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EXPERIMENTO 6 EXPERIMENTO 6 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) E CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Objetivo:  Utilizar a cromatografia em camada delgada para a identificação de diferentes compostos e a cromatografia em coluna para a separação de diferentes substâncias orgânicas.

Fundamentação Teórica: Normalmente trabalhamos em laboratório com substâncias quimicamente puras. Essa situação, no entanto, nem sempre é a verdadeira. Reagentes ou solventes podem estar impuros ou sofrer contaminação. Reações químicas, por outro lado, geralmente conduzem a misturas mais ou menos complexas de produtos que devem ser visualizados, separados e purificados ao final das mesmas. Muitos são os métodos existentes para a purificação/separação dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidos podemos citar a catação, a dissolução/cristalização/ recristalização fracionada, a extração, a destilação e a sublimação. Estes métodos são muito úteis, são largamente empregados em laboratórios e em indústrias com bons/excelentes resultados e serão objeto de estudo detalhado nesta disciplina, nas próximas semanas. Eles falham, no entanto, quando os diversos componentes da mistura possuem constantes físicas semelhantes, isto é, pontos de fusão ou ebulição próximos, solubilidade semelhante em um mesmo solvente (ou mistura de solventes), etc. A cromatografia permite resolver este problema. A cromatografia é um método de separação de substâncias baseado na distribuição seletiva dos diferentes componentes de uma mistura entre duas fases imiscíveis. Os métodos cromatográficos permitem separar os componentes de uma mistura pois dependem da migração seletiva e diferencial dos solutos através de um sistema constituído de duas fases: uma sólida (ou fixa) e outra fluida (ou

Unilasalle - CentroUniversitário La Salle

 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Unilasalle .CentroUniversitário La Salle . Este tipo de cromatografia é de execução muito simples e necessita quantidades muito pequenas das substâncias para realizar-se a análise. líquidos ou sólidos. hormônios. A fase sólida é denominada adsorvente e é estacionária. A amostra é aplicada na borda inferior de uma tira de papel filtro (cromatografia ascendente) ou na borda superior (cromatografia descendente).EXPERIMENTO 6 móvel). em camada delgada. separação e purificação (em pesquisa e em escala industrial) de numerosos produtos naturais: antibióticos. em fase gasosa e em fase líquida. em papel. corantes. No entanto. a tira é colocada em contato com o eluente escolhido. Seu uso mais conhecido. podendo ser arrastados por uma fase móvel. no entanto. denominada eluente.  Cromatografia em Papel Esta técnica cromatográfica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de uma tira de papel filtro de qualidade especial. A identificação das substâncias pode ser feita por visualização direta (quando possuem cor) ou pela utilização de reveladores adequados. deixando que ascenda ou descenda pela superfície do papel filtro. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares como os açúcares e os aminoácidos. etc. é o da análise. vitaminas. gases. possui o inconveniente de se prestar somente a cromatografia de pequenas quantidades das substâncias por vez. Cinco são os principais procedimentos cromatográficos: a cromatografia em coluna. localização e identificação de microgramas de substâncias em meios biológicos (exames "anti doping" e de medicina legal em geral). A cromatografia é muito utilizada para análise. cuidando para que o mesmo não entre em contato direto com a amostra. Adsorção é a capacidade de uma substância (o adsorvente) em deter ou concentrar seletivamente sobre a sua superfície. A seguir.

O adsorvente é misturado ou não com um aglutinante (geralmente gesso ou amido). pois seu suporte é mais resistente que o papel. A cromatografia em camada delgada é utilizada habitualmente em análise qualitativa e quantitativa devido à sua grande sensibilidade e precisão. suspenso em água ou outro solvente adequado e depositado uniformemente sobre a placa (manualmente ou por intermédio de aplicadores apropriados). o adsorvente permanece aderido à placa que. A espessura da camada varia de 0. Para quantidades maiores prefere-se a cromatografia em coluna que será vista mais adiante. Ao secar. deve ser ativada por aquecimento em estufa.EXPERIMENTO 6 A cromatografia em camada delgada é uma técnica cromatográfica muito parecida com a realizada em papel. A revelação e identificação das substâncias são feitas da mesma maneira que na cromatografia em papel. em geral. Possui a vantagem. Consiste em cobrir uma placa de vidro.0mm e deve ser a mais uniforme possível. de poder utilizar reveladores mais agressivos. solvente. Estes valores são reprodutíveis em condições idênticas de trabalho (temperatura. Este é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente. também. Pode ser utilizada. com um adsorvente adequado e com uma granulação especial.1 a 2. alumínio ou plástico.CentroUniversitário La Salle . umidade constantes) e servem para caracterizar e Unilasalle . Nas cromatografias em papel e em camada delgada expressa-se este movimento como um valor de "Rf" (Rate of flow). porém que demanda menor tempo para sua execução e que conduz a resultados muito mais eficientes e perfeitos de separação. no entanto. em escala preparativa para amostras de até 250mg. Um dos aspectos mais importantes da cromatografia é o de que em um determinado sistema cromatográfico o movimento relativo de um composto em relação à frente do solvente é uma propriedade característica e reprodutível.

A câmara cromatográfica deve ser um recipiente de vidro capaz de conter folgadamente a tira de papel filtro e possuir tampa. Caso a substância se encontre em concentração baixa repete-se a aplicação a intervalos de tempo suficientes para secar a aplicação anterior. Unilasalle .EXPERIMENTO 6 identificar as substâncias. Aconselha-se colocar o eluente escolhido na cuba algum tempo antes de proceder à análise para permitir que o ambiente fique saturado com seus vapores (pode-se também agitar a cuba para facilitar a saturação). Antes do desenvolvimento do cromatograma as manchas deverão estar absolutamente secas. A medida é feita desde a linha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) até o centro da mancha em estudo. O valor obtido é comparado aos tabelados na literatura especializada podendo servir para identificar a substância em questão.CentroUniversitário La Salle . Para aplicação das amostras utiliza-se tubos capilares ou micro conta-gotas de maneira que o diâmetro das manchas não exceda 2mm.

EXPERIMENTO 6 (a) (b) Figura 8: Câmaras cromatográficas. aplique a uma distância de 1 cm uma da outra as três soluções metanólicas em duas placas cromatográficas distintas.CentroUniversitário La Salle . Em seguida. Em 1-3 minutos. filtre e despreze o sólido (se houver). duas ou três aplicações serão suficientes. Após a secagem. Prepare duas cubas cromatográficas conforme instruções do professor. coloque ácido acetilsalicílico sintetizado e purificado em laboratório (experimento 4) e no terceiro tubo coloque ácido acetilsalicílico bruto proveniente do experimento 4. Prepare a seguir dois sistemas de eluentes: i) ii) acetona : clorofórmio 1:1 e tolueno : clorofórmio: ácido acético glacial: metanol 12:5:1. Após a eluição. Deixe-as secar.1. retire as placas da cuba. No primeiro. macere o sólido e agite cada tubo por 3-5 minutos. coloque o ácido acetilsalicílico proveniente de um medicamento (experimento 2). No segundo.8:0.5 mL de metanol nos três tubos. Coloque 2. uma para cada sistema de eluentes. aparecerão manchas amareladas sobre as placas. Coloque cada placa cromatográfica dentro de uma cuba.  Cromatografia em coluna (vide experimento 4) PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: PARTE 1: ANÁLISE DOS COMPONENTES DE UM ANALGÉSICO POR CCD COM O USO DE REVELADOR Separe 3 tubos de ensaio. Remova então as Unilasalle . Com a ajuda de um tubo capilar. coloque-as em uma atmosfera de iodo para revelar as manchas. Dependendo da concentração desta solução.

golpeie-a suavemente. Terminada a preparação. até obter uma pasta fluida. contornando cada mancha com o tubo capilar. Preencha a coluna cromatográfica com a pasta com o auxílio de uma pipeta Pasteur. com auxílio de uma pipeta ou conta-gotas. 3. Ao mesmo tempo. proceder a eluição com etanol.EXPERIMENTO 6 placas de dentro da cuba de iodo.5 mL de uma solução etanólica de alaranjado de metila e azul de metileno. Controle o nível do solvente abrindo ocasionalmente a torneira da coluna. Recolha as frações em tubo de ensaio. Terminada a eluição do primeiro corante. Em uma segunda placa cromatográfica de sílica aplique uma mistura de corante e elua em uma cuba contendo etanol. PARTE 2: SEPARAÇÃO EM COLUNA CROMATOGRÁFICA DE UM MISTURA DE CORANTES 1) Empacotamento da coluna: Prepare uma coluna para cromatografia utilizando sílica gel como fase estacionária.0 g de sílica gel em 10 mL de clorofórmio. Eluir todo o primeiro corante com etanol. de modo que ela sedimente aos poucos e de forma homogênea. evitando deixar secar o topo da coluna. tomando cuidado para não causar distúrbios ou agitação no topo da coluna (OBS. Após a adsorção pela coluna. da seguinte maneira: agite com um bastão em um béquer. homogênea e sem bolhas de ar incluídas. Unilasalle . observe o resultado e proceda a montagem da coluna cromatográfica da PARTE 2. o nível de clofórmio deve estar 1 cm acima do topo da coluna de sílica.CentroUniversitário La Salle . 0. de modo a expulsá-las. vertendo cuidadosamente o solvente pelas paredes internas da coluna. eluir o segundo corante retido na coluna com uma mistura de H2O:AcOH (1:1). 2) Separação dos Componentes de uma mistura: Distribuir homogeneamente sobre o topo da coluna de sílica.: utilize uma pipeta Pasteur para adicionar inicialmente o eluente pelas paredes da colna). Caso haja bolhas de ar oclusas na coluna. abrir a torneira para escoar o solvente. Calcule o Rf.