Short instructions

Measuring procedure for dsDNA

dsDNA P RO G R A M M E D FAC TO R 1 A260 = 50.0 g/mL

Select dsDNA method

7 dsDNA

Blank

or

Sample

dsDNA

BLANK A

Measure blank

Blank

0.000
Blank

or

Sample

When the sample is diluted: Example: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

dsDNA

SAMPLE 001

20+200 L

Enter
Blank or Sample

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A230 A260 A280 A320

563.20
Measure sample
Sample
1.97 2.03 20+200 L
260/ 280 260/ 230

If the result of the sample is to be converted:

1 Conversion Enter
C A L C : M O L A R I T Y: B A S E PA I R S 300 MOL.MASS 198 kDa

Bradford

4 Protein

0 Sample No.
C A L C : A M O U N T: TOTA L S A M P L E 140 L

3 BCA Enter

0 Sample No.

0 Sample No.

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL

563.20
Enter

20+200 L 79 g 2843 pmol/mL 398 pmol

dsDNA

SAMPLE 002 g/mL 0.689 0.788 0.623 0.003 A230 A260 A280 A320

Measure next sample

249.70
Sample
1.85 2.19 20+200 L
260/ 280 260/ 230

83

10 Short instructions

Bradford measuring procedure

BRADFORD C A L I B R AT I O N R A N G E 100 2000 g/mL

Select Bradford method

1 Bradford

Blank

or

Standard

If "Bradford micro" is to be selected:

1 Bradford

B R A D. m i c r o C A L I B R AT I O N R A N G E 1.0 20.0 g/mL

Blank

or

Standard BRADFORD BLANK A

Measure blank

Blank

0.000
Blank

or Sample

Standard

BRADFORD

STD 1 100 g/mL A

Measure rst standard

Standard

0.048
N E X T:

STD 2 200g/mL STD 6 2000 g/mL A

BRADFORD

Measure last standard

Standard

1.325

When the sample is diluted: Example: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

C V: 2 . 8 % C A L I B R AT I O N S TO R E D BRADFORD SAMPLE 001

20+200 L or Sample

Enter

Blank

Standard

BRADFORD

SAMPLE 001 g/mL 0.352 A595

Measure sample

368
Sample
20+200 L

BRADFORD

SAMPLE 002 g/mL 0.525 A595

Measure next sample

552
Sample
20+200 L

84

11 Ordering information

11.1 Ordering information

Order no. 6131 000.012 Photometer BioPhotometer (230 V; 50/60 Hz; European plug) (additional power supply variants available) BioPhotometer Software Package for online data transfer on PC Secondary UV-VIS lter, Test Filter Set, for checking the BioPhotometer Printer Thermal Printer DPU 414, incl. power supply 230 V unit and printer cable Thermal paper (5 rolls) Converter cable, 2029, cable for connecting parallel printer UVette (Disposable plastic cuvette for the UV / VIS range, 220 to 1,600 nm) UVette, 80 pcs., individually packaged Cuvette stand for 16 cuvettes

6131 810.006 6131 928.007

6131 011.006 0013 021.566 6131 071.009

0030 106.300 4308 078.006

11.2 Ordering information for USA and Canada

Order no. Photometer 952 00 000-4 952 01 020-4 952 01 022-1 BioPhotometer BioPhotometer Software Package, for online data transfer to PC Secondary UV-VIS Filter Test Set, for verifying photometric precision and the wavelength accuracy (NIST Traceable) Printer 952 01 015-8 952 01 017-4 952 01 016-6 952 01 018-2 952 01 040-9 952 01 057-3 Thermal Printer DPU-414, requires power supply unit and printer cable Power Supply Unit for Thermal Printer DPU-414, 115 V Power Supply Unit for Thermal Printer DPU-414, 230 V Printer Cable, for connecting serial printer Printer Paper, 5 rolls Printer Cable, for connecting parallel printer UVette* 952 01 005-1 940 00 110-2 UVette, 80 original Eppendorf disposable, individually packaged cuvettes Cuvette Stand * U.S. Patent No. 6,249,345

85

12 Calculation

12.1 Nucleic acids (dsDNA, ssDNA, RNA, oligo)

Calculation via factor C = A260 x F C = Calculated concentration A260 = Absorbance measured at 260 nm F = Factor (method-specic programming using the

Parameter

key)

The nucleic acid methods have the following special feature: The programmed factor is always based on the unit of concentration "g/mL". If the unit of concentration " g/ L" is selected, the factor is converted internally: F = F / 1000 F = Converted factor; used for the calculation of the concentration.

Sample dilution CDil, corr = C x (VP + VDil) / V P CDil, corr = Result converted using dilution factor VP = Volume of the sample in the measuring solution (entered using the VDil = Volume of the diluent in the measuring solution (entered using the

Dilution

Dilution

key) key)

Optical path length of the cuvette Application: Using cuvettes with an optical path length of 1 mm, 2 mm or 5 mm. The optical path length of the cuvette can be programmed for each method using the Acuv, corr = A x 2 (with an optical path length of 5 mm) Acuv, corr = A x 5 (with an optical path length of 2 mm) Acuv, corr = A x 10 (with an optical path length of 1 mm) Acuv, corr = Absorbance converted in accordance with an optical path length of 10 mm Correction A320 Application: Partial correction of incorrect absorbance caused by turbidity in the measuring solution. The calculation procedure with or without correction A320 can be programmed for each method using the Parameter key. Ax, corr = Ax - A320 Ax, corr = Absorbance at wavelength of 230, 260 and 280 nm, corrected mathematically Ax = Absorbance measured at wavelength of 230, 260 and 280 nm A320 = Absorbance measured at wavelength of 320 nm The corrected absorbance is used for further calculation of results.
Parameter

key.

Conversion key: Calculating the quantity Application: Calculating the quantity of nucleic acid in the total sample volume. M = C x VP, total

M = Calculated overall quantity of nucleic acid in sample vessel C = Calculated concentration VP, total = Volume of the sample in the sample vessel (entered using the

Conversion

key)

86

12 Calculation

Conversion key: Calculating the molar concentration Application: Calculating the molar concentration from the mass concentration and the relative molar mass. The molar mass is either entered directly or calculated by the device using the number of bases / base pairs per molecule. Cmol = C / N Cmol = Molar concentration (calculated) N = Relative molar mass, in kDa (entered using the key)

Conversion

If, instead of the relative molar mass, the number of bases / base pairs per molecule has been entered, N is calculated using the number of bases / base pairs: dsDNA: N = bp x 2 x 330 x 10-3 ssDNA, RNA, Oligo: N = b x 330 x 10-3 N = Calculated relative molar mass, in kDa bp = Number of base pairs per molecule (dsDNA) b = Number of bases per molecule (ssDNA, RNA, Oligo) The unit for molar concentration is programmed for each method using the
Parameter

key.

12.2 Direct photometric determination of protein

Selection for calculation of results: Absorbance Calculation of the concentration via factor Calculation of the concentration via one-point calibration Calculation of the concentration via Warburg formula

Calculation of the concentration via factor See Section 12.1; Measuring wavelength: 280 nm When the factor is entered using the be taken into consideration.
Parameter

key, the unit of concentration which has been programmed must

Calculation of the concentration via standard (one-point calibration) F = CS / A S F = Calculated factor CS = Nominal concentration of the standard (method-specic programming using the AS = Measured absorbance of the standard

Parameter

key)

If the standard multiple measurement (2x, 3x) has been programmed, calculation is based on the absorbances measured, including the zero value, via linear regression. After the regression has been calculated, a CV (coefcient of variation in "%") value is formed as a measure of the scattering of the measured values. If the CV value is greater than 10 %, it appears in the display. In this case, the calibration is not stored automatically; it must rst be conrmed by the user (see Section 12.3). The calculation of the sample concentration is carried out using the calculated factor: C = A280 x F

Calculation of the concentration via Warburg formula C = 1.55 x A280 - 0.76 x A260 for "mg/mL" concentration unit C = (1.55 x E280 0.76 x A260) x 1000 for "g/mL" concentration unit

87

12 Calculation

Sample dilution, optical light path of the cuvette and correction A320 See Section 12.1.

12.3 Protein with addition of reagent

Methods: Bradford, Bradford micro, BCA, BCA micro, Lowry, Lowry micro Selection for the calculation of results: Absorbance Calculation of the concentration via factor Calculation of the concentration via standard Selection for the calculation procedures via standard: One-point calibration Multiple-point calibration (standard line) Multiple-point calibration (standard curve) Calculating the concentration via factor and calculating the concentration via standard (one-point calibration) See Section 12.2; Measuring wavelength: 595 nm (Bradford; Lowry) or 562 nm (BCA) Calculating the concentration via standard (multiple-point calibration; calibration line) A calibration line (concentration as a function of the absorbance) is calculated from 2 to 10 standards, which are measured in single, double or triple determination. The equation of the line is calculated via linear regression. C = ao + a1A a1 = Slope of the calibration line (Factor) ao = Intersection point of the calibration lines with the concentration axis (concentration of a sample with the absorbance "0" [Offset]) After the calibration has been calculated, the CV value (coefcient of variation in "%") is calculated (exception: two-point calibration with single determination of the two standards). The CV value is a measure for the scattering of the measured values around the calculated calibration line. If the value is greater than 10 %, the calibration is not stored automatically; it must rst be conrmed by the user. In the case of more than two standards, the CV value always appears in the display (even when the value is lower than 10 %). The calculated parameters ("ao" and "a1") of the stored calibration line can be printed out by calling up the functions list by pressing the key.
Function

Calculating the concentration via standard (multiple-point calibration; calibration curve) A calibration curve (concentration as function of the absorbance) is calculated from 5 to 10 standards measured in single determination or from 4 to 10 standards measured in double or triple determination. The non-linear regression is calculated via a third-grade polynomial. C = ao + a1A + a2A2 + a3A3 + . . . a = Coefcients (The coefcients are determined using the least square method).

CV value: see above (linear regression). The calculated parameters of the stored calibration line can be printed via the
Function

key.

88

12 Calculation

Sample dilution and optical light path of the cuvette See Section 12.1.

12.4 OD 600
The measured values appear as absorbance values measured at a wavelength of 595 nm.

Sample dilution and optical light path of the cuvette See Section 12.1.

89

13 Testing the photometer

To enable the photometric accuracy and the wavelength accuracy to be tested, a lter set (secondary UV-VIS lter) is available from Eppendorf. This set contains three lters ("Sample A1", "Sample A2" and "Sample A3") for testing the photometric accuracy and two lters ("Sample 260 nm" and "Sample 280 nm") for testing the wavelength accuracy. The absorbance of the lters is measured against a blank lter ("Blank A0"). To carry out these measurements, blank lters and "sample lters" (test lters) are inserted into the cuvette holder in the same manner as cuvettes. When doing so, please ensure that the label with the lter description is facing the user. The absorbance values measured for the test lters are compared to those within the range of permitted values. The limits for the permitted range are contained in a table found on the inside of the lid of the lter box (see Figure: "X.XXX X.XXX A").

BioPhotometer
Secondary / Sekundr - UV - VIS - Filter Limits Grenzwerte 6131 Filter Type 914XXX Blank A0 measured against Blank A0 at approx. 20 C gemessen gegen Blank A0 bei ca. 20 C 921XXX Sample A1 922XXX Sample A2 Photometric accuracy Photometrische Richtigkeit 230nm 260nm 280nm 320nm 562nm 595nm 230nm to/bis 595nm 0.000 A 3.0 % 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 923XXX Sample A3

Function: PHOTOMETERTEST Order No./Best.Nr.: 6131 928.007 traceable to NIST rckfhrbar auf NIST 916XXX Sample 260 nm 917XXX Sample 280 nm

Wavelength accuracy Wellenlngenrichtigkeit

0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A Photometric precision Photometrische Przision 1.0 % 1.5 %

empty X.XXX - X.XXX A

___________________________ Date Datum Signature Unterschrift

Please protect against dust, heat and liquid The limits are valid for max. 2 years Bitte vor Staub, Hitze und Flssigkeiten schtzen Die Grenzwerte gelten fr max. 2 Jahre ab Datum.

eppendorf

Fig.: Inside of the lid of the lter box

90

13 Testing the photometer

Test procedure Carry out the test at approximately 20 C. Remove the lter from the lter box for a brief period only. Make sure that the surface of the lter is not contaminated or damaged. Protect the lter from dust, heat, liquid and aggressive vapors. When inserting the lter, ensure that the label with the lter description is facing the user. Select the function "Photometer test". This function is contained in devices with a software version of V 1.20 onwards. Contact Eppendorf before using the test lter with an older software version. Select the test lter. "A1", "A2" or "A3" for the measurement of the photometric accuracy at 230, 260, 280, 320, 562 and 595 nm. "A260" or "A280" for the measurement of the wavelength accuracy at 260 or 280 nm. Follow the instructions in the photometer display for the measurement of "Blank" and "Sample". The device carries out 10 measuring cycles and then prints out the mean values for the absorbances at the respective wavelengths. Compare the absorbance values with the permitted value range. In addition to information on accuracy values, the printout contains details of precision as well. The standard deviation and the CV are calculated from each of the ten measurements. If the absorbances measured are not within the permitted value range, please contact the Service Department at Eppendorf. The lters should be recalibrated by Eppendorf after two years.

91

Conformity Declaration for BioPhotometer 6131 in accordance with enclosure 15 of "Eichordnung" (German standardization regulations) Description of measurement Device used: Type: Manufacturer / Distributor: Mode of instruction: 1. Measuring system Light path: Light source: Spectral apparatus: Radiation receiver: Cuvette: Cuvette types: Single-beam lter photometer with reference beam and xed wavelengths BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Hamburg Operating manual

Lamp > aperture > lens > aperture > cuvette > aperture > diffraction grating > aperture > photodiode Xenon ash lamp Continuum spectral range 220 to 2,000 nm Grating polychromator Silicon photodiode Spectral range 200 to 1,100 nm Quartz glass, optical special glass or plastic, depending on measuring wavelength 10 mm macro min. vol. 1000 l 10 mm semi-micro min. vol. 400 l 10 mm suction min. vol. 300 l 10 mm ultra-micro min. vol. 70 l Not available Illuminated, graphic LCD, 33 x 66 mm2 Absorption, mass concentration, molar concentration

Cuvette temperature: Results display: Measured values displayed: 2. Measuring procedures Determination of the cuvette blank: Concentration determination: Reference measurement on reference material:

Wavelength-dependent individual measured value of the cuvette used Lambert-Beer-Bourguer law Check with calibrated secondary standards

3. Measuring range of the spectral absorption rate 0.000 to 3.000 A The error limits listed can be exceeded outside these measuring ranges as well as with nominal conditions of use other than those listed below. 4. Nominal conditions of use Cuvette blank: Wavelengths: Warm-up time: Supply voltage: Ambient temperature: Relative humidity:

Depending on cuvette used Xenon 230, 260, 280, 320, 562, 595 nm None 100 to 240 V 10 %, 50 to 60 Hz 5 % 15 to 35 C 15 to 70 %

5. Error limits and other limiting values Relative photometric uncertainty of the spectral absorption rate with all wavelengths for an individual measurement: 1.5 % at 1 A Relative photometric short-time standard deviation: Wavelength systematic error: Spectral half-intensity width: Integral fault-radiation level:

0.5 % at 1 A 1 nm at 230 to 280 nm, 2 nm at 320 to 595 nm 5 nm at 230 to 320 nm, 7 nm at 562 and 595 nm 0.03 % at 260 nm with GG 375-3 (Schott)

Date: 25.09.2000 Eppendorf AG Quality and standards

92

Sommaire

1 2 3 4 4.1 4.2 4.3 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 6.1 6.2 6.3 6.4 7 8 9 10 11 12 12.1 12.2 12.3 12.4 13

Prsentation de l'appareil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Spcications techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Consignes de scurit et mise en garde contre certains risques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Installation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . BioPhotometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Imprimante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cuves optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 100 101 102

Mode d'emploi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Clavier. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Dtermination des acides nucliques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 105 Dtermination photomtrique directe des protines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Dtermination de protines aprs ajout de ractif (Bradford, BCA, Lowry) . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Dtermination des OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Dtermination d'chantillons dilus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Modication du numro d'chantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Programmation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Principes de la programmation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Tableau des paramtres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Explication des paramtres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Tableau des valeurs programmes d'origine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 Fonctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Messages d'erreur, reprage des rsultats et textes auxiliaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Nettoyage et maintenance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 Mode d'emploi succinct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Nomenclature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 Exploitation des rsultats et conversions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Acides nucliques (ADNds, ADNss, ARN, Oligo)) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Protines directes par photomtrie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . Protines par ajout de ractif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . OD 600 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 132 133 134 135

Contrle du photomtre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 Certicat de conformit du BioPhotometer 6131 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

93

1 Prsentation de l'appareil

8 2 7

3 1 2 3 4

5 5 6 7 8 Touche dilution Touche conversion Touches de lecture Puits porte-cuve

Cadran-afcheur 9 touches de mthodologie Touche fonction (paramtres du systme) Touches paramtres (touches de programmation)

Le commutateur secteur, la prise d'alimentation et le connecteur pour imprimante sont situs l'arrire de l'appareil (voir chapitre 4 "Installation"). Le BioPhotometer Eppendorf est destin la dtermination rapide, simple et confortable des principales mthodes pratiques en laboratoire de biochimie molculaire et de recherche. Cuves Le puits porte-cuve est compatible avec les cuves rectangulaires en verre ou en matire de synthse, selon leur transparence optique aux diffrentes longueurs d'ondes. La cuve UVette Eppendorf est la premire cuve en matire de synthse qui permet la dtermination des acides nucliques. Il convient de tenir compte de la hauteur de la fentre du faisceau optique qui est de 8,5 mm et de la hauteur totale (au min. 36 mm) (voir chapitre 10 Mode demploi succinct ). Pour obtenir des rsultats justes et reproductibles, les faces optiques des cuves doivent toujours tre trs propres et la solution soumise mesure exempte de particules en suspension. L'appareil est livr avec un capuchon de protection pour le porte-cuve pour viter les dpts de poussire en priode d'immobilisation.

95

1 Prsentation de l'appareil

Mthodes

L'appareil est livr d'origine avec 12 mthodes prprogrammes qu'il t suf d'appeler par simple sollicitation d'une touche spci que: Acides nucliques dsDNA ssDNA RNA Oligo Protines Protines Bradford Bradford micro ADN double brin ADN simple brin ARN Oligonuclotides

par dtermination photomtrique Mthode de Bradford Mthode de Bradford dans le domaine des faibles concentrations Lowry Mthode de Lowry Lowry micro Mthode de Lowry dans le domaine des faibles concentrations BCA Mthode BCA BCA micro Mthode BCA micro Densit des suspensions bactriennes OD 600 Mesure de la turbidit Programme des mthodes Chaque mthode comporte un programme install d'origine en usine. Ce programme inclut un ensemble de paramtres tel que l'expression des units de concentration ainsi que la mthode d'exploitation des donnes de mesure. Cependant les programmes peuvent tre modis. Il suft de taper la touche Parameter pour accder aux modications. Lors de la premire utilisation d'une mthode, il convient de rappeler son programme pour examiner les paramtres et le cas chant de les modi er pour les adapter aux applications propres. Pour les mthodes comportant une srie standard, il conviendra d'adapter la concentration des standards. Pour effectuer une dtermination, il suft de taper la touche correspondant la mthode envisage. Les mthodes Bradford, Lowry et BCA comportent une particularit: chacune de ces mthodes est programme pour deux gammes de concentration et d'exploitation. Pour passer d'une mthode l'autre, il suf t de solliciter alternativement la mme touche pour basculer de l'une l'autre. ("BCA" et "BCA micro"). Pour dmarrer la lecture, appuyer sur l'une des trois touches ovales selon le cas. L'appareil ne ncessite pas de prchauffage, il est prt instantanment. Pour connatre laquelle des trois touches de mesure est disponible, se reporter la partie infrieure du cadran afcheur (voir descriptif de la procdure de mesure, chapitre 5, mode d'emploi. Pour que le rsultat soit automatique, chaque mthode comporte dans sa programmation une procdure d'exploitation (facteur, calibrage, formule de Warburg ou encore une sortie directe en absorbance). L'appareil fournit directement le rsultat, mais af che galement la valeur des absorbances, et pour les acides nucliques, les rapports d'absorbances usuelles. Les dilutions des chantillons peuvent galement tre prises en considration (touche ). En tapant la touche Conversion , l'appareil convertit les concentrations massiques en Dilution concentrations molaires. Par ailleurs, cette touche permet de calculer le rendement total dans le tube d'chantillon. Les rsultats peuvent tre lus sur le cadran-af cheur ou peuvent tre imprims sur une imprimante le cas chant. Pour exploiter les valeurs des lectures avec les formules de calcul d'un logiciel tableur install sur votre ordinateur PC, utiliser le programme de transfert de donnes Eppendorf qui est disponible sur commande (voir chapitre 11 "Nomenclature"). Les chantillons et les rsultats des calibrages sont stocks en mmoire; les donnes en mmoire peuvent tre consultes par sollicitation de la touche Function .

Dtermination

Exploitation des donnes

Sortie de rsultats

96

2 Spcications techniques

Photomtre Systme optique: Lampe source: Diffraction spectrale: Longueurs d'ondes de lecture: Slecteur de longueur d'ondes: Bande passante: Erreur systmatique de mesure de la longueur dondes: Gamme photomtrique:

Photomtre d'absorption monofaisceau, avec faisceau de rfrence et longueurs d'ondes xes Lampe ash xnon Rseau holographique concave Xe 230; 260; 280; 320; 562; 595 nm Fonction de la mthode, pilote par le programme 5 nm de 230 320 nm 7 nm de 562 595 nm 1 nm de 230 280 nm 2 nm de 320 595 nm Cuve quartz: 0,000 3,000 A (Eppendorf): 2,5 A 230 nm UVette 2,6 A 260 nm 2,8 A 280 nm 2,9 A 320 nm 0,002 A 0 A 0,005 A 1 A 1%1A 0,001 A < 0,05 % Photodiodes silicium

Erreur alatoire de mesure du photomtre: Erreur systmatique de mesure du photomtre: J ustesse de lecture: Lumire parasite: Rcepteur du faisceau: Mthode de lecture Mthode de mesure: Traitement des donnes en fonction de la mthode:

Point nal contre blanc Absorbance Concentration par facteur Concentration par la formule de Warburg Concentration par un calibrage utilisant entre 1 et 10 standards Calibrage un point (un standard) Rgression linaire (de 2 10 standards) Rgression non linaire (polynme du 3 degr; 4 ou 5 10 standards (voir chap. 12, exploitation des donnes); dtermination 1x; 2x; 3x Pour acides nucliques: Ratio 260/280 Ratio 260/230 Concentration molaire Rendement total

Capacit mmoire Mmoire mthode: Mmoire de calibrage: Mmoire pour rsultats:

12 programmes pour mthodes, prprogrammes, accessibles la modication Pour toutes les procdures de calibrage Pour 100 rsultats avec absorbance, valeur des ratios, numro d'chantillon, dilution d'chantillon, Date et heure (calendrier jusqu'en 2090)

97

2 Spcications techniques

Elments d'utilisation Nature des cuves:

ADNds, ADNss, ARN, Oligo, Protines: Nature des cuves: mesure en cuve Quartz ou plastique (UVette Eppendorf) OD 600, Bradford, Lowry, BCA: cuve verre ou plastique 12,5 mm x 12,5 mm, non thermostat Min. 36 mm 8,5 mm Largeur: 1 mm Hauteur: 1,5 mm 19 touches cloques Ecran graphique clair 33 mm x 60 mm Allemand, anglais, francais Cadran-afcheur et imprimante; absorbance; concentration, ratio

Porte-cuve: Hauteur de cuve: Hauteur du faisceau optique dans la cuve: Dimension du faisceau optique dans la cuve: Clavier: Cadran-afcheur: Menu d'assistance: Sortie des rsultats:

Spcications gnrales de l'appareil Alimentation: 100 240 V 10 %; 50 60 Hz 5 % Catgorie surtension: Degr de pollution: Puissance absorbe, restitue: Courant absorb: II (IEC 61010-1) 2 (IEC 664) Env. 20 W en fonctionnement, 10 W en veille < 0,3 A

Microcoupure de tension admissible: Env. 10 ms 90 V Env. 200 ms 220 V Fusibles: Ambiante admissible: T 1 A / 250 V, 5 mm x 20 mm (2 fusibles) 15 35 C avec justesse et rptabilit d nie 25 70 C hors service, entreposage 15 70 % humidit relative Non tropicalis Eviter l'incidence solaire directe RS 232 C, srielle L'imprimante connecte doit tre conforme aux directives EN 60950 et UL 1950. Conforme VDE, CE, IEC 1010-1 Largeur: 20 cm Profondeur: 32 cm Hauteur: 10 cm 3 kg (emball: 29 cm) (emballt: 43 cm) (emball: 20 cm) (emball: 4,8 kg)

Connexion imprimante:

Conformit aux normes: Dimensions:

Poids:

Toutes modications rserves!

98

3 Consignes de scurit et mise en garde contre certains risques

Avant utilisation du BioPhotometer, il est ncessaire de se familiariser compltement avec le mode demploi. Pour un travail scuris avec lappareil, les points suivants doivent tre absolument respects : Consignes caractre technique Ne pas ouvrir l'appareil. Ne pas laisser entrer de liquide l'intrieur de l'appareil. Avant toute intervention sur l'appareil ou changement de fusible, retirer le cordon d'alimentation; les tensions lectriques l'intrieur de l'appareil sont susceptibles de produire des chocs ltaux. L'appareil ne doit pas tre utilis dans des locaux risque explosif. Ne pas utiliser un appareil prsentant un dommage, en particulier lorsque le cordon d'alimentation lectrique est endommag. Toute rparation ou intervention technique est strictement rserve au service aprs vente de la Socit Eppendorf AG ou un service aprs-vente contractuellement accrdit. Le raccordement au secteur doit comporter une prise de terre. Toute utilisation non conforme de l'appareil est susceptible d'entraver la protection interne. Consignes concernant l'utilisation de matriaux biologiques et de produits chimiques Certains ractifs ou tampons de dilution sont susceptibles de produire des brlures ou d'autres atteintes la sant. Les chantillons (acides nucliques, protines, cultures bactriennes) peuvent tre de nature infectieuse ou constituer des risques pour la sant. Lors de la prparation des chantillons, au cours de la mesure, ainsi que lors du nettoyage de l'appareil ou des oprations de maintenance, il convient de respecter les directives de scurit du laboratoire (porter des vtements de protection, des gants, dsinfecter). Toujours rester prudent en manipulant les chantillons. Respecter les consignes et rgles de scurit concernant l'limination des dchets, des solutions ayant servi aux mesures, au nettoyage ou la dsinfection, des ustensiles.

99

4 Installation

Envergure de livraison

BioPhotometer Cordon secteur pour BioPhotometer Mode d'emploi complet, mode d'emploi succinct Capuchon pour compartiment porte-cuve

4.1 BioPhotometer
Raccordement de l'appareil au secteur Espace ncessaire: Raccordement secteur: largeur: 40 cm profondeur: 50 cm prise secteur avec borne de terre

Effectuer le raccordement au secteur. L'appareil effectue de lui-mme l'adaptation la tension du secteur, sous rserve de respecter la fourchette indique sur la plaquette d'identi cation et gurant au tableau des spcications techniques. Conditions ambiantes admissibles: voir spcications techniques

Retirer le lm protecteur du cadran-afcheur.

1 2

1 Commutateur secteur 2 Porte-fusible 3 Douille de raccordement au secteur

4 Interface srielle pour imprimante (RS 232 C)

100

4 Installation

4.2 Imprimante
Imprimante DPU 414 L'interface srielle RS 232 C du BioPhotometer permet de raccorder la thermoimprimante Eppendorf DPU 414 (Imprimante et cordon pour imprimante, voir chapitre 11 "Nomenclature"). Encher le cordon de l'imprimante dans la douille de connexion du BioPhotometer (voir gure) et serrer les vis de scurit. Encher le cordon d'imprimante dan l'imprimante et serrer les vis de scurit. Effectuer le raccordement au secteur 115 V ou 230 V. Paramtrage de l'imprimante BioPhotometer Slectionner la fonction "imprimante DPU 414" dans la liste des fonctions et valider. Imprimante DPU 414 Vrier le paramtrage de l'imprimante et effectuer au besoin les modi cations pour assurer la compatibilit avec le BioPhotometer conformment aux instructions de la che de l'imprimante. Instructions de paramtrage de l'imprimante pour la connexion avec le BioPhotometer: Dip SW-1 1 (OFF) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (ON) : 6 (OFF) : 7 (ON) : 8 (ON) : Input = Serial Printing Speed = High Auto Loading = ON Auto LF = OFF Setting Command = Enable Printing Density = 100 %

Dip SW-2 Les paramtrages du groupe "Dip SW-2" ne sont pas importants pour l'utilisateur, car le BioPhotometer les modie automatiquement en fonction de la langue choisie par l'utilisateur. Dip SW-3 1 (ON) : 2 (ON) : 3 (ON) : 4 (OFF) : 5 (OFF) : 6 (ON) : 7 (ON) : 8 (ON) : Data Length = 8 bits Parity Settings = No Parity Conditions = Odd Busy Control = XON/XOFF Baud Rate Select =9600 bps

101

4 Installation

Autres imprimantes La connexion srie du BioPhotometer admet d'autres imprimantes srielles en dehors du modle DPU 414. La connexion d'imprimantes parallles ncessite un cble d'adaptation. BioPhotometer Slectionner la fonction "imprimante srielle" dans la liste des fonctions et valider. Imprimante Conditions ncessaires pour l'imprimante srielle: Busy Control Baud Rate(ON) Data Bit Length Parity Permission Parity Conditions : : : : : XON/XOFF 9600 bps 8 bits Without Odd

Les imprimantes parallles peuvent tre connectes avec un cble-adaptateur rpondant aux conditions ci-dessus.

4.3 Cuves optiques

Le puits porte-cuve est compatible avec toutes les cuves rectangulaires usuelles dont la hauteur de la fentre de mesure est de 8,5 mm par rapport au fond et dont la hauteur totale est au minimum de 36 mm (voir schma du mode d'emploi succinct). Les dimensions du faisceau dans la cuve sont de 1,0 mm de large et de 1,5 mm de haut. Les cuves de verre et en plastique sont utilisables pour la lecture dans la mesure o leur transparence aux longueurs d'ondes envisages est compatible. Eppendorf propose sa cuve plastique UVette qui est transparente aux UV jusqu' 220 nm et convient, par consquent aux dterminations des acides nucliques.

102

5 Mode d'emploi

5.1 Clavier
Photometer

Standard 7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford 0 Sample No. 8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

Function

9 RNA 6 Oligo 3 BCA Blank Sample

Conversion

Clear

Parameter

Dilution

Enter

7 dsDNA

Appel de la mthode pour "ADN double brin" Touche du chiffre 7

8 ssDNA

Appel de la mthode pour "ADN simple brin" Touche du chiffre 8

9 RNA

Appel de la mthode pour "ARN " Touche du chiffre 9

6 Oligo

Appel de la mthode pour "Oligonuclotides" Touche du chiffre 6

4 Protein

Appel de la mthode pour "Protines " (mthode photomtrique directe)" Touche du chiffre 4

1 Bradford

Appel de la mthode "Bradford " et "Bradford micro" Mthodes alternantes entre "Bradford " et "Bradford micro" Touche du chiffre 1 Appel de la mthode "Lowry" et "Lowry micro" Mthodes alternantes entre "Lowry" et "Lowry micro" Touche du chiffre 2

2 Lowry

103

5 Mode d'emploi

3 BCA

Appel de la mthode "BCA" et "BCA micro" Mthodes alternantes entre "BCA" et "BCA micro" Touche du chiffre 3 Appel de la mthode "OD 600 (mesure de la densit bactrienne)" Touche du chiffre 5

5 OD 600

Parameter

Appel du chier de programmation quitter le chier de programmation

Function

Appel des chiers fonctions Quitter les chiers fonctions Touche du point Modication du numro d'chantillon Touche du chiffre 0

0 Sample No.

Dilution

Programmation de la dilution Dplacement du curseur vers la ligne suivante (liste des paramtres ou des fonctions)

Conversion

Calcul des concentrations molaires et de la quantit totale d'chantillon (rendement) Dplacement du curseur vers la ligne prcdante (liste des paramtres ou des fonctions)

Clear

Annuler une saisie

Enter

Validation d'une saisie

Standard

Dtermination d'un standard

Blank

Dtermination d'un blanc

Sample

Dtermination d'un chantillon

104

5 Mode d'emploi

5.2 Dtermination des acides nucliques

Descriptif valable pour les mthodes ADNds ADNss ARN Oligo

Rappeler la mthode

7 dsDNA

dsDNA fa c t e u r m t h o d e : 1 A 260 = 5 0 . 0

g/mL

Blank

ou

Sample

Traitement des donnes L'appareil est livr d'origine avec les mthodes prprogrammes. Pour les mthodes des acides nucliques, le programme comporte les facteurs de conversion habituellement utiliss pour passer de l'absorbance en concentration (dans l'exemple: 50). Cependant, les facteurs peuvent tre modis en tapant la touche Parameter (voir chapitre "programmation"). Le nombre de dcimales du facteur programm dtermine le nombre de dcimales du rsultat. En cas d'utilisation d'units de concentration diffrentes de g/ml ( g/ L par ex.), le BioPhotometer effectue de lui-mme la conversion du facteur en mmoire pour fournir la bonne valeur. Les solutions de mesure avec des absorbances plus faibles que 0,02 env. jusqu 0,03 260 E (correspondant une cong/mL) ne doivent pas tre centration DNA denv. 1,0 1,5 utilises puisque avec ces absorbances plus faibles, lin uence de parasites telles que de petites particules, des microbulles ou des troubles, est trs grande sur le rsultat de la mesure et que cela entrane souvent des rsultats non ables. Processus de lecture Les valeurs de blancs restent conserves jusqu'au changement de date. En cas de dtermination d'un blanc existant dans une journe, le BioPhotometer propose de ce fait dans la dernire ligne lors de l'appel d'une mthode soit de repasser un nouveau blanc, soit de procder directement la lecture de l'chantillon. En cas d'absence de valeur de blanc au chier, le systme propose de passer d'abord un blanc. Dtermination d'un blanc
dsDNA bl a n c A

Blank

0.000
Blank

ou

Sample

105

5 Mode d'emploi

Dtermination de l'chantillon

Sample

dsDNA

chant 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A260 A 280 A 320

70.0
1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Afchage du rsultat L'appareil af che le rsultat exprim en concentration et en absorbance 260 nm pour les acides nucliques. De plus, il donne des indications concernant la puret de l'acide nuclique en indiquant l'absorbance trois longueurs d'onde supplmentaires (230, 280 et 320 nm) ainsi que les quotients A260/A 280 und A260/A 230. L'absorbance 320 nm des chantillons devrait tre proche de 0 pour des chantillons purs. Des solutions de mesure troubles entranent des absorbances plus importantes pour toutes les longueurs dondes de mesure qui peuvent galement in uencer ngativement le rsultat de mesure. Dans de tels cas, il est possible de corriger partiellement lin uence sur le rsultat de mesure en activant le paramtre "Corr. par E320" (chapitre 6.3. "Explication des paramtres"). Dtermination de l'chantillon suivant Dilution de l'chantillon Pour passer la dtermination de l'chantillon suivant, appuyer nouveau sur la touche Sample . La dilution de l'chantillon dans la cuve optique peut tre saisie par la touche Dilution avant la lecture. Le systme en tient alors compte pour le calcul du rsultat (voir chapitre "dtermination d'chantillons dilus"). Le dernier rsultat dtermin en concentration peut tre exprim soit et / ou quantit d'acide nuclique (units de masse ou unit molaire):
quantit calcul: chant.total L

Touche conversion

Conversion

molarit calcule: paires bases masse mol kDa

Programmation "chantillon total" La valeur programme sera calcule par rapport la concentration mesure. Le rsultat est alors exprim en quantit d'acide nuclique prsent dans l'chantillon.

106

5 Mode d'emploi

Programmation "paires de bases' ou "masse molaire" Une seule saisie sur les deux lignes est sufsante. A l'aide de la valeur programme et de la concentration, le systme dtermine la concentration molaire. Pour passer sur les fentres de programmation non souhaites, taper Enter .
1 Bradford 4 Protein 0 Sample No. Enter 3 BCA 0 Sample No. 0 Sample No. Enter
dsDNA chant 001 g/mL

Afchage aprs programmation de "140 l d'chantillon" et "300 paires de bases":

70.0

353.5 pmol/mL 9.8 g 49.5 pmol

Enter

L'unit de concentration molaire (ici "pmol/mL") est prprogramme, mais elle peut tre modi e par la touche Parameter .

5.3 Dtermination photomtrique directe des protines

Rappeler la mthode
4 Protein
P ROT E I N absorbanche

Blank

ou

Sample

Exploitation En programmation d'origine, la mthode "protines" est en mode "Absorbance", c'est dire que le systme fournit les rsultats en absorbance. pour accder d'autres mthodes de conversion, passer par la touche Parameter et programmer d'autres formules de calcul (voir chapitre 6 "Programmation") facteur standard (calibrage en point nal) formule de Warburg Le nombre de dcimales programmes avec le facteur ou la concentration de dpart conditionne le nombre de dcimales du rsultat nal. Lors de la programmation du facteur, il convient de l'aligner sur l'unit de concentration choisie. Les solutions de mesure avec des absorbances plus faibles que 0,02 env. jusqu 0,03 280 E ne doivent pas tre utilises puisque avec ces absorbances plus faibles, lin uence de parasites telles que de petites particules, des microbulles ou des troubles, est trs grande sur le rsultat de la mesure et que cela entrane souvent des rsultats non ables.

107

5 Mode d'emploi

Droulement de la lecture L'exemple ci-aprs illustre le droulement d'une lecture en mode d'exploitation "Absorbance". Pour un droulement d'une lecture avec exploitation par un standard, voir le chapitre "dtermination de protines aprs ajout de ractif". La valeur des blancs reste conserve en mmoire jusqu'au changement de date. (voir chapitre "dtermination des acides nucliques"). Dtermination du blanc
P ROT E I N bl a n c A

Blank

0.000
Blank

ou

Sample

Dtermination de l'chantillon

Sample

P ROT E I N

echant 001 A 0 . 2 4 5 A260 0 . 4 3 0 A 280 0 . 0 0 2 A 320

0.430

Afchage du rsultat En plus du rsultat exprim en concentration et en absorbance 280 nm, le systme indique l'absorbance 260 A et A320 comme point de repre pour la puret de l'chantillon mesur. L'absorbance d'chantillons purs devrait tre proche de 0 320 nm. Des solutions de mesure troubles entranent des absorbances plus importantes pour toutes les longueurs dondes de mesure qui peuvent galement inuencer ngativement le rsultat de mesure. Dans de tels cas, il est possible de corriger partiellement lin uence sur le rsultat de mesure en activant le paramtre "Corr. par E320" (chapitre 6.3. "Explication des paramtres"). Dtermination de l'chantillon suivant Dilution de l'chantillon Pour passer la dtermination de l'chantillon suivant, taper nouveau la touche Sample . La dilution de l'chantillon dans la cuve optique peut tre programme par l'intermdiaire de la toucheDilution avant de procder la dtermination. Le systme intgrera cette donne pour le calcul de son rsultat (voir chapitre "dtermination d'chantillons dilus").

108

5 Mode d'emploi

5.4 Dtermination de protines aprs ajout de ractif (Bradford, BCA, Lowry)

Rappeler la mthode
1 Bradford
domaine calibrase XXX XXX g/mL BRADFORD

Blank

ou

Standard

Si le systme a dj effectu prcdemment un calibrage valid, il le possde en mmoire et l'af cheur indique l'heure et la date de la saisie en mmoire. Dans ce cas, on peut effectuer la dtermination du blanc et procder au recalibrage, ou passer directement la dtermination de l'chantillon en utilisant les donnes en mmoire pour le calcul du rsultat. Mthodes "micro" Les mthodes Bradford, Lowry et BCA comportent une particularit: elles peuvent tre programmes en deux domaines de concentration diffrents. Pour accder l'une ou l'autre des deux mthodes, il suft de solliciter la mme touche successivement pour basculer de l'une l'autre. Exploitation des donnes Les mthodes Bradford, Lowry et BCA ainsi que les mthodes micro associes, sont programmes d'origine sur un mode d'exploitation des rsultats qui passe par une courbe de calibrage stocke par le biais d'une rgression non linaire. La touche Parameter permet cependant de programmer d'autres mthodes d'exploitation en variante (voir chapitre 6 "Programmation"): Mthode par facteur (calcul de la concentration par l'intermdiaire d'un facteur). Absorbance (les rsultats sont fournis bruts, sans transformation par un calcul). La procdure d'exploitation prprogramme d'origine par un standard accepte la modication des paramtres suivants (voir chapitre 6 "Programmation"): Nombre de standards (de 1 10). Nombre de lectures rptitives par standard (1 3). Procdure d'exploitation par calibrage multipoints (calibrage linaire ou non linaire). Valeur de concentration des standards. Le nombre de dcimales programmes avec le facteur ou la concentration de dpart du premier standard conditionne le nombre de dcimales du rsultatnal. Lors de la programmation du facteur, il convient de l'aligner sur l'unit de concentration choisie.

109

5 Mode d'emploi

Droulement de la lecture Les valeurs des blancs restent conserves en mmoire jusqu'au changement de date. (voir chapitre "dtermination des acides nucliques"). Les valeurs des standards restent conserves en mmoire de faon illimite. Elles sont crases par de nouvelles valeurs lors de la dtermination d'une nouvelle srie de standards. Les rsultats d'une srie de dterminations d'chantillons sont toujours calculs sur la base de la srie standard la plus rcente. Mise en mmoire. Dans l'exemple ci-aprs, la programmation de la mthode Bradford utilise une procdure d'exploitation par une srie standard multipoints avec 5 valeurs en dtermination double et calcul par une rgression non linaire: Dtermination du blanc
BRADFORD bl a n c A

Blank

0.000
Blank

ou Sample

Standard

Dtermination des standards

Standard

BRADFORD

std 11 XXXX g/mL A

re lecture Standard 1 / 1

X.XXX
s u i va n t :

std 12 XXXX g/mL

Sur les deux premires lignes on lit les valeurs du standard qu'on vient de passer. Sur les deux dernires lignes, on lit les valeurs du standard suivant avec la valeur de sa concentration.
BRADFORD std 12 XXXX g/mL A re lecture Standard 1 / 2

Standard

X.XXX
s u i va n t :

std 21 XXXX g/mL

Afchage du systme aprs passage de la srie de standards:

110

5 Mode d'emploi

BRADFORD

std 52 XXXX g/mL A

X.XXX
cv: 2.8%

c a l i b ra s e m m o r i s

Le cv (coefcient de variation ) donne une indication de la dispersion des valeurs de standards autour de la courbe de rgression. Si le cv est infrieur 10 % la courbe est mmorise automatiquement. Si le cv est suprieur 10 %, le systme demande sa validation par la question "mmoriser? ENT/CLR". Cette procdure permet d'accepter le calibrage ou de le refuser auquel cas il est effac. Les sries de dtermination des chantillons sont toujours exploites sur la base des calibrages valids les plus rcents. Dtermination de l'chantillon
BRADFORD chant 001 g/mL X . X X X A5 9 5

Sample

X.XXX

Afchage du rsultat En plus du rsultat exprim en concentration, le systme indique l'absorbance la longueur d'onde de lecture (595 nm en mthode Bradford). Dtermination de l'chantillon suivant Dilution de l'chantillon Pour passer la dtermination de l'chantillon suivant, taper nouveau la touche Sample . La dilution de l'chantillon dans la cuve optique peut tre programme par l'intermdiaire de la toucheDilution avant de procder la dtermination. Le systme intgrera cette donne pour le calcul de son rsultat (voir chapitre "dtermination d'chantillons dilus").

111

5 Mode d'emploi

5.5 Dtermination des OD 600

Rappeler la mthode
5 OD 600
OD600

Blank

ou

Sample

Droulement de la lecture Les valeurs des blancs restent conserves en mmoire jusqu'au changement de date. (voir chapitre "dtermination des acides nucliques"). Dtermination du blanc
OD600 bl a n c A

Blank

0.000
Blank

ou

Sample

Dtermination de l'chantillon

Sample

OD600

chant 001 A

0.430

Dtermination de l'chantillon suivant Dilution de l'chantillon

Pour passer la dtermination de l'chantillon suivant, taper nouveau la touche Sample . La dilution de l'chantillon dans la cuve optique peut tre programme par l'intermdiaire de la toucheDilution avant de procder la dtermination. Le systme intgrera cette donne pour le calcul de son rsultat (voir chapitre "dtermination d'chantillons dilus"). La dtermination de l'OD 600 est une mesure de dispersion de lumire; le rsultat d'une telle lecture dpend fortement de la gomtrie du faisceau optique. Or celle-ci dpend directement du photomtre utilis.

112

5 Mode d'emploi

5.6 Dtermination d'chantillons dilus

Les dilutions d'chantillons sont programmes par la toucheDilution donne pour le calcul et la communication du rsultat. Les valeurs de blanc ont dj t lues dans l'exemple suivant:
dsDNA bl a n c A

avant la lecture. Le systme intgre cette

0.000
Blank

ou

Sample

Programmer la dilution

dsDNA

chant 001

Dilution
chant.+diluant + L

2 Lowry 0 Sample No. Enter

1 Bradford 8 ssDNA 0 Sample No. Enter

dsDNA

chant 001

2 0 + 1 8 0 L

Blank

ou

Sample

Dtermination de l'chantillon dilu

Sample

dsDNA

chant 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A 260 A 280 A 320

70 0.0
2 0 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Le systme a intgr la dilution pour l'laboration de son rsultat. Le facteur de dilution reste en machine et il est utilis pour le calcul du rsultat d'autres chantillons jusqu' ce qu'il soit cras par une nouvelle valeur. Effacer la donne relative la dilution Pour effacer le facteur de dilution, solliciter la touche Dilution puis effacer les valeurs gurant sous "Sample" et "Diluent" avec la touche Clear , ou craser les valeurs en tapant "zro".

113

5 Mode d'emploi

5.7 Modication du numro d'chantillon

Le numro courant d'chantillon est indiqu sur le cadran-af cheur en haut droite. Ce numro courant est incrment sparment pour chaque mthode et se remet sur "1" au changement de date. Il est possible d'intervenir sur ce numro courant et de le modi er pour repasser le mme chantillon par exemple:
dsDNA chant 005 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A 230 A 260 A 280 A 320

70 .0
2 + 1 8 0 L 1.97 2.03
260/ 280 260/ 230

Modication du numro d'chantillon

0 Sample No.

dsDNA

chant 005

3 BCA

dsDNA

chant 003

Enter

Blank

ou

Sample

Pour la dtermination du numro d'chantillon suivant, le numro a t ramen sur "3". Les numros d'chantillons suivants seront incrments ensuite partir de ce nouveau numro.

114

6 Programmation

6.1 Principes de la programmation

Chaque mthode est prprogramme d'origine et comporte en mmoire les paramtres tels que la formule de calcul du rsultat ou les units de concentration. Les mthodes programmes d'origine peuvent tre Parameter modies par l'accs aux paramtres par la touche . Rappeler la mthode
OLIGO fa c t e u r m t h o d e : 1 A 260 = 3 0 . 0 g/mL

6 Oligo

Blank

ou

Sample

Rappeler la liste des paramtres

OLIGO

page 13 30.0 nom * oui

Parameter
fa c t e u r c o r r. p a r A 3 2 0 . . . . . . . . . . . .

Il existe diffrentes listes de paramtres pouvant tre modies pour les mthodes (voir tableau au chapitre suivant). Les paramtres pour la mthode "Oligo" s'tendent sur trois pages d'af cheur du systme. Exemple: modication du facteur Les saisies de chiffres sont valides en mmoire par Saisir le facteur et le mmoriser
2 Lowry 0 Sample No. Function 0 Sample No. Enter
OLIGO fa c t e u r c o r r. p a r A 3 2 0 . . . . . . . . . . . . page 13 20.0 nom * oui

Enter

Aprs la validation en mmoire du facteur, le curseur a saut sur le bloc paramtrique suivant ("correction par A320").

115

6 Programmation

Exemple: modication des units Les paramtres slectionns sont points l'aide du curseur puis sont valids par Enter . La slection valide en mmoire est marque d'un astrisque ": " * Slectionner le paramtre souhait
OLIGO page 23 g/mL * ng/ L g/ L pmol/ L * mol/L

Dilution

unit . . . . . . . . . . . . . . . . . unit m. . . . . . . . . . .

Valider en mmoire le paramtre

OLIGO

page 23 g/mL ng/ L g/ L * pmol/ L * mol/L

Enter
unit . . . . . . . . . . . . . . . . . unit m. . . . . . . . . . .

" g/ L" le Aprs validation de l'unit de concentration curseur saut vers le bloc paramtrique suivant (unit molaire). Quitter le chier des paramtres Pour quitter le chier des paramtres, on peut slectionner la ligne "n paramtre" et valider par Enter ou simplement taper la touche Parameter n'importe quel moment.
OLIGO

Parameter
fa c t e u r m t h o d e : 1 A 260 = 2 0 . 0 g/mL

Blank

ou

Sample

116

6 Programmation

6.2 Tableau des paramtres

ADNds ADNss ARN Oligo Protines Bradford Brad.micro Lowry Low.micro BCA BCA micro Absorbance Standard Facteur OD 600

Calcul

(Observation 1)

(Observation 1)

Absorbance Standard Facteur Formule de Warburg Inactif Actif mg/mL g/mL

(Observation 1)

Correction par A320 Units

Inactif Actif g/mL ng/ L g/ L pmol/ L mol/L pmol/mL 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

Inactif Actif g/mL ng/ L g/ L pmol/ L mol/L 10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

mg/mL g/mL g

(Observation 2)

Unit molaire

Cuve

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

10 mm 5 mm 2 mm 1 mm

(pour les seules mthodes calcul par facteur) Facteur Chiffres Chiffres Chiffres Chiffres Chiffres

(pour les seules mthodes calcul par standard) Nombre de standards Dtermination des standards Rgression (observation 4) Standard Observation 1: Observation 2: Observation 3: Observation 4: Chiffres (Observation 3) 1x 2x 3x Chiffres 1x 2x 3x Linaire Non linaire Chiffres

Aucun choix possible; la procdure de calcul par facteur est ge au programme. Aucun choix possible; l'unit "absorbance" est ge au programme. Aucun choix possible; le nombre de standards "1" est g au programme. Il existe une possibilit de choix uniquement si la programmation au paramtre "Nombre de standards" a t au moins "4" (ou en dtermination simple du standard, au moins "5").

117

6 Programmation

6.3 Explication des paramtres

Les paramtres sont classs en deux catgories: les paramtres de "slection" et les paramtres ncessitant la saisie de "chiffres". Concernant les paramtres de slection, ceux-ci dpendent de variantes mthodologiques (voir tableau de ces paramtres au chapitre prcdent). Paramtre Calcul Saisie Slection Observations Permet la slection parmi les procdures de calcul du rsultat: absorbance, facteur, standard, et formule de Warburg. Pour un calcul utilisant la formule de Warburg, la valeur mesure A260 au cadran et l'impression est repre avec le signe " ". (uniquement en cas de slection de la procdure de calcul "facteur") Saisie d'un facteur: le nombre de dcimales du facteur dtermine le nombre de dcimales du rsultat (uniquement pour les mthodes pour acides nucliques et protines) Possibilit de slectionner entre "Corr. par A 320 inactif" et "Corr. par A320 actif"; Corr; par A320 actif signie que pour des absorbances mesures 260, 280 et 230 nm, celle mesure 320 nm sera dduite. Cette procdure peut s'utiliser pour des corrections de turbidit. Une correction active pour A320 sera signale l'aide du signe " " face aux rsultats de l'af cheur et du protocole d'imprimante. Slection des units de concentrations en fonction des mthodes. Slection des units selon la mthode (uniquement pour les mthodes des acides nucliques); Cette fonction est ncessaire pour convertir les concentrations pondrales en concentrations molaires (touche Conversion ). Slection du parcours optique des cuves: 10, 5, 2 et 1 mm. Le rsultat est toujours rapport un p.o. = 10 mm (voir chapitre 12 "Exploitation des rsultats et conversions").

Facteur

Chiffres (5 rangs)

Correction par E320

Slection

Units

Slection

Unit molaire

Slection

Cuve optique

Slection

118

6 Programmation

Les paramtres suivants ne sont proposs que dans le cadre de la programmation du mode de calcul "standard": Paramtre Nombre de standards Dtermination du standard Saisie Chiffres (1 10) Slection Observations Nombres de standards de concentration diffrente.

Slection parmi 1x, 2x, 3x, reprsentant le nombre de fois que la lecture du standard est rpte. La valeur moyenne de l'ensemble des dterminations des standards est utilise pour les calculs ultrieurs. (uniquement avec un nombre minimum de standards de 4 ou, pour une dtermination simple de standards, d'au moins 5) Slection d'une procdure de calcul parmi une rgression linaire et non linaire. Pour un nombre des standards suprieur 1 et infrieur 4 / 5 l'exploitation s'effectue toujours selon une rgression linaire (voir chapitre 12, exploitation des donnes). Programme de la valeur de concentration du standard. Le nombre de dcimales de la concentration du 1er standard dtermine le nombre de dcimales du rsultat.

Rgression

Slection

Std. 1 Std. 10

Chiffres (5 rangs)

119

6 Programmation

120

6.4 Tableau des valeurs programmes d'origine

ARN Standard - - - - - 1) 6 1x2) 1x 1x 1x 1x 1x 6 6 6 8 - - - - - 1) - - - - - 1) - - - - - 1) - - - - - 1) - - - - - 1) 5 1x Standard Standard Oligo Protines Bradford Lowry BCA

ADNds

ssADN

Calcul 40.0 inactif 30.0 inactif

Bradford micro Standard

Lowry micro Standard

BCA OD 600 micro Standard 1.000

50.0 inactif

37.0 inactif

Absorbance - - - - - 1) inactif

Facteur Corr. par A320 Nombre de standards Dtermination standard Rgression g/mL pmol/mL - - - - - 4) 100 250 500 750 1000 1500 1.00 2.5 5 10 15 25 100 250 500 750 1000 1500 pmol/ L 1.00 2.5 5 10 15 25 g/ L
3) g/mL

Non linaire Non linaire Non linaire Non linaire Non linaire Non linaire

g/mL

g/mL

g/mL

g/mL

g/mL

g/mL

g/mL

g/mL

pmol/mL

pmol/mL

Units pondrales Units molaires Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 Standard 6 Standard 7 Standard 8 Cuve 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm 10 mm

0.50 2 5 10 20

10 mm

10 mm

10 mm

25 125 250 500 750 1000 1500 2000 10 mm

10 mm

10 mm

Observations:

1) 2) 3) 4)

Calcul par facteur, ncessite une programmation de la valeur par l'utilisateur Avec calcul standard Avec calcul standard ou facteur Calcul par standard, ncessite une programmation de la valeur par l'utilisateur

7 Fonctions

Liste des fonctions Fonction Afchage des rsultats Saisie Rappel par
Enter

Observations Permet de visualiser les 100 derniers rsultats (le dernier rsultat dtermin est af ch en premier)
Conversion Enter Function Dilution

: Slection des rsultats Impression des rsultats afchs Retour la liste des fonctions

: :

Rapport de calibrage

Rappel par

Enter

Impression du rapport de calibrage;

Conversion Enter Function Dilution

: Slection de la mthode Impression du rapport de calibrage Retour la liste de fonctions Mise en mmoire Mise en mmoire

: : : :

Date Heure Absorbance en mmoire

Saisie de chiffres Saisie de chiffres Slection par

Enter

Enter

Enter

Impression des dernires absorbances mesures (100 lectures max.). Pour les valeurs de la mthode mesure en dernier, calcul et impression de la valeur moyenne, de l'cart standard et du cv. Lecture et calcul de rptabilit sur une srie de 10 lectures successives sur un chantillon. Pour l'exploitation des donnes, la machine utilisera les programmes de la dernire mthode appele. Contrle de la justesse photomtrique ainci que de la justesse de la longueur donde (voir chapitre13 "Contrle du photomtre"). Permet la slection de la langue de son choix; "english" et "U.S. english" ne se distinguent que par le format de la date.

Lecture de rptabilit

Slection par

Enter

Test photomtrique

Slection par

Enter

Sprache Deutsch Language English Language U.S.English langue franaise Imprimante DPU 414 Imprimante srie

Slection

Slection

DPU 414: connexion de la thermoimprimante Eppendorf DPU 414 (voir chapitre 4.2 "Imprimante"). Srielle: Connexion d'une imprimante autre (voir chapitre 4.2 "Imprimante"). Fonction uniquement accessible pour le technicien de service aprs-vente.

Service

121

7 Fonctions

Exemple: modier la version linguistique Rappel de la liste des fonctions

Function
FUNKTION SEITE 14

ERGEBNISSE ANZEIGEN K A L I B R AT I O N S R E P O RT DAT U M UHRZEIT 27.06.1998 20:44

Slectionner la fonction souhaite

FUNKTION

SEITE 34

Dilution

S P R AC H E D E U T S C H * L A N G UAG E E N G L I S H L A N G UAG E U. S. E N G L l a n g u e franaise

Entrer la fonction en mmoire

fo n c t i o n

page 44 *

Enter
imprimante DPU 414 srie service n fo n c t i o n

Pour quitter le chier des fonctions on peut soit slectionner la ligne "fonction n", soit taper Enter , ou encore taper la touche Function partir de n'importe quelle ligne. Le systme retourne ensuite dans la mthode pralablement programme. Quitter le chier des fonctions
Function
OLIGO fa c t e u r m t h o d e : 1 A 260 = 2 0 . 0 g/mL

Blank

ou

Sample

122

8 Messages d'erreur, reprage des rsultats et textes auxiliaires Message d'erreur, reprage des rsultats et textes auxiliaires

Reprage des rsultats

Repre 1.586 A260 Observations Le repre ct de A cheur et sur le protocole d'imprimante 260 sur l'af (uniquement sur mthode "protines direct") signie que le rsultat a t obtenu par la formule de Warburg. Le repre ct de A cheur et sur le protocole d'imprimante 320 sur l'af (uniquement sur mthode "protines direct" et mthode pour acide nucliques) signie que les absorbances 260, 280 et 230 nm sont corriges par l'absorbance 320 nm. (voir chapitre 6, "Programmation").

0.015 A320

Messages d'erreurs accompagnant les rsultats

Message d'erreur +++++ Observation / cause L'absorbance mesure est suprieure A = 3.0. Remde Diluer l'chantillon. Vrier la cuve (hauteur du faisceau optique). Nettoyer le puits porte-cuve (voir chap. 9). Placer la cuve dans le bon sens (face optique dans le faisceau optique). Utiliser une cuve transparente la longueur d'onde utilise (cuve quartz ou UVette Eppendorf pour les lectures sur acides nucliques). ! ! ! ! ! Rsultat calcul non reprsentable (valeur trop leve). Vrier les paramtres (facteur trop lev?)

( la place d'une valeur pour un ratio): Rpter la lecture, Le ratio n'a pas pu tre dtermin, l'une au besoin avec un chantillon dilu. des valeurs du ratio ayant une valeur d'absorbance A = 0 ou A > 3.0.

123

8 Message d'erreur, reprage des rsultats et textes auxiliaires

Messages d'erreur dans le droulement de la lecture

Message d'erreur
lire d'abord blanc

Observation / cause La mthode slectionne ne comporte pas encore de blanc. La mthode slectionne ne comporte pas encore de calibrage valid.

Remde Effectuer un blanc.

lire d'abord standard

Lire les standards. Programmer un autre mode de calcul (facteur xe ou absorbance en direct). Rpter la lecture, le cas chant avec un chantillon dilu.

en dehors calibrage

(uniquement sur exploitation en rgression non linaire): Le rsultat de l'chantillon est situ en dehors du domaine calibr. Diffrentes anomalies dans le module mesure.

err. module lecture 1 err. module lecture 2 err. module lecture 3

Faire appel au service aprs-vente.

Message d'erreur dans le processus de calibrage

Message d'erreur
mthode std absente

Observation / cause La touche Standard a t sollicite, mais la mthode appele est programme sans standard dans son mode d'exploitation.

Remde Effectuer une nouvelle lecture sans passer par standard. Programmer un mode d'exploitation "standard". Refaire une lecture du standard, le cas chant , prparer un nouveau standard. Vrier la srie de standards et reprsenter les valeurs dans l'ordre correct de concentration croissante. Vrier les standards et les reprsenter dans un ordre de concentration croissante.

valeurs lues non plausibles (en calibrage en point nal)

L'absorbance lue est de 0 A

valeurs lues non monotones (en calibrage multipoints)

La srie lue n'est pas rgulire ni en croissance, ni en dcroissance.

courbe calibrage non monotone

(en rgression non linaire:) La courbe calcule n'est pas rgulire.

124

8 Message d'erreur, reprage des rsultats et textes auxiliaires

Message d'erreur
CV suprieur 10 %

Observation / cause

Remde

(en n de la srie standard) Vrier les rsultats du calibrage. La dispersion autour de la droite de Enter : Mmorisation du calibrage ou de la courbe est trop calibrage. importante (voir chapitre 12, "Exploitation"). Clear : Annuler le calibrage, refaire un nouveau calibrage, ou rappeler un calibrage en mmoire.

Messages d'erreur dans le droulement de la programmation

Message d'erreur Observation / cause Remde Vrier le paramtre, au besoin, le reprogrammer. Vrier la programmation et effectuer la saisie en ordre croissant.

anomalie, vrier paramtre Le paramtre de la mthode a t mthode programm de faon incorrecte. programmer standards par ordre croissant

(calibrage multipoints:) Les valeurs des concentrations des standards n'ont pas t programmes en ordre croissant.

Autres messages d'erreur

Message d'erreur
saisie invalide

Observation / cause (lors de la saisie des numros courants 0 des chantillons par la touche Sample ) No. La saisie comporte un chiffre hors limites compatibles de 1 999.

Remde Refaire la saisie en respectant les limites.

Textes d'aide
Texte d'aide
programmer standards

Observation / cause (apparat l'af cheur aprs appel de la mthode) La mthode comporte bien des standards, mais aucune srie de concentration standard n'a t saisie. (apparat l'af cheur aprs appel de la mthode) La mthode comporte bien un facteur, mais aucune valeur n'a t saisie.

Remde Programmer les valeurs de concentration de la srie de standards (touche Parameter ). Programmer une autre mthode sans standard. Programmer la valeur du facteur (touche Parameter ). Programmer une autre mthode sans facteur.

programmer facteur

125

9 Nettoyage et maintenance

Photomtre

Retirer le cordon secteur avant de procder aux oprations de maintenance ou changement de fusible. Les tensions prsentes l'intrieur de l'appareil peuvent causer des chocs lectriques dangereux. Essuyer tout l'appareil l'aide d'un chiffon humide et d'un dtergent doux. Pour dsinfecter, essuyer avec un chiffon lgrement imprgn d'un mlange eau / thanol 70 %. En aucun cas des liquides ne devront pntrer l'intrieur de l'appareil.

Puits porte-cuve

Nettoyer le puits porte-cuve l'aide d'un coton-tige lgrement humide, jamais grande eau comme avec une pissette. Lorsque l'appareil est hors service, poser l'obturateur livr avec l'appareil sur le porte-cuve pour viter les dpts de poussire. Toute prsence de poussire ou de rsidus de ractifs sur le parcours optique peut tre source d'erreur de lecture.

Changement de fusible Retirer le cordon secteur. Au-dessus du raccordement secteur se trouve le porte-fusible (voir g. au chapitre 4.1). La position du support est scurise par un petit verrou se trouvant au bas du support. Pousser le levier de verrouillage vers le haut et extraire le support. Remplacer les fusibles (voir spcications au chapitre 2 "Spcications techniques"). Rinsrer le support dans sa logette et le pousser jusqu' l'encliquetage du verrou. Raccorder nouveau au secteur.

126

10 Mode d'emploi succinct

Prparation
L'appareil est directement oprationnel aprs mise sous tension.

Mthodes

7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford

8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

9 RNA 6 Oligo 3 BCA

7 dsDNA

8 ssDNA

9 RNA 6 Oligo

ADNds ADNss ARN Oligo Lecture directe des acides nucliques 260 nm. Quotients A 260/A 280 et A260/A 230. Correction de la lecture de l'absorbance par l'absorbance A 320. Lecture en cuve quartz ou en UVette Eppendorf. OD 600 Lecture directe de la suspension bactrienne 600 nm (par turbidimtrie). Lecture avec cuve en verre ou en plastique. Protines Lecture directe des protines 280 nm. Lecture directe de l'absorbance ou conversion par facteur, standard ou formule de Warburg. Correction de la lecture de l'absorbance par l'absorbance A. 320 Lecture en cuve quartz ou en UVette Eppendorf.

5 OD 600

4 Protein

1 Bradford

2 Lowry

3 BCA

Bradford Lowry BCA Bradford micro Lowry micro BCA micro Lecture directe des protines avec les ractifs de Bradford, Lowry, BCA. Lecture directe de l'absorbance ou conversion par facteur ou calibrage standard (calibrage un point, rgression linaire ou non linaire). Nombres et valeurs des lments calibrants programmables. Mthodes pour protines disponibles galement en micro-mthodes (taper deux fois la touche). Lecture avec cuve en verre ou en plastique.

Cuves
Base 12,5 mm x 12,5 mm Hauteur totale mini. 36 mm

UVette

Ultra-micro

semi-micro

macro

vidange

Niveau de remplissage mini. Faisceau lumineux Epaisseur max. de la base Volume mini.

10 mm 8,5 mm 7 mm 0 mm

50 L

70 L

400 L

1000 L

300 L

127

10 Mode d'emploi succinct

Programmation
Les mthodes installes d'origine en mmoire mthode peuvent tre modi es. Exemple: Programmation de l'unit "g/mL" et mthode de conversion par standard (500 g/mL) pour la mthode "protines".
P ROT E I N absorbance

Slectionner "protines"

4 Protein
Blank P ROT E I N calcul ou Sample page 13 std fa c t e u r ex t i n c t i o n Wa r bu r g *

Dbuter la programmation

Parameter

P ROT E I N

page 13 std fa c t e u r ex t i n c t i o n Wa r bu r g *

Slectionner calibrage avec standards (STD)

calcul

Dilution

ou

Conversion

P ROT E I N

page 24 nom * oui 1 x * 2 x 3 x page 34 mg/mL* g/mL

c o r r. p a r A 3 2 0

et valider
(l'affichage saute sur le bloc de slection suivant aprs la validation)

Enter
lecture std

P ROT E I N unit

Slectionner l'unit g/mL

Dilution

ou

Conversion

std

- - - -

mg/mL

P ROT E I N unit

page 34 mg/mL g/mL *

et valider

Enter
std - - - -

g/mL

P ROT E I N c u ve

page 44 10 5 2 1 mm mm mm mm *

Saisir la valeur des concentrations standards et valider

(l'affichage saute sur le bloc de slection suivant aprs la validation)

5 OD 600

Sample No. Sample No. Enter

n p a ra m t r e

Terminer la programmation
128

Parameter

10 Mode d'emploi succinct

Droulement de la lecture ADNds

dsDNA fa c t e u r m t h o d e 1 A260 = 50.0

Slectionner la mthode ADNds

7 dsDNA

g/mL

Blank

ou

Sample

dsDNA

bl a n c A

Lire le blanc

Blank

0.000
Blank

ou

Sample

Si l'chantillon est dilu: Exemple: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

dsDNA

chant 001

20+200 L

Enter
Blank ou Sample

dsDNA

chant 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A230 A260 A280 A320

563.20
Lecture de l'chantillon
Sample
1.97 2.03 20+200 L
260/ 280 260/ 230

Si le rsultat de la lecture doit tre converti:

1 Conversion Enter
molarit calcule: paires bases 300 masse mol 198 kDa

Bradford

4 Protein

0 Sample No.
quantit calcul: chant.total 140 L

3 BCA Enter

0 Sample No.

0 Sample No.

dsDNA

chant 001 g/mL

563.20
Enter

20+200 L 79 g 2843 pmol/mL 398 pmol

dsDNA

chant 002 g/mL 0.689 0.788 0.623 0.003 A230 A260 A280 A320

Lire l'chantillon suivant

249.70
Sample
1.85 2.19 20+200 L
260/ 280 260/ 230

129

10 Mode d'emploi succinct

Droulement de la lecture Bradford

BRADFORD d o m a i n e c a l i b ra s e 100 2000

Slectionner la mthode Bradford

1 Bradford

g/mL

Blank

ou

Standard

Pour slectionner la micromthode:

1 Bradford

B R A D. m i c r o d o m a i n e c a l i b ra s e 1.0 20.0

g/mL

Blank

ou

Standard BRADFORD bl a n c A

Lire le blanc

Blank

0.000
Blank

ou Sample

Standard

BRADFORD

std 1 100 g/mL A

Lire le premier standard

Standard

0.048
s u i va n t :

std 2 200g/mL std 6 2000 g/mL A

BRADFORD

Lire le dernier standard

Standard

1.325

Si l'chantillon est dilu: Exemple: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

cv: 2.8 % c a l i b ra s e m m o r i s BRADFORD chant 001

20+200 L ou Sample

Enter

Blank

Standard

BRADFORD

chant 001 g/mL 0.352 A595

Lecture de l'chantillon

368
Sample
20+200 L

BRADFORD

chant 002 g/mL 0.525 A595

Lire l'chantillon suivant

552
Sample
20+200 L

130

11 Nomenclature

11.1 Nomenclature de commande

Code commande 6131 000.012 6131 810.006 6131 928.007 Photomtre BioPhotometer (230 V; 50/60 Hz; Fiche secteur Europe) (possibilit dobtenir dautres variantes de raccord secteur) Package logiciel BioPhotometer pour transfert de donnes en-ligne pour PC Filtre UV-VIS secondaire, le lot, jeu de ltres de contrle, pour contrle du BioPhotometer Imprimante Thermo-imprimante DPU 414, y compris bloc secteur 230 V et cble imprimante Papier pour thermo-imprimante, les 5 rouleaux Cble convertisseur type 2029 cble de connexion pour imprimantes parallles UVette (Cuve usage unique pour UV/VIS de 220 1 600 nm) UVette, en conditionnement individuel sous blister, les 80 Porte-cuves pour 16 cuves

6131 011.006 0013 021.566 6131 071.009

0030 106.300 4308 078.006

11.2 Nomenclature de commande pour USA et Canada

Code commande Photomtre 952 00 000-4 952 01 020-4 952 01 022-1 BioPhotometer Package logiciel BioPhotometer, pour transfert de donnes en ligne pour PC Filtre UV-VIS secondaire, 1 lot, pour contrle de la prcision photomtrique et de lexactitude de la longueur des ondes (traabilit NIST) Imprimantes 952 01 015-8 952 01 017-4 952 01 016-6 952 01 018-2 952 01 040-9 952 01 057-3 Thermo-imprimante DPU 414, requires power supply unit and printer cable Bloc-secteur pour thermo-imprimante DPU-414, 115 V Bloc-secteur pour thermo-imprimante DPU-414, 230 V Cble imprimante, pour imprimantes connectes en srie Papier pour thermo-imprimante, 5 rouleaux Cble imprimante, pour imprimantes connectes en parallle UVette 952 01 005-1 940 00 110-2 UVette 80 cuves Eppendorf dorigine usage unique, en conditionnement individuel Portes-cuves * U.S. Patent No. 6.249.345
131

12 Exploitation des rsultats et conversions

12.1 Acides nucliques (ADNds, ADNss, ARN, Oligo))

Conversion par facteur C = A260 x F C = Concentration calcule A260 = Absorbance lue 260 nm F = Facteur ( programmer au cas par cas selon la mthode par la touche Parameter ) Particularit de la mthode pour acides nucliques: le facteur programm se rapporte toujours l'unit de concentration "g/mL". Si on slectionne l'unit de concentration g/ L, le facteur sera automatiquement rvalu en interne: F = F / 1000 F = Facteur interne converti; est utilis pour le calcul de la concentration.

Dilution de l'chantillon Cdil, corr = C x (VP + Vdil) / V P Cdil, corr = Rsultat calcul avec un facteur de dilution Vp = Volume de l'chantillon de la solution lue (saisie par la toucheDilution Vdil = Volume du diluant dans la solution de lecture (saisie par la touche Parcours optique de la cuve Application: utilisation de cuves de p.o. = 1, 2 ou 5 mm. Le parcours optique de la cuve est programm spci quement chaque mthode par la touche Parameter . Acuve, corr = A x 2 (pour un p.o. de 5 mm) Acuve, corr = A x 5 (pour un p.o. de 2 mm) Acuve, corr = A x 10 (pour un p.o. de 1 mm) Acuve, corr = Absorbance rapporte un parcours optique d'une cuve de 10 mm Correction A320 Application: correction partielle pour l'interfrence de la turbidit d'une solution lue sur une lecture. quement La procdure de conversion avec ou sans correction pour le trouble E320 est programme spci selon la mthode par la touche Parameter . Ax, corr = Ax - A320 Ax, corr = Absorbance corrige mathmatiquement par les absorbances aux longueurs d'onde 230, 260 et 280 nm Ax = Absorbance lue aux longueurs d'onde 230, 260 et 280 nm A320 = Absorbance lue aux longueurs d'onde 320 nm L'absorbance corrige est ensuite utilise pour le calcul nal du rsultat.

)
Dilution

Touche "Conversion": calcul des concentrations massiques Application: dtermination de la quantit totale d'acide nuclique dans le volume total d'chantillon M = C x Vp, tot

M = Masse totale d'acide nuclique dans le tube d'chantillon C = Concentration calcule Vp, tot = Volume de l'chantillon dans le tube (saisie par la touche Conversion

132

12 Exploitation des rsultats et conversions

Touche "Conversion": calcul de la concentration molaire Application: calcul des concentrations molaires partir des concentrations massiques et de la masse molaire relative. La masse molaire relative sera saisie directement ou sera calcule par le systme partir du nombre de bases ou paires de bases par molcule. Cmol = C / N Cmol = concentration molaire calcule N = masse molaire relative en kDa (saisie par la touche )

Conversion

Si le nombre de base ou de paires de base est programm la place de la masse molaire relative, N sera calcul partir du nombre de bases (-paires): ADNds: N = bp x 2 x 330 x 10-3 ADNss, ARN;, Oligo: N = b x 330 x 10-3 N = Masse molaire relative calcule exprime en kDa bp = Nombre de paires de bases programmes par molcule (ADNds) b = Nombre de bases programmes par molcule (ADNss, ARN, Oligo)
Parameter L'unit de concentration molaire est programme au cas par cas pour chaque mthode par la touche

12.2 Protines directes par photomtrie

Slection de l'expression des rsultats: Absorbance Calcul de la concentration par un facteur Calcul de la concentration par calibrage un point Calcul de la concentration par la formule de Warburg

Calcul de la concentration par un facteur Voir chapitre 12.1; longueur d'onde de lecture: 280 nm Lors de la programmation du facteur par la touche concentration.
Parameter

, il convient de tenir compter de l'unit de

Calcul de la concentration par un standard (calibrage un point) F = Cs / A s F = Facteur calcul Cs = Concentration donne du standard ( programmation au cas par cas par la touche Parameter mthode) As = Absorbance lue pour la standard

selon la

Si la lecture multiple du standard a t programme (2x, 3x), le calcul du rsultat se fera partir des absorbances lues par rgression linaire avec intgration de la valeur zro. Aprs calcul de la rgression un CV (coefcient de variation en %) sera form pour valuer la dispersion des lectures. Si le CV est suprieur 10 %, il sera af ch. Dans ce cas, le calibrage ne sera mis en mmoire qu'aprs validation. (voir chap. 12.3). Le calcul de la concentration de l'chantillon s'effectuera l'aide du facteur calcul: C = A280 x F

Calcul de la concentration par la formule de Warburg C = 1.55 x A280 0.76 x A260 pour l'unit de concentration "mg/mL" C = (1.55 x A280 0.76 x A260) x 1000 pour l'unit de concentration "g/mL"

133

12 Exploitation des rsultats et conversions

Dilution de l'chantillon, parcours optique de la cuve et correction A320 Voir chapitre 12.1.

12.3 Protines par ajout de ractif

Mthodes: Bradford, Bradford micro, BCA, BCA micro, Lowry, Lowry micro Slection de l'expression du rsultat: Absorbance Calcul de la concentration par un facteur Calcul de la concentration par standards Slection des modes de calcul partir de standards: Calibrage un point Calibrage multi-points (droite d'talonnage) Calibrage multi-points (courbe d'talonnage) Calcul des concentrations par un facteur et calcul de la concentration par un standard (calibrage un point) Voir chapitre 12.2; longueur d'onde: 595 nm (Bradford; Lowry) ou 562 nm (BCA) Calcul de la concentration par standards (calibrage multi-points; droite d'talonnage) La droite d'talonnage sera tablie partir d'une srie de standards de 2 10 valeurs, avec dtermination simple, double ou triple (concentration en fonction de l'absorbance). L'quation de la droite sera calcule par une rgression linaire. C = ao + a1A a1 =Pente de la droite d'talonnage (facteur) ao = Point d'intersection de la droite d'talonnage avec l'axe des concentrations (concentration d'un chantillon l'absorbance "0" [dcalage]) Aprs calcul du calibrage un CV (coefcient de variation %) sera form pour valuer la dispersion des lectures. (exception: calibrage deux points avec dtermination simple des deux standards) Si le CV est suprieur 10 % il sera afch. Dans ce cas, le calibrage ne sera mis en mmoire qu'aprs validation. Avec plus de deux standards, la valeur du cv sera toujours afche, mme si sa valeur est < 10 %). Les paramtres calculs "a o" et "a1" de la droite d'talonnage pourront tre imprims l'aide de la touche . Function Calcul de la concentration par une srie standard (calibrage multi-points, courbe d'talonnage) Une courbe d'talonnage (concentration en fonction de l'absorbance) sera tablie partir d'une srie de 5 10 standards en dtermination simple, de 4 10 standards en dtermination double ou triple. La rgression non linaire sera calcule partir d'un polynme du 3 degr. C = ao + a1A + a2A2 + a3A3 + . . . a = Coefcient (les coefcients sont dtermins partir de la mthode des moindres carrs)

Valeur du CV: voir ci-dessus (rgression linaire) Les diffrents paramtres calculs pour la courbe d'talonnage mmorise peuvent tre imprims l'aide de la touche Function .

134

12 Exploitation des rsultats et conversions

ProDilution des chantillons et p.o. des cuves Voir chapitre 12.1.

12.4 OD 600
Les valeurs sont exprimes comme tant les absorbances lues la longueur d'onde de 595 nm.

Dilution des chantillons et p.o. des cuves Voir chapitre 12.1.

135

13 Contrle du photomtre

Eppendorf propose un jeu de ltres (ltre UV-VIS secondaire) pour contrler la justesse photomtrique et celle des longueurs d'onde. Cet ensemble de ltres est compos de trois ltres de contrle de la justesse photomtrique ("Sample A1, Sample A2, Sample A3") et de deux ltres pour le contrle de la justesse spectrale des longueurs d'onde ("Sample 260 nm, Sample 280 nm"). L'absorbance de ces ltres est lue contre un ltre de blanc ("Blank A0"). Pour le contrle, les ltres reprsentant le blanc et l'chantillon de contrle sont introduits dans le porte cuve comme s'il s'agissait de cuves. Pour l'orientation, ltre le sera tourn de telle sorte que l'autocollant d'identi cation soit positionn vers l'avant, ct utilisateur. Les absorbances lues pour le ltre reprsentant l'chantillon de contrle sont ensuite compares avec la fourchette des valeurs de tolrance. Les tolrances pour chaque ltre sont donnes dans un tableau de valeurs livr avec chaqueltre et coll l'intrieur du couvercle du coffret des ltres. (voir tableau: "X.XXX X.XXX A").

BioPhotometer
Secondary / Sekundr - UV - VIS - Filter Limits Grenzwerte 6131 Filter Type 914XXX Blank A0 measured against Blank A0 at approx. 20 C gemessen gegen Blank A0 bei ca. 20 C 921XXX Sample A1 922XXX Sample A2 Photometric accuracy Photometrische Richtigkeit 230nm 260nm 280nm 320nm 562nm 595nm 230nm to/bis 595nm 0.000 A 3.0 % 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 923XXX Sample A3

Function: PHOTOMETERTEST Order No./Best.Nr.: 6131 928.007 traceable to NIST rckfhrbar auf NIST 916XXX Sample 260 nm 917XXX Sample 280 nm

Wavelength accuracy Wellenlngenrichtigkeit

0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A 0.000 A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A X.XXX - X.XXX A Photometric precision Photometrische Przision 1.0 % 1.5 %

empty X.XXX - X.XXX A

___________________________ Date Datum Signature Unterschrift

Please protect against dust, heat and liquid The limits are valid for max. 2 years Bitte vor Staub, Hitze und Flssigkeiten schtzen Die Grenzwerte gelten fr max. 2 Jahre ab Datum.

eppendorf

Tableau: Reproduction du document se trouvant coll l'intrieur du couvercle du coffret de ltres

136

13 Contrle du photomtre

Environnement du contrle du photomtre Raliser le contrle env. 20 C. N'extraire le ltre de son coffret que pendant le temps strictement ncessaire la lecture et le prserver de tout dommage et de toute souillure. Prserver les ltres de la poussire, de la chaleur, des liquides et des vapeurs agressives. Installer le ltre dans le porte-cuve avec l'autocollant orient vers l'utilisateur. Slectionner la fonction "test photomtrique". Cette fonction est installe sur les appareils comportant la version logicielle partir de V 1.20. Pour une utilisation des ltres de contrle sur des appareils avec des logiciels plus anciens, s'adresser Eppendorf. Slectionner les ltres-test "A1", "A2", "A3" pour la lecture de justesse photomtrique 230, 260, 280, 320, 562, et 595 nm. "A260" ou "A280"" pour la lecture de la justesse de longueur d'onde 260 nm ou 280 nm. Suivre les instructions de l'af cheur du photomtre pour les lectures du "blanc" et de "l'chantillon". L'appareil effectue 10 cycles de lecture et imprime par la suite la valeur moyenne des absorbances dtermines aux diffrentes longueurs d'onde. Comparer les valeurs des absorbances la fourchette des valeurs tolre pour cette longueur d'onde. En plus de l'information concernant la justesse, le protocole imprim comporte des informations sur la dlit; l'appareil dtermine chaque fois les carts standards et les coef cients de variation partir d'une srie de 10 lectures par ltre. Si les absorbances lues avec les ltres de contrle ne correspondent pas aux fourchettes de tolrance, il convient de contacter le service aprs-vente Eppendorf. Les ltres eux-mmes doivent tre recalibrs en usine aprs deux ans.

137

Certicat de conformit du BioPhotometer 6131 Conforme l'annexe 15 de la directive d'talonnage Descriptif mtrologique Nature: Type: Fabriquant / distributeur: Instructions d'emploi: 1. Systme de mesure Trajet du faisceau: Emetteur source: Systme spectral: Rcepteur spectral: Cuves optiques: Types de cuves: Photomtre monofaisceau avec faisceau de rfrence et longueurs d'onde xes BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Hambourg Mode d'emploi

Lampe > diaphragme > lentille > diaphragme > cuve > diaphragme > grille de renvoi > diaphragmes > photodiodes Lampe ash Xnon, domaine spectral continu de 220 nm 2000 nm Grille polychromateur Photodiodes silicium, domaine spectral de 200 1100 nm Quartz, verre optique spcial, matire plastique, selon longueur d'onde 10 mm macro; volume mini. 1000 l 10 mm semi-micro; volume mini. 400 l 10 mm vidange; volume mini. 300 l 10 mm ultra-micro; volume mini. 70 l Absente Eclair, type graphique LCD 33 x 66 mm2 Absorbance, concentrations massique et molaire

Thermostatisation de cuve: Cadran-afcheur: Grandeurs afches: 2. Procdure de mesure Dtermination de la valeur du blanc de la cuve: Dtermination de la concentration: : Mesure relative par rapport au matriau de rfrence:

Lecture individuelle de chaque cuve en fonction de la longueur d'onde Selon la loi de Beer-Lambert-Bourguer Contrle par standards secondaires calibrs

3. Domaine spectral de la mesure d'absorbance Domaine: 0,000 3,000 A Les limites d'erreur cites peuvent tre dpasses en dehors des gammes de mesure ainsi qu'en cas d'utilisation autre que les utilisations nominales. 4. Conditions d'utilisation nominales Blanc cuve: Selon le type de cuve utilis Longueur d'onde de lecture: Xnon 230, 260, 280, 320, 562, 595 nm Temps de prchauffage: Aucun Tension d'alimentation : 100 240 V 10 %, 50 60 Hz 5 % Ambiante admissible: 15 35 C Humidit relative de l'air: 15 70 % 5. Limites d'erreur et autres limites Incertitude photomtrique relative de la mesure d'absorbance spectrale sur toutes les longueurs d'onde pour une mesure individuelle: 1,5 % A = 1 Ecart standard photomtrique court terme: Erreur systmatique de la longueur dondes: Demi-valeur spectrale: Taux de lumire parasite: Date: 25.09.2000 Eppendorf AG Service Qualit et normes

0,5 % A = 1 1 nm de 230 280 nm, 2 nm de 320 595 nm 5 nm de 230 320 nm, 7 nm de 562 et 595 nm 0,03 % 260 nm avec GG 375-3 (Schott)

138

Indice

1 2 3

Misure di sicurezza e avvertenze di pericolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 Pulizia e manutenzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Istruzioni brevi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

139

1 Misure di sicurezza e avvertenze di pericolo

Prima di utilizzare il biofotometro vi preghiamo di leggere attentamente e per intero le relative istruzioni per luso. Per poter lavorare con la necessaria sicurezza, occorre assolutamente osservare i seguenti punti: Sicurezza tecnic Non aprire l'apparecchio. Impedire ai liquidi di penetrare nell'apparecchio. Prima dei lavori di manutenzione o della sostituzione di fusibili, staccare la spina. All'interno dellapparecchio sono presenti tensioni elettriche pericolose per la vita dellutente. L'apparecchio non deve funzionare in locali esposti al pericolo di esplosione. Non utilizzare l'apparecchio qualora si rilevassero danni, in particolare se il cavo di collegamento danneggiato. Le riparazioni possono essere eseguite unicamente dal personale dell'assistenza tecnica della Eppendorf AG e dai rivenditori autorizzati. L'apparecchio deve essere collegato ad una presa di corrente dotata di conduttore di protezione. Qualora l'apparecchio non venisse utilizzato conformemente alla sua destinazione, si potrebbe compromettere la funzione di protezione dellapparecchio stesso. Impiego di materiale biologico e chimico Reagenti e tamponi di diluizione possono provocare irritazioni ed altri danni alla salute. I campioni (acidi nucleici, proteine, colture batteriche) possono essere infettivi o provocare altri danni alla salute. Durante la preparazione dei campioni, la misurazione e la pulizia o la manutenzione dell'apparecchio, osservare sempre le norme di sicurezza vigenti nel laboratorio (ad esempio indumenti protettivi, guanti di protezione, disinfezione) relative all'impiego di materiale di prova. Le soluzioni di misura ed i materiali utilizzati per la pulizia e la disinfezione devono essere smaltiti conformemente alle disposizioni vigenti nel laboratorio.

140

2 Pulizia e manutenzione

Fotometro

Prima di procedere ai lavori di manutenzione o alla sostituzione dei fusibili, staccare la spina. Allinterno dellapparecchio sono presenti tensioni elettriche pericolose per la vita dellutente. Stronare lintero apparecchio con un panno leggermente inumidito con detergente delicato. Per la disinfezione, stronare con un panno leggermente inumidito con alcol etilico al 70 % ed acqua. Impedire ai liquidi di penetrare nellapparecchio.

Camera per cuvette

Pulire la camera per cuvette unicamente con un bastoncino di cotone inumidito, non utilizzare grandi quantit di liquido (ad esempio acone spray). Quando lapparecchio non in uso, proteggere la camera per cuvette con la chiusura di protezione contro la polvere fornita in dotazione. La polvere o i residui di soluzioni di misura nel cammino ottico potrebbero falsare i risultati delle misurazioni.

Cambio dei fusibili

Staccare la spina dalla presa di corrente. Sopra il collegamento di rete si trova un portafusibili (vedi gura al Capitolo 4.1). Il portafusibili viene mantenuto in posizione da una levetta a scatto a molla sulla parte inferiore del portafusibili. Spingere la levetta a scatto verso lalto e s lare il portafusibili. Sostituire i fusibili (per le speciche si veda il Capitolo 2 "Dati tecnici"). Ricollocare il portafusibili nel supporto nch la levetta non scatta. Inserire nuovamente la spina nella presa di corrente.

141

3 Istruzioni brevi

Allestimento
Lapparecchio pronto alla misurazione subito dopo laccensione.

Metodi

7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford

8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

9 RNA 6 Oligo 3 BCA

7 dsDNA

8 ssDNA

9 RNA 6 Oligo

dsDNA ssDNA RNA Oligo Misurazione diretta degli acidi nucleici a 260 nm. Quozienti A 260/A 280 e A260/A 230. Correzione a scelta dei valori di estinzione con A320. Misurazione con cuvetta in vetro al quarzo o UVette di Eppendorf. OD 600 Misurazione diretta della densit delle sospensioni batteriche a 600 nm (torbidimetria). Misurazione con cuvetta in vetro o in plastica. Proteine Misurazione diretta della proteina a 280 nm. Misurazione diretta dellestinzione oppure analisi tramite fattore, standard o formula di Warburg. Correzione a scelta dei valori di estinzione con A320. Misurazione con cuvetta in vetro al quarzo o UVette di Eppendorf.

5 OD 600

4 Protein

1 Bradford

2 Lowry

3 BCA

Bradford Lowry BCA Bradford micro Lowry micro BCA micro Misurazione di proteine con il reagente di Bradford, di Lowry o BCA. Misurazione diretta dellestinzione o analisi con il fattore o la calibratura (calibratura burst, regressione lineare o regressione non lineare). Numero e valori nominali dei calibratori sono programmabili. I metodi per le proteine sono disponibili anche in scala micro (premere il tasto Metodo due volte). Misurazione con cuvetta in vetro o in plastica.

Cuvette
Area base 12,5 mm x 12,5 mm Altezza totale 36 mm

UVette

Ultramicro

Semimicro

Macro

Aspirazione

Altezza riempimento 10 mm 8,5 mm Raggio luminoso Spessore max. fondo 7 mm 0 mm Volume min.

50 L

70 L

400 L

1000 L

300 L

142

3 Istruzioni brevi

Programmazione
I programmi metodologici memorizzati per default possono essere modicati. Esempio: le programmazioni dellunit "g/mL e di un procedimento di analisi con Standard (500 g/mL) per il metodo Protein (Proteine).
P ROT E I N ABSORBANCE

Selezionare il metodo Protein

4 Protein
Blank P ROT E I N C A L C U L AT I O N or Sample PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R BU R G *

Iniziare la programmazione

Parameter

P ROT E I N

PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R BU R G *

Selezionare la calibratura con Standard (STD)

C A L C U L AT I O N

Dilution

oppure

Conversion

P ROT E I N

PAG E 2 4 OFF * ON

CORR.WITH A320

e confermare
(dopo la conferma, il display visualizza il blocco di selezione successivo)

Enter

STD MEASUREMENT 1 x * 2 x 3 x P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL * g/mL - - - mg/mL

Selezionare lunit g/mL

Dilution

oppure

Conversion

STD

P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL g/mL * - - - - g/mL

e confermare

Enter
STD

P ROT E I N CUVETTE

PAG E 4 4 10 5 2 1 mm mm mm mm *

Immettere la concentrazione standard e confermare

(dopo la conferma, il display visualizza il blocco di selezione successivo)

5 OD 600

Sample No. Sample No. Enter

PA R A M E T E R E N D

Chiudere la programmazione

Parameter

143

3 Istruzioni brevi

Ciclo di misurazione dsDNA

dsDNA P RO G R A M M E D FAC TO R 1 A260 = 50.0 g/mL

Selezionare il metodo dsDNA

7 dsDNA

Blank

or

Sample

dsDNA

BLANK A

Misurare il valore vuoto

Blank

0.000
Blank

or

Sample

Se il campione diluito: esempio: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

dsDNA

SAMPLE 001

20+200 L

Enter
Blank or Sample

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A230 A260 A280 A320

563.20
Misurare il campione
Sample
1.97 2.03 20+200 L
260/ 280 260/ 230

Se il risultato del campione deve essere convertito:

1 Conversion Enter
C A L C : M O L A R I T Y: B A S E PA I R S 300 MOL.MASS 198 kDa

Bradford

4 Protein

0 Sample No.
C A L C : A M O U N T: TOTA L S A M P L E 140 L

3 BCA Enter

0 Sample No.

0 Sample No.

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL

563.20
Enter

20+200 L 79 g 2843 pmol/mL 398 pmol

dsDNA

SAMPLE 002 g/mL 0.689 0.788 0.623 0.003 A230 A260 A280 A320

Misurare il campione successivo

249.70
Sample
1.85 2.19 20+200 L
260/ 280 260/ 230

144

3 Istruzioni brevi

Ciclo di misurazione di Bradford

BRADFORD C A L I B R AT I O N R A N G E 100 2000 g/mL

Selezionare il metodo Bradford

1 Bradford

Blank

or

Standard

Se si deve selezionare il metodo micro:

1 Bradford

B R A D. m i c r o C A L I B R AT I O N R A N G E 1.0 20.0 g/mL

Blank

or

Standard BRADFORD BLANK A

Misurare il valore vuoto

Blank

0.000
Blank

or Sample

Standard

BRADFORD

STD 1 100 g/mL A

Misurare il primo standard

Standard

0.048
N E X T:

STD 2 200g/mL STD 6 2000 g/mL A

BRADFORD

Misurare lultimo standard

Standard

1.325

Se il campione diluito: esempio: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

C V: 2 . 8 % C A L I B R AT I O N S TO R E D BRADFORD SAMPLE 001

20+200 L or Sample

Enter

Blank

Standard

BRADFORD

SAMPLE 001 g/mL 0.352 A595

Misurare il campione

368
Sample
20+200 L

BRADFORD

SAMPLE 002 g/mL 0.525 A595

Misurare il campione successivo

552
Sample
20+200 L

145

Contenido

1 2 3

Medidas de seguridad e indicaciones sobre los riesgos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 Limpieza y Mantenimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Instrucciones breves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

146

1 Medidas de seguridad e indicaciones sobre los riesgos

Antes de utilizar el BioPhotometer debe conocer a fondo el manual de instrucciones. Para trabajar de manera segura con el aparato es necesario tener en cuenta los siguientes puntos: Seguridad tcnica No abrir el aparato. Los lquidos no debern penetrar en el aparato. Antes de efectuar los trabajos de mantenimiento o el cambio de fusibles, deber extraerse la clavija de enchufe de la red. En el interior del aparato existen tensiones elctricas peligrosas. El aparato no deber utilizarse en espacios con peligro de explosin. No deber utilizarse el aparato si muestra daos, especialmente si est daado el cable de la red. Las reparaciones slo debern llevarse a cabo por el servicio de Eppendorf AG y colaboradores contractuales autorizados. El aparato ha de conectarse a una caja de enchufe con conductor protector. En caso de utilizacin no prevista del aparato, podr quedar afectada la funcin de proteccin del aparato. Manipulacin de material biolgico y qumico Los reactivos y tampones de dilucin pueden producir causticaciones y pueden ser nocivos para la salud. Las muestras (cidos nucleicos, protenas, cultivos de bacterias) pueden ser infecciosas o ser nocivas para la salud. En la preparacin de las muestras, en la operacin de medicin, as como en la limpieza o el mantenimiento del aparato debern observarse las prescripciones de proteccin vlidas para el laboratorio (p.ej. vestimenta de proteccin, guantes, desinfeccin) al manipular el material de muestras. Las soluciones de medicin y los materiales utilizados para la limpieza y desinfeccin debern eliminarse de acuerdo con las prescripciones vlidas para laboratorios.

147

2 Limpieza y Mantenimiento

Fotmetro

Antes de efectuar los trabajos de mantenimiento o cambiar los fusibles deber extraerse la clavija de enchufe de la red. Existen tensiones elctricas peligrosas en el interior del aparato. Deber limpiarse el aparato con un pao hmedo y un agente limpiador suave. Para su desinfeccin, limpiar con un pao ligeramente hmedo y una mezcla de etanol / agua al 70 %. Los lquidos no debern penetrar en el aparato.

Caja de cubetas

La caja de cubetas slo deber limpiarse con bastoncillos algodn hmedos y no con grandes cantidades de lquidos (p.ej. frasco lavador). Si no se utiliza el aparato, la caja de cubetas deber protegerse contra el polvo con un cierre que tambin se suministra. El polvo o los restos de soluciones de medicin en el recorrido ptico puede producir mediciones errneas.

Cambio de fusibles Extraer la clavija de enchufe de la red. Por encima de la conexin de la red se encuentra el portafusibles (vase la ilustracin en el captulo 4.1). La posicin del portafusibles se asegura por medio de una pequea palanca de encastre elstica en la parte inferior del portafusibles. Presionar hacia arriba la palanca de encastre y extraer el portafusibles. Cambiar los fusibles (en cuanto a la especicacin, vase el captulo 2 "Datos Tcnicos). Introducir de nuevo el portafusibles en el soporte hasta que engrane la palanca de encastre. Conectar la clavija de enchufe de la red.

148

3 Instrucciones breves

Preparaci
Inmediatamente despus de su conexin, el aparato est listo para la medicin.

Mtodos

7 dsDNA 4 Protein 1 Bradford

8 ssDNA 5 OD 600 2 Lowry

9 RNA 6 Oligo 3 BCA

7 dsDNA

8 ssDNA

9 RNA 6 Oligo

dsDNA ssDNA RNA Oligo Medicin directa de los cidos nucleicos con 260 nm. Cocientes A260/A 280 y A260/A 230. Opcionalmente correccin de los valores de extincin por A 320. Medicin con la cubeta de cristal de cuarzo o UVette de Eppendorf. OD 600 Medicin directa de la densidad de las suspensiones de bacterias con 600 nm (medicin de turbiedad). Medicin con cubeta de cristal o plstico. Protenas Medicin directa de protenas con 280 nm. Medicin directa de la extincin o evaluacin a travs del factor, estndar o frmula Warburg. Opcionalmente, correccin de los valores de extincin mediante A 320. Medicin con la cubeta de cristal de cuarzo o UVette de Eppendorf.

5 OD 600

4 Protein

1 Bradford

2 Lowry

3 BCA

Bradford Lowry BCA Bradford micro Lowry micro BCA micro Medicin de protenas con reactivo Bradford, Lowry o BCA. Medicin directa o extincin o evaluacin mediante factor o calibracin (calibracin de un solo punto, regresin lineal o no lineal). Nmero y valores exigidos de los calibradores programables. Los mtodos de protenas tambin estn disponibles a microescala (Pulsar dos veces la tecla de mtodo). Medicin con cubeta de cristal o plstico.

Cubetas
Superficie bsica 12,5 mm x 12,5 mm Con altura mn. total 36 mm

UVette

Ultramicro

Semimicro

Macro

Aspiracin

Altura de llenado mn.10 mm 8,5 mm Rayo de luz 7 mm Espesor mximo del fondo 0 mm Volumen min.

50 L

70 L

400 L

1000 L

300 L

149

3 Instrucciones breves

Programacin
Los programas de mtodos almacenados desde fbrica pueden ser modi cados. Ejemplo: Programaciones de la unidad "g/mL y de un mtodo de evaluacin a travs del estndar (500 g/mL) para el mtodo de protena.
P ROT E I N ABSORBANCE

Seleccionar el mtodo de protena

4 Protein
Blank P ROT E I N C A L C U L AT I O N or Sample PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R B U R G *

Comenzar la programacin

Parameter

P ROT E I N

PAG E 1 3 STD FAC TO R ABSORBANCE WA R B U R G *

Seleccionar la calibracin Con el estndar (STD)

C A L C U L AT I O N

Dilution

Conversion

P ROT E I N

PAG E 2 4 OFF * ON

CORR.WITH A320

y conrmar
(la indicacin saltar al siguiente bloque de seleccin despus de la activacin)

Enter

STD MEASUREMENT 1 x * 2 x 3 x P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL * g/mL - - - mg/mL

Seleccionar la unidad g/mL

Dilution

Conversion

STD

P ROT E I N UNIT

PAG E 3 4 mg/mL g/mL * - - - - g/mL

y conrmar

Enter
STD

P ROT E I N CUVETTE

PAG E 4 4 10 5 2 1 mm mm mm mm *

Introducir y conrmar la concentracin patrn

(la indicacin saltar al siguiente bloque de seleccin despus de la activacin)

5 OD 600

Sample No. Sample No. Enter

PA R A M E T E R E N D

Terminar la programacin
150

Parameter

3 Instrucciones breves

Desarrollo de la medicin dsDNA

dsDNA P RO G R A M M E D FAC TO R 1 A260 = 50.0 g/mL

Seleccionar el mtodo dsDNA

7 dsDNA

Blank

or

Sample

dsDNA

BLANK A

Medir el valor vaco

Blank

0.000
Blank

or

Sample

Si la muestra est diluida: Ejemplo: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

dsDNA

SAMPLE 001

20+200 L

Enter
Blank or Sample

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL 0.694 1.408 0.715 0.002 A230 A260 A280 A320

563.20
Medir la muestra
Sample
1.97 2.03 20+200 L
260/ 280 260/ 230

Si el resultado de la muestra ha de ser convertido:

1 Conversion Enter
C A L C : M O L A R I T Y: B A S E PA I R S 300 MOL.MASS 198 kDa

Bradford

4 Protein

0 Sample No.
C A L C : A M O U N T: TOTA L S A M P L E 140 L

3 BCA Enter

0 Sample No.

0 Sample No.

dsDNA

SAMPLE 001 g/mL

563.20
Enter

20+200 L 79 g 2843 pmol/mL 398 pmol

dsDNA

SAMPLE 002 g/mL 0.689 0.788 0.623 0.003 A230 A260 A280 A320

Medir la siguiente muestra

249.70
Sample
1.85 2.19 20+200 L
260/ 280 260/ 230

151

3 Instrucciones breves

Desarrollo de la medicin Bradford

BRADFORD C A L I B R AT I O N R A N G E 100 2000 g/mL

Seleccionar el mtodo Bradford

1 Bradford

Blank

or

Standard

Si se pretende seleccionar el micromtodo:

1 Bradford

B R A D. m i c r o C A L I B R AT I O N R A N G E 1.0 20.0 g/mL

Blank

or

Standard BRADFORD BLANK A

Medir el valor vaco

Blank

0.000
Blank

or Sample

Standard

BRADFORD

STD 1 100 g/mL A

Medir el primer patrn

Standard

0.048
N E X T:

STD 2 200g/mL STD 6 2000 g/mL A

BRADFORD

Medir el ltimo patrn

Standard

1.325

Si la muestra est diluida: Ejemplo: 20 + 200 L

Dilution 2 Lowry 2 Lowry 0 Sample No. 0 Sample No. 0 Sample No. Enter

C V: 2 . 8 % C A L I B R AT I O N S TO R E D BRADFORD SAMPLE 001

20+200 L or Sample

Enter

Blank

Standard

BRADFORD

SAMPLE 001 g/mL 0.352 A595

Medir la muestra

368
Sample
20+200 L

BRADFORD

SAMPLE 002 g/mL 0.525 A595

Medir la siguiente muestra

552
Sample
20+200 L

152

Eppendorf AG 22331 Hamburg Germany Phone: +49 40-5 38 01-0 Fax: +49 40-5 38 01-556 e-mail: eppendorf@eppendorf.com Internet: www.eppendorf.com Application Hotline: Phone: +49 180-3 66 67 89 e-mail: application-hotline@eppendorf.de Brinkmann Instruments, Inc. One Cantiague Road, P.O. Box 1019 Westbury, New York 11590-0207 (USA) Phone: 800-645-3050 Fax: 516-334-7506 e-mail: info@brinkmann.com Internet: www.brinkmann.com
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