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PRÁCTICA 2

CUANTIFICACIÓN DE AMINOACIDOS (MÉTODO DE NINHIDRINA)

INTRODUCCIÓN

Hace muchos años, Ruhemann demostró que los aminoácidos y la ninhidrina reaccionan con gran sensibilidad para dar un compuesto púrpura, ahora conocido como púrpura de Ruhemann. El ensayo se basa en la reacción con ninhidrina del grupo amino de aminoácidos libres y de los grupos amino de la molécula proteínica. Este proceso transcurre en varias etapas. En un principio, como resultado de la interacción del aminoácido con la ninhidrina se forma una base de Schiff. Luego ésta sufre un reagrupamiento, se descarboxíla y se descompone en aldehído y aminodicetohidrindeno como se observa en la siguiente figura:

El aminodicetohidrindeno se condensa con otra molécula de ninhidrina más y el compuesto formado, al enolizar, toma un color violeta azul. Esta reacción se verifica según el esquema siguiente:

OBJETIVO Cuantificar el contenido de aminoácidos libres de una muestra problema por el método de ninhidrina. etanol etc. la reacción transcurre del modo siguiente: El producto de esta reacción contiene en su composición el radical R. Analizar las características fisicoquímicas de los aminoácidos y los fundamentos químicos en los que se basa la cuantificación de aminoácidos por el método de ninhidrina.20 En presencia de disolventes orgánicos (acetona.) en los cuales se prepara la disolución de ninhidrina. los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan solamente un producto amarillo-café. Aunque los aminoácidos forman el púrpura de Ruhemann bajo condiciones apropiadas (pH cercano a 5. . roja y amarilla) en los compuestos que surgen en la reacción entre los aminoácidos y la ninhidrina.del aminoácido inicial que provoca diferentes coloraciones (azul claro. violeta.0).

0 1 0.1 0.4 1.2 0.7 1. en ella interpole el valor de absorbancia del tubo problema para determinar:  la concentración de aminoácidos en 0. 4. Utilice como muestra problema el extracto acuoso separado en la práctica 1 sección A: REACTIVO ( ml ) Patrón de Leucina 100 g/ml Agua destilada Muestra problema Reactivo de Ninhidrina 2% Blanco 1. Reactivo de Ninhidrina 2% en metilcelosolve.0 2.1 1. 3.9 0.9 0. 5. 6. Prepare los tubos con las soluciones indicadas según la siguiente tabla.0 2 0.3 0. MÉTODO 1.01 ml de la muestra y .0 7 0. Con los resultados construya una curva patrón graficando g de proteína vs absorbancia. Transcurrido el tiempo enfríelos sumergiendo los tubos en un poco de agua fría cuidando que no se contaminen con el agua.0 TUBO 4 5 0. Patrón de Leucina 100 g/ml. Obtenga en el espectrofotómetro la A570 de las mezclas de la curva patrón y de los problemas (Tubo 7 y 8). Incúbelos en baño María a ebullición durante 15 minutos.0 1. Agregue a cada tubo 5 ml de etanol al 50 % a cada tubo y agite.0 6 0.1 y 0.0 8 0.6 0. calibrando con el contenido del tubo 1 (blanco de reactivos).0 1. Mezcle suavemente los tubos y tápelos con papel aluminio.01 1.5 1.21 Material 10 tubos de ensayo de 15 X 100 mm 3 pipetas de 1 ml y 3 de 5 ml 1 espectrofotómetro 1 gradilla 1 parrilla eléctrica 2 vasos de precipitados de 250 ml 1 piseta con agua destilada 1 vaso de precipitados de 500 ml o vaso metálico Reactivos Muestra problema de aminoácidos.5 0.9 1.8 1.0 3 0.6 0.4 0.

¿Puede considerarse que un solo aminoácido ya sea polar.I. CUESTIONARIO 1.. Glicina. Anual Biochem...¿Pueden reaccionar con las moléculas de ninhidrina los grupos amino libres presentes en las cadenas laterales de Lisina. G. reacciona siempre solo con dos moléculas de ninhidrina? ¿Siempre se mantiene esta relación estequiométrica? 2. M. Editorial Mir. V. Pokusay. básico o ácido. 72 248.V. Voronianski. Moscú. no polar. . A rapid and sensitive method for the quantitative of microquantities of protein. Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral. Chechetkin A. M. 1976.. Asparagina y Glutamina? BIBLIOGRAFÍA Bradford. 1984.22  la concentración total de aminoácidos de la muestra problema en mg por gramo de tejido.G.

5 con HCl o KOH. Ajustar el pH a 5.5. Almacenar en refrigeración. Pesar 10 mg (0. . Reactivo de ninhidrina 2 % en metilcelosolve Disolver 5 g de ninhidrina en 187.5 se disuelven 272 g de acetato de sodio en 300 ml de agua destilada calentando.5 ml de metilcelosolve (etilenglicol monometil eter) agitando suavemente. Aforar a 500 ml con agua destilada. De preferencia debe prepararse fresco justo antes de usarse. en estas condiciones se mantiene útil por un mes. Nota: El reactivo no dura más de 5 horas a temperatura ambiente. Para preparar el amortiguador de acetato 4M pH 5.01 g) de leucina disolver en un poco de agua destilada y aforar a 200 ml. aforar a 250 ml con amortiguador de acetato de sodio 4M pH 5. por lo que debe mantenerse en refrigeración siempre. Enfriar a 25°C y agregar 50 ml de ácido acético. Almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Almacenar en frasco ámbar en refrigeración.23 Reactivos Práctica 2 Solución Patrón de Leucina 100 g/ml.

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