COLIMÉTRIE

Bibliographie : Microbiologie alimentaire 5ème édition de C. et J.N. Joffin Activités technologiques en microbiologie Terminale BGB de G. Leyral, C. et J.N. Joffin, E. Verne, J.L. Larpent Règlement (CE) N°2073/2005 de la commission du 15/11/2005 concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires

2.1.4. Lecture

La colimétrie correspond aux méthodes de dénombrement des coliformes. Les techniques de colimétrie ont pour objectif le dénombrement et, éventuellement, l’identification des coliformes totaux, des coliformes thermotolérants (ou coliformes fécaux) ou d’Escherichia coli en particulier. L’intérêt de ces manipulations est de déterminer pour le produit testé une contamination fécale et d’en apprécier l’ampleur, car les coliformes sont des bactéries vivant principalement dans les intestins. De plus, les coliformes thermotolérants et Escherichia coli survivant difficilement hors de l’intestin traduiront donc une contamination fécale récente.

a. Si un tube par dilution La présence d’un trouble (culture) et la production de gaz dans la cloche (au moins 1/10 du volume de la cloche) permet de conclure à la présence d’au moins un coliforme dans le mL d’inoculum de la dilution testée. b. Si 2 ou 3 tubes par dilution On utilise la table de Mac Grady afin de déterminer statistiquement la quantité de coliformes présents dans un mL de produit pur. (voir cours sur « les techniques de dénombrement »). 2.2. En milieu solide
2.2.1. Milieux utilisés : gélose au désoxycholate ou gélose VRBL

1. Témoins de contamination fécale
1.1. Définitions
1.1.1. Coliformes totaux

Ces deux milieux contiennent du désoxycholate qui inhibe les bactéries Gram + (mais pas les coliformes), du lactose utilisé comme source de carbone et d’énergie et du rouge neutre (indicateur de pH permettant la lecture du caractère « lactose » : colonies rouges lactose +). Le milieu VRBL est plus sélectif du fait de la présence de cristal violet en plus du désoxycholate.
2.2.2. Ensemencement

Un coliforme est une entérobactérie fermentant le lactose à 30 ou 37 °C avec production de gaz.
1.1.2. Coliformes thermotolérants

Le dénombrement est réalisé dans la masse des milieux pré-cités en double couche.
2.2.3. Incubation

Un coliforme thermotolérant est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec production de gaz.
1.1.3. Escherichia coli

24 heures à 30°C.
2.2.4. Lecture

Escherichia coli est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec production de gaz et produisant de l’indole à 44 °C. 1.2. Principe de base des techniques de dénombrement Tous les milieux utilisés contiennent du lactose. Les milieux liquides possèdent une cloche afin de mettre en évidence la production de gaz. Un certain nombre de milieux utilisent des agents sélectifs, inhibiteurs des bactéries Gram + : vert brillant, cristal violet, désoxycholate,… Des milieux récents chromogènes permettent le dénombrement direct d’Escherichia coli par mise en évidence de l’activité ß-glucuronidase.

Toutes les colonies rouges (lactose +) d’un diamètre minimum de 0,5 mm en 24 heures sont considérés comme étant des coliformes. Les milieux contiennent un agent de différenciation : les normes préconisent alors de prendre en compte les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies.

3. Dénombrement des coliformes thermotolérants
Il se réalise sans dénombrement préalable des coliformes par la même technique en milieu solide (DCL ou VRBL) mais avec une température d’incubation de 44°C.

4. Dénombrement d’Escherichia coli : test de Mackensie
Le test de Mackensie permet un dénombrement d’Escherichia coli après avoir dénombré les coliformes totaux en milieu liquide (BLBVB à 30 ou 37°C). Il utilise la propriété d’Escherichia coli de produire de l’indole à 44°C et de fermenter le lactose à 44°C. 4.1. Milieux utilisés • Un tube de BLBVB • Un tube d’eau peptonée 4.2. Ensemencement Pour chaque tube positif où l’on soupçonne la présence de coliformes en BLVB, on prélève une anse de culture que l’on reporte dans un BLBVB et dans une eau peptonée. 4.3. Incubation 24 à 48 h à 44°C 4.4. Lecture Le résultat se rapportera au tube initial. Le tube BLBVB est positif s’il présente un trouble et que la cloche présente du gaz (au moins un 1/10 du volume de la cloche). La lecture du caractère « indole » s’effectue après ajout du réactif de Kovacs : la présence d’un anneau rouge permet de conclure à « indole + ».
C. LARCHER

2. Dénombrement des coliformes
Le dénombrement des coliformes peut se faire, selon les produits, par des techniques en milieux liquides ou solides. La démonstration de la nature « coliforme » n’est jamais parfaite mais le principal est de suivre les normes permettant la standardisation des méthodes. 2.1. En milieu liquide
2.1.1. Milieu utilisé : BLBVB + cloche (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant)

Ce milieu contient deux agents sélectifs : la bile (ou désoxycholate) et le vert brillant. Il contient des peptones et du lactose (caractère biochimique). Il n’y a pas d’indicateur de pH. La production de gaz se fait à partir de l’utilisation du lactose.
2.1.2. Ensemencement

1 mL de chaque dilution est introduit dans un tube de BLBVB + cloche. Homogénéiser l’inoculum afin qu’il se répartisse dans tout le tube, cloche comprise.
2.1.3. Incubation

24 heures à 30°C.
C. LARCHER

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4. d’un Clark et Lubs et d’un Citrate de Simmons).1. 6.1. 5.2. LARCHER Colimétrie – Page 4 / 4 – . Identification Les principaux genres appartenant aux coliformes sont : • Escherichia • Citrobacter • Klebsiella • Enterobacter 5. C.2.1.1. 5. roses avec un centre violet.2.1. Test IMViC (Indole – rouge de Méthyle – Voges Proskauer – (inositol) – Citrate) Lactose – (ou + sans gaz) à 44°C Indole – Présence de moins de un coliforme thermotolérant dans le tube initial Ce test classique de microbiologie alimentaire ne permet pas une identification très précise mais il est relativement peu coûteux (ensemencement d’une eau peptonée. Le tableau suivant permet de donner une conclusion approximative : Indole + (parfois – pour E. Bilan de la recherche des coliformes Isoler classiquement à partir d’un tube de BLBVB positif ou à partir d’un bouillon contenant des coliformes présumés. avec très souvent un reflet métallique Colonies grosses de 4 à 6 mm de diamètre.1. Isolement et identification des coliformes 5. coli Genres bactériens probables Lactose + avec gaz à 44°C Indole + Présence d’au moins un E. LARCHER Colimétrie – Page 3 / 4 – C.5. Ensemencement Galerie classique en macrométhode ou galerie Api 20E. violet très foncé. coli dans le tube initial 5. muqueuses Colonies violet pâle avec un centre et un reflet métallique peu marqué Petites colonies grises Très petites colonies transparentes Lactose – (ou + sans gaz) à 44°C Indole + Présence de moins de un E. plates. convexes.3. coli dans le tube initial Autres bacilles Gram – Bactéries Gram + Aspect obtenu Colonies de 2 à 3 mm de diamètre. Incubation 24 à 48 h à 37°C.1. coli dans le tube initial Klebsiella Citrobacter Lactose + avec gaz à 44°C Indole – Présence d’au moins un coliforme thermotolérant et de moins de un E. Lecture Aspect des tubes après incubation à 44°C BLBVB Eau peptonée Interprétation Conclusion E. coli atypique) RM + + – VP – – + Citrate – + + Genre ou espèce Escherichia coli Citrobacter Enterobacter ou Klebsiella Remarque : le test de Mackensie peut être remplacé par le test de Schubert où le lactose est remplacé par du mannitol.2. On peut donc observer la culture de coques Gram + qui est en général faible. Galeries biochimiques Ce milieu (de Lévine) ne contient pas d’agents sélectifs très puissants (éosine et bleu de méthylène ne font qu’inhiber partiellement la culture des Gram +) ni d’indicateur de pH. Milieu utilisé : EMB (éosine – bleu de méthylène) – (parfois + pour Enterobacter atypique) 5. Isolement des coliformes 5.2. – (parfois + pour Citrobacter atypique) 5.