METODE DE EXTRACTIE SI SEPARARE A CAROTENOIDELOR DIN PLANTE

Consideratii generale Dezvoltarea impetuoasa a tehnicilor de izolare si identificare a compusilor naturali a avut ca rezultat o imbogatire rapida a numarului pigmentilor carotenoidici. Pentru izolarea din amestecurile de produsi naturali, se tine cont de proprietatile lor fizice si chimice. Pigmentii carotenoidici sunt sensibili la lumina, caldura, oxigen, acizi si baze alcaline. Din acest motiv, trebuie respectate anumite conditii, pentru pastrarea materialului supus analizei. Prin expunerea la lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. De aceea, materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de actiunea luminii.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la !!" si la intuneric. #n cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie prote$ate prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate %&!- '!!"(. #n prezenta oxigenului %aer( sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita %in cromatograme, pe coloana si pe strat subtire(. )ste necesar sa se lucreze in stare inerta %in atmosfera de azot sau vacuum(. *xidarea in timpul extractiei si saponificarii poate fi minima prin utilizarea unei atmosfere de azot.

Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice actiunii acizilor, au loc o serie de transformari, cum sunt descompunerile oxidative, izomerizarea cis-trans si izomerizarea +,'-epoxizilor la +,,epoxizi. #nlaturarea acestor inconveniente se realizeaza prin neutralizarea cu "a"*&, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se lucreaza cu solventi purificati si proaspat distilati, indeosebi derivatii clorurati, cum este diclormetanul, care contine in mod frecvent -"l. Depozitarea pigmentilor carotenoidici se realizeaza la intuneric, sub atmosfera de azot sau in vacuum, la o temperatura de . !!". "el mai bine se pastreaza in stare cristalina. Pastrarea sub forma de solutie se realizeaza in eter de petrol, hexan sau benzen. Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire, temperatura de fierbere, densitatea, indicele de refractie, intensitatea
.

absorbtiei la anumite lungimi de unda etc., ofera date distincte care permit individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. /otusi, in cercetarile actuale se utilizeaza metodele spectrale, care ofera informatii mai precise privind structura si proprietatile substantelor organice. Metodele spectrale au avanta$ul, fata de metodele chimice de identificare, ca furnizeaza date in timp mult mai scurt si sunt mai precise, necesita cantitati mici de substanta si ofera posibilitatea analizarii continue, in diferite etape ale prelucrarii compusului extras, fara modificarea compozitiei substantei cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.

#n lucrarea de fata sunt prezentate principalele metode de extractie, separare si identificare a compusilor organici, cu aplicatii directe la pigmenti carotenoidici. Metode de extractie Generalitati privind etodele generale de extractie
Distributia intr- o mare varietate de materiale si lichide biologice a compusilor biologic activi a facut sa nu se poata adopta o metoda generalvalabila de extractie care sa poata fi aplicabila in mod universal si adoptata ca o tehnica standardizata. 0cest lucru se datoreaza structurii diferite a compusilor biologic activi, chiar si cei din aceeasi clasa deosebindu-se intre ei prin lungimea catenei, prin grupari functionale specifice sau configuratie, solubilizarii diferite in solventi etc. Metoda de extractie se

alege in de natura materialului d usurin extractiei functie vegetal, e ta cu solvent cantitat s proprietatile compusilor supusi i, de ea i extractiei %solubilitate, termolabilitate( etc. 1.2 Dupa natura substantei de extras, lichida sau solida, se aplica extractia solid-lichid, in marea cazurilo s extract lichidma$oritate a r, i ia lichid, s adi extract un lichi a a principiilor active aflate intr-un ca ia ui d u lichid %rezultatul primei faze de extractie(, cu a$utorul altui lichid nemiscibil. Produsul vegetal proaspat sau uscat se pulverizeaza sau se zdrobeste
foarte fin pana la gradul de maruntire convenabil realizarii extractiei.

0leger solventul es determina ea ui te ta proprietatile fizico-chimice ale

de

principiilo activ natura r e, selectivitatea solventului.

solventului,

#n s gener substante termolabile extrase la prin a al, le sunt rece percolare u agitar Pent extract l ca s folosesc mul meto i e. ru ia a ld e mai te de n functi d regim de s anu extract la reflux, e e ul extractie, i me ia extractia continua solid-lichid sau lichid-lichid. "ele mai bune rezultate se obtin prin aplicarea extractiei in contracurent. * metoda eficace de extractie o constituie ultrasonicarea materialului supus extractiei cu solventi.

Metode de extractie a carotenoidelor

Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari, de regula eter etilic sau cloroform, prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere. Se impune un grad de maruntire avansat, deoarece solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.

Materialul vegetal supus extractiei poate fi in stare proaspata sau uscata. Daca materialul supus extractiei se afla in stare proaspata, acest lucru implica si existenta apei in tesuturi, pentru indepartarea ei fiind necesara uscarea prealabila a materialului vegetal prin extractia cu solventi miscibili cu apa %acetona, metanol, etanol(, materialul trebuind sa fie suficient de deshidratat pentru a se preta extractiilor ulterioare cu solventi neaposi. #n cazul materialului uscat, extractia se realizeaza cu solventi nemiscibilicu apa. Solutia extractiva organica contine derivati carotenoidici nativi, alaturi de numeroase substante balast, cum ar fi clorofila. Extractia din tes!t!rile plantelor s!perioare Schema generala de extractie a carotenoidelor din produse vegetale este cea prezentata mai $os.1 2 Pentru tesuturile plantelor superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie, in continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei generale de extractie. 1.2 Metoda I
Materialul vegetal este maruntit foarte fin %din considerentele aratate mai sus( si omogenizat cu acetona, timp de .- minute, in atmosfera de azot. *mogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu acetona, pana cand omogenatul devine incolor. )xtractele acetonice se reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la rotavapor. Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat distilat, omogenizand amestecul si spalandu-l apoi cu o solutie de 3a"l %pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita emulsionarea amestecului(, pana la indepartarea completa a acetonei.

0ceasta metoda este foarte utilizata in cazul in care se realizeaza extractii ale tesuturilor verzi ale plantelor, flori si fructe.

&

EXTRACTIA CAROTENOIDELOR DIN PROD"SE #EGETALE PROD"S #EGETAL P"L#ERI$AT

-epuizare cu eter%cloroform(4macerare,agitare,percolare,refluxare

%A$A ORGANICA

RE$ID"" #EGETAL

-distilare volum redus4agitare 3a "*&

%A$A APOASA ALCALINA

%sapunuri ale acizilor grasi liberi(

-saponificare 5*- .!6 in alcool%.- ore in baia de apa in fierbere(4racire4epuizare cu eter

%A$A ORGANICA

%A$A ALCALINA %A$A ORGANICA

-anhidrizare cu 3a S*7 sicc.,filtrare,

%lipide saponificate(

distilare vid volum mic

&idrocar'!ri ali(atice

%A$A ORGANICA
o -racire +-.! "4filtrare

%A$A ORGANICA

RE$ID"" TOTAL CAROTENOIDIC

precipitat albsidefos

-evaporare

reluari repetate cu eter

SOL"TIE EXTRACTI#A ETERICA

filtrare4evaporare

RE$ID""

reluari cu "-&*8 64

filtrare4evaporare

TOTAL CAROTENOIDIC I &IDROCAR)"RI CAROTENOIDICE XANTO%ILE MONO&IDROXILATE

TOTAL CAROTENOIDIC II XANTO%ILE DI&IDROXILATE ALTE CAROTENOIDE S"PERIOR OXIDATE

Metoda II 0ceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici de substanta. /esutul este maruntit si triturat cu 3a S*7 anhidru, pana se obtine o pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu acetona, urmata de eter etilic. )xtractul se centrifugheaza, precipitatul obtinut extragandu-se in continuare pana la incolor, solutiile supernatante reunindu-se si concentrandu-se, transferandu-se apoi intr-un volum egal de eter etilic, ca si in cazul metodei #. Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care permite indepartarea substantelor balast, mai ales clorofile s hidroliz a i, i a esterilor xantofilei. Saponificarea se prin de realizeaza adaugarea 5*7

.+6 peste %.9.! v:v 0ceas saponifica se poate realiza extract , (. ta re in doua moduri9 1- incalzirea amestecului alcalin timp de .!-.+ minute pe baie de apa, in atmosfera de azot, la intuneric4 2- pastrarea la temperatura camerei sau la +!", la intuneric, timp de .!-.+ ore. )ste de preferat utilizarea metodei de saponificare prin racire, datorita faptului ca unii pigmenti carotenoidici %cum sunt xantofilele( sunt labile termic, existand posibilitatea degradarii. Extractia din alge
#n cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda generala prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta, este necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea, extractia carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat acetona %etanol sau amestec acetona9etanol(, datorita faptului ca au polaritate mare si permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. 1&2 Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata si racirea timp de +-, ore inaintea extractiei propriu-zise, apoi extractia cu metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de -& minute, apoi racirea rapida cu gheata. 0cest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor, dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor.

Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de extractie. Un procedeu care implica uscarea prealabila a algelor a fost utilizat la extractia carotenoidelor din Fucus serratus, cand algele sunt uscate timp de cateva zile, macinate, apoi pudra este amestecata cu apa %,!! ml apa la +!! g pudra(, dupa care amestecul este eluat intr-o coloana prin percolare cu amestec benzen9metanol %.9.!, v:v(. )luatele de culoare verde se indeparteaza, iar zona bruta se elueaza cu mult solvent, se concentreaza si se cromatografiaza pe coloana de "a"*&. Cro atogra(ia
"romatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia componentelor dintr-un amestec intre doua faze9 una fixa, denumita faza stationara, si alta mobila, ce strabate faza stationara. ;aza stationara
+

poate fi un adsorbant solid %cromatografie de adsorbtie(, un lichid depus pe suprafata unui suport solid %cromatografie de repartitie(, un schimbator de ioni %cromografie prin schimb ionic( sau un gel %cromatografie prin excluziune sterica(.1+2 "romatografia se aplica in scopul izolarii unor componenti prin separarea acestora la elutia coloanei %in cromatografia pe coloana(, prin razuirea spoturilor de pe cromatoplaci %cromatografia in strat subtire( sau prin taierea spoturilor de pe hartie %cromatografia pe hartie(.1'2 /ermenul de cromatografie, care inseamna .scriere in culori. %chrom<culoare in limba greaca( a fost dat de /vet %.8!'(, cu ocazia separarii colorantilor din frunze verzi %clorofile, carotenoide(, prin adsorbtie lichid-solid.
Principiul metodei /vet consta in stabilirea unui echilibru intr-un proces cinetic de adsorbtie-desorbtie intre faza solida fixa si faza lichida mobila. ;aza stationara este alcatuita din material adsorbant, granular, plasat intr-o coloana, iar faza mobila este o solutie a amestecului de separat intr- un solvent potrivit. Solutia se deplaseaza in coloana prin cadere libera sau cu a$utorul unei diferente de presiune. Pentru distantarea zonelor in care s-au

adsor diversi componenti ai amestecului se adauga un solvent bit la parte superioa a coloanei. "omponentii migreaza cu viteze a ra diferite, datorita faptului ca sunt retinuti in mod diferit de catre faza stationara. Procesul este denumit developarea cromatogramei.
Separarea completa a componentilor din coloana, numita elutia

cromatogram s realizea pri adaugar de diferi ei, e za n ea solventi ti si culegerea respecti in diferit "omponen ie di solutiilor ve vase e. tii s n coloana in ordinea inversa adsorbabilitatii lor in faza stationara. Dintre metodele cromatografice, cromatografia in faza gazoasa si p cromatografia gaz-lichid foart raspandit datorita faptului o sunt e e, ca t fi aplicate amest de componenti lichizi cu temperaturi $oase oricarui ec de fierbere. Pentru compusii c volatilita redusa, utilizea organici u te se za cromatografia in strat subtire si cromatografia pe hartie. #n cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita

dintr-o foaie de hartie de filtru, pe care aplica la extremita picatur se o te o a di amestec d analiza -arti se introduce apoi extremitat n ul e t. a cu ea continand picatura intr-un eluent situat intr- un vas acoperit. )luentul urca prin capilaritate si antreneaza componentele in ordinea crescanda a valorii Rf, ce reprezinta raportul dintre viteza de migrare a componentului si viteza de migrare a eluentului9
'

=f <

Practic se masoara distanta de migrare a solventului si distanta de migrare a componentului. =ecunoasterea componentilor incolori se realizeaza cu a$utorul unui reactiv specific cu care dau compusi colorati.
"and se doreste separarea neta a componentilor unui amestec, se realizeaza o cromatografie bidimensionala cand, dupa o prima developare, hartia se usuca, se roteste cu 8!! si se asaza intr-un nou eluent.

#n cromatografia in strat subtire, faza stationara este un strat adsorbant %de silicagel sau alumina( cu o grosime de fractiune de milimentru, depus pe o placa de sticla. Principiul separarii este acelasi ca la cromatografia pe hartie, insa prezinta avanta$ul unei separari mai rapide si mai precise. Metode de separare a carotenoidelor Separarea carotenoidelor dintr-un amestec este dependenta de natura lor, si anume de polaritatea moleculei si de gruparile functionale din molecula, ce determina caracterul lor hidrofil. Datorita acestor proprietati exista doua metode de separare a carotenoidelor, si anume9 1repartitia intre doua faze lichide nemiscibile intre ele4 2separare prin adsorbtie pe adsorbant. Schema generala de separare implica urmatoarele etape9 - faza organica, obtinuta dupa saponificarea extractului, este anhidrizata cu 3a S*7 sicc., se supune repartitiei intre eter de petrolmetanol 8 6 pentru a separa hidrocarburile carotenoidice si xantofilele monohidroxilate care trec in epifaza%eter(, iar xantofilele dihidroxilate si alte carotenoide superior oxidate trec in hipofaza %alcool(4 - fiecare faza se supune cromatografierii pe coloana de oxid de aluminiu %0l *& standardizat .>roc?mann ##-###( sau alt adsorbant, utilizand ca eluanti eter, alcool etilic9eter %.98, v:v(, alcool etilic absolut, acetona. Se retin fractiuni de +!-.!! ml, carora li se determina puritatea prin cromatografie in strat subtire, folosind drept faza stationara silicagel, iar drept faza mobila un sistem de solventi.
@

Separarea prin repartitia lic*id+lic*id Dupa cum s-a aratat mai sus, un sistem de repartitie il constituie eterul de petrol si metanolul. Prin aceasta metoda se pot separa carotenoidele hidrocarburice de xantofile. Separarea este utilizata ca o faza preliminara cromatografiei pe coloana sau in strat subtire. Separarea prin repartitie intre doua lichide poate fi o alternativa a saponificarii in vederea indepartarii clorofilei din extractele ce nu se pot saponifica prin adaugare de baze, datorita existentei carotenoidelor sensibile la aceste substante. 0cest procedeu implica trecerea xantofilelor in hipofaza metanolica, clorofilele trecand in epifaza. * alta varianta este extractia unei solutii metanolice a unui pigment cu eter de petrol, pana cand clorofilele sunt indepartate. #n ambele cazuri, xantofilele din hipofaza sunt trecute in eter etilic si apoi spalate cu apa.
0cest procedeu este din ce in ce mai putin utilizat datorita sensibilitatii metodelor cromatografice, prin repartitie randamentul de separare fiind destul de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite, putandu-se gasi in ambele fractiuni de repartitie. #n cazul unei carotenoide ce poseda solubilitate doar in unul din cei doi solventi %glicozid sau acid(, acest procedeu se poate aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.

Separarea prin etoda distri'!tiei contrac!rent 0cest procedeu consta in repartitie repetata intre cei doi solventi descrisi mai sus, a$ungandu-se la metoda denumitadistributia contracurent.1@2 Dupa un numar suficient de mare de repartitii, amestecul original este separat in fractiuni, avand fiecare o anumita solubilitate9 hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono si dihidroxilate, etc. 0cest procedeu este urmat de o fractionare prin cromatografie pe coloana, prin adsorbtie diferita datorata gruparilor specifice fiecarei grupe de carotenoide. 0cest procedeu este util in cazul separarii xantofilelor foarte polare, care sunt puternic adsorbite. Separea prin etode cro atogra(ice
utilizate metodele Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte

cromatografice, atat cea in strat subtire, cat si cea pe coloana. Cromatografia in strat subtire
"romatografia in strat subtire este o tehnica foarte utilizata in separarea si purificarea carotenoidelor. /ehnica de baza a acestei metode a fost descrisa de diferiti autori.1,2 Aradul de purificare prin aceasta metoda este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloana.
,

#n functie de natura carotenoidului se vor alege faza stationara, precum si faza mobila si sistemul de eluare din placi. #n cromatografia in strat subtire a carotenoidelor trebuie luate anumite precautii, si anume9 1- aplicarea rapida a probei4 2- aplicarea probei la lumina slaba4 3- developarea imediata a cromatogramei4 4- developarea la intuneric a cromatogramei4 5- utilizarea unei atmosfere de azot.
Materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de actiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la !!" si la intuneric. #n cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie prote$ate prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate %&!-'!!"(. #n prezenta oxigenului %aer( sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita %in cromatograme, pe coloana si pe strat subtire(.

Alegerea fazei stationare Pot fi utilizati drept faza stationara foarte multi adsorbanti, dupa cum rezulta din tabelul .. Sistemele cele mai utilizate in cromatografia in strat subtire cuprind separarea carotenoidelor pe strat cu silicagel si developarea cu eter de petrol %B+6 eter etilic( sau pe Mg* si developare cu benzen9eter de petrol %89., v:v(. "romatoplacile ce au drept sistem stationar Cn"*&, developate cu amestec hexan- alcool, dau rezolutii foarte bune pentru xantofile, in timp ce "a"*&, Mg* si "a%*-( sunt utile atat in separarea hidrocarburilor carotenoidice, cat si a xantofilelor. Alegerea solventului Solventii utilizati in separarea carotenoidelor prin cromatografie in strat subtire sunt eluanti slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum si amestec de solventi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etilbenzen etc. Solventii care dau o inalta rezolutie, datorita proprietatilor lor, sunt alcoolii tertiari. "loroformul este in general omis datorita urmelor de acid clorhidric pe care le contine si care pot conduce la
8

transformari ale carotenoidelor. 0cidul acetic este utilizat doar in cazul carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant. Adsorbanti utilizati pentru cromatografia in strat subtire a carotenoidelor (tabelul 1):
Nr,cr t 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Adsor'a nt Al-O. Cel!lo/a
CaCO.0MgO0Ca1O&21.304056 7 7 2 Ca1O&2-

Ca1O&2-0silicagel 18086 7 2 9ieselg!*r Manitol MgO MgO0celita180-6

MgO0silicagel 18086 7 2

7 2

Silicagel $a*aro/a $nCO.

Detectarea carotenoidelor
Datorita faptului ca acesti pigmenti sunt colorati, se poate realiza si identificarea vizuala a lor %se poate detecta vizual pana la !,!+ g - caroten(. "arotenoidele, insa, se decoloreaza rapid pe placa cromatografica, din acest motiv fiind necesara stropirea cromatoplacii cu o solutie de parafina in eter de petrol 1,2. Unele carotenoide carbonilice sau produsii de descompunere oxidativa pot fi identificati cu o solutie de rodamina .6 in acetona 182 sau prin stropirea cu o solutie de Sb"l& in cloroform. "ea mai sensibila metoda ramane totusi identificarea cu vapori de iod, cand se formeaza spoturi de culoare bruna, prin aceasta metoda identificandu-se si eventualele impuritati. "ompusii incolori pot fi detectati prin vizualizarea fluorescentei verde caracteristica la absorbtie in ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci

)luarea se face in functie de stratul adsorbant si de polaritatea carotenoidelor. Da cromatografiere pe silicagel A eluarea se face cu eter
.!

etilic sau eter etilic B+-.!6 etanol %carotenoide polare(, iar la cromatografiere pe Mg* eluarea se face cu acetona %hidrocarburi carotenoidice si xantofile(. )luarea se face dupa scoaterea zonei colorate de pe suport, urmatE de filtrare. Cromatografia pe coloana
"ea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor, cromatografia pe coloana, a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie. 0ceasta metoda este utilizata prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida de inalta performanta, metoda care prezinta avanta$ele utilizarii cantitatilor mici de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita scara, neputand fi utilizatE in scopuri preparative 1.!2.

#n functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si solventul de developare adecvat.

Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru separarea carotenoidelor, pot fi amintiti celuloza, "a%*-( %utilizat mai ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice(, zaharoza, amidon, silicagel, 0l *& %folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor(, "a"*& si Mg* %acestia fiind utilaizaFi la separarea carotenoidelor cu polaritate intermediara, cum este cazul xantofilelor(. Pe aceeasi coloana se pot utiliza si adsorbanti diferiti asezati in functie de puterea de adsorbtie, cel mai adsorbant fiind asezat in partea superioara a coloanei.1..2 Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt eluanti slabi. De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. "oloana de adsorbtie trebuie incarcata cu adsorbant in proportie de G, o parte ramanand pentru solvent si extract. 0dsorbantul trebuie sa fie foarte bine compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu-se cu portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. )xtractul carotenoidic trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o singura data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se incepe developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.1. 2

#n cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru separarea carotenoidelor, si anume 9 1) cromatografia in zone4
2) cromatografia elutiei in trepte

c(cromatografia elutiei in gradient.

..

romatografia in zone
0mestecul de carotenoide care se afla intr-un solvent nepolar se aplica pe la partea de sus a coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloana este utilizat un solvent adecvat pentru developare. Conele sunt scoase din coloana, fiecare zona fiind apoi eluata individual cu un solvent polar.

romatografia elutiei in trepte #n aceasta metoda se aplica principiul general al cromatografiei pe coloana, si anume introducerea amestecului carotenoidic in partea superioara a coloanei, apoi aplicarea solventilor, in functie de polaritate. Pigmentii sunt eluati in ordinea cresterii afinitatii lor de adsorbtie si colectati. ;iecare zona eluata este apoi evaporata la sec, redizolvata intr-un volum mic de solvent, in vederea spectrofotometrarii. Concl!/ii #n perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un accent deosebit pe superioara a plantelor de cultura si valorificarea a celor din flora spontana, surselor naturale in general, in functie a de compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se impune ca o cerinta de prima marime. 3umai prin cunoasterea compozitiei chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu continut ridicat in substante biologic active, care maresc valoarea biologica a plantelor in care se gasesc. Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a proprietatilor fizico-chimice a unui compus biologic activ, este necesara mai intai izolarea lui din amestecul de compusi naturali.
Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie de proprietatile compusilor supusi extractiei. )xtractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari %eter etilic,

cloroform(, prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe a p i fierber impunandu-se un grad de avans a n e, maruntire at, faptul ca solventul nepolar nu patrunde prin ui membrana pentru a dizolva carotenoidele.

baia de datorit a celula ra

Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si in strat subtire, precum si separarile prin repartitia lichid-lichid si prin metoda distributiei contracurent.
.

)I)LIOGRA%IE
[1] V./amas, A.3eamtu-Pigmenti carotenoidici si metaboliti , vol .,

)d. "eres, >ucuresti %.8,'(

[2] #."iulei, V.#studor, M.Palade-Analiza farmacognostica si fitochimica

a produselor vegetale, )d. Didactica si Pedagogica, >ucuresti %.88@(

[3] >.0motz, 0.5atz, M.0vron- !.Ph"col., .,9+ 8-&@ %.8, (

#.PoganH, M.>anciu-#ehnica e$perimentala in chimia organica , )d.Stiint.)ncicl.>ucuresti %.8@@(

[4] [5] M.#ovu -

himie organica, )d Didactica si Pedagogica, >ucuresti %.8, (

[6] ). Dederer, M.Dederer- hromatograph". A Revie% of Priciples

and Applications, )lsevier, 0msterdam %.8@8(

[7] #.0."url, A.;.>aileH - !.Agr.Food [8] ).Stahl-#hin-&a"e

hem., :, 7!& %.8@@(

hromatograph", Springer-Verlag, 3.I.

%.8@8( 182J.0vigan, D.Steinberg - !. &ipid Res., ;, .!! %.8'&( 1.!2 0> >arua, J0 *lson- !. hromat.'iomed.(ci.Appl., @!@9.- , '8@8 %.88,( 1..2J.Dietz >rHant, J.D.Mc"ord, D.5night Unlu, J.K.)rdman!.Agric.Food hem.)vol.7!, 3o.7, +7+-+78 %.88 (
1. 2 P.-ugueneH, S.=omer, M.5untz, >."amara- !.'iochem., !8, &88-7!@

%.88 ( >utterLorth, Dondra %.8'7(

.&

P DF to Wor