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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA









PRODUO DE ACAR INVERTIDO PELO
USO DE INVERTASE IMOBILIZADA EM
RESINAS






Autora: Lbia Diniz Santos Marquez
Orientadores: Elozio Jlio Ribeiro (UFU)
Vicelma Luiz Cardoso (UFU)


Uberlndia
2007



UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA



FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA






PRODUO DE ACAR INVERTIDO PELO
USO DE INVERTASE IMOBILIZADA EM
RESINAS


Lbia Diniz Santos Marquez



Dissertao de mestrado apresentada ao
Programa de Ps-Graduao em Engenharia
Qumica da Universidade Federal de
Uberlndia como parte dos requisitos
necessrios obteno do ttulo de Mestre em
Engenharia Qumica, rea de concentrao em
Pesquisa e Desenvolvimento de Processos
Qumicos.

Uberlndia
2007
























Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)



M357p


Marquez, Lbia Diniz Santos, 1978-
Produo de acar invertido pelo uso de invertase imobilizada em
resinas / Lbia Diniz Santos Marquez. - 2007.
137 f. : il.

Orientadores: Elozio Jlio Ribeiro, Vicelma Luiz Cardoso.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Uberlndia, Progra-
ma de Ps-Graduao em Engenharia Qumica.
Inclui bibliografia.

1. Processos qumicos - Teses. 2. Enzimas - Teses. I. Ribeiro, Elozio
Jlio. II. Cardoso, Vicelma Luiz. III. Universidade Federal de Uberlndia.
Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica. III. Ttulo.


CDU: 66.09

Elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogao e Classificao







Agradecimentos

A conquista do ttulo de Mestre em Engenharia Qumica vem acompanhada de
reconhecimentos sinceros queles que contriburam solidariamente na execuo e
elaborao deste trabalho, direta ou indiretamente. Seria impossvel expressar a minha
gratido a todos, e o que posso oferecer uma pequena, mas valorosa lembrana do
quanto vocs representam para mim.
Primeiramente, agradeo a Deus pela vida e oportunidade de desenvolvimento
intelectual e pessoal. A meu marido, pela compreenso, apoio e pelos valiosos
incentivos. A meus pais e irmos, pelo apoio incondicional, pelos preciosos conselhos e
afeto dedicados sempre.
Agradeo a voc Elozio Jlio Ribeiro, que me acompanha desde o primeiro
ano de graduao, direcionando meus trabalhos, me incentivando e contribuindo para
minha formao pessoal e profissional. uma pessoa que merece todo meu respeito e
carinho pela sua simplicidade, competncia e afeto dispensado durante toda
convivncia. A voc, meus sinceros agradecimentos pela sua orientao.
A professora Vicelma Luiz Cardoso, pela co-orientao incomum, tpica do seu
profissionalismo e pelo comprometimento com cada etapa desenvolvida na dissertao.
Aos professores Miriam Maria de Resende e Ubirajara Coutinho Filho, pelas
diretrizes necessrias e fundamentais conduo experimental e anlises dos resultados.
A professora Carla Eponina Hori, que no poupou esforos para auxiliar em
equipamentos necessrios durante a execuo dos ensaios experimentais.
Pelos professores Carlos, Cludio Mezenga, Daniel, Marcos Barroso, Lima
Verde e Luz Gustavo, pela ajuda indispensvel em diferentes momentos da realizao
desta pesquisa.
A todos os professores da FEQUI que muito contriburam para minha
formao acadmica.
Aos funcionrios da FEQUI: Ansio, Cleide, Jos Henrique, Roberta, Silvino
Tiago e Zuleide, sempre dispostos a ajudar de forma cordial.
Ao engenheiro dio Jos Alves pelas informaes preciosas e indispensveis.
Ao amigo Marco Antnio Martins de Oliveira pela confeco do reator.
Ao professor Antnio Meireles da Faculdade de Engenharia de Alimentos da
UNICAMP pela gentileza da doao da resina Duolite A-568 utilizada nesta pesquisa.

Aos amigos que colaboraram de vrias maneiras na realizao deste estudo:
Bruna Vieira, Bruno Daniel, Cristian, Fernanda Freitas, Fabiano, Gislaine, Gustavo,
Janana, Jos Luiz, Karen, Patrcia Anglica, Raquel, Ricardo, Sandra Faria, Sandra.
Ao CNPq pela concesso da bolsa.
CAPES, pelo apoio financeiro atravs do Projeto Procad.
Ao programa de ps-graduao em Engenharia Qumica da Universidade
Federal de Uberlndia, pela oportunidade concedida.


























ndice

i
iii
iv
v
vi
1
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Nomenclatura
Resumo
Abstract
Captulo 1 Introduo
Captulo 2 Reviso Bibliogrfica 4
2.1 - Enzimas 4
2.1.1 Enzimas como Catalisadores 4
2.1.2 - Invertase 6
2.2 Acar Invertido 8
2.2.1 Processo de Fabricao de Acar Invertido 10
2.2.2.1 Inverso cida 10
2.2.2.2 Inverso com Resinas Catinicas 10
2.2.2.3 Inverso Enzimtica 11
2.3 Enzimas Imobilizadas 12
2.3.1 Mtodos de Imobilizao de Enzimas 14
2.3.1.1 Ligao a Suportes Insolveis 15
2.3.1.2 Imobilizao por Reteno Fsica 21
2.3.2 Comparao Entre os Mtodos de Imobilizao 23
2.3.3 Suportes para Imobilizao 23
2.3.3.1 Imobilizao em Resinas 26
2.4 Cintica Enzimtica 27
29
32
33

2.4.1 Presena de Inibidores no meio Reacional
2.4.2 Determinao dos Parmetros Cinticos
2.4.3 Influncia da Temperatura e do pH na Atividade e na Estabilidade
2.4.4 Efeito da Imobilizao nas Propriedades da Enzima 37
2.5 Reatores com Enzimas Imobilizadas 38
39
41
43

2.5.1 Reatores Descontnuos
2.5.2 Reatores Contnuos
2.5.3 Fatores que Influenciam a Seleo do Reator
2.5.4 Problemas Operacionais de Reatores Enzimticos 45
Captulo 3 Materiais e mtodos 46
3.1 Materiais 46
3.1.1 Enzima e Reagentes 46
3.1.2 Suportes para Imobilizao 46
3.1.3 - Reator 47
3.2 - Metodologia 47
47
49

3.2.1 Determinao de Aucares Redutores
3.2.2 - Dosagem de Protena
3.2.3 Determinao da Atividade pelo Mtodo das Taxas Iniciais 50
3.2.4 Planejamento Composto Central 51
55

3.2.5 Influncia da Temperatura e do pH na Atividade de Invertase
Livre.
3.2.6 Estabilidade da Enzima Livre em Relao ao pH

56
3.2.7 Estabilidade Trmica da Enzima Livre 56
3.2.8 Influncia da Concentrao Inicial de Sacarose na Atividade de
Invertase Livre
58

3.2.9 Imobilizao da Invertase 58
3.2.9.1 Escolha das Resinas para a Imobilizao de Invertase 58
3.2.9.2 Influncia do Tempo no Processo de Imobilizao 59
3.2.9.3 Influncia da Temperatura, do pH e da Concentrao de
Enzima no Meio de Imobilizao
60
3.2.9.4 Influncia do pH e Temperatura na Atividade da Enzima
Imobilizada em Duolite A-568
61
3.2.9.5 Eficincia da Enzima Imobilizada em Relao ao Nmero
de Usos
62
3.2.9.6 Estabilidade da Enzima Imobilizada em Relao ao pH 63
3.2.9.7 Estabilidade Trmica da Enzima Imobilizada 63
3.2.9.8 Influncia da Concentrao Inicial da Sacarose na
Atividade de Invertase Imobilizada
64
3.2.9.9 - Influncia da Concentrao Inicial de Glicose e Frutose
na Atividade de Invertase Imobilizada
64
Captulo 4 Resultados e Discusso 67
4.1 - Atividade da Invertase usada no Trabalho 67
4.2 - Influncia da Temperatura e do pH na Atividade de Invertase Livre 67
4.3 Estabilidade de Invertase Livre em Relao ao pH 71
4.4 - Estabilidade Trmica de Invertase Livre 72
4.5 - Influncia da Concentrao de Substrato na Cintica da Reao da
Enzima Livre
79
4.6 - Imobilizao de invertase 81
4.6.1 - Escolha do Suporte 81
82
83
90
95

95

4.6.2 Influncia do Tempo no Processo de Imobilizao
4.6.3 Otimizao do Processo de Imobilizao
4.6.4 - Otimizao da Imobilizao em Relao Temperatura e pH
4.6.5 - Estabilidade da Enzima Imobilizada em Relao ao Nmero de
Usos
4.6.6 - Estabilidade de Invertase Imobilizada em Relao ao pH
4.6.7 - Estabilidade Trmica da Invertase Imobilizada 97
105

4.6.8 Influncia da Concentrao de Substrato na Cintica da Reao da
Enzima Imobilizada
4.6.9 Influncia da Concentrao dos Produtos na Cintica da Reao da
Enzima Imobilizada
107
Captulo 5 Concluses e Sugestes 115
Referncias Bibliogrficas 117
ANEXOS













i
LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Mecanismo sugerido para a formao do complexo ativo invertase-
sacarose.
8
Figura 2.2 - Classificao dos mtodos de imobilizao de enzimas. E: enzimas;
S: suportes; A: albumina.
15
Figura 2.3 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio competitiva. 31
Figura 2.4 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio no
competitiva.
31
Figura 2.5 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio acompetitiva. 32
Figura 2.6 - Exemplos de reatores para enzimas imobilizadas. 41
Figura 3.1 - Foto do reator utilizado para realizar os ensaios. 47
Figura 3.2 - Esquema de reaes envolvidas no mtodo DNS. 48
Figura 3.3 - Translao da superfcie de resposta da origem para o ponto
estacionrio.
54
Figura 4.1 - Distribuio dos resduos relativa atividade enzimtica. 69
Figura 4.2 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo
para a resposta de atividade enzimtica
70
Figura 4.3 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade enzimtica de invertase livre.
70
Figura 4.4 - Influncia do pH na estabilidade de invertase solvel. 72
Figura 4.5 - Atividade relativa (A/Ao), em funo do tempo, para as
temperaturas estudadas.
73
Figura 4.6 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 66C. 75
Figura 4.7 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 63C. 76
Figura 4.8 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 60C. 77
Figura 4.9 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 57C. 77
Figura 4.10 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 54C. 78
Figura 4.11 - Regresso linear da equao de Arrhenius. 79
Figura 4.12 - Perfil da influncia da concentrao de sacarose na atividade da
enzima livre.
81
Figura 4.13 - Influncia do tempo de imobilizao na atividade enzimtica
relativa da invertase imobilizada.
83
Figura 4.14 - Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade
para a resposta de atividade enzimtica.
87
Figura 4.15 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo para a resposta de atividade enzimtica.
87
Figura 4.16 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade de invertase imobilizada no processo de imobilizao de
invertase em Duolite A-568.
88
Figura 4.17 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e da
concentrao de enzima na atividade de invertase imobilizada no processo
de imobilizao de invertase em Duolite A-568.
88
Figura 4.18 - Superfcie de resposta da influncia do pH e da concentrao de
enzima na atividade de invertase imobilizada no processo de imobilizao
de invertase em Duolite A-568.
89
Figura 4.19 - Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade
para a resposta de atividade enzimtica.
92
Figura 4.20 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo para a resposta de atividade enzimtica.
93

ii
Figura 4.21 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade enzimtica de invertase imobilizada.
93
Figura 4.22 - Perfil de atividade enzimtica em relao ao nmero de usos. 95
Figura 4.23 - Influncia do pH na estabilidade de invertase imobilizada em
Duolite A-568.
96
Figura 4.24 - Atividades relativas (A/Ao), em funo do tempo, para diferentes
temperaturas.
97
Figura 4.25 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 63C. 100
Figura 4.26 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 60C. 101
Figura 4.27 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 55,5C. 101
Figura 4.28 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 57C. 102
Figura 4.29 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 51C. 103
Figura 4.30 - Regresso linear da equao de Arrhenius 105
Figura 4.31 - Perfil da influncia da concentrao de sacarose na atividade da
enzima imobilizada.
106
Figura 4.32 - Perfil da influncia da concentrao de glicose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio competitiva.
110
Figura 4.33 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo de inibio competitiva para a resposta de atividade enzimtica.
110
Figura 4.34 - Perfil da influncia da concentrao de glicose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio no competitiva.
111
Figura 4.35 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo de inibio no competitiva para a resposta de atividade
enzimtica.
111
Figura 4.36 - Perfil da influncia da concentrao de frutose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio competitiva.
113
Figura 4.37 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo de inibio competitiva para a resposta de atividade enzimtica
113
Figura 4.38 - Perfil da influncia da concentrao de frutose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio no competitiva.
114
Figura 4.39 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo de inibio no competitiva para a resposta de atividade enzimtica
114



















iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Exemplos de uso de enzimas nas indstrias. 6
Tabela 2.2 - Algumas propriedades da invertase. 7
Tabela 2.3 - Alguns exemplos de capacidade de trocadores inicos. 18
Tabela 2.4 - Comparao entre os mtodos de imobilizao. 23
Tabela 2.5 - Classificao dos suportes de acordo com a composio. 25
Tabela 2.6 - Classificao de reatores enzimticos. 39
Tabela 3.1 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito da
temperatura e do pH na atividade enzimtica da invertase livre.
55
Tabela 3.2 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito da
temperatura, do pH e da concentrao da enzima na imobilizao de invertase na
resina Duolite A-568.
61
Tabela 3.3 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito da
temperatura e do pH na atividade de invertase imobilizada na resina Duolite A-
568.
62
Tabela 3.4 - Condies experimentais para o estudo da influncia dos produtos
da reao na taxa de hidrlise.
66
Tabela 4.1 - Matriz com resultados obtidos para avaliar a influncia da
temperatura e pH.
67
Tabela 4.2 - Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC. 68
Tabela 4.3 - ANOVA para a resposta de atividade enzimtica. 69
Tabela 4.4 - Ajustes dos parmetros na desativao trmica.. 74
Tabela 4.5 - Tempo de meia vida para cada temperatura. 78
Tabela 4.6 Taxas iniciais de reao (v), em funo da concentrao inicial de
substrato (S), para invertase livre.
80
Tabela 4.7 - Resultados preliminares de imobilizao de invertase nas resinas. 82
Tabela 4.8 - Matriz com os resultados obtidos para avaliar a influncia da
temperatura, do pH e da concentrao de invertase no processo de imobilizao.
84
Tabela 4.9 - Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC. 85
Tabela 4.10 - ANOVA para a resposta de atividade enzimtica. 86
Tabela 4.11 - Matriz com os resultados obtidos de atividade enzimtica de
invertase imobilizada para avaliar a influncia da temperatura e do pH.
90
Tabela 4.12 - Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC. 91
Tabela 4.13 - ANOVA para a resposta de atividade enzimtica. 92
Tabela 4.14 - Anlise da desativao trmica. 99
Tabela 4.15 - Clculo do tempo de meia vida para cada temperatura em estudo. 104
Tabela 4.16 - Taxas iniciais de reao (v), em funo da concentrao inicial de
substrato (S), para invertase imobilizada.
106
Tabela 4.17 - Resultados experimentais de taxa de reao em funo das
concentraes iniciais de sacarose, glicose e frutose no meio reacional.
108
Tabela 4.18 - Parmetros dos modelos cinticos estudados em presena de
glicose como inibidor.
109
Tabela 4.19 - Parmetros dos modelos cinticos estudados em presena de
frutose como inibidor.
112

iv

Nomenclatura


U
S
: Atividade de invertase solvel - grama de acar redutor produzido por litro, por
minuto, por grama de invertase em p comercial
U
i
: Atividade de invertase imobilizada - grama de acar redutor por litro, minuto,
grama de suporte
F
calc
: valor calculado do teste F para um conjunto de pontos experimentais
F
T
: valor tabelado do teste F de estatstica para hipteses

1
: Relao entre a atividade da enzima no estado E
1
e a atividade da enzima nativa E
0

2
: Relao entre a atividade da enzima no estado E
2
e a atividade da enzima nativa E
0
E
1
: Atividade da enzima no estado E
1
E
2
: Atividade da enzima no estado E
2
k
1
: Coeficiente de velocidade de desativao de primeira ordem do estado E
0
para E
1
k
2
: Coeficiente de velocidade de desativao de primeira ordem do estado E
0
para E
2
t
1/2
: tempo de meia-vida (min)
k
d
: Constante cintica desativao trmica
A: fator de freqncia para a reao
E
a
: energia de ativao do processo de desativao trmica (kJ/mol)
T: temperatura absoluta (K)
S: concentrao de sacarose (g/L)
F: concentrao de frutose (g/L)
G: concentrao de glicose (g/L)
v: taxas iniciais de reao ou velocidade da reao
V
m
: velocidade mxima da reao (U
S
)
S: concentrao de substrato (g/L)
K
m
: constante de Michaelis Menten (M
sac
)
K
i
: constante de inibio (M
sac
)
IA: ndice de adsoro;
TPA : total de protena antes da imobilizao (g/L)
STP: total de protena no sobrenadante depois da imobilizao (g/L)
A
I
: atividade da invertase imobilizada (U
i
)
A/A
0
: atividade relativa
(V-V
modelo
)
2
: somatria dos quadrados dos desvios














v
Resumo


O desenvolvimento do plano de trabalho proposto para esta dissertao refere-
se produo de acar invertido por invertase imobilizada em resinas trocadoras de
ons. Os ensaios foram conduzidos em um microrreator de mistura com controle de
temperatura e provido de agitao magntica. As concentraes de reagentes, de
produtos, de invertase livre ou imobilizada e condies de pH e de temperatura
seguiram planejamentos experimentais pr-estabelecidos, uma vez definida as variveis
do processo e seus nveis. Primeiramente realizou-se testes cinticos com invertase livre
a fim de determinar os parmetros cinticos, as melhores condies de atividade
enzimtica e estabilidade. A influncia do pH e da temperatura foi analisada por meio
de um Planejamento Composto Central (PCC) resultando em uma temperatura tima
igual a 47C e pH 4,7. O intervalo de pH onde a enzima livre manteve-se estvel est
compreendido entre 5,5 a 7,5. A energia de ativao do processo de desativao trmica
foi de 360 kJ/mol. A cintica de hidrlise de sacarose por invertase livre se ajustou ao
modelo de inibio pelo substrato com a velocidade mxima de 0,0803 M/min, a
constante cintica (K
m
) de 45,2 mM e a constante de inibio (K
i
) de 1,06 M. Na
seqncia foram testadas resinas para imobilizao de invertase por adsoro visando
obter o melhor suporte para o biocatalisador. A partir da definio da Duolite A-568
como sendo o melhor suporte realizaram-se testes cinticos com a invertase
imobilizada. O estudo da influncia conjunta da temperatura, pH e concentrao de
invertase no meio de imobilizao foi realizado por um PCC fixando um tempo de
imobilizao em 24 horas, obtendo como condies timas temperatura de 29C, pH 5,0
e concentrao de invertase 12,5 g/L. Nessas condies foram estudadas as influncias
da temperatura e do pH na atividade enzimtica de invertase imobilizada por um PCC.
A temperatura tima foi 40C e dentro da faixa de pH estudada, este apresentou pouca
influncia no resultado. A estabilidade em relao ao pH de invertase imobilizada ficou
restrita ao intervalo 5,5 a 6,0, uma faixa menor se comparada enzima livre. A energia
de ativao do processo de desativao trmica do biocatalisador imobilizado foi 415
kJ/mol, maior do que o obtido pela enzima livre o que implica ser este mais sensvel
variao de temperatura. Os parmetros encontrados para o modelo de inibio pelo
substrato foram V
m
de 0,047 M
sac
/min.g
cat
, K
m
de 176 mM e K
i
de 1,08 M.


Palavras-chave: invertase, resina de troca inica, imobilizao, acar invertido,
sacarose.














vi
Abstract

This work aims to offer a contribution for the development of the production
of invert sugar by invertase immobilized on ion exchanging resins. The experiments
were conduced in a batch stirred microreactor with temperature control and magnetic
agitation. Firstly, kinetic assays on free invertase were conduced aiming to determine
the hydrolysis kinetic and the best conditions of enzymatic activity and stability. The
influences of pH and temperature were analyzed by a Central Composite Design (CCD)
resulting in optimal values of 47C for temperature and 4.7 for pH. The soluble enzyme
was stable from pH 5.5 to 7.5. The activation energy from the thermal deactivation
process was 360 kJ/mol. The sucrose hydrolysis kinetic by free invertase fitted
according substrate inhibition model with a kinetic constant (K
m
) of 45.2 mM and an
inhibition constant (K
i
) of 1.06 M. Invertase immobilization by adsorption on ion some
exchange resins were then tested. After choosing Duolite A-568 as support, kinetic tests
with the immobilized invertase were done. The study of the combined influence of
temperature, pH and invertase concentration on immobilization medium was
accomplished by a CCD, with an immobilization time of 24 hours, thus being obtained
a temperature of 29C, a value of 5.0 for pH and an invertase concentration of 12.5 g/L
as optimal conditions for immobilization process. The influences of temperature and pH
in the enzymatic activity of immobilized invertase were studied by a CCD. The optimal
temperature found was 40C and the pH presented little influence on the enzymatic
activity. For the immobilized invertase, the stability in relation to the pH was restricted
to an interval ranging from 5.5 to 6.0, a smaller range when compared to the enzyme
free form. The activation energy from the biocatalyst thermal deactivation process was
415 kJ/mol, a higher value when compared with the free enzyme, showing that the
immobilized enzyme is more sensible to temperature variations. The parameters found
for the substrate inhibition model were a V
m
of 0,047 M
sac
/min.g
cat
, a K
m
of 176 mM and
a K
i
of 1,08 M.


Key-words: Invertase, ion exchanging resin, immobilization, invert sugar, sucrose.


















CAPTULO 1 - INTRODUO

1.1 - Introduo

O acar invertido uma mistura de acares em soluo, constituda
principalmente de glicose, frutose e sacarose residual, obtida pela reao de hidrlise ou
inverso da sacarose. Esta reao pode ser catalisada por enzimas, por cidos ou por
resinas trocadoras de ctions.
Invertase ou -D-frutofuranosidase (E.C.3.2.1.26) a principal enzima
utilizada na indstria alimentcia para a hidrlise da sacarose, a qual atua no terminal
no redutor do resduo -D-frutofuranosdeo em frutofuranosdeos. A invertase catalisa
tambm reaes de transferncia com outros aceptores, alm da gua. Isso resulta na
formao de oligossacardeos constitudos por unidades de glicose e frutose (VICENTE,
2000; DAVID et al., 2006).
A enzima invertase pode ser encontrada em leveduras, fungos, bactrias,
insetos, mamferos e vegetais, mas as principais fontes para produo industrial so as
leveduras. A invertase de levedura apresenta-se em duas formas, pode estar localizada
entre a membrana plasmtica e a parede celular ou desprovidas de carboidratos e
localizadas no protoplasma (CABRAL, 1982; ISIK et. al., 2003).
Os processos enzimticos empregam as enzimas nas formas livres ou
imobilizadas. H vrios benefcios ao utilizar as enzimas imobilizadas em relao s
solveis, tais como a reutilizao do biocatalisador heterogneo, reduo de custos e
melhoria no controle do processo (CAO, 2005). A hidrlise de sacarose catalisada por
invertase na forma imobilizada ou livre produz um xarope de alta qualidade, com baixas
concentraes de hidroximetil furfural (HMF) e sem desenvolvimento de cor (CHEN et.
al., 2000; ALMEIDA et. al., 2005).
As enzimas esto sujeitas inativao por fatores qumicos, fsicos e
biolgicos, durante armazenamento ou uso (DALLA-VECCHIA et al., 2004). O uso
adequado das enzimas requer condies especficas, pois elas so ativas em estreitas
faixas de pH e temperatura (ERGINER et al., 2000). A aplicao de enzimas em
processos industriais tem sido restringida devido ao seu alto custo, dificuldade de
recuperao das mesmas no final do processo e ainda sua instabilidade. Assim, a

Captulo 1 Introduo__________________________________________________2
utilizao de enzimas na forma solvel pode requerer etapas adicionais de separao ou
inativao das mesmas ao final do processo e isto aumenta o custo. A aplicao da
enzima na forma imobilizada pode apresentar vrias vantagens em relao forma livre,
tais como reduo de custo, possibilidade de melhor controle de processo, operao
contnua, aumento de estabilidade, porm algumas alteraes nas propriedades cinticas
da enzima tambm podem ser verificadas (KENNEDY e CABRAL, 1987; ZDURAL
et al., 2003; DAVID, 2004 ).
A escolha de um processo de imobilizao para uma dada enzima depende de
fatores essenciais do processo, tais como os substratos utilizados, os tipos de reaes e
as configuraes do reator, exigindo um projeto adequado para atender s necessidades
da reao. Um dos principais fatores a seleo de um suporte adequado para fixao
da enzima. Assim o mtodo escolhido deve atender a duas necessidades, a cataltica,
expresso em produtividade, rendimento, estabilidade e seletividade e a no-cataltica,
relativa a controle e down-streaming process (DALLA-VECCHIA et. al., 2004; CAO,
2005).
A imobilizao em resinas de troca inica realizada de modo simples,
comparado aos outros mtodos de imobilizao. Basicamente envolve interaes inicas
e eletrostticas entre os ons da protena e os ons de carga oposta da resina. Apesar das
foras de ligao entre enzima e suporte serem mais fortes que na adsoro, as
condies de imobilizao so brandas, as alteraes conformacionais so pequenas,
resultando em uma atividade enzimtica elevada. Como desvantagem do mtodo h a
possibilidade de desprendimento da enzima quando h variao do pH e da fora inica
do meio. Apesar disso, as vantagens so muitas, tais como recuperao do suporte,
baixo custo e disponibilidade no mercado. A natureza das resinas trocadoras de ons
complexa, sendo que a maioria so polmeros. Os ons ativos so ctions em um
trocador catinico e nions em um trocador aninico (JEFFERY et al., 1992; COLLINS
et al., 1993; OOSTEROM et al., 1998 TOMOTANI & VITOLO, 2006).
Logo, baseando-se nas consideraes expostas, o objetivo geral desse trabalho
foi estudar a imobilizao de invertase em resinas de troca inica, como as Marathon A
e C e Duolite A-568 e S-761 e determinar a cintica de hidrlise de sacarose pela
enzima livre e imobilizada.
Como objetivos especficos podem ser citados:
Avaliar as concentraes de invertase e as condies de pH e
temperatura no processo de imobilizao.

Captulo 1 Introduo__________________________________________________3
Verificar a influncia de pH e temperatura na atividade da enzima livre
e imobilizada.
Analisar a estabilidade da enzima livre e imobilizada em relao ao pH
e temperatura.
Estudar a cintica de reao de inverso da sacarose pela enzima livre e
imobilizada em termos de substrato e de produtos.











































CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Enzimas

2.1.1 Enzimas como Catalisadores

Com exceo de um pequeno grupo de molculas catalticas de RNA, todas as
enzimas so protenas (GALVO, 2004). Pode-se definir a grande maioria das enzimas
como sendo protenas globulares formadas por resduos de aminocidos unidos por
ligaes peptdicas. So catalisadores biolgicos que diminuem a energia de ativao,
acelerando uma reao termodinamicamente possvel, sem alterar a constante de
equilbrio e a energia livre de reao (ERGINER et al., 2000; GRSEL et al., 2003;
ISIK et al., 2003).
A utilizao das enzimas antiga, antes de sua funo e dos prprios
microrganismos serem conhecidos. Um dos primeiros alimentos preparados pela
humanidade que se tem notcia, o po, utilizou a ao enzimtica. Pasteur, no final do
sculo XIX demonstrou a interveno das leveduras no processo de fermentao
alcolica e o trabalho que evidenciou a ao das enzimas fora das clulas (CABRAL,
1982).
Com a compreenso da natureza das enzimas e de sua capacidade cataltica,
vrias foram descobertas, purificadas e cristalizadas nas dcadas de 40 e 50 (SEGEL,
1979). Atualmente, as enzimas so os catalisadores mais eficientes e mais procurados
em reas extremamente variadas: biocatlise industrial (sntese de aminocidos,
peptdeos, nucleotdeos, antibiticos), tecnologia de alimentos, aplicaes farmacuticas
e clnicas, bioconverso, potencialidades energticas e outras (CABRAL, 1982).
Na indstria de alimentos o uso de enzimas bastante comum devido sua alta
especificidade e a no gerao de subprodutos txicos, o que pode ocorrer se usar
catalisadores sintticos ou cidos para catalisar as reaes (SANJAY & SUGNAN,
2005).
Essencialmente as enzimas apresentam trs propriedades principais:
estabilidade, atividade e especificidade (BAILEY e OLLIS, 1986; GALVO, 2004):
Estabilidade: a capacidade de uma enzima depende de sua estrutura nativa, a
qual mantida por meio de foras de interao (pontes de hidrognio e ligaes de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________5
sulfeto, foras de Van der Waals, interaes apolares e inicas). Alteraes no ambiente
reacional podem debilitar essas interaes, alterando a estrutura tridimensional nativa e
ocasionando perda parcial ou total da sua funcionabilidade biolgica. Assim a
estabilidade pode ser afetada por variao de temperatura, pH e presena de solventes
polares.
Atividade: esta propriedade de uma enzima atua na diminuio da energia de
ativao requerida para transformar um substrato em produto, aumentando a velocidade
de reao. A capacidade cataltica da enzima reside no seu stio ativo e este compreende
um nmero pequeno de aminocidos. O stio ativo uma estrutura complexa cuja
configurao permite alojar a molcula de substrato na posio correta para que os
grupos funcionais da enzima efetuem sua transformao qumica.
Especificidade: a especificidade define a afinidade de uma enzima por grupos
especficos em um determinado substrato. Esta uma propriedade imprescindvel das
enzimas enquanto catalisadores. Duas caractersticas estruturais so determinantes na
especificidade da enzima: O substrato possui ligaes qumicas que podem ser atacadas
pelos grupos funcionais do stio ativo da enzima e o substrato possui grupos funcionais
que se unem enzima, permitindo seu correto alinhamento no stio ativo para que a
reao possa ocorrer.
As enzimas esto sujeitas inativao por fatores qumicos, fsicos e
biolgicos, podendo ocorrer quando estocadas ou durante o uso (DALLA-VECCHIA et
al., 2004). O perfeito funcionamento das enzimas requer condies especficas, pois elas
so ativas em estreitas faixas de pH e temperaturas (ERGINER et al., 2000). As
excees so as extremozimas que so produzidas por bactrias extremfilas e assim
so ativas em condies anormais (GALVO, 2004).
Como as enzimas no so consumidas na reao, sua ao cataltica
semelhante aos catalisadores inorgnicos. Porm, diferente dos catalisadores sintticos
comuns pela forma suave que realiza a catlise, geralmente em solues aquosas
neutras, temperatura e presso ambiente e, principalmente, com elevado grau de
especificidade em relao ao substrato (SEGEL, 1979; RIBEIRO, 1989; COUTINHO
FILHO, 1996; VICENTE, 2000). O processo de imobilizao tem sido bastante
estudado para viabilizar o uso de enzimas industrialmente, permitindo a recuperao e o
reaproveitamento da mesma, pois o uso da enzima livre invivel economicamente. Na
Tabela 2.1 verifica-se alguns exemplos de aplicaes de enzimas na indstria.


Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________6
Tabela 2.1 Exemplos de uso de enzimas nas indstrias (DAVID, 2004).
Enzima Substrato Produto Escala
(Ton/ano)
Glicose
isomerase
Glicose Frutose >10
6
Penicilina
amidohidrolase
Penicilina cido 6-
aminopenicilnico
1000
Lipase Triglicerdeo Gordura de cacau >10
6
cido asprtico
amnia liase
cido fumrico L- cido asprtico 1000
Subtilisina --------------- (S)-fenilalanina ------------------

2.1.2 Invertase

Invertase ou -D-frutofuranosidase (E.C.3.2.1.26) uma enzima que catalisa a
hidrlise do terminal no redutor do resduo -D-frutofuranosdeo em
frutofuranosdeos. Alm disso, a invertase catalisa reaes de transferncia com outros
aceptores, alm da gua. Isso resulta na formao de oligossacardeos constitudos por
unidades de glicose e frutose (VICENTE, 2000).
A principal fonte de invertase industrial so as leveduras, 80% das enzimas so
externas e os 20% restantes so intracelulares. A forma externa uma glicoprotena com
cerca de 50% de carboidratos, ao passo que a interna destituda dos mesmos.
Apresentam atividade cataltica similares, mas sua composio de aminocidos
diferente, a invertase externa contm cistena enquanto a interna no (CABRAL, 1982;
ISIK et al., 2003; VICENTE, 2000). Algumas propriedades da invertase externa e
interna esto apresentadas na Tabela 2.2 (GSCON et al., 1981).












Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________7
Tabela 2.2 Algumas propriedades da invertase (GSCON et al., 1981).
Propriedades
Invertase externa
Invertase interna
Massa molecular (kg) 270000 135000
% carboidrato 50 3
Atividade especfica U/mg de protena 2700 2900
K
m
[mM] (sacarose) 26 25
pH - estabilidade 3,0 7,5 6,0 9,0
pH timo - atividade 3,5 5,5 3,5 5,5
U = micromol sacarose hidrolisado por minuto.

A temperatura tima depende do grau de purificao da enzima e da
concentrao do substrato, tendo sido encontrado valores entre 23 e 55C (DRAETTA,
1971). A estabilidade trmica da invertase pode ser devido estrutura terciria da
protena, a qual contm interaes carboidrato-protena, com ligaes cruzadas na
cadeia polipeptdica (WISEMAN & WOODWARD, 1975).
O mecanismo de ao da invertase no totalmente conhecido, mas estudos
com a enzima tm sugerido o envolvimento de um nion carboxilato e uma histidina
residual na atividade cataltica (WISEMAN & WOODWARD, 1975). Um mecanismo
para a formao do complexo ativo invertase-sacarose foi proposto por LAIDLER
(1958) e citado por BOWSKI et al. (1971), o qual est representado na Figura 2.1.
Pode-se observar a influncia do pH no mecanismo de ligao do stio ativo da invertase
com grupos cidos e bsicos.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________8

Figura 2.1 Mecanismo sugerido para a formao do complexo ativo
invertase-sacarose (BOWSKI et al., 1971).

Neste mecanismo observa-se que as formas carregadas eletricamente so
ativas. Assim existe um pH no qual a concentrao da forma ativa mxima, sendo este
considerado como pH timo, acarretando a atividade mxima (CABRAL, 1989).

2.2 Acar Invertido

O acar invertido um xarope composto de glicose, frutose e sacarose
residual resultante de uma reao de hidrlise da sacarose (AKGOL et al., 2001;
RODRIGUES et al., 2000). A hidrlise conhecida como reao de inverso, pois o
xarope dos monossacardeos (glicose e frutose) desvia um feixe de luz polarizada para a

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________9
esquerda, enquanto as solues de sacarose desviam esse feixe para a direita (CABRAL,
1989).
Se comparado o acar invertido com o acar cristal, o invertido apresenta
diversos benefcios, tais como:
Melhoria do controle do processo de fabricao e da manuteno de
condies higinicas nas indstrias alimentcias;
Alta pureza qumica evitando a gerao de precipitados indesejveis em
funo de elevados teores de ferro, cobre ou clcio;
Alto controle microbiolgico, devido menor atividade de gua,
dispensando a necessidade de pasteurizao por parte do cliente;
Menor espao necessrio para a estocagem;
Economia de despesas operacionais para o tratamento de acar cristal,
como gastos com energia, gua e vapor;
Elimina a necessidade de investimentos em equipamentos para a
dissoluo e filtrao do acar;
Reduo das perdas, menor poluio e gastos com seu controle.
Alm destes benefcios, em diversas aplicaes industriais o acar invertido
apresenta propriedades mais interessantes se comparado soluo de sacarose, tais
como:
Apresenta maior higroscopicidade, retendo umidade mesmo em ambientes
muito secos;
Maior solubilidade, atuando como inibidores de cristalizao e reduzindo
custos com frete;
Reduz o ponto de congelamento, propriedade til em produtos que so
conservados em congeladores;
Em produtos com baixo teor de gordura, sua utilizao evita que esses
comecem a quebrar e secar;
Possui viscosidade baixa, conferindo plasticidade a sorvetes, cremes e
fondants;
Maior doura relativa do que a sacarose.





Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________10
2.2.1 Processos de Fabricao de Acar Invertido

O acar invertido pode ser obtido por catlise enzimtica, catlise cida ou
por troca inica com as resinas. O processo enzimtico pode ocorrer pela adio direta
da enzima ou pela imobilizao da mesma em suportes inertes (AKGOL et al., 2001;
RODRIGUES, 2000).

2.2.2.1 Inverso cida

A inverso qumica o processo de hidrlise mais antigo utilizado
industrialmente, relativamente fcil por no necessitar de pessoal qualificado para
realizao do processo, porm resulta em um produto de qualidade inferior, alm do
inconveniente de utilizar altas temperaturas e agentes corrosivos que comprometem a
segurana dos operrios e a manuteno dos equipamentos (AKGOL et al., 2001).
Existe ainda o problema da necessidade da neutralizao final do produto e da gerao
de subprodutos, como furfurais e outros aromticos indesejveis, alm de
oligossacardeos por reao de polimerizao (CASTELLANI, 1973 apud VICENTE,
2000). Geralmente o problema de neutralizao resolvido adicionando cal ao xarope, o
que provoca incrustaes nos equipamentos, alm de ocasionar perda de aucares no
armazenamento devido presena de sais insolveis de clcio.
Por catlise cida o processo homogneo o mais empregado industrialmente,
onde a escolha do cido depende de sua compatibilidade com o produto final, porm os
xaropes obtidos so altamente coloridos devido s condies drsticas de reao, pH e
temperatura (RODRIGUES, 2000). Este processo consiste na adio de solues cidas
em caldas refinadas a elevadas temperaturas e em reator descontnuo. Xaropes de
sacarose com concentrao entre 60 a 70 Brix so aquecidos at 70C e acidificados
at o pH 2,0. O tempo de reao depende muito do tipo de cido utilizado e do grau de
inverso que se deseja (CASTELLANI, 1973 apud VICENTE, 2000; MARTINS,
2000).

2.2.2.2 Inverso com Resinas Catinicas

Segundo VICENTE (2000), o mtodo da inverso com resinas trocadoras de
ons foi desenvolvido e patenteado por HUGHES em 1952 para a produo contnua de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________11
xaropes de acar invertido. Esse mtodo consiste em clarificar e reduzir a cor com
carvo ativo, por meio de uma resina de troca inica com grupos sulfnicos em sua
superfcie na passagem da soluo concentrada de sacarose em pH cido. A soluo de
sacarose cida mantida a 50C at a hidrlise ter sido processada na extenso desejada
(KIRK OTHMER, 1994). Neste processo heterogneo, ocorre uma perda de acar
devido degradao do mesmo, levando formao de HMF (Hidroximetil furfural) e
produo de um xarope colorido pelas reaes de Maillard e de caramelizao (AKGOL
et al., 2001).
RODRIGUES et al. (2000) desenvolveram um processo utilizando resinas de
troca inica para a inverso da sacarose, utilizando a resina catinica do tipo gel,
Amberlite IR-120 fornecida pela Rohm and Haas. O processo heterogneo consistia em
introduzir o xarope inicial em uma coluna de vidro encamisada da resina IR-120, onde
ocorria a inverso.

2.2.2.3 Inverso por Via Enzimtica

Os mtodos enzimticos empregam as enzimas livres ou imobilizadas. Existem
vrios benefcios ao utilizar as enzimas imobilizadas em relao s solveis, tais como a
reutilizao do biocatalizador heterogneo, reduo de custos e melhoria no controle do
processo (CAO, 2005). A hidrolise heterognea catalisada pela enzima invertase produz
um xarope de alta qualidade com baixas concentraes de HMF e sem desenvolvimento
de cor (CHEN et al., 2000; ALMEIDA et al., 2005).
Um processo tpico de produo industrial consiste na adio de 100g de
invertase em uma tonelada de xarope com teor de slidos de 60%, que dever ser
mantida sob agitao constante e temperatura controlada em torno de 60C, durante 12
horas, para a obteno de um grau de inverso superior a 90% (MARTINS, 2000).
A temperatura do processo tem muita influncia no controle da inverso. Em
Cuba, estabeleceu-se a regra de ouro, que consiste em se manter a temperatura tima
de inverso igual ao grau Brix do xarope (CASTELLANI, 1973 apud VICENTE, 2000).
As principais aplicaes industriais esto relacionadas com aquelas que
utilizam o acar no estado dissolvido, tais como bebidas carbonatadas, sucos
concentrados, xaropes medicinais, doces e molhos, onde o acar invertido tem sido
preferencialmente utilizado pela sua estabilidade em altas concentraes, em funo da

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________12
sua alta solubilidade, permitindo maior tempo de vida de prateleira dos produtos se
comparado com aqueles que usaram solues de sacarose (ERGINER et al., 2000).

2.3 Enzimas Imobilizadas

Enzimas imobilizadas so enzimas fisicamente confinadas ou localizadas em
uma determinada regio do espao, com reteno de sua atividade cataltica e que
podem ser usadas repetida e continuamente.
O uso de enzimas em processos industriais relativamente baixo, o que se deve
ao seu alto custo, dificuldade de recuperao da mesma no final do processo e ainda
sua instabilidade. Isso restringe o uso de enzimas solveis em processos industriais, pois
com a dificuldade de recuperao e de isolamento, pode causar prejuzos econmicos
uma vez que resqucios da enzima no produto final, no qual necessria a desativao
da mesma, torna o processo antieconmico (KENNEDY & CABRAL, 1987,
ZDURAL et al., 2003). Alm disso, o desenvolvimento e conhecimento de protenas e
avanadas tcnicas de imobilizao criam grande variedade de usos de enzimas em
reaes particulares, principalmente, devido possibilidade de recuperao das mesmas
(DAVID, 2004).
Com o objetivo de aproveitar as vantagens da catlise biolgica em relao
qumica, foram desenvolvidos mtodos a fim de fixar as enzimas em um suporte slido.
Assim a oportunidade de utilizar as enzimas nos processos industriais aplicar as
tecnologias de imobilizao da mesma em um suporte insolvel (BERGAMASCO et
al., 2000).
As enzimas imobilizadas possuem vrias vantagens sobre as enzimas livres
(BERGAMASCO et al., 2000; AKGOL et al., 2001; GRSEL et al., 2003; GMEZ et
al., 2005; SZYMANSKA et al., 2007), tais como:
Processos com enzimas imobilizadas podem ser conduzidos
preferencialmente de modo contnuo, usando leitos fixos ou fluidizados,
por serem facilmente controlados;
Reutilizao sem um significativo decrscimo da atividade;
possvel usar alta dosagem de enzima por volume de reator, comparada
ao uso de enzimas livres;
Os produtos so facilmente separados do meio reacional;

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________13
Em alguns casos a estabilidade e a atividade so aumentadas pela
imobilizao;
Esta tcnica permite a reduo do capital operacional j que a vida til de
uma enzima imobilizada suficientemente longa.
As principais desvantagens da imobilizao so: a possvel perda da atividade
enzimtica durante o processo de imobilizao e os efeitos difusionais devido ao
transporte do substrato e do produto ao stio ativo da enzima imobilizada (RIBEIRO,
1989; BAYRAMOGLU et al., 2003).
O primeiro trabalho sobre imobilizao de enzimas data do incio do sculo
XX, quando NELSON & GRIFFIN (1916) adsorveram invertase em carvo ativado e
alumina, com reteno de atividade na inverso de sacarose.
O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao de enzimas com a finalidade
de melhorar suas propriedades catalticas s ocorreram no incio da dcada de sessenta,
quando extensivos estudos foram realizados em novas tcnicas de imobilizao, com
vrios suportes, obtendo preparaes com altos teores de enzimas imobilizadas e
caractersticas de estabilidade melhoradas (CHIBATA, 1978; AHMAD et al., 2001;
DAVID, 2004).
Em 1969 CHIBATA et al. (1972) instalaram o primeiro processo industrial
bem sucedido com enzimas imobilizadas, operando de modo contnuo, usando
aminoacilase fngica imobilizada em DEAE-Sephadex, para resoluo de misturas
racmicas de aminocidos.
Embora na dcada de 70 um grande nmero de trabalhos sobre enzimas
imobilizadas tenha sido publicado, eles em sua maioria, restringiam o processo a
pequenas escalas, sendo vivel apenas para produtos de alto valor agregado.
Contrariando essa expectativa surgiu em 1975 nos Estados Unidos um processo de
produo em larga escala de um produto de baixo valor agregado, o xarope de glicose
isomerizado (VICENTE, 2000).
Alm de aplicaes mdicas, os biocatalisadores imobilizados tm sido
amplamente usados em escala industrial, particularmente em biomateriais,
bioseparadores e biosensores, por imobilizao em vrios suportes (CHEN et al., 2000;
AKGOL et al., 2001; BAYRAMOGLU et al., 2003). Um grande sucesso industrial foi a
isomerizao da glicose em frutose catalisada por glicose isomerase adsorvida em
DEAE-celulose (GODFREY, 2001, apud TOMOTANI & VITOLO, 2006).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________14
O uso de enzimas imobilizadas na rea de alimentos cresce a cada dia, pois o
controle dos custos do processo muito rgido devido ao baixo valor agregado dos
produtos (DAVID, 2004; SANJAY & SUGUNAN, 2005; OSMAN et al., 2005). A
principal aplicao em larga escala de enzimas imobilizadas na rea de alimentos,
como na produo de xarope de alto teor de frutose (high fructose syrups) usando
glicose isomerase e na indstria farmacutica (produo de cido 6-aminopenicilnico
usando penicilina amidase imobilizada) (DAVID, 2004).
Uma outra rea em potencial a construo de rgos artificiais como o uso da
urease imobilizada em rins artificiais que removem a uria do sangue para uma
desintoxicao extracorporal (HEARN & NEUFELD, 2000).
2.3.1 Mtodos de Imobilizao de Enzimas

A aplicao do mtodo de imobilizao das enzimas depende de fatores
essenciais do processo, como os substratos utilizados, os tipos de reaes e as
configuraes do reator, exigindo um projeto adequado para atender s necessidades da
reao. O principal fator selecionar um suporte adequado, o que definido como uma
parte no-cataltica da imobilizao de enzimas, na qual a parte cataltica construda.
Assim o mtodo escolhido deve atender as duas necessidades a cataltica, expresso em
produtividade, rendimento, estabilidade e seletividade e a no-cataltica, relativa a
processos de controle e separao (DALLA-VECCHIA et al., 2004; CAO, 2005).
A imobilizao pode afetar a estabilidade, o pH e a temperatura tima, as
constantes cinticas e a mxima velocidade de reao da enzima (DANISMAN et al.,
2004; ERGINER et al., 2000). A imobilizao pode oferecer uma estabilidade adicional
para uma variedade de enzimas sendo que essa estabilidade influenciada pelo nmero
de laos formado entre a enzima e o suporte, a natureza dos laos (covalentes, no-
covalentes), o grau de aprisionamento das molculas de enzima na matriz e as condies
de imobilizao (DANISMAN et al., 2004; CAO, 2005).
Nos ltimos anos houve um crescimento do uso de tcnicas de imobilizao,
acredita-se que cada mtodo possui sua vantagem, cabe utilizar o mtodo adequado, e se
necessrio combin-los, a fim de obter melhores resultados (CAO, 2005).
Existem vrias formas de classificar os mtodos de imobilizao de enzimas,
de acordo com a natureza da interao responsvel pela imobilizao. Podem ser

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________15
classificadas em duas categorias: imobilizao por ligao ou por reteno fsica,
conforme pode ser verificado na Figura 2.2.

Figura 2.2 - Classificao dos mtodos de imobilizao de enzimas. E: enzimas; S: suportes;
A: albumina. (Adaptado de BLANCH e KLARK, 1996).

A imobilizao por ligao envolve alterao na estrutura da enzima, pela ligao
desta com o suporte insolvel (ligao ao suporte) ou entre as molculas da prpria
enzima (ligaes cruzadas). J a imobilizao por reteno fsica no envolve nenhuma
alterao da estrutura da enzima, com apenas alterao do seu microambiente
(BLANCH & KLARK, 1996; VICENTE, 2000; BULCHHOLZ et al., 2005; CAO,
2005)

2.3.1.1 Ligao a Suportes Insolveis

So ligaes entre as enzimas e um suporte slido e o principal mtodo de
imobilizao. Pode ser dividido em cinco categorias de acordo com o tipo de interao
enzima-suporte (adsoro fsica, ligao inica, ligao metlica, ligao covalente e
ligaes cruzadas e co-cruzadas).





Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________16
a) Adsoro fsica

Segundo WEETALL (1975) este mtodo muito pouco entendido, mas o
mais antigo. Consiste na exposio da soluo enzimtica ao suporte sob condies
apropriadas, tais como, pH, natureza do solvente, fora inica da soluo, quantidade de
enzima, tempo de contato e temperatura. um processo de fcil preparao e possibilita
o reuso do suporte (OSMAN et al., 2005). A atividade da enzima imobilizada aumenta
com a concentrao da enzima, aproximando a um valor de saturao a altas
concentraes de enzimas (KENNEDY & CABRAL, 1987).
A adsoro fsica de enzimas ao suporte realizada por foras de ligao
relativamente fracas. As principais ligaes entre as molculas de protenas e o
adsorvente so: pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas e foras de Van der Walls
(RIBEIRO, 1989). Como no ocorre reao qumica, existe pouca mudana
conformacional da enzima e no h destruio do seu centro ativo, assim obtm-se um
derivado semelhante enzima solvel. Se o suporte adequado, o processo simples e
efetivo, mas a principal desvantagem que a enzima adsorvida pode desprender do
suporte durante a utilizao, devido fraca ligao entre enzima e suporte (KENNEDY
& CABRAL, 1987 e MESSING, 1978).
Basicamente o que ocorre na adsoro uma interao eletrosttica entre a
protena carregada e a carga oposta do on da resina (TOMOTANI & VITOLO, 2006).
comum utilizar o mtodo de adsoro juntamente com o covalente para melhorar a
interao da resina suporte evitando o desprendimento da enzima durante o processo.
SANJAY & SUGUNAN (2005) imobilizou invertase em slica comercial
(montmorillonite K-10) usando as duas tcnicas: adsoro e ligao covalente. GMEZ
et al. (2005) utilizaram um novo mtodo de imobilizao para invertase quimicamente
modificada com polissacardeos inicos, baseado na formao de complexos de
polieletrlitos, com suportes recobertos com polmeros de carga oposta. O
biocatalisador de invertase imobilizada em quitina recoberto com alginato de sdio
apresentou maior termo estabilidade do que a enzima nativa. Os valores timos de pH e
temperatura para a atividade cataltica de invertase foram aumentados em relao
enzima livre.
No trabalho de DSOUZA & GODBOLE (2002) a invertase foi imobilizada em
casca de arroz por adsoro seguida de ligao cruzada utilizando 2% de glutaraldedo.
Como a casca de arroz possui slica obteve timas caractersticas de estabilidade.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________17
OOSTEROM et al. (1998) tambm utilizou a adsoro seguida da ligao cruzada para
imobilizar a enzima -galactosidase em uma resina de troca inica tipo Duolite S-761
para utilizar na sntese de galactosdios.

b) Ligao inica

Este mtodo de imobilizao baseado na ligao inica entre a enzima e o
suporte. Pode ocorrer a imobilizao por adsoro juntamente com a inica, a qual se
diferencia apenas pela intensidade da interao enzima-suporte, mais forte no caso da
inica. Apesar de ser mais forte, os procedimentos de imobilizao so os mesmos,
cujas condies so brandas, em comparao com os mtodos que envolvem as ligaes
covalentes e as mudanas de conformao produzidas so pequenas, implicando em
uma atividade elevada em comparao solvel (ALMEIDA et al., 2005).
Como desvantagem deste mtodo tambm h a possibilidade de desprendimento
da enzima do suporte, quando houver variao no pH e na fora inica do meio. As
vantagens apresentadas so: possibilidade de reutilizao do suporte, baixo custo,
simplicidade do mtodo, disponibilidade de suportes e obteno de enzimas
imobilizadas com alta atividade (WEETALL, 1975).
Os suportes utilizados so em menor escala suportes inorgnicos,
principalmente slica e resinas de troca inica, preparadas principalmente a partir de
matrizes orgnicas, com grupos trocadores de ons. De acordo com o tipo de trocadores
eles so classificados como aninicos ou catinicos. O trocador aninico mais comum
contm grupos funcionais derivados de aminas e o trocador catinico contm como
grupos funcionais sulfato, fosfato e seus derivados (KENNEDY & CABRAL, 1987).
Um exemplo foi a imobilizao de -galactosidase em uma resina de troca
inica fracamente bsica, Duolite A-568, em um reator de leito empacotado para a
obteno de glicose e galactose (OZDURAL et al., 2003). Na Tabela 2.3 so
apresentadas alguns exemplos de resinas trocadoras de ons adequadas para ligao
inica.





Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________18
Tabela 2.3 Alguns exemplos de capacidade de trocadores inicos (COLLINS
et al., 1993).
Capacidade de alguns trocadores inicos
Trocador Tipo
Capacidade total
meq/g
a
meq/100mL
b
Dowex 50 X-8 cido forte 5,1 170
Amberlite IR-120 cido forte --- 190
SP-Sephadex C-25 cido forte 2,3 0,3 30
Amberlite IRC-84 cido fraco --- 400
CM-Sephadex C-25 cido fraco 4,5 0,5 56
CM-Sephadex CL-6B cido fraco --- 12
CM-Cellex cido fraco 0,7 0,1 ---
Dowex 1 Base forte 3,2 140
Amberlite IRA 400 Base forte --- 140
QAE-Sephadex A-25 Base forte 3,0 0,4 50
Dowex 3X-4 Base forte 2,8 190
Amberlite IRA 45 Base forte --- 190
DEAE-Sephadex A-25 Base forte 3,5 0,5 50
DEAE-Sephadex CL-6B Base fraca --- 15
DEAE-Sephacel Base fraca 1,4 0,1 17,1
Cellex D Base fraca 0,7 0,1 ---
a: Valor obtido por titulao e referente quantidade total de miliequivalentes em relao ao
peso do trocador usado na determinao.
b: Valor obtido tomado por base 100 mL da suspenso do trocador.

c) Ligao metlica

Baseia-se em imobilizar enzimas empregando compostos de metais de
transio ou xidos metlicos precipitados a partir de seus sais, para ativar a superfcie
de suportes orgnicos ou inorgnicos (VICENTE, 2000). Esse mtodo baseado na
propriedade de quelao dos metais de transio, que podem ser usados para ligar
enzimas. Embora o tipo de ligao seja parcialmente covalente, observa-se o
desprendimento da enzima do suporte em operaes de longa durao (CABRAL, 1982;
KENNEDY & CABRAL, 1987).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________19
Os sais metlicos mais utilizados nos processos so: TiCl
3
, TiCl
4
, Ti
2
(SO
4
)
3
,
FeCl
3
, FeSO
4
, ZnCl
4
, SnCl
4,
SnCl
2
e VCl
3
. A tcnica consiste em umedecer o suporte
com uma soluo metlica, sec-lo, lav-lo para remover o excesso de sal e coloc-lo
em contato com a soluo de enzimas, normalmente no pH timo da enzima
(VICENTE, 2000). Contudo as estabilidades conseguidas com tais catalisadores tm
sido baixas devido perda de enzimas para a soluo (FLYNN, 1978).
Suportes orgnicos como papel de filtro, serragem, quitina, celulose e
inorgnicos como celite, l de vidro, alumina e slica tm sido utilizados neste processo
de imobilizao (KENNEDY & CABRAL, 1987).
Devido no reprodutibilidade dos resultados obtidos quando se usa o suporte
inorgnico nesse mtodo de imobilizao, alm das baixas estabilidades operacionais
obtidas, vrias modificaes do mesmo tm sido propostas, como o uso de agentes de
ligao cruzada, tais como glutaraldedo e cido tnico (CABRAL, 1982; RIBEIRO,
1989).

d) Ligao covalente

um mtodo que consiste na formao de ligao covalente entre molculas
da enzima e o material do suporte. o mtodo mais difundido e investigado de
imobilizao, pois proporciona uma grande estabilidade funcional ao biocatalisador
(GMEZ et al., 2004). As condies de reao requeridas para a formao dessa
ligao geralmente no so brandas. Em alguns casos, a ligao altera a estrutura
conformacional da enzima e o centro ativo da mesma, resultando em diminuio da
atividade e mudana de especificidade de substrato. Como a ligao covalente forte, a
enzima imobilizada estvel e no ocorre perda da enzima para a soluo, mesmo na
presena de substrato ou solues de alta fora inica (CHIBATA, 1978; KENNEDY &
CABRAL, 1987).
A ligao covalente pode induzir alta resistncia temperaturas, a
desnaturantes e a solventes orgnicos em geral. A extenso disso depende das condies
do sistema, da natureza da enzima e do tipo de suporte (BAYRAMOGLU et al., 2003).
A grande variedade de processos covalentes de imobilizao e de matrizes com
grupos qumicos capazes de participarem diretamente ou serem ativados para formar as
ligaes, faz desse mtodo uma aplicao quase geral. A maior dificuldade o

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________20
conhecimento da estrutura da enzima, o que dificulta o estabelecimento de uma regra
geral para a imobilizao (MESSING, 1978; VICENTE, 2000).
RIBEIRO (1989), estudou o processo de imobilizao de invertase de levedura
por processo covalente em slica de porosidade controlada, ativada por silanizao e
glutaraldedo.
CHEN et al. (2000), imobilizaram invertase covalentemente em partculas e
filmes do copolmero de polianilina e cido acrlico. A enzima imobilizada reteve de 20
a 40% de atividade comparada enzima solvel e melhorou a atividade da enzima a
baixas temperaturas. Alm disso, aumentou sua estabilidade no armazenamento em
soluo tampo.
BERGAMASCO et al. (2000) imobilizaram invertase em partculas de slica de
poros controlados pelo mtodo de ligao covalente utilizando um mtodo com silana e
glutaraldedo e obtiveram uma atividade relativa baixa em torno de 24%.
Na imobilizao da invertase por ligao covalente usando ligao cruzada
com glutaraldedo em um suporte de lecitina de ervilha (lectin Cajanus cajan) obteve-se
um complexo de alta resistncia inativao quando exposta em altas temperaturas, pH,
desnaturantes e enzimas proteolticas (AHMAD et al., 2001).
AMAYA-DELGADO et al. (2005) imobilizaram invertase covalentemente em
nylon-6, a qual foi estvel em uma ampla faixa de pH e temperatura similar a da enzima
livre e COUTINHO FILHO et al. (2005) imobilizaram invertase em slica de porosidade
controlada, a qual mostrou ser um excelente suporte para imobilizao desta enzima.

e) Ligaes cruzadas e co-cruzadas

O nome de ligaes cruzadas se d devido s ligaes das molculas de
enzimas entre si, por meio de reagentes bi ou multifuncionais na ausncia de suportes
slidos, formando gis de alta pureza. tambm comum adicionar ao suporte outra
protena, como a albumina, de menor custo, para aumentar as interaes e assim
promover maior estabilidade. Entre os agentes de ligao cruzada mais usado est o
glutaraldedo (KENNEDY & CABRAL, 1987). O glutaraldedo tambm muito
utilizado juntamente com outro mtodo de imobilizao, principalmente com a ligao
covalente (AHMAD et al., 2001) e com adsoro (DSOUZA & GODBOLE, 2002).
A maior vantagem deste mtodo a obteno da enzima quase pura, pois
requer apenas um agente bi ou multifuncional para uma reao muito simples de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________21
imobilizao. A desvantagem apresentada a necessidade de grande quantidade de
enzima, alm da perda de atividade provocada pela participao do stio ativo na ligao
e as propriedades mecnicas indesejveis da enzima imobilizada obtida, na forma de um
produto gelatinoso (KENNEDY & CABRAL, 1987).
O glutaraldedo foi utilizado por AKGOL et al. (2001) para imobilizar
invertase em microesferas de polivinilalcool, conseguindo uma reteno de atividade de
74%.
CHANG & JUANG (2005) compararam a imobilizao das enzimas -
amilase, -amilase e glucoamilase em quitosana, com ligaes cruzadas com
glutaraldedo. Em geral as enzimas imobilizadas alcanaram altas atividades em faixas
maiores de temperatura e pH se comparada com as livres.
EMREGUL et al. (2006) imobilizaram invertase em gelatina e poliacrilamida
utilizando como agentes da ligao cruzada, acetato de cromo III, sulfato de cromo III e
ou sulfato potssio de cromo III. A mxima atividade de invertase imobilizada foi
obtida quando utilizou-se acetato de cromo III.

2.3.1.2 - Imobilizao por Reteno Fsica

a) Imobilizao de enzimas por ocluso

O mtodo baseado em reteno das enzimas nos espaos intersticiais,
podendo ser feito em gis, fibras e por microencapsulao em membranas. O importante
reter as enzimas e permitir que as molculas de substratos e produtos de pesos
moleculares adequados possam se difundir atravs e dentro da rede polimrica
(CHIBATA, 1978; KENNEDY & CABRAL, 1987; ISIK et al., 2003).
Como no h nenhuma ligao entre a enzima e a estrutura do suporte, este
mtodo pode ser aplicado para qualquer tipo de enzima ou mesmo a clulas e organelas.
um processo muito simples e as enzimas no sofrem modificaes qumicas
(VICENTE, 2000).
A ocluso em matrizes pode ocorrer de duas formas em gel ou em fibras:
Ocluso em gis: ocorrem em gis polimricos insolveis em gua. Os gis
so obtidos, normalmente, por polimerizao em sistemas bifsicos, de
forma a permitir o controle mecnico do tamanho da partcula. O grau de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________22
ligao do polmero deve ser controlado para permitir uma distribuio do
tamanho de poros adequada (KENNEDY & CABRAL, 1987).
Ocluso em fibras: um mtodo similar ao de produo de fibras txteis,
pois aprisiona as enzimas nas microcavidades de fibras sintticas. Nesta
tcnica o monmero dissolvido em um solvente orgnico e emulsionado
numa soluo aquosa de enzima. A emulso forada atravs de um
processo de extruso com um lquido coagulante (tolueno ou ter de
petrleo), precipitando o polmero numa forma filamentosa, com as micro
gotas de soluo de enzimas retidas. A principal fibra utilizada para esse
mtodo o acetato de celulose (KENNEDY & CABRAL, 1987;
VICENTE, 2000).
O mtodo de aprisionamento em membranas envolve o confinamento da
enzima em membranas semipermeveis ou em micro cpsulas.
Encapsulao: inclui a enzima em cpsulas polimricas semipermeveis
que possibilita a passagem do substrato pela membrana externa. A grande
vantagem do mtodo a imobilizao de vrias enzimas ao mesmo tempo e
a grande rea superficial de contato. E a desvantagem que o processo no
pode ser usado no caso de substratos de alto peso molecular (KENNEDY &
CABRAL, 1987).
Membranas (ultrafiltrao e fibras ocas): o mtodo consiste em colocar a
soluo da enzima e o substrato de um mesmo lado da membrana,
permitindo o contato ntimo entre a enzima e o substrato. Esse processo
pode ser utilizado na converso de substratos de alto peso molecular
(KENNEDY & CABRAL, 1987).
TANRISEVEN & DOGAN (2001) imobilizaram invertase em cpsulas de
alginato e esta resultou em 87% de atividade relativa e garantiu a atividade por 36 dias
sem decrscimo. Com a imobilizao foi possvel garantir maior estabilidade a altos
valores de pH (3-6) e temperatura (60C).
Invertase foi imobilizada por uma reao de condensao de grupos epxidos
na estrutura da membrana porosa de pHEMA-GMA ( 2-hidroxietil metacrilato-glicidil
metacrilato) com grupos amino da enzima, melhorando estabilidade trmica e em
relao ao pH quando comparada a enzima livre no trabalho de DANISMAN et al.
(2004).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________23
BAGAL & KARVE (2006) utilizaram uma membrana porosa de biopolmero
para imobilizar a invertase por meio de um composto de agarose-agar e a eficincia
alcanada nesta imobilizao foi de 91%.

2.3.2 Comparao entre os Mtodos de Imobilizao

Nenhum mtodo de imobilizao pode ser considerado ideal, pois cada enzima
possui suas particularidades de estrutura e de composio, alm de cada processo
industrial ter limitaes caractersticas. Para encontrar o melhor mtodo de imobilizao
para uma situao especfica preciso que resulte numa boa atividade e em alta
estabilidade operacional (KENNEDY & CABRAL, 1987; VICENTE, 2000; RIBEIRO,
1989). A Tabela 2.4 apresenta algumas vantagens e desvantagens dos diferentes tipos de
imobilizao:

Tabela 2.4 Comparao entre os mtodos de imobilizao (CHIBATA, 1978;
KENNEDY & CABRAL, 1987).
Caractersticas Ligaes
Cruzadas
Adsoro
Fsica
Ligao
Inica
Ligao
Metlica
Ligao
Covalente
Ocluso
Preparao Intermedirio Simples Simples Simples Difcil Difcil
Fora da
Ligao
Forte Fraca Intermedirio Intermedirio Forte Intermedirio
Atividade Baixa Intermedirio Alta Alta Alta Baixa
Recuperao
do Suporte
Impossvel Possvel Possvel Possvel Rara Impossvel
Custo Intermedirio Baixo Baixo Intermedirio Alto Intermedirio
Estabilidade Alta Baixa Intermedirio Intermedirio Alta Baixa
Aplicabilidade
Geral
No Sim Sim Sim No Sim
Proteo
Microbiana
Intermedirio No No No No Sim

2.3.3 Suportes para Imobilizao

Vrios suportes, naturais ou sintticos, tem sido utilizados para a imobilizao
de enzimas. Embora se saiba que no existe um suporte universal, existem
caractersticas primordiais a serem observados para a escolha de um suporte, baseados

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________24
em diferentes propriedades que afetam o processo de produo (MESSING, 1978;
GALVO, 2004; CAO, 2005), como:
rea de superfcie e porosidade: desejvel ter materiais com alta rea
superficial (>100m
2
/g) para cargas de enzima altas e alta porosidade para
promover o acesso da enzima ao substrato. Os poros >30nm so ideais
para a difuso da enzima durante o processo de imobilizao;
Grupos funcionais na superfcie: a quantidade de enzima que se une a
matriz de um suporte depende da densidade de carga de grupos funcionais
na superfcie e sua distribuio. A escolha dos grupos funcionais, tambm
afeta o rendimento e a estabilidade do material;
Estabilidade mecnica e qumica: para prevenir a perda de enzimas, a
integridade do suporte deve ser mantida e deve ser resistente degradaes
qumicas que possam ocorrer durante o processo;
Tamanho e forma: ideal ter partculas de tamanho uniforme,
preferencialmente esferas para facilitar os propsitos de modelagem;
Resistncia microbiana: uma das principais preocupaes de qualquer
sistema de enzimas imobilizadas a presena de microrganismos. A
durabilidade do suporte afetada pela resistncia degradao microbiana;
Natureza hidrofbica e hidroflica: a compatibilidade do suporte com a
fase lquida importante para assegurar a troca do substrato e do produto
na matriz. Tambm pode determinar o tempo de vida do complexo enzima-
suporte a partir da adsoro ou de ligaes no especficas;
Os suportes podem ser classificados de acordo com sua composio e
morfologia. A Tabela 2.5 ilustra os diferentes tipos de suportes classificados.











Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________25
Tabela 2.5-Classificao dos suportes de acordo com a composio (GALVO,
2004)
Suportes
Orgnicos Inorgnicos
Naturais Sintticos Minerais Fabricados
Polissacardeos Protenas Poliestireno Areia Vidro (PC)
Celulose Colgeno Poliacrilatos Bentonita Cermica (PC)
Agarose Albumina Polivinilos Homeblenda Slica (PC)
Agar Gelatina Nylon Pedra-pome Aluminossilicato
Quitosana Seda Poliamidas xido de Ferro
Amido Vinil xido de Nquel
Policrilamidas

Os suportes podem ser classificados como porosos ou no-porosos. Os porosos
tm grande rea superficial interna disponvel para a imobilizao e protege a enzima
contra turbulncias externas, j os no-porosos tm a desvantagem de no possuir
grande rea para a imobilizao, mas elimina o problema de transferncia de massa
interna, devido diminuio do tamanho das partculas e pelo aumento de velocidade de
escoamento do fludo (CARDIAS, 1996 apud GALVO,2004).
Na imobilizao utilizando suportes porosos, estes devem ter poros de tamanho
suficiente para permitir a acomodao da enzima e o acesso do substrato. Suportes
porosos insolveis para imobilizao resultam em grandes reas superficiais
disponveis, mas implica em dificuldades difusionais para entrada de reagentes e sadas
de produtos, principalmente quando os substratos so macro-molculas (GALVO,
2004; SZYMANSKA et al., 2007).
Os suportes porosos so mais adequados para o uso em reatores industriais, por
permitirem acomodao de alta carga de enzimas. Eles podem apresentar uma
distribuio controlada de poros uniformes ou no. Com a distribuio de poros
aleatrios somente uma frao destes estar disponvel para acomodar as enzimas.
Suportes com distribuio controlada de poros so totalmente disponveis para a
imobilizao, com um amplo intervalo de dimetros de poros (COUTINHO FILHO et
al., 2005; KENNEDY & CABRAL, 1987; RIBEIRO, 1989).
A maior parte dos suportes no permite o acoplamento direto da enzima,
necessitando de uma etapa de ativao do mesmo. Utilizam para isso reagentes

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________26
ativadores como os brometos de cianognio e reagentes bifuncionais contendo grupos
epxidos ou aldedos (GALVO, 2004).
Entre os suportes orgnicos e inorgnicos, os ltimos apresentam melhores
caractersticas para serem utilizados nos processos industriais, principalmente pela sua
estabilidade degradao fsica, qumica, trmica e microbiana, alm da resistncia
mecnica e estabilidade industrial, que evita a compactao em processos contnuos e a
possibilidade de regenerao do suporte por processo piroltico (CABRAL, 1982;
MESSING, 1978; RIBEIRO, 1989; COUTINHO FILHO et al., 2005). Os suportes
orgnicos apresentam uma diversidade de radicais disponveis para a ligao com as
enzimas, enquanto os inorgnicos possuem um carter inerte (KENNEDY & CABRAL,
1987).
Os polmeros so reportados como os principais suportes a serem usados para
imobilizar invertase como nos trabalhos de TANRISEVEN & DOGAN (2001),
GMEZ et al. (2005), GRSEL et al. (2003), KIRALP et al. (2003) e SANJAY &
SUGUNAN (2005). Os maiores problemas ao utilizar os suportes de polmeros so o
baixo pH e a baixa estabilidade trmica (SANJAY & SUGUNAN, 2005).
Existem inmeros suportes para a adsoro de enzimas, como bentonita,
cermicas porosas, alumina e resinas de troca inica. So suportes baratos, abundantes,
de alta resistncia mecnica, quimicamente estveis, no-txicos, no poluentes e de
fcil regenerao (TOMOTANI & VITOLO, 2006).
BAYRAMOGLU et al. (2003) concluram que o suporte poly (HEMA-GMA)
(2-hidroxietil metacrilato glicidil metacrilato) foi excelente para imobilizar invertase,
pois foi de fcil imobilizao, sem necessitar de uma pr-ativao.

2.3.3.1 Imobilizao em Resinas

Resinas de troca inica so muito utilizadas para imobilizao de enzimas. A
resina trocadora de ons deve conter ons prprios para efetuar a troca com rapidez
suficiente, sendo necessrio uma estrutura molecular aberta e permevel, de modo que
as molculas possam mover-se livremente. A natureza do trocador de ons complexa
e, em sua maioria so polmeros. Os ons ativos so ctions em um trocador catinico e
nions em um trocador aninico (COLLINS et al., 1993).
As propriedades fsicas das resinas trocadoras de ons so determinadas pelo
grau de reticulao, este determina a preferncia de uma resina por um on e o grau de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________27
intumescimento da resina quando esta entra em contato com a gua. As resinas
altamente reticuladas so, geralmente, quebradias, mais duras e mais impermeveis
que as de baixa reticulao (JEFFRERY et al., 1992; COLLINS et al., 1993).
As resinas catinicas trocam seu ction disponvel com o ction do meio at
atingir o equilbrio. As resinas aninicas so semelhantes, trocam nions, seu carter
bsico deve-se presena de grupos amnio quaternrio, amina substituda e amina,
sendo aquelas que tm amnio quaternrio uma resina fortemente bsica (JEFFRERY et
al., 1992).
A troca de ons em uma resina fortemente cida ocorre independentemente do
pH, j se for uma resina fracamente cida a troca se d somente em solues alcalinas,
na sua forma salina, sendo fracas na forma carboxlica. As resinas fortemente bsicas
so muito ionizadas, tanto na forma de hidrxido como na de seu sal, tambm tem sua
ao independente do pH (JEFFRERY et al., 1992; COLLINS et al., 1993).
OOSTEROM et al. (1998) imobilizaram as enzimas comercialmente
disponveis, -galactosidases de Aspergillus oryzae e de Kluyveromyces fragilis em
uma resina de troca inica, fenol-formaldedo, tipo Duolite S-761 e Duolite A-7,
respectivamente.
OZDURAL et al. (2003) estudaram os parmetros cinticos da reao de
hidrlise de lactose utilizando a enzima -galactosidase imobilizada em uma resina de
troca inica fracamente bsica, Duolite S-568, em um processo utilizando um reator de
leito empacotado.
ROCHA et al. (2006) utilizaram a resina Amberlite IRC da Rohm and Haas
para imobilizar a inulinase de Aspergillus niger e estudar a cintica e as condies
timas da enzima imobilizada, comparando-as com a livre.

2.4 Cintica Enzimtica

Cintica enzimtica definida como o estudo da velocidade da reao
enzimtica e como ela alterada devido s mudanas nas condies experimentais,
principalmente em respeito concentrao da enzima, concentrao de ligantes
(substratos, inibidores e ativadores), pH, fora inica e temperatura.
De acordo com SEGEL (1979) a anlise correta destas mudanas das
condies experimentais possibilita caracterizar a reao enzimtica:

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________28
Variando-se a concentrao de substrato e produto possvel deduzir-se
um mecanismo cintico da reao;
O estudo dos efeitos da variao do pH e da temperatura nas constantes
cinticas pode fornecer informao em relao aos grupamentos dos stios
ativos;
A anlise cintica pode levar a um modelo para a reao enzimtica e,
reciprocamente, os princpios da cintica enzimtica podem ser usados
para escrever a equao da velocidade para um modelo proposto, o qual
poder ento ser testado experimentalmente.
Qualquer taxa de reao catalisada por enzima depende diretamente da
concentrao desta. Uma tcnica experimental muito utilizada em cintica enzimtica
a determinao das taxas iniciais de reao. A taxa de formao de produto ou de
consumo de substrato deve ser constante em toda a faixa de tempo de estudo para se
medir a verdadeira taxa inicial. Assim, preciso estabelecer o limite de linearidade para
utilizar o procedimento de taxas iniciais, antes que a concentrao de produtos (P)
versus tempo (t) e velocidade (v) versus concentrao de enzimas (E
t
) se tornem no
lineares.
Na reao catalisada por enzimas, sabe-se que esta combina com o substrato de
maneira muito especfica. Dentre as vrias maneiras que tentam explicar a
especificidade da enzima e sua atividade, o conceito de stio ativo e complexo enzima-
substrato so universalmente aceitos e so a base para os diversos modelos de equaes
propostos (CARBERRY, 1976; SEGEL, 1979).
Com relao ao efeito da concentrao do substrato, para situaes onde efeitos
inibitrios de substrato e de produto so desprezveis, o modelo cintico mais utilizado
o de Michaelis-Menten, Equao 2.1 ( BAILEY & OLLIS, 1986).
.
m
m
V S
v
K S
=
+
(2.1)
O parmetro V
m
indica a velocidade limitante de uma reao catalisada por
enzima nas condies de saturao, sendo denominado velocidade mxima da reao
(ou taxa mxima de reao), e K
m
a constante do modelo de Michaelis-Menten.
A equao de Michaelis-Menten muito utilizada para modelar diversas
reaes enzimticas, mas sabe-se que para ser aplicada com sucesso a concentrao da
enzima deve ser pequena se comparada quela do substrato e ainda a concentrao de
produto deve ser desprezvel, ou seja, nos instantes iniciais da reao. Para situaes

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________29
onde as concentraes de enzimas e substratos so comparveis, a equao de Michaelis
e Menten pode ser inapropriada, como ocorre nos finais dos processos enzimticos
conduzidos em batelada. Para situaes de processos industriais, em presena de altas
concentraes de substrato ou de produtos e em presena de inibidores presentes no
meio reacional, deve-se utilizar modelos cinticos mais elaborados, porm a maioria
destes tem como ponto de partida a equao de Michaelis-Menten, na qual so inseridos
termos de correo, para levar em conta inibidores, ativadores e mltiplos substratos
(RIBEIRO, 1989).
ROCHA et al. (2006) obtiveram a descrio adequada da sua cintica
utilizando inulinase livre e imoblizada pelas equaes de Michaelis e Menten nas
condies de temperatura e abaixo do pH timo. O uso do mtodo de regresso no-
linear para determinar os parmetros cinticos contando com o melhor ajuste dos dados
experimentais foi comparado com a linearizao convencional de Lineweaver-Burk.
Obteve o K
m
da inulinase livre igual a 153 g/L a 55C e pH=4,5, enquanto o K
m

aparente da inulinase imobilizada foi 108 g/L a pH=5,5 e 50C.

2.4.1 Presena de Inibidores no Meio Reacional

A determinao da cintica enzimtica de reaes na presena de inibidores
pelo modelo de Michaelis-Menten, feitas as devidas modificaes relativamente
simples e possvel. Porm, medida que os sistemas vo se tornando mais complexos a
determinao cintica requer um tratamento mais detalhado e rigoroso. A seguir so
apresentados alguns modelos cinticos que consideram inibio pelo substrato ou pelos
produtos da reao, todos derivados do modelo clssico de Michaelis-Menten, muito
utilizados em processos com reaes envolvendo um substrato, ou dois substratos, com
um deles em excesso, como comum nas reaes de hidrlise (RIBEIRO, 1989).
Quando uma alta concentrao de substrato est presente, esta pode inibir a
taxa de reao. A velocidade da reao atinge um mximo conforme vai aumentando a
concentrao de substrato e aps este ponto, um acrscimo de substrato inibe a reao.
assumido um mecanismo onde a segunda molcula de substrato se liga ao complexo
ES, formando um complexo ESS. A Equao 2.2 representa este efeito inibitrio,
conhecida como modelo de inibio pelo substrato:

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________30
2
*
m
m
i
V S
v
S
K S
K
=
+ +
(2.2)
Sendo: K
i
a constante de inibio pelo substrato.

Alm da inibio pelo substrato, na literatura apresentado grande nmero de
modelos de inibio enzimtica, tanto pelos produtos da reao, como por componentes
do meio reacional, sendo os modelos mais comuns: inibio competitiva, no-
competitiva, acompetitiva, mista linear e parcialmente no-competitiva, os quais so
representadas pelas Equaes 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 e 2.7 , respectivamente:

.
. 1
m
m
i
V S
v
I
S K
K
=

+ +


(2.3)
.
* 1 * 1
m
m
i i
V S
v
I I
K S
K K
=

+ + +


(2.4)
.
. 1
m
m
i
V S
v
I
K S
K
=

+ +


(2.5)
.
. 1 . 1
m
m
i i
V S
v
I I
K S
K K
=

+ + +

(2.6)
. 1
. 1
m
i
m
i
I
V S
K
v
I
K S
K

+


=

+ +


(2.7)

A inibio competitiva caracteriza pela competio entre o inibidor e o
substrato pelo stio ativo da enzima. Enquanto este agente se mantm ligado enzima
no ocorre reao, pois impede a formao do complexo enzima-substrato. Esse agente
pode ser um anlogo no metabolizvel ou um derivado de substrato verdadeiro ou um
produto da reao. Neste tipo de inibio o valor de K
m
aumenta e V
m
permanece
constante. A Figura 2.3 ilustra esquematicamente o mecanismo de inibio competitiva.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________31


Figura 2.3 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio competitiva
(GALVO, 2004).

Na inibio no-competitiva o inibidor se liga ao um stio diferente ao que o
substrato iria se ligar, formando o complexo EI e o ESI, impedindo que o substrato se
aloje perfeitamente em seu stio ativo, diminuindo a velocidade de formao de produto.
Esta inibio ir produzir reduo em V
m
, mas a afinidade da enzima pelo substrato no
sofrer alterao, ou seja, no haver alterao no K
m
. A Figura 2.4 ilustra
esquematicamente o mecanismo de inibio no-competitiva.


Figura 2.4 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio no
competitiva (GALVO, 2004).

A inibio acompetitiva caracteriza-se pela formao de um complexo ESI
inativo. Assim, qualquer que seja a concentrao de substrato haver sempre uma forma
improdutiva (complexo ESI), reduzindo-se a velocidade mxima da reao. O valor do
parmetro K
m
tambm diminui, pois parte do complexo produtivo ES consumido no

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________32
processo de formao do complexo improdutivo. A Figura 2.5 ilustra esquematicamente
o mecanismo de inibio acompetitiva.


Figura 2.5 - Representao esquemtica do mecanismo de inibio
acompetitiva (GALVO, 2004).

Na inibio mista linear a presena do inibidor I na enzima modifica a
constante de dissociao de K
m
para A*K
m
. E na inibio parcialmente no competitiva
o inibidor I modifica diretamente a velocidade mxima e o valor de K
i
.
Um inibidor comum presente em vrias reaes a concentrao do substrato,
por isso importante estudar a concentrao ideal de substrato que no oferece risco de
inibio. A invertase uma enzima muito sensvel inibio pela sacarose. BAGAL &
KARVE (2006) estudaram a inibio pelo substrato na enzima livre e na imobilizada
em membranas, em vrias concentraes de sacarose, e obteve uma inibio de 12% na
livre e de 20% na imobilizada.

2.4.2 Determinao dos Parmetros Cinticos

Cada sistema enzima-substrato apresenta valores caractersticos dos parmetros
cinticos para cada modelo cintico considerado, para condies especficas de pH,
temperatura e concentrao de substrato. Para cinticas com enzimas imobilizadas, os
parmetros cinticos podem sofrer alterao em relao s livres. DANISMAN et al.
(2004), sugeriram um aumento de K
m
e uma diminuio de V
m
na imobilizao de
enzimas em polmeros.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________33
GRSEL et al. (2003) estudaram os parmetros cinticos K
m
e V
m
para
invertase livre e imobilizada em temperatura e pH constantes, enquanto variava a
concentrao de substrato. O perfil da atividade enzimtica seguiu a cintica de
Michaelis e Menten, e os parmetros K
m
e V
m
foram obtidos pelo mtodo grfico de
Lineweaver-Burk, indicando diminuio para o valor de V
m
e aumento de K
m
para
enzima imobilizada em relao livre.
Os parmetros cinticos de invertase imobilizada e livre foram determinados
por BAYRAMOGLU et al. (2003). O valor da constante de Michaelis K
m
mostrou um
significativo crescimento de 2,7 vezes quando a enzima estava imobilizada enquanto o
V
m
diminuiu.
CHANG & JUANG (2005) estudaram a cintica da reao enzimtica de trs
enzimas: -amilase, -amilase e glucoamilase. Os valores encontrados de K
m
e V
m
das
trs enzimas foram maiores quando estas estavam imobilizadas, com exceo da
glucoamilase que obteve o V
m
maior quando o ensaio era com a enzima livre.
BORA et al. (2005) determinaram os valores de K
m
e V
m
igual a 45,12mM e
362,31 U/mg, respectivamente, para a invertase imobilizada. Para a enzima livre
encontrou-se K
m
= 25,91mM e V
m
=416,67 U/mg. Pode ser observado que o valor de K
m

para a invertase imobilizada foi de 1,7 vezes livre.

2.4.3 Influncia da Temperatura e do pH na Atividade e na Estabilidade

A temperatura exerce uma grande influncia na atividade e estabilidade das
enzimas. Um aumento desta imprime maior energia cintica s molculas dos reagentes
ocasionando maior nmero de colises produtivas por unidade de tempo (SEGEL,
1979). As constantes de taxa de reao variam com a temperatura segundo o modelo de
Arrhenius, Equao 2.8.
*
Ea
RT
k A e

= (2.8)
Sendo: k a constante da taxa de reao, A o fator de freqncia para a reao, E
a
a
energia de ativao e T a temperatura absoluta.
O conhecimento da cintica de desativao das enzimas de grande
importncia no projeto de reatores enzimticos. A estabilidade das enzimas um dos
fatores primordiais na determinao da possibilidade de sua aplicao em muitos
processos biotecnolgicos. Segundo HENLEY & SADANA (1985) o modelo de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________34
desativao de primeira ordem freqentemente adequado para representar a cintica
de desativao enzimtica. No entanto, por uma reviso na literatura disponvel,
verificaram que a taxa de decrscimo em atividade no sempre constante. Esses
autores classificaram as curvas de desativao em dois casos. Num deles, a atividade
sempre menor que a inicial e no outro, a atividade pode ser maior que a inicial num
perodo de tempo e propem uma cintica de desativao em srie e agrupam os casos
de desativao, encontrados nesta literatura, em vrias categorias diferentes. O modelo
de desativao trmica em srie est representado no mecanismo seguinte.

1 2 1 2
1 2
k k
E E E


Sendo:
1
e
2
as taxas especficas de atividade
E
E
e
E
E
2 1
respectivamente ;
k
1
e k
2
os coeficientes da taxa de desativao de primeira ordem;
E, E
1
e E
2
os estados de enzima que possuem diferentes atividades especficas.

O estado intermedirio E
1
e o estado final E
2
so ambos homogneos. Este
modelo considera duas etapas de primeira ordem irreversveis na presena da enzima
ativa (E), tanto quanto as espcies modificadas (E
1
e E
2
), sendo estas com atividades
especficas diferentes da enzima na sua forma nativa (JURADO, et al., 2004). A
Equao 2.9 ilustra a expresso da atividade mdia que foi obtida derivando o estado
final E
2
, admitindo valor especfico de atividade diferente de zero GIACOMINI, et al.
(2001):
1
1 1 2 2 1
1 1 2 2
2 1 2 2 1
1 exp( ) ( )exp( )
k k k
A k t
k k k k k k







= + +

2
k t
1
(2.9)

Se k
2
for igual a zero a Equao 2.9 se reduz 2.10:

1 1
(1 ) exp( ) A k t = + (2.10)

Na maioria dos estudos de desativao trmica de enzimas, considera-se
cintica de primeira ordem para relacionar atividade enzimtica com o tempo, a uma
dada temperatura (RIBEIRO, 1989). Supondo desativao de primeira ordem, obtm-se
a Equao 2.11.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________35

d
dA
k A
dt
= (2.11)

Integrando a Equao 2.11 para o intervalo de tempo t = 0 at t, obtm-se a
Equao 2.12.

0
.exp( ) .
d
A A k t = (2.12)
Sendo k
d
a constante cintica de desativao trmica, ou taxa especfica de inativao
trmica, representada na equao 2.9 por k
1
.

Um conceito comum em cintica qumica e enzimtica o tempo de meia vida,
t

, que o tempo necessrio para que a atividade relativa da enzima (A/A


o
), da Equao
2.12, seja igual a 0,5, ou seja, o tempo necessrio, a uma temperatura T, sob condies
especficas, para que a atividade cataltica seja reduzida metade da inicial. Da Equao
2.12, e com o conceito de tempo de meia vida, tem-se a Equao 2.13.
( )

ln 0, 5
d
t
k
= (2.13)
Por outro lado, k
d
varia com a temperatura segundo o modelo de Arrenhius,
dado pela Equao 2.14.
exp
d
d
E
k A
R T

=


(2.14)
A Equao 2.14 na forma linearizada pode ser representada pela Equao 2.15,
na qual possvel determinar a energia de ativao do fenmeno de desativao trmica
da enzima estudada.
( ) ( )
1
ln ln
d
d
E
k A
R T
= (2.15)
Seguindo a lei de Arrhenius, CHANG & JUANG (2005) determinaram a
desativao trmica das enzimas -amilase, -amilase e glucoamilase, na forma
imobilizada e na livre por uma descrio da equao cintica de pseudo-primeira-
ordem.
Em uma reao enzimtica o aumento da temperatura leva ao um aumento da
taxa at atingir um mximo correspondente temperatura tima, depois decresce
rapidamente devido desnaturao da enzima. Na determinao desta temperatura

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________36
tima deve se tomar cuidado para que a atividade da enzima seja constante pelo menos
durante a realizao do experimento, pois caso contrrio tem-se dois efeitos, o aumento
da taxa da reao e a desnaturao da enzima (SEGEL, 1979).
A estabilidade trmica da enzima depende do meio em que ela se encontra, tais
como: pH, concentrao de substrato, presena de estabilizadores e tambm se est na
forma livre ou imobilizada (BAILEY & OLLIS, 1986).
O pH tambm exerce grande influncia na atividade e estabilidade das
enzimas. Os vrios aminocidos que compe a protena possuem grupos laterais
bsicos, neutros ou cidos, portanto a enzima pode ser carregada positivamente ou
negativamente, dependendo do pH. Tais grupos ionizveis so frequentemente parte do
stio ativo, j que um mecanismo cataltico cido-base est ligado catlise enzimtica.
Assim a enzima para estar cataliticamente ativa s existe um estado particular de
ionizao. Dessa forma, a enzima ativa ser uma frao maior ou menor da
concentrao total da enzima, dependendo do pH. A taxa da reao aumenta com pH at
um valor timo a partir do qual a taxa decresce, ou devido desnaturao ou a
existncia de estados de ionizao inadequados (SEGEL, 1979; DIXON & WEBB,
1979).
BORA et al. (2005) obtiveram o pH timo tanto para a invertase livre quanto
para a imobilizada igual a 5,0, embora as atividades residuais da enzima imobilizada
foram menores do que a solvel. A temperatura tima das enzimas livres e imobilizadas
tambm coincidiu por volta de 45C e com o aumento de temperatura acima da tima as
enzimas livres decaram rapidamente sua atividade, enquanto as imobilizadas retiveram
um pouco mais de atividade, devido o aumento da sua estabilidade trmica.
A invertase adsorvida em slica demonstrou um aumento em K
m
e um alto
gfeito difusional devido resistncia transferncia de massa. Isso pode ser resultado
da adsoro da enzima muito prximo ao stio ativo. O pH timo foi inalterado na
imobilizao por ligao covalente, enquanto aumentou nas espcies adsorvidas. A
estabilidade em relao ao pH tambm melhorou. Similarmente, a temperatura tima e a
estabilidade trmica foram aumentadas na imobilizao (SANJAY e SUGUNAN,
2005).
Estudo cintico mostrou que invertase adsorvida em polietilenoglicol
dimetacrilato quelado com cobre seguiu uma desativao trmica de pseudo-segunda-
ordem e foi mais resistente desnaturao a altas temperaturas do que a solvel. O valor
da constante K
m
foi significativamente maior na forma adsorvida, o que indica

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________37
diminuio de afinidade da enzima pelo seu substrato, considerando que V
m
foi menor
na invertase adsorvida. A temperatura tima da forma adsorvida foi 10C acima da livre
e a estabilidade de armazenamento aumentou com a adsoro (OSMAN et al., 2005).
GOMZ et al. (2005) tambm obtiveram um aumento da temperatura tima de 10C e
de 9C na termoestabilidade a partir da imobilizao da invertase.
AMAYA-DELGADO et al. (2005) observaram a influncia do pH na atividade
da invertase na hidrlise de sacarose na faixa de 5,0 a 7,0 e o pH de maior atividade
tanto para a livre quanto para imobilizada foi de 5,5. A temperatura de maior atividade
da invertase foi na faixa de 65 a 70C para a imobilizada e 55 a 65C para a livre, e
ambas tiveram uma rpida queda a partir de 70C.

2.4.4 Efeito da Imobilizao nas Propriedades da Enzima

A enzima imobilizada apresenta vrias vantagens em relao livre, porm
alguma alterao nas propriedades fsicas e qumicas, depois da imobilizao pode
implicar em mudanas na atividade, estabilidade e cintica da enzima imobilizada. Nos
processos utilizando enzimas imobilizadas o parmetro de maior importncia a
estabilidade operacional, pois somente com o tempo de meia-vida suficientemente
longo os processos com enzimas imobilizadas sero mais econmicos se comparado
com o uso de enzimas solveis. Isto reduziria o custo devido a menor quantidade de
enzima necessria, o qual deve ser suficiente para cobrir os custos de imobilizao
(ZANIN, 1989).
A estabilidade operacional da enzima imobilizada depende de fatores como:
desprendimento da enzima do suporte; obstruo dos poros por impurezas ou produtos
secundrios; perda do suporte por atrito ou dissoluo; obstruo de leitos fixos,
causando canais preferenciais e crescimento de microrganismos. (ZANIN, 1989).
Normalmente as enzimas imobilizadas mantm sua atividade em condies de
estocagem especficas de temperatura e pH. A estabilidade de estocagem das enzimas
imobilizadas geralmente superior a das livres, mas depende do mtodo de
imobilizao, do suporte e da soluo a ser estocada (CHIBATA, 1978; BAGAL &
KARVE, 2006).
Quando a enzima imobilizada o pH de maior atividade pode ou no se alterar.
Se o suporte carregado, as propriedades cinticas da enzima imobilizada pode diferir
da solvel, mesmo na ausncia de efeitos difusionais. Esse comportamento pode ser

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________38
atribudo ao fato de que as concentraes de espcies carregadas, tais como substrato,
ons hidrognio ou hidroxila e outros no microambiente da enzima imobilizada, so
diferentes da soluo externa, devido a interaes eletrostticas com cargas fixas no
suporte (RIBEIRO, 1989).
A alterao no perfil de temperatura pode ser observada entre as enzimas livres
e imobilizadas, o que pode ser causado pelos efeitos difusionais, mudanas
conformacionais e efeitos estereoqumicos. Essas podem refletir em um aumento ou
diminuio da temperatura tima alcanada pela enzima imobilizada em relao
solvel (RIBEIRO, 1989).
Em 2006, BAGAL & KARVE obtiveram uma excelente estabilidade de
estocagem com a invertase imobilizada em membranas, uma vida de prateleira de 110
dias. Alm disso, a invertase entrelaada mostrou a melhor estabilidade operacional e
foi reutilizada por at 12 ciclos. Os parmetros cinticos da invertase imobilizada e da
solvel sugeriram que a matriz oferece resistncia mnima para a difuso do produto e
do substrato.

2.5 Reatores com Enzimas Imobilizadas
Das vrias aplicaes para enzimas imobilizadas a mais importante sua
aplicao industrial, por isso o assunto to discutido. Em processos industriais, as
enzimas imobilizadas so empregadas em reatores qumicos, normalmente similares aos
utilizados em catlise qumica (CHIBATA, 1978; CAO, 2005; BULCHHOLZ et al.,
2005).
Os reatores enzimticos so classificados em homogneos e heterogneos,
dependendo do nmero de fases presentes no processo, sendo que no processo
homogneo ocorre apenas uma fase, enquanto no heterogneo h duas ou mais fases.
Um exemplo de heterogneo a soluo de substrato sendo a fase lquida e a enzima
imobilizada a fase slida. Outra classificao baseia-se na forma de operao,
descontnuo (batelada) ou contnuo, ao grau de mistura: perfeita ou de escoamento
tubular. O perfil de concentrao dentro dos reatores pode variar apreciavelmente
(RIBEIRO, 1989; CHIBATA, 1978; CAO, 2005; BULCHHOLZ et al., 2005).
Enzimas imobilizadas possibilitam uma catlise heterognea com timas
vantagens: possvel utilizar um nico grupo de enzimas repetidas vezes e parar a
reao apenas removendo fisicamente as enzimas imobilizadas da soluo, alm disso,
inclui a facilidade de determinao analtica de uma mistura complexa em um volume

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________39
pequeno (ERGINER et al., 2000). Uma classificao de reatores levando em conta o
modo de operao e as caractersticas hidrodinmicas est representada na Tabela 2.6.

Tabela 2.6-Classificao de reatores enzimticos (ZANIN, 1989).
Modo de
operao
Caractersticas
hidrodinmicas
Tipo de reator
Descontnuo
(Batelada)
Mistura perfeita Reator batelada de tanque agitado (BSTR)
Tubular Reator batelada com recirculao (BRR)
Contnuo Mistura perfeita Reator contnuo de tanque agitado(CSTR)
Reator contnuo com agitao e com membrana de
ultrafiltrao (CSTR-UF)
Tubular Reator de leito fixo (PBR)
Reator de leito fluidizado (PFR)
Reator de membranas

2.5.1 Reatores Descontnuos

So reatores utilizados, em sua maioria, para processos com enzimas em
soluo, onde o substrato e a enzima so introduzidos juntos no reator e o contedo
descaregado quando se atinge o grau de converso desejado.
Como vantagem o reator batelada possui alta eficincia da transferncia de
calor e massa devido boa agitao do sistema. E como principais desvantagens tm-se
(ZANIN, 1989):
Mudanas nas condies no decorrer da reao, o que acarreta
equipamentos de controle mais complexos;
Problemas na ampliao de escala, pois difcil manter a entrada
proporcional de potncia medida que o volume do reator aumenta;
Variao da qualidade do produto de uma batelada outra;
Presena de tempo morto entre as bateladas.
Um reator batelada tipo tanque agitado (BSTR- Batch Stirred Tank Reactor)
de concepo bastante simples, pois trata-se de um tanque com um agitador mecnico,
que permite um bom grau de mistura, apresentado na Figura 2.6a. Quando as enzimas
imobilizadas so utilizadas neste reator estas devem ser separadas em uma etapa
subseqente, podendo ser por filtrao ou centrifugao, o que pode provocar perdas de

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________40
partculas do catalisador, bem como a desativao parcial das enzimas imobilizadas.
Ainda pode haver a quebra de alguns suportes devido ao contato com o agitador. Para
superar ou minimizar alguns desses problemas foram criados outros modelos de reatores
descontnuos. Um desses o reator com agitao provido de um cesto (basket reactor)
que retm as enzimas imobilizadas, impedindo sua perda por atrito com o agitador ou
no processo de separao de produtos (CARBERRY, 1976; MESSING, 1978).
BERGAMASCO et al. (2000) utilizaram o reator batelada com a invertase livre
e imobilizada covalentemente em slica de poros controlados, com volume de soluo
de substrato de 50 mL, onde a reao ocorreu com intensa agitao e com o controle de
temperatura.
J no trabalho de TANRISEVEN & DOGAN (2001) a atividade da invertase
imobilizada em cpsulas de gel foi determinada em um reator de mistura com agitao
magntica de 450 rev./min, de volume de 1000 L, 50 L de mistura de reao e 950
L de gua destilada.

Figura 2.6 Exemplos de reatores para enzimas imobilizadas (VICENTE,
2000).

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________41

2.5.2 Reatores Contnuos

A maior parte dos processos industriais operada em reatores contnuos, pois
este oferece vantagem superior s bateladas, pois possibilita o controle automtico
facilitando a obteno de um produto de qualidade. Os reatores de fluxo contnuo
podem ser divididos em: reator contnuo tipo tanque agitado (CSTR Continuous
Stirred Tank Reactor), com mistura completa e o reator tipo tubular, em que a mistura
ocorre radialmente (VICENTE, 2000).
O reator contnuo tipo tanque agitado (CSTR) consiste em um tanque com
entrada de substrato e sada de produtos. Possui uma eficiente agitao que promove o
contato ntimo entre a enzima e o meio reacional, evitando gradiente de concentrao e
de temperatura. Existe uma variedade de configuraes de CSTR, em sua forma mais
simples, como mostrado na Figura 2.6b, o substrato adicionado ao tanque contendo a
enzima imobilizada, a qual fica em suspenso, enquanto que o produto e o substrato
remanescente so retirados continuamente. Um filtro colocado na sada do tanque
impedindo que as enzimas imobilizadas sejam retiradas do sistema.
Outra configurao desse reator mostrada na Figura 2.6c, na qual as enzimas
imobilizadas so retidas nas ps do eixo de agitao, com intuito de minimizar a
resistncia transferncia de massa entre a fase lquida e o biocatalisador, e
principalmente reduzir a quebra e o desgaste da partcula.
O reator tubular ideal caracterizado por uma variao das concentraes dos
componentes da entrada at a sada. O fluido escoa atravs de um tubo ou de uma
coluna promovendo o chamado de fluxo pistonado. Os reatores tubulares utilizados com
enzimas imobilizadas so de leito fixo, de leito fluidizado e de membrana. O reator de
leito fixo (PBR Packed Bed Reactor) o mais utilizado na catalise heterognea.
Consiste de uma coluna recheada com partculas do biocatalisador, a qual percolada
pela soluo de reagente a ser tratada, demonstrado na Figura 2.6d. O escamento no
reator pode ser ascendente ou descendente. A desvantagem de utilizar o fluxo
descendente a possvel compactao natural das partculas ocasionando caminhos
preferenciais do fluido na coluna.
RODRIGUES et al. (2000) estudaram a inverso da sacarose pela invertase
imobilizada em resinas catinicas Amberlite IR-120, as quais foram empacotadas nas

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________42
colunas por onde passava o xarope de sacarose e sofria a hidrlise. O reator era formado
por uma coluna de vidro encamisada, um banho termostatizado com recirculao de
gua e uma bomba peristltica. A condio de processo desenvolvida permitiu a
obteno de um produto final de alta qualidade, preservando a integridade das resinas.
O produto final estava de acordo com as especificaes da National Soft Drink
Association of USA, podendo ser utilizada na fabricao de refrigerante.
Em escala de laboratrio um reator de coluna contendo invertase imobilizada
em CCL-Seralose extrada do Cajanus cajan, manteve a atividade enzimtica por um
ms e reteve 80% de atividade durante 60 dias temperatura de 4C (AHMAD et al.,
2001).
ZDURAL et al. (2003) estudaram os parmetros cinticos de uma inibio
competitiva do produto por uma enzima -galactosidase imobilizada covalentemente
em uma resina utilizando um reator de leito empacotado de fluxo contnuo.
A estabilidade da invertase imobilizada foi estudada utilizando um reator de
leito empacotado, a 30C e observou-se um decrscimo de 20% em relao atividade
inicial aps as 50 h em um processo contnuo (GOMZ et al., 2005).
O reator de leito fluidizado (FBR Fluidized Bed Reactor) um hibrido do
PBR e do CSTR, em termos de comportamento de fluido. Possui a forma geomtrica de
uma coluna, onde as partculas imobilizadas ficam em suspenso, evitando o risco de
colmatao (Figura 2.6e). O fator limitante para o uso desse tipo de reator o custo
energtico necessrio. So os mais adequados quando a reao ocorre em soluo
contendo substrato com elevada viscosidade ou ainda quando substrato ou produto so
gasosos.
A operao de reatores de membranas fundamentada na separao de
enzimas, produtos e substratos por uma membrana semi-permevel que estabelece uma
barreira seletiva, permitindo apenas a passagem do substrato e/ou produto (Figura 2.6f).
Os reatores de membranas so divididos em duas categorias: aqueles que operam com
substratos de baixo peso molecular que tanto o substrato quanto o produto permeiam a
membrana e aqueles que convertem substratos de macromolculas, em que somente o
produto permeia a membrana. Entre as inmeras vantagens desse processo est o
aumento da transferncia de massa, com conseqente aumento da produtividade e a
possibilidade de conduzir reaes bifsicas. Por outro lado, a desvantagem a
possibilidade de escape das enzimas nos poros da membrana, causando uma reduo

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________43
gradual da eficincia. No caso da enzima imobilizada na superfcie da membrana, pode
ocorrer inibio, normalmente por concentraes inadequadas de substratos e produtos,
devido ao acmulo gradual dos mesmos na forma de uma camada de gel adjacente
membrana (VICENTE, 2000).
BAYRAMOGLU et al. (2003) utilizaram um reator contnuo de leito fixo para
hidrolisar a sacarose com invertase imobilizada em um filme de HEMA-GMA (poli
(hidroximetil metacrilato-co-glicidil metacrilato)). Aps 90 horas de operao a enzima
no perdeu atividade e aps 168 horas houve uma queda de 8% da atividade inicial,
resultado da inativao da enzima em uso.

2.5.3 Fatores que Influenciam a Seleo do Reator

De acordo com MESSING (1978), BAILEY & OLLIS (1986), CAO (2005) a
seleo do tipo de reator a ser utilizado em um processo com enzimas imobilizadas
depende de fatores como:
Forma da enzima imobilizada
Uma enzima imobilizada pode se apresentar em diversas formas tais como:
partculas, membranas, fibras.
Um reator tipo CSTR aconselhado para partculas bem resistentes ao
atrito, pois pode ocorrer reduo do dimetro mdio das partculas do biocatalizador,
que pode sair do reator, contaminando o produto final. A opo do reator tipo cesta
reduz muito a intensidade dessa abraso.
Partculas com dimetro reduzido (<300m) no deve ser utilizados em
reatores de leito fixo, pois acarretam um aumento na queda de presso ao longo do leito
cataltico. Assim, a melhor opo para empregar enzimas imobilizadas deformveis e de
dimetro reduzido a utilizao de leito fluidizado, o qual evita a queda de presso e
problemas de entupimento (VICENTE, 2000).
Enzimas na forma de membranas ou em fibras so mais adequadas ao uso de
leito fixo e em alguns casos quando esto divididas em pedaos pequenos, pode utilizar
reator tipo CSTR.
Natureza do substrato
Substratos que contm slidos em suspenso, natureza coloidal ou apresentam
alta viscosidade so suscetveis de bloquear reatores de leito fixo, conduzindo a

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________44
elevadas quedas da presso. Por isso, neste caso o mais utilizado o reator tipo CSTR
que pode processar substratos coloidais e at insolveis, desde que o grau de agitao
seja intenso.
Para solues de substratos que contenham impurezas insolveis, as mesmas
devem ser filtradas na entrada para ser possvel a utilizao em leito fixo.
Requisitos operacionais de reao
Para sistemas que requerem controle de pH e temperatura, os reatores mais
adequados so do tipo CSTR.
Cintica da reao
As enzimas que seguem a cintica de Michaelis-Menten, em que a velocidade
da reao menor em baixas concentraes de substrato, so menos produtivas em
reatores tipo CSTR do que em leito fixo. Ento quando se deseja um alto grau de
converso e apresenta gradientes de concentrao de substrato no interior do reator o
mais adequado o de leito fixo.
Teor de enzima no suporte
A concentrao de biocatalisador (massa de suporte/volume de reator)
pequena em CSTR, mediana em leito fluidizado e alta em leito fixo. Logo se a
capacidade do suporte em reter a enzima for baixa, a utilizao de reatores tipo CSTR
e leito fluidizado pode necessitar de um elevado tempo de residncia ou operaes em
vrios reatores em srie, o que pode acarretar problemas de viabilidade econmica do
processo.
Caractersticas de transferncia de massa
A possibilidade de utilizao de partculas biocatalticas de pequeno dimetro
(da ordem de 10m), e a decorrente acessibilidade do substrato a estas nos reatores de
leito fluidizado, conduzem diminuio dos problemas de transferncia de massa e de
calor neste tipo de reator comparativamente ao de leito fixo, sem causar o problema de
abraso existente nos reatores do tipo CSTR.
Facilidade de substituio do catalisador e sua regenerao
Quando h a necessidade de manipulao do biocatalisador no interior do
reator para manuteno da atividade cataltica, ou seja, operaes de retirada contnua
ou peridica de enzimas imobilizadas, os reatores de leito fluidizado e tipo CSTR so
as melhores opes.
Facilidade de construo do reator e custo do mesmo

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica________________________________________45
O reator tipo tanque contnuo agitado CSTR o de concepo mais simples
e, portanto, o mais simples de construir. Entretanto, os custos operacionais deste e do
leito fluidizado so mais elevados que o de leito fixo, devido necessidade de uma
potencia alta de agitao e de fluidizao do contedo do reator.

2.5.4 Problemas Operacionais de Reatores Enzimticos

Alm dos problemas de natureza fsica, como entupimento, abraso de
partculas, dificuldades de fluidizao, pode citar outros que contribuem para a
desativao e queda de converso, como o excesso de agitao, variaes de
temperatura por falha do controle termosttico, variaes de composio na corrente de
alimentao e, principalmente, contaminao microbiana.
Em reatores submetidos a longos perodos de operao contnua, a contaminao
pode se tornar um problema muito srio. Uma alternativa um tratamento peridico do
reator com agentes bacterostticos ou fungicidas, no prejudiciais ao biocatalisador ou a
esterilizao do substrato na alimentao do reator (CHEETHAM, 1985). Outra opo
seria a operao em temperaturas elevadas, mas depende do limite da estabilidade da
enzima.
























CAPTULO 3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Enzima e Reagentes

A enzima utilizada neste trabalho foi invertase (-frutofuranosidase
frutohidrolase, E.C.3.2.1.26, Grau V, cdigo 9001-57-4, da levedura Sacaromyces
cerevisae), adquirida da Sigma. A atividade enzimtica declarada no rtulo pelo
fabricante era de 46 U/mg de slido, sendo U definido como 1 micromol de sacarose
hidrolisada a acar invertido por minuto a pH 4,5 e 55C, que corresponde a 16,6 U
s
.
Esta enzima utilizada na forma de p e por todo trabalho a concentrao da mesma
refere-se a grama do produto comercial por litro (g/L).
O substrato utilizado foi sacarose de grau analtico das marcas Isofar e Vetec.
Todos os demais reagentes foram de grau analtico.

3.1.2 Suportes para Imobilizao

As resinas de troca inica, Marathon A e Marathon C foram obtidas da Dow
Chemical Company, so esferas totalmente perfeitas e Duolite A-568 e Duolite S-761
foram adquiridas da Rohm Hass. A resina aninica fortemente bsica Dowex Marathon
A aplicada em desmineralizao de gua; Dowex Marathon C um trocador catinico
fortemente cido, utilizado para aplicaes em abrandamento e desmineralizao de
gua; Duolite A-568 um trocador aninico fracamente bsico, com ligaes cruzadas
de fenol-formaldedo que usada como suporte de enzimas em vrias aplicaes de
bioprocessos, possui um tamanho mdio de poro de 0,78 mL/ grama de volume de poro;
Duolite S-761 um trocador aninico fracamente bsico que utilizado para remoo
de protenas, impurezas orgnicas com aplicao comercial na purificao de frmacos,
possui um tamanho mdio de poro 0,43 mL/grama de volume de poro.





Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________47
3.1.3 Reator

O reator utilizado nos experimentos de hidrlise de sacarose por invertase nas
formas livre e imobilizada foi um microrreator de mistura, com volume total de 200 mL,
com camisa externa para circulao de gua proveniente de um banho termostatizado
para controle de temperatura e provido de agitao magntica. Para os ensaios com a
enzima na forma imobilizada, as partculas da mesma eram retidas em uma cesta de ao
inox de 100 mesh, evitando assim as colises entre o agitador e as partculas catalticas.
O reator de mistura apresentava altura 8,2 cm e dimetro interno 5,5 cm. e a cesta de
ao inox possua altura igual a 6,7 cm e dimetro de 2,4 cm. A Figura 3.1 uma foto da
montagem experimental.


Figura 3.1 Foto do reator utilizado para realizar os ensaios.

3.2 Metodologia

3.2.1 Determinao de Aucares Redutores

A determinao de aucares redutores foi realizada pelo mtodo do cido 3,5
dinitrosaliclico (MILLER, 1959).
O mtodo de DNS baseia-se na reduo do cido 3,5-dinitrosaliclico a cido
3-amino-5-nitrosaliclico e, ao mesmo tempo, na oxidao do grupo aldedo ou cetnico
a grupos carboxlicos, com o desenvolvimento da cor laranja-marrom forte. A seqncia
de reaes apresentada na Figura 3.2.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________48

Figura 3.2 Esquema de reaes envolvidas no mtodo DNS (BERGAMASCO, 1989
apude VICENTE, 2000).

O mtodo de DNS utiliza os seguintes reagentes: cido dinitrosaliclico, sal de
Rochelle e hidrxido de sdio, cada uma com uma funo especfica.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________49
Sal de Rochelle: constitui de uma soluo de tartarato de sdio e potssio,
usado para impedir a oxidao do reagente pelo oxignio dissolvido.
Hidrxido de sdio: atua como redutor da ao da glicose sobre o cido
dinitrosaliclico.
Preparao do reagente: dissolvia-se 16 g de hidrxido de sdio em 200 mL de
gua destilada para a obteno de uma soluo 2 N. A seguir 10 g de cido 3,5-
dinitrosaliclico e 500 mL de gua destilada era misturada com a soluo de hidrxido
de sdio. Aps essa diluio, adicionava-se 300 g de sal de Rochelle em banho Maria a
40C completando o volume a 1000 mL com gua destilada.
Para a determinao da concentrao de acares redutores, 1 mL de amostra
diluda de modo que a concentrao destes situasse na faixa de 0,0 a 1,0 g/L era
acrescentada a 2,0 mL de reagente DNS em um tubo de Folin-Wu e levada para um
banho de gua em ebulio por 5 minutos. Aps este tempo, resfriavam-se os tubos em
banho com gelo e completava o volume a 25 mL com gua destilada, os quais eram
homogeneizados e a seguir realizada a leitura da absorbncia a 540 nm, em
espectrofotmetro Thermo Spectronic modelo Genesys 10 UV, utilizando cubetas de
vidro. A calibrao do zero no aparelho era feita utilizando um teste em branco, onde
1mL de gua destilada substitua a amostra, seguindo o mesmo procedimento.
A curva de calibrao do mtodo do DNS, em termos de concentrao de
acares redutores em funo da absorbncia, foi determinada utilizando solues de
glicose na faixa de 0,0 a 1,0 g/L, com intervalo de 0,1 g/L.
Durante os ensaios foram obtidas curvas de calibrao para toda soluo de
DNS preparada.

3.2.2 Dosagem de Protena

A dosagem de protena foi realizada atravs do Mtodo de Lowry (1951),
constitudos das solues A, B e AB.
Reativo A: 2 g de Na
2
CO
3
seco mais 0,02 g de tartarato duplo de sdio e
potssio em 100 mL de NaOH 0,1 M
Reativo B: 0,5 g de CuSO
4
mais 2 gotas de H
2
SO
4
concentrado em 100 mL de
gua destilada.
Soluo AB: 50 mL de reativo A e 1 mL de reativo B, preparado
imediatamente antes da dosagem.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________50
Reativo de Folin: preparava uma soluo 1 N e era armazenado ao abrigo da
luz.
Soluo padro de soro de albumina bovina (BSA) 100 mg/L. Adicionava-se
cuidadosamente 100 mg de BSA em 1000 mL para evitar a formao de bolhas. Esta
soluo era conservada sob refrigerao.
Para a dosagem de protena fazia-se a diluio das amostras para que a
absorbncia situasse na faixa de 0,0 a 1,0. Amostras de 1,0 mL contendo protena a ser
dosada eram adicionadas a um frasco tipo penicilina cor mbar no qual eram
acrescentados 3 mL de soluo AB, cobertos com parafilm, homogeneizados,
protegidos da luz e mantidos desta forma por 10 minutos. Aps este tempo adicionava-
se 0,3 mL de reativo Folin 1 N e deixava por mais 30 minutos ao abrigo da luz. Ao final
efetuava a medida da absorbncia em espectrofotmetro Thermo Spectronic modelo
Genesys 10 UV, utilizando cubetas de vidro, utilizando um comprimento de onda igual
a =760 nm.
A leitura da absorbncia era convertida em concentrao de protena pela curva
de calibrao realizada anteriormente pelo mesmo procedimento, com medidas de
absorbncia em relao a concentraes de BSA na faixa de 0 a 100 g/mL, que
resultou em uma equao linear.

3.2.3 Determinao da Atividade pelo Mtodo das Taxas Iniciais

A atividade da enzima invertase em sua forma solvel e imobilizada foi
determinada pelo mtodo das taxas iniciais de reao, utilizando o reator do item 3.1.3.
A reao de hidrlise de sacarose por invertase era realizada um volume
reacional igual a 100 mL, nas condies de pH, temperatura e agitao definidas para
cada experimento. Inicialmente colocava no reator a soluo de sacarose no tampo
adequado, e aps atingir a temperatura desejada, acrescentava o volume necessrio da
soluo de invertase livre para resultar em uma concentrao desta de 0,01 g/L,
marcando o tempo de incio da reao. No caso das enzimas imobilizadas, aps atingir a
temperatura desejada para o experimento, adicionava ao reator a cesta com certa massa
de invertase imobilizada nas resinas, iniciando a contagem do tempo. As amostras eram
tomadas, normalmente em nmero de cinco, a intervalos de trs em trs minutos. Cada
amostra era introduzida em um tubo Folin-Wu contendo 2mL de DNS,o qual inativa a
enzima possibilitando determinar o teor de acares redutores naquele momento.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________51
A taxa inicial de reao foi obtida a partir da inclinao da reta de
concentrao de aucares redutores formados, em funo do tempo.
A atividade de invertase livre foi expressa por grama de acar redutor
produzido por litro de meio, por minuto, por grama de enzima. A atividade de invertase
imobilizada foi expressa por grama de acar redutor produzido por litro de meio, por
minuto, por grama de resina.

3.2.4 Planejamento Composto Central

Para a realizao de experimentos significativos e confiveis, deve-se utilizar
um mtodo cientfico de planejamento. Alm disso, quando o problema envolver dados
que podem conter erros experimentais, um modo adequado de anlise por mtodos
estatsticos. Em qualquer anlise experimental devem-se seguir duas etapas: o
planejamento experimental e a anlise estatstica dos dados, esta ltima dependente do
tipo de planejamento realizado.
As vantagens do uso do planejamento experimental so:
Reduo do tempo de experimentao, pois permite a otimizao do
nmero de experimentos;
Reduo dos custos relativos execuo dos ensaios, fato que est
relacionado reduo da quantidade de experimentos;
Permite a avaliao e minimizao do erro experimental;
Permite uma otimizao multivariada;
Permite a verificao conjunta da influncia das variveis estudadas.
Supondo que dentro da regio experimental a atividade enzimtica pode ser
ajustada por uma superfcie de resposta de 2 ordem, optou-se por estudar as variveis
que influenciam na imobilizao. Neste caso em particular a temperatura e o pH que
propiciam um melhor resultado de atividade enzimtica para condies de enzimas livre
e imobilizada, por um Planejamento Composto Central.
Esse tipo de planejamento estatstico estuda os efeitos da interao dos
parmetros em questo. Cada varivel estudada com 5 diferentes nveis (-, -1, 0, 1,
+), cada nvel possui seu respectivo valor nominal. O parmetro utilizado foi o
ortogonal de modo a se obter um planejamento, onde a matriz de varincia e covarincia
diagonal e os parmetros estimados no so correlacionados entre si (BOX et al.,
1978).

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________52
O valor de , foi calculado pela Equao 3.1:
1/ 4
.
4
QG


=


(3.1)
Sendo: (3.2) ( )
2
1/ 2
1/ 2
Q G T G

= +

G = nmero de pontos fatoriais (G = 2


k
, se completo);
T = nmero de pontos adicionais no PCC;
T = 2k + nmero de rplicas centrais.
Os nveis das variveis estudadas foram colocados na forma codificada
(adimensionalizada), utilizando a Equao geral de codificao (3.3).
( )
0
1 1
2
n
X X
X
X X
+

=

(3.3)
Sendo: Xn o valor da varivel no experimento na forma codificada;
X o valor real da varivel a ser calculado;
X
0
o valor real da varivel no ponto central;
X
+1
o valor real da varivel no nvel superior;
X
-1
o valor real da varivel no nvel inferior.

A varivel dependente, atividade enzimtica representada pela resposta (Y).
A equao do modelo polinomial de segunda ordem obtido por um mtodo de regresso
mltipla representada pela Equao 3.4.

2
0
1 1 1 1
k k k k
m j j jm j
j j m j
Y b b x b x x b
= = = =
= + + +
jj j
x (3.4)
Sendo: Y = atividade enzimtica
k= n de variveis independentes
x = variveis independentes
b
0
, b
j
, b
ij
, b
jj
= parmetros do modelo

Com a equao emprica da regresso mltipla possvel construir uma
superfcie de resposta que permite verificar a existncia de uma regio tima para a
atividade enzimtica onde se encontra uma faixa de combinao das variveis em
questo, alm de fornecer informaes sobre a robustez do processo, ou seja, qual a

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________53
variao de uma varivel que pode ser admitida ao redor do valor timo que mantm o
processo na condio otimizada.
A esta equao foram aplicados os resultados experimentais obtidos e feita
uma avaliao estatstica da estimao dos parmetros por meio dos valores de t de
Student para cada um, sendo eliminados aqueles com nvel de significncia (p) superior
a 10%, ou seja, as variveis relacionadas a estes so consideradas no relevantes quando
(p) superior a 10%. Assim os parmetros no significativos so eliminados, obtendo-se
assim, uma equao que representa os efeitos das variveis em determinado estudo.
Pode-se ainda, prever qual a melhor condio para este processo. O valor do coeficiente
de determinao (R
2
) e a comparao entre F calculado e F tabelado foram utilizados
para constatao da significncia ou no do modelo conforme descrito por
RODRIGUS & IEMMA (2005).
Com o objetivo de encontrar o valor do ponto estacionrio da resposta
estudada deriva a equao da resposta Y pela varivel X
k
, isto :
1 2
... 0
k
Y Y Y
X X X

= = = =

(3.5)
Sendo, Y = b
0
+ xb + xBx (3.6)
' '
0
2 0
y
b x b x Bx b Bx
x x

= + + = +


= (3.7)
Sendo: b
0
o termo independente;
xb so os termos de 1. ordem na funo de resposta;
xBx a contribuio quadrtica.

Ento, o ponto estacionrio ser dado por: x
0
= - (1/2) B
-1
b, onde B a matriz
(k x k) na qual a diagonal composta pelos coeficientes dos termos quadrticos da
equao e os termos fora da diagonal so correspondentes aos coeficientes das
interaes divididos por 2 (ex: a
12
e a
21
correspondem a metade do coeficiente da
interao X
1
X
2
). A matriz b uma matriz coluna composta pelos coeficientes
associados s variveis isoladas (variveis lineares).
O ponto estacionrio (x
0
) pode ser:
Um ponto onde a superfcie atinge um mximo;
Um ponto onde a superfcie atinge um mnimo, ou

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________54
Um ponto nem de mximo, nem de mnimo Ponto de sela (saddle
point).
Para determinar a natureza desse ponto estacionrio foi necessrio fazer uma
anlise cannica, que considera uma translao da superfcie de resposta da origem (X
1
,
X
2
, ... , X
k
) = (0, 0, ... , 0) para o ponto estacionrio x
0
(Figura 3.3). Da a funo de
resposta formulada em termos de novas variveis, w
1
, w
2
, ... , w
k
.







Figura 3.3 Translao da superfcie de resposta da origem para o ponto
estacionrio.
X
W
1
W
2
X
0
X

Ento, obtm-se a funo de resposta em termos das novas variveis:
2 2
0 1 1 2 2
...
k k
Y y w w w = + + + +
2
(3.8)
Sendo: y
0
: a resposta estimada no ponto estacionrio e,

1
,
2
, ... ,
k
so as razes caractersticas

Os sinais dos s e a grandeza dos s ajudam a determinar a natureza do ponto
estacionrio e, a relao entre os ws e os xs tambm so importantes, pois indicam ao
pesquisador regies teis para explorao.
Se i < 0, sendo i = 1,2,...,k, quando movimentamos em qualquer direo a
partir do ponto estacionrio, teremos um decrscimo de Y, isto , o ponto estacionrio
x
0
um ponto de resposta mxima da superfcie ajustada. Se i > 0, o ponto estacionrio
x
0
um ponto de mnimo para a superfcie ajustada e, se os s tm sinais diferentes, o
ponto estacionrio x
0
no nem ponto de mximo, nem de mnimo.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________55
A obteno dos pontos estacionrios e a anlise cannica dos dados para
clculo dos pontos de maximizao das respostas foram realizados utilizando um
algoritmo implementado no software Maple VIII (Anexo 1).
3.2.5 Influncia da Temperatura e do pH na Atividade de Invertase Livre.

Com o objetivo de determinar as melhores condies operacionais no processo
de hidrlise de sacarose com invertase solvel foi realizado um Planejamento Composto
Central (PCC) com duas variveis (temperatura e pH), totalizando 11 ensaios, 2
2
ensaios
para investigao de um modelo linear, 3 rplicas centrais e 4 ensaios distribudos
rotacionalmente (pontos axiais) a uma distncia do ponto central, apresentados na
Tabela 3.1. O valor do ortogonal foi de 1,1474.
A atividade enzimtica foi obtida pelo mtodo das taxas iniciais de reao de
hidrlise de sacarose, conforme o item 3.2.3, num mini-reator de mistura, item 3.1.3,
contendo 100 mL de sacarose a 50 g/L, e concentrao de invertase de 0,01 g/L. Os
experimentos com a enzima solvel, foram realizados com tampo acetato na faixa de
pH 2,8 6,2 , no intervalo de temperatura de 27 73C.

Tabela 3.1 Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito
da temperatura e do pH na atividade enzimtica da invertase livre.
Experimentos Valor real (valor codificado)
Temperatura (C) pH
1 30 (-1) 3,0 (-1)
2 30 (-1) 6,0 (1)
3 70 (1) 3,0 (-1)
4 70 (1) 6,0 (1)
5 27 (-) 4,5 (0)
6 73 (+) 4,5 (0)
7 50 (0) 2,8 (-)
8 50 (0) 6,2 (+)
9 50 (0) 4,5 (0)
10 50 (0) 4,5 (0)
11 50 (0) 4,5 (0)

As equaes de codificao para a temperatura e pH so Equaes 3.9 e 3.10,
respectivamente.
20
50
1

=
T
X (3.9)
5 , 1
5 , 4
2

=
pH
X (3.10)

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________56
Aps obtidos os resultados dos experimentos , estes foram analisados por
superfcie de resposta e por anlise cannica, conforme item 3.2.4.

3.2.6 Estabilidade da Enzima Livre em Relao ao pH

O procedimento experimental consistiu em preparar solues de invertase a 0,8
g/L utilizando tampo acetato 10
-1
M para a faixa de pH 3,0 6,0 em intervalos de pH
0,5 e utilizando tampo citrato-fosfato 10
-1
M para a faixa de pH 6,5 8,0 em intervalos
de pH 0,5. Essas solues foram mantidas em um banho termostatizado 25C durante
24 horas. Aps esse perodo determinou-se as taxas iniciais de reao de hidrlise de
sacarose para cada soluo de invertase no referido pH (atividade residual), seguindo os
procedimentos do item 3.2.3. As condies reacionais foram: concentrao inicial de
sacarose 50 g/L, 30C (temperatura que apresenta alta estabilidade trmica, mantendo
atividade constante durante todo o experimento), pH 4,5 (condio de pH sugerida pelo
fabricante), onde adicionou-se 1,25 mL das solues de invertase previamente
incubadas, resultando em 0,01 g/L de invertase no meio reacional. As atividades
relativas foram obtidas pela relao entre as atividades residuais e a atividade inicial,
antes da incubao.

3.2.7 Estabilidade Trmica da Enzima Livre

Solues de invertase a 2 g/L em tampo acetato pH 4,5, foram introduzidas
em um banho termostatizado em temperaturas na faixa de 54 66C e amostras das
mesmas foram retiradas em intervalos adequados de tempo, para a determinao da
atividade residual. Estas amostras foram resfriadas rapidamente em banho de gelo e a
seguir 0,5 mL das mesmas foram adicionadas a 100 mL de soluo de sacarose a 50g/L,
resultando em uma concentrao de invertase de 0,01 g/L, pH 4,5 na temperatura de
30C para determinar as taxas iniciais da reao de hidrlise de sacarose conforme
metodologia descrita no item 3.2.3
Os resultados de atividade enzimtica em funo do tempo de incubao
obtidos foram analisados pelo modelo de desativao de primeira ordem e pela
modelagem de desativao enzimtica em srie com dois estgios, realizando regresses
no-lineares aplicadas s Equaes 3.11, 3.12 e 3.13, para determinar os melhores
ajustes e os parmetros cinticos.

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________57

1 2 1 2
1 2
k k
E E E


( )
1
A
e
Ao
k t
=
(3.11)
( )
1
1
(1 ).
A
e
Ao
k t
1

= + (3.12)
( ) (
1 1 2 2 1 1 2 2
2
2 1 2 1 2 1 2 1
1 2
1
k t k t
k k k k A
e e
Ao k k k k k k k k


= + +



)

(3.13)
Sendo:
0
A
A
= atividade relativa

1
=
1
E
E

2
=
2
E
E

k
1
e k
2
= constantes cinticas

Os tempos de meia vida foram determinados para cada temperatura,
considerando o melhor ajuste dos dados experimentais s Equaes desativao trmica
em srie e a energia de ativao do processo de desativao trmica foi calculada pela
regresso linear da equao de Arrhenius (3.15).
( )

ln 0, 5
d
t
k
= (3.14)
( ) ( )
1
ln ln
a
d
E
k A
R T
= (3.15)
Sendo: k
d
= constante cintica de desativao trmica (corresponde ao valor de k
1
na
Equao 3.11).
A = fator de freqncia para a reao
E
a
= energia de ativao do processo de desativao trmica
T = temperatura absoluta.






Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________58
3.2.8 Influncia da Concentrao Inicial de Sacarose na Atividade de Invertase
Livre

Determinou-se as taxas iniciais de reao, conforme descrito no item 3.2.3, a
30C, em tampo acetato pH 4,5, usando concentraes iniciais de sacarose varivel de
2 a 500 g/L. As amostras retiradas do reator para medir a concentrao de acar
redutor era diluda sempre que necessria para que no ultrapassasse o limite
correspondente a 1,0 g/L de acar redutor e tomando sempre o intervalo linear de
concentrao de redutores em funo do tempo de reao.
O modelo cintico de inibio pelo substrato, Equao 3.16, foi ajustado aos
resultados experimentais de taxas iniciais de reao em funo da concentrao de
substrato, sem adio de produtos da reao, por meio de regresso no linear utilizando
o software Statistic 7.0, o que permitiu clculo dos parmetros e a anlise da qualidade
do ajuste.
2
.
m
m
i
v
V S
S
K S
K
=
+ +
(3.16)
Sendo: v = velocidade da reao
V
m
= velocidade mxima da reao
S = concentrao de substrato
K
m
= constante de Michaelis Menten
K
i
= constante de inibio

3.2.9 Imobilizao da Invertase

3.2.9.1 Escolha das Resinas para a Imobilizao de Invertase

As resinas foram escolhidas a partir de testes como suporte para imobilizao
de invertase pelo mtodo de adsoro.
As resinas Dowex Marathon A e C da Dow Chemical Company e as resinas
Duolite A-568 e Duolite S-761, da Rohm Hass, inicialmente foram ativadas de acordo
com recomendaes do fabricante e a reativao das resinas foi pelo mesmo processo de
ativao.
A resina Dowex Marathon A, foi ativada com seis volumes de hidrxido de
sdio 3% por volume de leito de resina. A Dowex Marathon C, a qual um trocador

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________59
catinico fortemente cido, foi ativada com cinco volumes de cido sulfrico 5% por
volume de leito de resina.
A resina Duolite A-568 e a resina Duolite S-761 foram ativadas com uma
soluo de cido clordrico 1M, seguido de hidrxido de sdio 1M e lavado com gua
destilada. Em todas as etapas utilizou se 10 volumes de soluo por volume de resina.
Aps a ativao das resinas foram realizados testes preliminares de
imobilizao de invertase. Em todos estes experimentos, incubou-se 10 mL de uma
soluo de invertase 1g/L em tampo acetato pH 3,5, com 1,0 g de resina, durante 24
horas, sob agitao de 45 rpm 27C em mesa agitadora. Aps a imobilizao, as
resinas eram lavadas com tampo acetato pH 4,9 e utilizadas para determinao de
atividade enzimtica, pelo mtodo das taxas iniciais de reao, item 3.2.3, com soluo
de sacarose 50g/L, pH 4,9 40C.
A eficincia de imobilizao na resina foi determinada pela atividade da
invertase imobilizada (A
I
), medida pelo mtodo das taxas iniciais, e pelo ndice de
adsoro, calculado pela Equao 3.17, respectivamente:
TPA STP
IA
TPA

= (3.17)
Sendo: IA o ndice de adsoro;
TPA o teor de protena antes da imobilizao
STP o total de protena no sobrenadante depois da imobilizao.

3.2.9.2 Influncia do Tempo no Processo de Imobilizao

Uma vez que Duolite A-568 foi o suporte que apresentou melhor reteno de
atividade enzimtica no processo preliminar de imobilizao, a seqncia do trabalho
foi conduzida com esta resina.
Amostras de 0,5g da resina Duolite A-568 ficaram imersas em soluo de
invertase 10g/L, em tampo acetato a pH 3,5 e 27C por tempos de imobilizao iguais
a: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 18, 24, 27 e 40 horas. Aps estes tempos de imobilizao
determinou-se as taxas iniciais de reao das respectivas amostras, conforme item 3.2.3,
a 30C, pH 4,5 e soluo de sacarose 50 g/L, visando determinar o tempo timo para a
imobilizao de invertase na resina.



Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________60
3.2.9.3 Influncia da Temperatura, do pH e da Concentrao de Enzima no Meio
de Imobilizao

Aps um tempo de imobilizao de 24 horas no houve aumento significativo
de reteno de atividade imobilizada e este foi escolhido como tempo de imobilizao
para o restante do trabalho.
O estudo da influncia simultnea das variveis concentrao de enzima, pH
do meio e temperatura no processo de imobilizao foi realizado por um Planejamento
Composto Central (PCC) com trs rplicas centrais, totalizando 17 experimentos,
utilizando-se o software Statistica 7.0. A temperatura variou de 9 a 45C, o pH de 3,0 a
7,0 e a concentrao de enzima de 0,5 a 19,5 g/L. Foram utilizados os tampes acetato
10
-1
M na faixa de pH 3,0 a 5,0 e citrato-fosfato 10
-1
M 6,5 a 7,0 dependendo do pH
utilizado no experimento. O de ortogonalidade utilizado no planejamento foi de
1,3531 e as Equaes de codificao foram 3.18, 3.19 e 3.20, para temperatura, pH e
concentrao de invertase, respectivamente.
1
27
13
T
X

= (3.18)
2
5, 0
1, 5
pH
X

= (3.19)
3
. 10
7
Conc
X

= (3.20)
A imobilizao foi realizada incubando 10 mL de uma soluo de invertase a
10g/L, com 0,5 g de resina, durante 24 horas, nas condies definidas pelo PCC, Tabela
3.2, sob agitao de 60 rpm em mesa rotatria.
















Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________61
Tabela 3.2 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito
da temperatura, do pH e da concentrao da enzima na imobilizao de invertase na
resina Duolite A-568.
Experimentos Valor real (valor codificado)
Temperatura (C) pH Concentrao de invertase (g/L)
1 14 (-1) 3,5 (-1) 3,0 (-1)
2 14 (-1) 3,5 (-1) 17,0 (1)
3 14 (-1) 6,5 (1) 3,0 (-1)
4 14 (-1) 6,5 (1) 17,0 (1)
5 40 (1) 3,5 (-1) 3,0 (-1)
6 40 (1) 3,5 (-1) 17,0 (1)
7 40 (1) 6,5 (1) 3,0 (-1)
8 40 (1) 6,5 (1) 17,0 (1)
9 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0)
10 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0)
11 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0)
12 9 (-) 5,0 (0) 10,0 (0)
13 45 (+) 5,0 (0) 10,0 (0)
14 27 (0) 3,0 (-) 10,0 (0)
15 27 (0) 7,0 (+) 10,0 (0)
16 27 (0) 5,0 (0) 0,5 (-)
17 27 (0) 5,0 (0) 19,5(+)

Aps a imobilizao, os biocatalisadores obtidos foram lavados com tampo
acetato pH 4,5 e utilizados para determinao de atividade pelo mtodo das taxas
iniciais a 30C, pH 4,5 e soluo de sacarose 50 g/L.
As condies de imobilizao para os estudos subseqentes correspondem s
condies timas encontradas neste planejamento composto central.

3.2.9.4 Influncia do pH e Temperatura na Atividade da Enzima Imobilizada em
Duolite A-568

O biocatalisador obtido nas condies de imobilizao otimizadas
anteriormente foi utilizado para estudar o efeito conjunto da temperatura e do pH na
atividade da enzima imobilizada por um Planejamento Composto Central (PCC) com
trs rplicas centrais, conforme Tabela 3.3. A atividade enzimtica foi obtida pelo
mtodo das taxas iniciais de reao de hidrlise de sacarose, num minireator de mistura
contendo 100 mL de sacarose a 50 g/L, pH 4,5 a 30C. Os experimentos foram
realizados utilizando o tampo acetato com pH varivel entre 2,7 a 5,1, e no intervalo de
pH varivel entre 7,0 a 7,5 utilizou-se tampo citrato-fosfato. O efeito da temperatura

Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________62
foi analisado para temperaturas variveis entre 13 a 74C e o ortogonal utilizado foi
de 1,1474.

Tabela 3.3 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito
da temperatura e do pH na atividade de invertase imobilizada na resina Duolite A-
568.
Experimentos Valor real (valor codificado)
Temperatura (C) pH
1 17 (-1) 3,0 (-1)
2 17 (-1) 7,2 (1)
3 70 (1) 3,0 (-1)
4 70 (1) 7,2 (1)
5 13 (-) 5,1 (0)
6 74 (+) 5,1 (0)
7 44 (0) 2,7 (-)
8 44 (0) 7,5 (+)
9 44 (0) 5,1 (0)
10 44 (0) 5,1 (0)
11 44 (0) 5,1 (0)

As equaes de codificao da temperatura e do pH so apresentadas nas
Equaes 3.21 e 3.22, respectivamente.
1
43, 5
26, 5
T
X

= (3.21)
2
5,1
2,1
pH
X

= (3.22)
Os resultados experimentais foram analisados conforme item 3.3.4, que
permitiram determinar os valores timos de pH e de temperatura, os quais foram
utilizados nos estudos cinticos.

3.2.9.5 Eficincia da Enzima Imobilizada em Relao ao Nmero de Usos

Amostras de 0,5g do biocatalisador imobilizado em Duolite A-568 sob
condies timas j determinadas foram lavadas com tampo acetato pH 4,9 e
determinadas as taxas iniciais de reao de hidrlise de sacarose pelo mtodo descrito
no item 3.2.3 sob as seguintes condies: temperatura 40C, pH 4,9 (condies timas
encontrada no item 3.2.9.4) e concentrao inicial de sacarose 50 g/L. O experimento
foi repetido 17 vezes e calculada a atividade relativa em relao atividade inicial.


Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________63
3.2.9.6 Estabilidade da Enzima Imobilizada em Relao ao pH

Primeiramente imobilizou-se invertase em Duolite A-568 nas condies timas
definidas no item 3.2.9.3. A enzima imobilizada era lavada e incubada em 10 mL de
tampo, utilizando tampo acetato 10
-1
M para a faixa de pH 3,0 6,0 em intervalos de
0,5 e utilizando tampo citrato-fosfato 10
-1
M para a faixa de pH 6,5 8,0 em intervalos
de 0,5. Essas solues enzimticas foram mantidas em banho termostatizado 25C
durante 24 horas. Aps esse perodo, os biocatalisadores foram lavados com tampo
acetato 4,9 e colocadas na cesta de ao inox e determinada a atividade residual com uma
soluo de sacarose 50 g/L, pH 4,9 temperatura de 40C. A atividade relativa para
cada valor de pH foi determinada pela relao entre a atividade residual e a atividade
antes da incubao.

3.2.9.7 Estabilidade Trmica da Enzima Imobilizada

Amostras de 0,1g do biocatalizador imobilizado nas condies timas
encontradas no item 3.2.9.3 foram lavadas com tampo acetato pH 5,75 (pH de maior
estabilidade) e misturadas com 5 mL do mesmo tampo e incubados em vrias
temperaturas em um banho termostatizado.
A temperatura de cada incubao variou na faixa de 51 a 63C, e as amostras
foram retiradas em intervalos adequados de tempo, resfriadas rapidamente em banho de
gelo, transferidas para a cesta de ao inox e determinada a atividade residual no reator
usando 100 mL de soluo de sacarose a 50 g/L, pH 5,5 na temperatura de 40C.
Os resultados de atividade enzimtica obtidos foram analisados pela
modelagem em srie, utilizando as Equaes 3.11, 3.12 e 3.13 por meio de regresses
no-lineares para determinar os melhores ajustes e os parmetros cinticos.
Os tempos de meia vida foram determinados para cada temperatura,
considerando o melhor ajuste dos resultados experimentais s Equaes de desativao
trmica em srie (Equaes 3.11, 3.12 e 3.13) e a energia de ativao do processo de
desativao trmica foi calculada pela regresso linear da equao de Arrhenius (3.15).





Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________64
3.2.9.8 Influncia da Concentrao Inicial da Sacarose na Atividade de Invertase
Imobilizada

A enzima imobilizada segundo as condies timas determinadas no
item.3.2.9.3, foi lavada com tampo acetato pH 5,75 e transferida para a cesta de ao
inox, determinando-se a seguir as taxas iniciais de reao, conforme descrito no item
3.2.3., a 40C, pH 5,5, usando concentraes de sacarose variando entre 2 a 500 g/L.
Os resultados de taxas iniciais assim obtidos foram ajustados ao modelo de
inibio pelo substrato (Equao 3.16) e determinados os parmetros cinticos por meio
de uma regresso no linear.

3.2.9.9 - Influncia da Concentrao Inicial de Glicose e Frutose na Atividade de
Invertase Imobilizada

Analisou-se a influncia dos produtos da reao na hidrlise de sacarose em
diferentes concentraes de sacarose, glicose e frutose no meio reacional, conforme
Tabela 3.4. A determinao das taxas iniciais de reao foi realizada nas condies
timas definidas no item 3.2.9.4 em pH 5,5 e a imobilizao de invertase na resina
Duolite A-568 seguiram as melhores condies de imobilizao do item 3.2.9.3.
Os resultados experimentais de taxa inicial de reao foram ajustados aos
modelos cinticos de Inibio competitiva (Equao 3.23), Inibio no competitiva
(Equao 3.24), Inibio acompetitiva (Equao 3.25), Inibio mista linear (Equao
3.26) e Inibio parcialmente no competitiva (Equao 3.27).
Inibio Competitiva
.
. 1
m
m
i
v
V S
I
S K
K
=







+ +
(3.23)
Inibio No Competitiva
.
* 1 * 1
m
m
i i
V S
v
I I
K S
K K







=
+ + +
(3.24)




Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________65
Inibio Acompetitiva
.
. 1
m
m
i
V S
v
I
K S
K







=
+ +
(3.25)
Inibio Mista Linear
.
. 1 . 1
m
m
i i
V S
v
I I
K S
K K







=
+ + +

(3.26)
Inibio Parcialmente No Competitiva
. 1
. 1
m
i
m
i
I
V S
K
v
I
K S
K











+
=
+ +
(3.27)































Captulo 3 Materiais e Discusso________________________________________66
Tabela 3.4 Condies experimentais para o estudo da influncia dos produtos
da reao na taxa de hidrlise.
Ensaios
Sacarose
(g/L)
Glicose
(g/L)
Frutose
(g/L) Ensaios
Sacarose
(g/L)
Glicose
(g/L)
Frutose
(g/L)
1 20 0 0 32 20 0 5
2 20 5 0 33 20 0 10
3 20 10 0 34 20 0 15
4 20 15 0 35 20 0 20
5 20 20 0 36 20 0 25
6 20 25 0 37 40 0 0
7 40 0 0 38 40 0 5
8 40 5 0 39 40 0 10
9 40 10 0 40 40 0 15
10 40 15 0 41 40 0 20
11 40 20 0 42 40 0 25
12 40 25 0 43 60 0 0
13 60 0 0 44 60 0 5
14 60 5 0 45 60 0 10
15 60 10 0 46 60 0 15
16 60 15 0 47 60 0 20
17 60 20 0 48 60 0 25
18 60 25 0 49 80 0 0
19 80 0 0 50 80 0 5
20 80 5 0 51 80 0 10
22 80 15 0 53 80 0 20
23 80 20 0 54 80 0 25
24 80 25 0 55 100 0 0
25 100 0 0 56 100 0 5
26 100 5 0 57 100 0 10
27 100 10 0 58 100 0 15
28 100 15 0 59 100 0 20
29 100 20 0 60 100 0 25
30 100 25 0
31 20 0 0

A partir dos resultados obtidos dos ajustes de parmetros foi possvel analisar o
modelo que melhor descreve a influncia dos produtos, glicose e frutose, na reao
enzimtica da invertase imobilizada.








CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Atividade da Invertase usada no Trabalho

Por meio dos resultados de taxas iniciais de reaes de hidrlise de sacarose,
determinados em quadruplicata conforme item 3.2.3, obtidos a 30C, usando como
substrato uma soluo de sacarose de concentrao 50g/L, em tampo acetato, pH 4,5
obteve-se uma atividade mdia de 4,06 U
S
(grama de acar redutor produzido por litro,
por minuto, por grama de invertase em p comercial).
O teor de protena determinado pelo mtodo de Lowry conforme o item 3.2.2,
foi de 15% de protena na enzima em p comercial.
4.2 Influncia da Temperatura e do pH na Atividade de Invertase Livre

Os resultados da influncia simultnea do pH e da temperatura na atividade
enzimtica de invertase solvel, definidos pelo Planejamento Composto Central
conforme item 3.2.5, esto representados na Tabela 4.1.
A Tabela 4.1 Matriz com resultados obtidos para avaliar a influncia da
temperatura e pH.
Experimentos Valor real (valor codificado) Atividade enzimtica (U
S
)
Temperatura (C) (x
1
) pH (x
2
)
1 30 (-1) 3,0 (-1) 6,95
2 70 (1) 3,0 (-1) 2,15
3 30 (-1) 6,0 (1) 5,09
4 70 (1) 6,0 (1) 0,06
5 50 (0) 4,5 (0) 18,04
6 50 (0) 4,5 (0) 19,69
7 50 (0) 4,5 (0) 18,58
8 27 (-) 4,5 (0) 7,66
9 73 (+) 4,5 (0) 0,18
10 50 (0) 2,8 (-) 3,01
11 50 (0) 6,2 (+) 15,12

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________68
A atividade enzimtica alcanada durante os experimentos variou de 0,06 U
S
,
na temperatura de 70C e pH 6,0, a 19,69 U
S
no ponto mdio do planejamento
composto central, onde esto as maiores atividades alcanadas nos ensaios do PCC.
De acordo com a literatura a atividade e estabilidade das enzimas so muito
sensveis a ao da temperatura, desta forma valores altos de temperatura implicaram
em desnaturao da enzima como pode ser constatado nos resultados de atividade dos
experimentos 2, 4 e 9.
Com os resultados experimentais de atividade enzimtica em funo do pH e
temperatura realizou-se uma regresso mltipla e analisou os valores de p encontrados
pelo teste t- Student, onde X
1
representa a temperatura e X
2
representa o pH. Esto
representados na Tabela 4.2 os parmetros lineares (L), as interaes e os termos
quadrticos (Q) das duas variveis estudadas.
Tabela 4.2 Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC.
Utilizando os resultados da atividade enzimtica apresentados na Tabela 4.1,
aps a re
1 2
(4.1)

modelo com as variveis significativas codificadas est representado na
Equao ajustada 4.2.
Fatores Coeficiente
de
regresso
Erro
Padro
p-valor
Mdia 18,1199 2,1614 0,0003
X
1
(L) -2,775 1,530 0,129
X
1
(Q) -9,702 2,117 0,0059
X
2
(L) 1,149 1,530 0,372
X
2
(Q) -5,794 2,117 0,040
X
1
X
2
-0,057 1,970 0,977


alizao da regresso mltipla no programa Statistica 7.0, obteve-se a Equao
4.1 completa com todos os parmetros:

2 2
1 2 1 2
18,1199 2, 775. 1,149. 9, 702. 5, 794. 0, 057. Atividade X X X X X X = +
O

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________69
2 2
1 1 2
18,1199 2, 775. 9, 702. 5, 794. X X X = (4.2)
O coeficiente
Atividade
de determinao (R
2
) de 0,84 indica um ajuste adequado dos
dados experimentais na obteno da atividade de enzi
84% da
ado de F calculado
(F
calc
) fo
dos.
ma imobilizada, mostrando que
variabilidade dos dados foram explicadas pela Equao 4.2.
Realizando a anlise de varincia (ANOVA) visualizada na Tabela 4.3,
verifica-se que o F
calc
foi altamente significativo (p<0,004). O result
i superior ao F tabelado (F
T
) para um nvel de significncia de 10%. Esses
resultados indicam uma boa concordncia entre os valores experimentais e previstos
pelo modelo, expressos na Figura 4.2.
Tabela 4.3 ANOVA para a resposta de atividade enzimtica.
F
T
= F
3; 7; 0,1
=3,07
A Figura 4.1 mostra a distribuio dos resduos em torno do zero e a Figura
4.2, a representao dos valores preditos em funo dos observa

Figura 4.1 Distribuio dos resduos relativa atividade enzimtica.

variao quadrados
s de
liberdade
Quadrado
mdio
F
calc
P - valor Fonte de Soma de Grau
Regresso 493,8654 3 164,62 12,44 0,003
Resduos 92,6132 7 13,23
Total 586,4787


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________70

Figura 4. o para a
resposta de atividade enzimtica.
Observando a Figura 4.1, v-se que a distribuio dos resduos comportou-se
aleatoriamente em torno do zero, no apresentando nenhuma tendncia quanto
distribuio. Na Figura 4.2, nota-se que as respostas experimentais obtidas para
atividade enzimtica apresentaram valores prximos aos fornecidos pela equao
emprica.
O modelo foi significativo, assim foi possvel construir uma superfcie de
resposta para analisar a regio de interesse. A superfcie esta representada na Figura 4.3.
2 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo model

Figura 4.3 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade enzimtica de invertase livre.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________71
Observa-se pela superfcie de resposta que para uma faixa de temperatura e pH
prximos ao ponto central do PCC, a atividade enzimtica obtida mxima. Assim a
faixa de temperatura que alcana a mxima atividade est entre 39 a 55C e o intervalo
de pH est compreendido entre 3,7 a 5,1.
Na maioria dos trabalhos citados na literatura a faixa de temperatura e pH
timos est prxima deste trabalho. No trabalho de BAGAL & KARVE (2006), as
influncias da temperatura e do pH foram analisadas isoladamente uma da outra, mas
mesmo assim obtiveram resultados prximos aos deste estudo. A faixa de temperatura
que resultou em alta atividade ficou compreendida entre 30 e 50C e o pH 4,5 foi o
responsvel pela maior atividade enzimtica.
A
en ealizou-se uma anlise cannica utilizando a
equao
igual a 18,21 U
S
.
po acetato para o estudo de pH no intervalo de 3,0 a
6,0 e o t
po pH 4,5 (condies
fim de obter o ponto estacionrio que maximiza a resposta de atividade
zimtica no processo de imobilizao, r
completa (Equao 4.1). Implementou-se um algoritmo no programa Maple
VIII para calcular o ponto estacionrio de obteno da mxima atividade enzimtica. As
variveis das coordenadas X
1
= -0,15 e X
2
= 0,13, representam os valores codificados
que maximizam a resposta.
Utilizando as equaes de codificao (3.9) e (3.10) obtm-se os valores reais
das concentraes das variveis no ponto de maximizao da atividade enzimtica,
sendo a temperatura (X
1
) igual a 47C e o pH (X
2
) igual a 4,7.
Para a validao do modelo, foi realizado experimentos nas condies do
ponto timo encontrado e a atividade obtida pelo ensaio foi de 17,38 U
S
, sendo a
atividade prevista pelo modelo (Equao 4.2)

4.3 Estabilidade de Invertase Livre em Relao ao pH

A influncia do pH na estabilidade de invertase solvel foi estudada,
incubando-se amostras de soluo de invertase com atividade conhecida, em solues
tampo 10
-1
M, a 25C durante 24 horas, a valores de pH na faixa de 3,0 a 8,0, com
intervalos de 0,5. Utilizou-se o tam
ampo citrato-fosfato para pH 6,5 a 8,0. Aps 24 horas, foram determinadas
suas atividades residuais a 30C (condio de temperatura que garante alta estabilidade
trmica), utilizando soluo de sacarose 50 g/L em tam

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________72
recomendada pelo fabricante). Na Figura 4.4 so representadas as atividades relativas,
A/A
0
, definidas pela relao entre a atividade aps 24 horas de incubao e a inicial.

1,0
2 3 4 5 6 7 8 9
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a

A
/
A
o
pH

Figura 4.4 Influncia do pH na estabilidade de invertase solvel.

Verifica-se pela Figura 4.4 um aumento da estabilidade de invertase solvel
para pH variando de 3,0 a 5,5, no perdendo atividade entre pH 5,5 at 7,5 e a partir
desse ponto, com o aumento do pH houve um decrscimo da atividade relativa. O pH
para a obteno de mxima atividade enzimtica obtida no item 4.2 foi de 4,7, prximo
a faixa de estabilidade de invertase livre.

4.4 Estabilidade Trmica de Invertase Livre

A influncia da temperatura na estabilidade da invertase solvel foi estudada
conforme a o item 3.2.7. As atividades relativas em funo do tempo de incubao, a
vrias temperaturas, esto apresentadas na Figura 4.5.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________73
0 50 100 150 200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
t
i
v
i
d
a
Tempo (min)
66C
63C
60C
57C
54C
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a

(
A
/
A
o
)

Figura 4.5 Atividade relativa (A/Ao), em funo do tempo, para as
temperaturas estudadas.

Uma anlise da Figura 4.5 evidencia a forte dependncia da estabilidade
trmica da enzima solvel com a temperatura. Temperaturas maiores que 60C
implicam em rpida desnaturao da protena enzimtica.
Os resultados de atividade relativa em funo do tempo de incubao s vrias
temperaturas estudadas foram analisados segundo um modelo de desativao em srie
seguir:
com dois estgios (HENLEY e SADANA, 1985), conforme modelo apresentado a
1 2 1 2
1 2
k k
E E E


As Equaes 3.11, 3.12 e 3.13 so representativas do mecanismo de
desativa
s por uma regresso no-linear pelo mtodo Quasi-Newton (BISHOP, 1975) e
Levenberg-Marquardt (MOR, 1977) utilizando o software Statistica 7.0 e na Tabela
4.4 esto os resultados do melhor ajuste com os coeficientes de determinao para cada
equao
eis de significncia menores que 10%.
o dado pelo modelo acima e os seus parmetros cinticos foram ajustados por
regresso no-linear.
Para as temperaturas de 54 a 66C as Equaes 3.11, 3.12 e 3.13 foram
ajustada
, os quadrados dos desvios, com os respectivos parmetros ajustados e anlise
de significncia, utilizando o teste t-Student, adotando como parmetros significativos
os que apresentam nv





Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________74
Tabela 4.4 Ajustes dos parmetros na desativao trmica.
Temperatura 66C R
2
(V-V
modelo
)
2
Temperatura 57C R
2
(V-V
modelo
)
2
Eq. Eq.
3.11 k
1
0,37051 p 0 0,99 0,013 3.11 k
1
0,0068 p 0 0,93 0,0005
3.12 k
1
0,3986 p 0 0,98 0,032 3.12 k
1
0,0173 p 0 0,98 0,0002

1
0,0297 p 0,248
1
0,3640 p 0
3.13 k
1
-0,0839 p 0,987 0,99 0 3.13 k
1
0,0260 p 0,01 0,99 0,0004
0
1
5,8596 p 0,984
1
0,5248 p
k 0,4 50 p k 0,0 25 0,08
2
2 0
2
0 p

2
0,0421 p 0, 6 0 27
2
0,0032 p ,86
Temp 6 (V
o
)
2
m e C ( )
2
eratura 3C R
2
-V
model Te p ratura 54 R
2
V-V
modelo
Eq. Eq.
3.11 k
1
0,1210 p 0 0,98 0,157 3.11 k
1
0,0043 p 0 0,90 0,049
3.12 0,99 0,016 3.12 0 0, 0,0 k
1
0,1380 p 0 k
1
0,0155 p ,0 98 007

1
0,0570 P 0,05
1
0,4800 p 0
3.13 0,78 3.13 0,95 0,008 k
1
0,1157 p 0,99 0 k
1
0,045 p 0,01
0
1
-0,2518 p 0,99
1
0,7166 p
k 0,1 58 p 0,99 k 0,0 23 0,02
2
1
2
0 p

2
0,087 p 0, 1 0 00
2
0,0115 p ,64
Temp 6 (V
o
)
2
eratura 0C R
2
-V
model



Eq.


3.11 k
1
0,0186 p 0 0,98 0,0086


3.12 0,99 0,0 20 k
1
0,0236 p 0 0



1
0,0900 p 0,001


3.13 0,99 0,00 002 k
1
0,029 p 0 0


7
1
0,195 p 0,17
k 0,0 38 p 0,335
2
0

2
0,031 p 0, 9 18
p valo de p d a a ise tude

r encontra o n nl de t-s nt.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________75
Pa em e d 66C mente Eq o .11 foi ajust a com
parm os a omparao entre os resultados ex erim ntais de atividade
re tiv os o e esto representados na Figura 4.6.
1,2
ra a t p ratura e so a ua 3 ad
etr signific tivos. A c p e
la a e predit s p los modelos
0 2 4 6 8 10 12
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.6 Perfil da desativao trmica na temperatura de 66C.

Analisando a Figura 4.6 verifica-se um bom ajuste entre os valores
experimentais e os tericos. O ajuste com a Equao 3.11 obteve coeficiente de
determinao igual a 0,99 e a soma dos quadrados dos desvios igual a 0,013. Os
parmetros ajustados a este modelo esto representados na Equao 4.3.
( ) 0,3705.t
A
e
Ao

=
(4.3)
coeficiente de
determinao. Os resultados experimentais e os ajustados pelos modelos esto
representados nas Figuras 4.7 e 4.8,
respectiv
Com as temperaturas 63C e 60C foi possvel ajustar as Equaes 3.11 e 3.12
com parmetros significativos, mas o melhor ajuste foi a Equao 3.12, devido ao
menor valor dos quadrados dos desvios e maior valor encontrado do
para a temperatura de 63C e 60C,
amente.
Os parmetros ajustados pelos modelos da Equao 3.12 esto representados
na Equao 4.4 para a temperatura de 63C e na Equao 4.5 para temperatura de 60C,
com coeficiente de determinao igual a 0,99 para as duas temperaturas.
( ) 0,138.
(1 0, 057). 0, 057
t
A
e
Ao

= + (4.4)

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________76
( ) 0,0236.
0, 09). 0, 09
t
e
Ao
+ (4.5) (1
A
=
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a

Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.7 Perfil da desativao trmica na temperatura de 63C.

Para as menores temperaturas analisadas neste estudo, ou seja, para as
temperaturas 57 e 54C, os resultados de atividade relativa foram ajustados s Equaes
3.11, 3.12 e 3.13, obtendo todos parmetros significativos apenas nas Equaes 3.11 e
3.12. O .13 no
significativo para nenhuma das duas temperaturas. Os ajustes dos modelos esto
represen
bserva-se na Tabela 4.4 que o parmetro
2
para a Equao 3
tados nas Figuras 4.9 e 4.10 para 57C e 54C, respectivamente. Foram
escolhidos o modelo da Equao 3.12 como os mais adequados devido aos coeficientes
de determinao 0,99 para 57C e 0,98 para 54C e aos menores valores da somatria
dos quadrados de desvios.
Os modelos com os parmetros ajustados pela Equao 3.12 esto
representados na Equao 4.6 para 57C e Equao 4.7 para temperatura de 54C.

( ) 0,0173.
(1 0, 364).
t
A
e
Ao

= + 0, 364 (4.6)
( ) 0,0155.
0, 463). 0, 463
t
e
Ao

+ (4.7) (1
A
=

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________77
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.8 Perfil da desativao trmica na temperatura de 60C.

1,1
1,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
Tempo (min)
a
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.9 Perfil da desativao trmica na temperatura de 57C.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________78
0 50 100 150 200 250
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.10 Perfil da desativao trmica na temperatura de 54C.

Observa-se que quanto maior a temperatura melhor o ajuste cintica da
Equao 3.11, enquanto as temperaturas mais baixas se ajustam melhores aos outros
modelos cinticos.
Alm disso, quanto maior a temperatura maior o parmetro da constante da
taxa de desativao trmica (k
d
), o que realmente deveria acontecer, pois de acordo com
a Equao de Arrhenius, k
d
diretamente proporcional temperatura.
Com as constantes de ativao do processo de desativao trmica dos modelos
de melhor ajuste para cada temperatura foram calculados os tempos de meia-vida,
apresentados na Tabela 4.5, pela Equao 3.11, 3.12 e 3.13.

Tabela 4.5 Tempo de meia vida para cada temperatura.
Temperatura (C) k
d
Equao do Modelo t
1/2
(min)
66 0,370 3.11 1,87
63 0,138 3.12 5,47
60 0,024 3.12 33,78
57 0,017 3.12 89,16
54 0,015 3.12 210,19

Uma regresso linear com os resultados de k
d
em funo da temperatura foi
possvel determinar a energia de ativao do processo de desativao trmica com a
equao de Arrhenius (Equao 3.15), como pode ser observado na Figura 4.11.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________79
2,94 2,96 2,98 3,00 3,02 3,04 3,06
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
l
n

(
k
d
)
1000/T (K)

Figura 4.11 Regresso linear da equao de Arrhenius.

O ajuste linear obtido alcanou uma determinao de 0,99 e est representada
na Equao 4.8.
ln( ) 53077, 24.(1/ ) 155, 65 Kd T = + (4.8)
Assim a energia de ativao encontrada foi da ordem de 360 kJ/mol ou 86
kcal/mol.

4.5 Influncia da Concentrao de Substrato na Cintica da Reao da Enzima
Livre

Os resultados experimentais de taxas iniciais de reao de hidrlise de
sacarose, com invertase livre, na ausncia de produtos de reao, so apresentados na
Tabela 4.6. Eles foram obtidos a 30C, conforme item 3.2.3, usando uma concentrao
de enzima de 0,01 g/L em tampo acetato 4,5.









Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________80
Tabela 4.6 Taxas iniciais de reao (v), em funo da concentrao inicial de
substrato (S), para invertase livre.
Experimentos Concentrao inicial sacarose (g/L) - S Taxas iniciais (U
S
) - v
1 2 4,0
2 5 7,0
3 7,5 9,0
4 10 12,0
5 15 15,0
6 20 16,0
7 30 17,0
8 40 18,0
9 45 19,0
10 50 19,0
11 55 24,0
12 60 22,0
13 70 22,0
14 75 22,0
15 90 21,0
16 100 21,0
17 150 20,0
18 200 18,0
19 250 17,0
20 300 16,0
21 350 14,0
22 450 17,0
23 500 9,0

Os resultados experimentais foram ajustados ao modelo de inibio pelo
substrato pela Equao 3.16, e os parmetros determinados por uma regresso no-
linear utilizando o software Statistica 7.0. O ajuste alcanou um coeficiente de
determinao de 98,7% e uma comparao entre os resultados experimentais e os
preditos pelo modelo obtido pode ser observado na Figura 4.12.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________81

Figura 4.12 Perfil da influncia da concentrao de sacarose na atividade da
enzima livre.

Os parmetros ajustados esto apresentados na Equao 4.9.
2
28, 917.
15, 471
363, 27
S
v
S
S
=
+ +
(4.9)
Sendo: V
m
= 28,917 U
S
= 0,0803 M
sac
/min
K
m
= 15,471 g
sac
/L = 45,2 mM
sac
K
i
= 363,27 g
sac
/L = 1,06 M
sac


Esses valores esto prximos aos valores encontrados na literatura para a
invertase livre, por exemplo, no trabalho de ISIK et al. (2003) foi encontrado um K
m
de
59mM, em 1989 RIBEIRO encontrou um K
m
de 62,3mM. BORA et al. (2004),
determinaram um K
m
de 25,91Mm e SANJAY & SUGNAN (2005), K
m
26,6mM.

4.6 Imobilizao de invertase

4.6.1 Escolha do Suporte

As resinas Dowex Marathon A e C da Dow Chemical Company e as resinas
Duolite A-568 e Duolite S-761, da Rohm Hass aps ativao, foram preliminarmente
testadas em triplicatas com relao reteno de atividade de invertase a partir de
solues da enzima conforme item 3.2.9.1.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________82
Os testes preliminares de imobilizao de invertase nas resinas citadas
anteriormente indicaram que apenas Duolite A-568 e Duolite S-761 apresentaram
atividade enzimtica imobilizada, sendo que a atividade alcanada com a primeira foi
bastante superior, como pode ser verificado na Tabela 4.7. Em funo destes resultados,
na seqncia do trabalho foi utilizado como suporte para imobilizao a resina Duolite
A-568.
A unidade utilizada para expressar atividade da invertase imobilizada U
i

(grama de acar redutor por litro, minuto, grama de resina).

Tabela 4.7 Resultados preliminares de imobilizao de invertase nas resinas
Resinas IA (%) A
I
(U
i
)
Dowex Marathon A 35,44 0,31 0
Dowex Marathon C 22,70 0,75 0
Duolite A-568 54,81 0,41 0,562 0,03
Duolite S-761 39,10 1,61 0,274 0,02

Sendo IA calculada pela Equao 3.17 e A
I
a atividade da invertase imobilizada.
A presena de adsoro de protenas pelas resinas Marathon A e C e a no
atividade enzimtica pode ser causada pela alterao da forma da enzima ou pela
adsoro da resina por protenas diferentes invertase.

4.6.2 Influncia do Tempo no Processo de Imobilizao

A influncia do tempo no processo de imobilizao de invertase na resina
Duolite A-568 apresentada na Figura 4.13, na qual verifica-se um aumento
significativo de atividade da enzima imobilizada at 24 horas. Com base nestes
resultados, todos os experimentos de imobilizao realizados neste trabalho utilizaram
um tempo de 24 horas.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________83
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo de imobilizao (h)

Figura 4.13 Influncia do tempo de imobilizao na atividade enzimtica
relativa da invertase imobilizada.

4.6.3 Otimizao do Processo de Imobilizao

Visando otimizar o processo de imobilizao de invertase na resina Duolite A-
568, foram estudadas as influncias conjuntas da temperatura (X
1
), pH (X
2
) e
concentrao de enzima (X
3
) no meio por um Planejamento Composto Central (PCC),
conforme apresentado no item 3.2.9.3. Os resultados das atividades enzimticas obtidos
esto apresentados na Tabela 4.8.










Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________84
Tabela 4.8 - Matriz com os resultados obtidos para avaliar a influncia da

temperatura, do pH e da concentrao de invertase no processo de imobilizao.
Observa-se pela Tabela 4.8 que a atividade enzimtica alcanada durante os
experim
Experimentos Valor real (valor codificado) Atividade
enzimtica (U
i
)
Temperatura C
(X
1
)
pH (X
2
) Concentrao de
invertase - g/L (X
3
)

1 14 (-1) 3,5 (-1) 3,0 (-1) 0,4822
2 14 (-1) 3,5 (-1) 17,0 (1) 2,1956
3 14 (-1) 6,5 (1) 3,0 (-1) 0,5342
4 14 (-1) 6,5 (1) 17,0 (1) 0,7618
5 40 (1) 3,5 (-1) 3,0 (-1) 0,6682
6 40 (1) 3,5 (-1) 17,0 (1) 2,3204
7 40 (1) 6,5 (1) 3,0 (-1) 1,3322
8 40 (1) 6,5 (1) 17,0 (1) 1,7288
9 9 (-) 5,0 (0) 10,0 (0) 1,9222
10 45 (+) 5,0 (0) 10,0 (0) 3,2266
11 27 (0) 3,0 (-) 10,0 (0) 1,3176
12 27 (0) 7,0 (+) 10,0 (0) 2,6404
13 27 (0) 5,0 (0) 0,5 (-) 0,4144
14 27 (0) 5,0 (0) 19,5 (+) 4,2622
15 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0) 4,5354
16 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0) 5,0254
17 27 (0) 5,0 (0) 10,0 (0) 4,9366

entos variou de 0,4144 U
i
5,0254 U
i
. Os maiores valores de atividade
alcanados foram nos ensaios do ponto central do PCC.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________85
Os resultados experimentais de atividade enzimtica imobilizada foram
ajustados por regresso mltipla. Assim, esto representados na Tabela 4.9 os termos
lineares, as interaes e os termos quadrticos das trs variveis estudadas e as
respectivas anlises do p valor encontrado, que uma conseqncia do teste t Student.
Tabela 4.9 Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC.
Aps a realizao da regresso mltipla no pro a Statistica 7.0, utilizando
os result
2
3
0, 33. 0, 041. 0, 79. 1, 01. 1, 34. 1,14.
0,18. 0, 013. 0, 34.
X X X X X X
X X X X X X
+ + +
+ +
(4.10)
Devido a grande variedade inerente aos processos bioqumicos que en
enzimas
pH/concentrao de enzima (X
2
X
3
).
Fatores Coeficiente
de
regresso
Erro
Padro
p-valor
Mdia 4,66 0,389 0,000006
X
1
(L) 0,33 0,219 0,177
X
1
(Q) -1,01 0,289 0,009
X
2
(L) 0,041 0,219 0,856
X
2
(Q) -1,34 0,289 0,002
X
3
(L) 0,79 0,219 0,008
X
3
(Q) -1,14 0,289 0,005
X
1
X
2
0,18 0,265 0,515
X
1
X
3
0,013 0,265 0,96
X
2
X
3
-0,34 0,265 0,237


gram
ados da atividade enzimtica apresentados na Tabela 4.9, obteve-se a Equao
4.10 completa:
4, 66 Atividade =
2 2
1 2 3 1 2
1 2 1 3 2 3
volvem
, foram considerados significativos os parmetros de nvel de significncia
menores que 10% (p<0,1). Observa-se na Tabela 4.9 que as variveis no significativas
do modelo foram a temperatura e o pH nos seus termos lineares (X
1
(L) e X
2
(L)), as
interaes temperatura/pH (X
1
X
2
), temperatura/concentrao de enzima (X
1
X
3
) e

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________86
O modelo ajustado com as variveis significativas codificadas est
representado na Equao 4.11.
2 2 2
3 1 2 3
4, 6598 0, 7886. 1, 018. 1, 3432. 1,147. X X X X = + (4.11)
O coeficiente de deter
Atividade
minao (R
2
) de 0,87 indica um ajuste adequado dos
dados experimentais na obteno da atividade de enzima imobilizada, mostrando que
87% da
F
calc
foi significativo (p<0,01). O resultado de F calculado (F
calc
) foi
superior
o
a resposta de atividade enzimtica.
A Figura 4.14 mostra a distribuio dos resduos em torno do zero e a Figura
4.15, a representao dos valores preditos em funo dos observados.

Fonte de
variao
Soma de quadrados Graus de
liberdade
Quadra
mdio
F
calc
P - valor
variabilidade dos dados foram explicadas pela equao empricas proposta
(Equao 4.11).
Realizando a anlise de varincia (ANOVA) visualizada na Tabela 4.10
verifica-se que o
ao F tabelado (F
T
) para um nvel de significncia de 10%. Esses resultados
indicam uma boa concordncia entre os valores experimentais e previstos pelo m delo,
expressos nas Figuras 4.14 e 4.15.

Tabela 4.10 ANOVA para
do
Regresso
37,6094 9 4,1788 7,4179 0,0075
Resduos
3,9434 7 0,5633
Total
41,5527

F
T
= F
9; 7; 0,1
= 2,72


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________87

Figura 4.14 Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade
para a resposta de atividade enzimtica.


Figura 4.15 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo
modelo para a resposta de atividade enzimtica.

Observando a Figura 4.14, verifica-se que a distribuio dos resduos
comportou-se aleatoriamente em torno do zero, no apresentando nenhuma tendncia
quanto distribuio. Na Figura 4.15, nota-se que as respostas experimentais para

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________88
obtidas para atividade enzimtica apresentaram valores prximos aos fornecidos pela
equao emprica.
Como o modelo foi significativo foi possvel construir as superfcies de
respostas, analisadas duas a duas, e definir regies de interesse. As superfcies esto
representadas nas Figuras 4.16, 4.17 e 4.18.

Figura 4.16 Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade de invertase imobilizada no processo de imobilizao de invertase em Duolite
A-568.


Figure 4.17 Superfcie de resposta da influncia da temperatura e da concentrao
de enzima na atividade de invertase imobilizada no processo de imobilizao de
invertase em Duolite A-568.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________89

Figure 4.18 Superfcie de resposta da influncia do pH e da concentrao de
enzima na atividade de invertase imobilizada no processo de imobilizao de invertase
em Duolite A-568.

Observa-se que em todas as superfcies existe uma regio correspondente
uma resposta mxima. Analisando as Figuras 4.16, 4.17 e 4.18 observa-se que a faixa de
pH e de temperatura correspondente mxima atividade esta compreendida prxima ao
ponto central, a regio de mxima atividade engloba a temperatura de 21 a 36C e o pH
de 4,2 a 5,7. Nas Figuras 4.17 e 4.18, observa-se que a regio de maior atividade
correspondente concentrao enzimtica est um pouco deslocada para a esquerda, ou
seja, engloba o ponto central e acima dele, a concentrao de invertase varia de 8,5 a
16,5 g/L na regio de mxima atividade obtida.
A fim de obter o ponto estacionrio que maximiza a resposta de atividade
enzimtica no processo de imobilizao, realizou-se uma anlise cannica utilizando a
equao completa (Equao 4.10). As variveis das coordenadas X
1
= 0,058; X
2
= 0,210
e X
3
= 0,508, representam os valores codificados que maximizam a resposta.
Utilizando as Equaes de codificao 3.18, 3.19 e 3.20 obtm-se os valores
reais das concentraes das variveis no ponto de maximizao da atividade enzimtica.
Os valores encontrados para a maximizao da atividade foram a temperatura (X
1
) igual
a 29C, o pH (X
2
) igual a 5,0 e concentrao de invertase (X
3
) igual a 12,5 g/L.
No trabalho de ARICA & BAYRAMOGLU (2006) a condio que melhor
adsorveu invertase em um suporte base de polietilenoimina foi pH 5,5, utilizando a
proporo de 52 mg de invertase por grama de catalisador a 20C.
Para a validao do modelo, foram realizados experimentos nas condies do
ponto timo encontrado e a atividade obtida pelo ensaio foi 4,606 U
i
e calculando-se a

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________90
atividade enzimtica pelo modelo da Equao 4.11, obteve-se atividade de 4,704 U
i
,
prxima da experimental.

4.6.4 Otimizao da Imobilizao em Relao Temperatura e pH

Utilizando-se as melhores condies para imobilizar invertase por adsoro na
resina fracamente bsica Duolite A-568, estudou-se as condies de temperatura e pH
que resultaria em maior atividade enzimtica, representadas por X
1
e X
2
,
respectivamente. Conforme a matriz de planejamento de experimento composto central
apresentada no item 3.2.9.4, estes foram realizados obtendo resposta para cada ensaio,
apresentada na Tabela 4.11.

Tabela 4.11 - Matriz com os resultados obtidos de atividade enzimtica de invertase

imobilizada para avaliar a influncia da temperatura e do pH.
A atividade alcanada durante os experimentos variou de 0,126 U
i
, na
temperat
Experimentos
Valor real (valor codificado) Atividade enzimtica (U
i
)
Temperatura C (X
1
) pH (X
2
)
1 17 (-1) 3,0 (-1) 2,667
2 17 (-1) 7,2 (1) 1,972
3 70 (1) 3,0 (-1) 0,233
4 70 (1) 7,2 (1) 1,400
5 13 (-) 5,1 (0) 2,200
6 74 (+) 5,1 (0) 0,126
7 44 (0) 2,7 (-) 4,382
8 44 (0) 7,5 (+) 4,000
9 44 (0) 5,1 (0) 4,623
10 44 (0) 5,1 (0) 4,062
11 44 (0) 5,1 (0) 4,905

ura mais alta do planejamento (experimento 6), 4,905 U
i
, no ponto mdio do
Planejamento Composto Central (experimento 11). As maiores atividades alcanadas
esto nos experimentos 9,10 e 11, ou seja nos ensaios do ponto mdio do PCC, observa-
se grande reprodutividade das respostas de atividade enzimtica nestes experimentos.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________91
Com as atividades obtidas pelo planejamento possvel avaliar um modelo
matemtico para descrever o processo. Assim, esto representados na Tabela 4.12 os
termos lineares, as interaes e os termos quadrticos das duas variveis estudadas
obtidos por uma regresso mltipla e os respectivos valores de p encontrados pelo teste
t- Student.
Tabela 4.12 Resultado da regresso mltipla aplicada ao PCC.
Utilizando os resultados da atividade enzimtica apresentados na Tabela 4.12,
aps a re
1 2
57 0, 812. 0, 005. 2, 624. 0, 324. 0, 465. X X X X X X + + (4.12)
O parmetro avaliado pelo teste de hiptese utilizando a estatstica t de
que apre
ariveis significativas codificadas esta representado na
Equao
1 2
0, 812. 2, 624. 0, 324. 0, 465. X X X X X + (4.13)
O coeficiente de determinao (R
2
) de 0,98 indica um a
dados ex
Fatores Coeficiente
de
regresso
Erro
Padro
p-valor
Mdia 4,557 0,182 0,000002
X
1
(L) -0,812 0,129 0,0015
X
1
(Q) -2,624 0,179 0,00002
X
2
(L) 0,005 0,129 0,9696
X
2
(Q) -0,324 0,179 0,1294
X
1
X
2
0,465 0,166 0,03840


alizao da regresso mltipla no programa Statistica 7.0, obteve-se a Equao
4.12 completa:
4, 5 Atividade =
2 2
1 2 1 2
Student
sentou nvel de significncia maior que 10% foi negligenciado, como o pH no
seu termo linear X
2
(L). Com a eliminao deste, obteve-se as seguintes relaes
apresentadas na Tabela 4.12.
O modelo com as v
4.13.
4, 557 Atividade =
2 2
1 1 2
juste adequado dos
perimentais na obteno da atividade de enzima imobilizada.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________92
Realizando a anlise de varincia (ANOVA) visualizada na Tabela 4.13,
verifica-se que o F
calc
foi altamente significativo (p<0,0001). O resultado de F calculado
(F
calc
) foi superior ao F tabelado (F
T
) para um nvel de significncia de 10%. Esses
resultados indicam uma boa concordncia entre os valores experimentais e previstos
pelo modelo, expressos na Figura 4.19 e 4.20.
Tabela 4.13 ANOVA para a resposta de atividade enzimtica.
ostra a distribuio dos resduos em torno do zero e a Figura
4.20, a r
Fonte de
variao
Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
mdio
F
calc
P - valor
Regresso
29,4924 5 5,8985 52,9967 0,000025
Resduos
0,5565 5 0,1113
Total
30,0489

F
T
= F
5; 5; 0,1
=3,45

A Figura 4.19 m
epresentao dos valores preditos versus observados.

Figura 4.19 Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a
resposta de atividade enzimtica.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________93

Figura 4.20 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo para
a resposta de atividade enzimtica.
Observando a Figura 4.19, verifica-se que a distribuio dos resduos
comportou-se aleatoriamente em torno do zero, no apresentando nenhuma tendncia
quanto distribuio. Na Figura 4.20, nota-se que as respostas experimentais obtidas
para atividade enzimtica apresentaram valores prximos aos fornecidos pela equao
emprica, com coeficiente de determinao de 98%.
O modelo foi altamente significativo, assim foi possvel construir uma
superfcie de resposta para analisar a regio de interesse. A superfcie esta
representada na Figura 4.21.

Figura 4.21 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na
atividade enzimtica de invertase imobilizada.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________94

Observa-se pela superfcie de resposta que para uma faixa de temperatura
prxima ao ponto central do PCC, para toda a faixa de pH estudada a atividade
enzimtica obtida mxima. Assim a faixa de temperatura que alcana a mxima
atividade esta entre 30,0 a 49,0C.
A fim de obter o ponto estacionrio que maximiza a resposta de atividade
enzimtica no processo de imobilizao, realizou-se uma anlise cannica utilizando a
equao completa (Equao 4.12). Implementou-se um algoritmo no programa Maple
VIII para calcular o ponto estacionrio de obteno da mxima atividade enzimtica. As
variveis das coordenadas X
1
= -0,1644 e X
2
= -0,1097, representam os valores
codificados que maximizam a resposta.
Utilizando as equaes de codificao 3.21 e 3.22 obtm-se os valores reais
das concentraes das variveis no ponto de maximizao da atividade enzimtica. Os
valores encontrados para a maximizao da atividade foram na temperatura (X
1
) de
40C e pH (X
2
) de 4,9.
No trabalho de TOMOTANI & VITOLO (2006), a temperatura e o pH timo
encontrada para invertase imobilizada na resina Dowex 1x4 foi de 45C e 5,0,
respectivamente, valores prximos aos obtidos neste trabalho. A diferena que o estudo
realizado por estes autores para otimizar os valores de temperatura e pH foram feitos
isolados, fixando um pH de 5,5 para encontrar a melhor temperatura de trabalho e
fixando uma temperatura de 37C para encontrar o pH timo.
A fim de validar o modelo, foram realizados experimentos nas condies do
ponto timo encontrado e a atividade mdia obtida pelos ensaios foi de 4,82 U
i
.
Comparando com a atividade enzimtica prevista pelo modelo utilizando os valores
codificados do ponto estacionrio na Equao 4.13 o valor obtido foi igual a 4,63 U
i
,
prximo ao dos ensaios.
O valor de pH de mxima atividade enzimtica foi praticamente o mesmo,
tanto para a enzima na forma livre, quanto imobilizada. Estes resultados contrariam
aqueles de TOMOTANI & VITOLO (2006) que imobilizaram a invertase em uma
resina aninica Dowex 1X4, e verificaram que o pH que maximizou a atividade da
enzima imobilizada foi menor que o da enzima na forma livre. Porm, a enzima
imobilizada do presente trabalho apresentou uma temperatura tima menor que a livre,

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________95
resultado que est de acordo com os resultados obtidos por TOMOTANI & VITOLO
(2006).

4.6.5 Estabilidade da Enzima Imobilizada em Relao ao Nmero de Usos

A invertase imobilizada em Duolite A-568 nas condies de imobilizao
otimizadas no item 4.6.3 foi analisada quanto estabilidade em relao ao nmero de
usos e os resultados de atividade enzimtica residual, determinados conforme item
3.2.9.5, esto representados na Figura 4.22.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
A
t
i
v
i
d
a
d
e

(
U
i
)
Nmero de usos

Figura 4.22 Perfil de atividade enzimtica em relao ao nmero de usos.


Uma anlise da Figura 4.22 indica que aps 14 processos bateladas a medida
de atividade enzimtica da enzima imobilizada reteve 90% da original, iniciando uma
queda na atividade a partir da, mantendo 87% da atividade inicial aps 17 usos.
Este comportamento da estabilidade enzimtica em relao ao pH est de
acordo com os resultados de MILOVANOVIC et al. (2006), no qual aps 40 ciclos
manteve 90% da atividade de invertase imobilizada em alginato de clcio.

4.6.6 Estabilidade de Invertase Imobilizada em Relao ao pH

A estabilidade da invertase imobilizada em relao ao pH foi analisada,
incubando-se amostras da enzima imobilizada, de atividade conhecida, em solues
tampo 10
-1
M, a 25C durante 24 horas, a valores de pH variando de 3,0 a 8,0, em

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________96
intervalos de 0,5, conforme o item 3.2.9.6. Na Figura 4.23 so representadas as
atividades relativas, A/A
0
, definidas pela relao entre a atividade aps 24 horas de
incubao e a inicial em funo do pH.

2 3 4 5 6 7 8 9
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a

(
A
/
A
o
)
pH

Figura 4.23 Influncia do pH na estabilidade de invertase imobilizada em
Duolite A-568.

Observa-se na Figura 4.23 um aumento da estabilidade de invertase
imobilizada para pH variando de 3,0 a 5,5, praticamente no perdendo atividade entre
5,5 a 6,0, uma faixa bem menor se comparada enzima livre, que se mostrou estvel na
faixa de 5,5 a 7,5. Segundo TOMOTANI & VITOLO (2006), ARICA &
BAYRAMOGLU (2006), DAVID et al. (2006), o pI (ponto isoeltrico) de invertase
situa-se na faixa de pH 3,4 a 4,5, o que significa que para valores baixos de pH h um
predomnio de cargas positivas nas molculas da enzima, facilitando o seu
desprendimento da resina. Por outro lado para valores altos de pH ocorre uma tendncia
de ligao dos grupos (OH)
-
presentes no meio na resina competindo com a ligao da
enzima na resina.
Para uso do biocatalisador imobilizado pode ser conveniente usar um pH do
meio reacional na faixa de maior estabilidade, uma vez que a influncia do pH na
atividade da enzima imobilizada pouco significativa na faixa de 2,7 a 7,5 conforme
Figura 4.21. Nos experimentos de estabilidade em relao ao pH, durante 24 horas de
incubao em pH 5,0, a atividade enzimtica residual foi de 88%, o que justifica
trabalhar na faixa de maior estabilidade.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________97
Este comportamento da estabilidade relativa ao pH, com uma faixa pequena de
estabilidade est de acordo com o trabalho de COUTINHO FILHO et al. (2005), onde a
estabilidade ficou na faixa de 4,5 a 5,0 com invertase imobilizada em slica de
porosidade controlada.

4.6.7 Estabilidade Trmica da Invertase Imobilizada

A estabilidade trmica da invertase imobilizada foi analisada conforme o item
3.2.9.7. Os resultados de atividade relativa em funo do tempo, a vrias temperaturas,
so apresentados na Figura 4.24.

0 50 100 150 200 250
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
51C
55,5C
57C
60C
63C
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a

(
A
/
A
o
)
Tempo (min)

Figura 4.24 Atividades relativas (A/Ao), em funo do tempo, para diferentes
temperaturas.

Uma anlise da Figura 4.24 evidencia a forte dependncia da estabilidade da
invertase imobilizada em relao temperatura. Temperaturas maiores que 57C
implicam em rpida desnaturao da protena enzimtica.
Os resultados de atividade relativa em funo do tempo de incubao s vrias
temperaturas estudadas foram analisados segundo um modelo de desativao em srie
com dois estgios (HENLEY & SADANA, 1985), conforme modelo mecanstico
apresentado abaixo:
1 2 1 2
1 2
k k
E E E


Os resultados de atividade relativa (A/Ao) para invertase imobilizada para as
temperaturas de 51 a 63C em funo do tempo foram ajustados s Equaes 3.11, 3.12

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________98
e 3.13 por uma regresso no-linear pelo mtodo Quasi-Newton (BISHOP, 1975) e
Levenberg-Marquardt (MOR, 1977) utilizando o software Statistica 7.0 . Os
resultados dos melhores ajustes alcanados para cada temperatura com os coeficientes
de determinao para cada equao, os quadrados dos desvios, os respectivos
parmetros ajustados e a anlise de significncia utilizando o teste t-Student, adotando
como parmetros significativos os que apresentam nveis de significncia menores que
10%, esto apresentados na Tabela 4.17.
Observa-se na Tabela 4.17 que em nenhuma das temperaturas estudadas foi
possvel ajustar a cintica de desativao segundo a Equao 3.13, com todos
parmetros significativos, o que tambm ocorreu no trabalho de COUTINHO FILHO et
al. (2005), considerando este modelo, com dois estgios intermedirios, como
representativo da desativao da invertase imobilizada em slica de porosidade
controlada.
Somente para temperaturas de 51C e 63C foi possvel ajustar a cintica
segundo a Equao 3.12, com parmetros significativos, como pode ser visualizado
pelos valores dos nveis de significncia na Tabela 4.14.



















Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________99
Tabela 4.14 Anlise da desativao trmica.
Temperatura 63C R
2
(V-V
modelo
)
2
Temperatura 55,5C R
2
(V-V
modelo
)
2
Eq. Eq.
3.11 k
1
0,182 p 0 0,99 0,0039 3.11 k
1
0,0058 p 0 0,96 0,012
3.12 k
1
0,228 p 0 0,99 0,00003 3.12 k
1
0,0014 p 0,66 0,96 0,007

1
0,063 p 0
1
-1,30 p 0,79
3.13 k
1
0,056 p 0,005 0,99 0 3.13 k
1
0,009 p 0,14 0,98 0

1
-3,342 p 0,009
1
0,906 p 0,07
k
2
0,306 p 0 k
2
0,03 p 0,57

2
0,0009 p 0,917
2
-0,012 p 0,76
Temperatura 60C R
2
(V-V
modelo
)
2
Temperatura 51C R
2
(V-V
modelo
)
2
Eq. Eq.
3.11 k
1
0,065 p 0 0,98 0,0038 3.11 k
1
0,0008 p 0 0,25 0,03
3.12 k
1
0,054 p 0 0,97 0,0064 3.12 k
1
0,023 p 0,09 0,84 0,0003

1
-0,11 p 0,205
1
0,85 p 0,05
3.13 k
1
0,0406 p 0,99 0,98 0 3.13 k
1
5,02 p 0,99 0,27 0

1
-0,593 p 0,99
1
0,9206 p 0
k
2
0,0405 p 0,99 k
2
0,0003 p 0,39

2
0,037 p 0,32
2
0,0001 p 0,99
Temperatura 57C R
2
(V-V
modelo
)
2



Eq.


3.11 k
1
0,027 p 0 0,99 0,000002


3.12 k
1
0,027 p 0,0001 0,99 0,00002



1
-0,003 p 0,9935


3.13 k
1
0,035 p 0,79 0,98 0



1
0,337 p 0,88
k
2
0,046 p 0,89



2
0,009 p 0,84
p valor de p encontrado na anlise de t-student.

Para a temperatura de 63C os ajustes alcanados com os modelos das
Equaes 3.11 e 3.12 apresentaram todos os parmetros significativos e 0,99 de

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________100
coeficiente de determinao. Os ajustes dos resultados experimentais e os previstos
pelos modelos esto representados na Figura 4.25.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (mIn)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.25 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 63C.

Analisando a Figura 4.25 e a soma dos quadrados dos desvios igual a 0,00003
verifica-se que o melhor ajuste entre os valores experimentais e tericos so obtidos
com a Equao 3.12. Os parmetros ajustados ao modelo esto representados na
Equao 4.14.
( ) 0,228.
(1 0, 063). 0, 063
t
A
e
Ao

= + (4.14)
Para as temperaturas de 60 e 55,5C os modelos cinticos das Equaes 3.12 e
3.13 no se ajustaram de maneira significativa, pois apesar dos coeficientes de
determinao serem maiores e os quadrados dos desvios serem menores os parmetros
obtidos no possuem significado fsico. O parmetro
1
e
2
so as razes especficas de
atividade
1
E
E
e
2
E
E
, respectivamente, no sendo possvel admitir valor negativo.
Assim os ajustes aos modelos cinticos, para 60 e 55,5C esto representados nas
Figuras 4.26 e 4.27, respectivamente.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________101
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a

Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.26 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 60C.

0 20 40 60 80 100 120 140
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.27 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 55,5C.

Observa-se na Figura 4.26 para temperatura de 60C um ajuste entre os valores
experimentais e tericos, com a Equao 3.11 obteve-se um coeficiente de determinao
igual a 0,98 e soma dos quadrados dos desvios igual a 0,0038. Os parmetros ajustados
a este modelo esto representados na Equao 4.15.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________102
( 0,065.t
A
e
Ao

=
)
(4.15)
Verifica-se um ajuste entre os valores experimentais na temperatura de 55,5 e
tericos com o coeficiente de determinao igual a 0,95 e com a soma dos quadrados
dos desvios igual a 0,012 ao ajuste Equao 3.11. Os parmetros ajustados a este
modelo esto representados na Equao 4.16.
( 0,0058.t
A
e
Ao

=
)
(4.16)
Comparando os resultados apresentados na Tabela 4.14 para a temperatura de
57C, para os trs tipos de cintica, observa-se que a cintica da Equao 3.11
corresponde ao melhor ajuste devido ao coeficiente de determinao igual a 0,99, ao
valor da somatria dos quadrados dos desvios igual a 0,000002 e por apresentar
parmetros significativos. Os ajustes dos modelos cinticos aos resultados
experimentais esto representados na Figura 4.28.
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)
Eq. 3.11
Eq. 3.12
Eq. 3.13

Figura 4.28 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 57C.

Os parmetros ajustados ao modelo da Equao 3.11 na temperatura de 57C
est representado pela Equao 4.17.
( 0,027.t
A
e
Ao

=
)
(4.17)


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________103
Para a temperatura de 51C o ajuste da cintica de desativao da Equao 3.11
resultou em um baixo coeficiente de determinao, observado na Tabela 4.14, igual a
0,25. Assim o possvel ajuste foi com o modelo cintico da Equao 3.12 o qual
apresentou parmetros significativos. Os ajustes aos modelos esto representados na
Figura 4.29.
0 50 100 150 200 250
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
A
t
i
v
i
d
a
d
e

R
e
l
a
t
i
v
a
Tempo (min)

Figura 4.29 - Perfil da desativao trmica na temperatura de 51C.

As atividades relativas encontradas na temperatura de 51C so, praticamente,
constantes com o tempo, por isso no ajustou a nenhuma das equaes que descrevem o
modelo de desativao trmica em srie, demonstrando ser o biocatalisador imobilizado
extremamente estvel a baixas temperaturas. Aps 4 horas de incubao da enzima
imobilizada nesta temperatura, a atividade relativa era da ordem de 90% e no
apresentava tendncia de queda.
Quanto maior a temperatura maior o parmetro da constante da taxa de
desativao trmica (k
d
), o que realmente deveria acontecer, pois de acordo com
Arrhenius k
d
diretamente proporcional temperatura.
Com as constantes de ativao do processo de desativao trmica dos modelos
que apresentaram melhor ajuste para cada temperatura foram calculados os tempos de
meia-vida, citados na Tabela 4.15, pela Equao 3.14.




Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________104
Tabela 4.15 Clculo do tempo de meia vida para cada temperatura em estudo.
Temperatura (C) k
d
Equao do
Modelo
t
1/2
(min)
63 0,228 3.12 3,33
60 0,065 3.11 10,66
57 0,027 3.11 25,67
55,5 0,0058 3.11 119,50
51 0,023* 3.12* -
* No foi possvel calcular o tempo de meia-vida pelos resultados experimentais e pelo modelo
ajustado, indicando um tempo de meia-vida alto.

Os tempos de meia-vida de invertase imobilizada foram menores do que os
tempos de meia-vida da invertase livre para as temperaturas 63, 60 e 57C. Para
temperaturas mais baixas, como a de 51C, para invertase imobilizada e 54C para
invertase solvel, a enzima imobilizada alcana alto valor no tempo de meia-vida, como
pode ser observado comparando as Figuras 4.5 e 4.24.
No trabalho de AMAYA-DELGADO et al. (2005), tanto para temperaturas
mais altas quanto para as mais baixas estudadas o tempo de meia-vida obtido para
invertase imobilizada covalentemente em Nylon-6 foi maior se comparada solvel. O
mesmo ocorreu no trabalho de DANISMAN et al. (2004) para invertase imobilizada por
ligao covalente em membranas de poli hidroxi metacrilato.
Para encontrar a energia de ativao do processo de desativao trmica
realizou-se uma regresso linear na equao de Arrhenius (Equao 3.15), utilizando as
constantes de desativao trmica dos melhores ajustes citados na Tabela 4.14, como
pode ser observado na Figura 4.30.


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________105
0,00296 0,00300 0,00304 0,00308
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
l
n
(
K
d
)
1/T (K)

Figura 4.30 Regresso linear da equao de Arrhenius.

O ajuste linear obtido alcanou uma determinao linear de 0,97 e est
representada na Equao 4.18.
ln( ) 49936.(1/ ) 146, 9
d
k T = + (4.18)
Assim a energia de ativao encontrada foi da ordem de 415 kJ/mol ou 99
kcal/mol.

4.6.8 Influncia da Concentrao de Substrato na Cintica da Reao da Enzima
Imobilizada
Para invertase imobilizada na resina Duolite A-568, os resultados
experimentais de taxas iniciais de reao de hidrlise de sacarose, na ausncia de
produtos de reao, so apresentados na Tabela 4.16. Eles foram obtidos a 40C,
conforme item 3.2.9.8, usando tampo acetato 5,0.












Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________106
Tabela 4.16 Taxas iniciais de reao (v), em funo da concentrao inicial
de substrato (S), para invertase imobilizada.
Experimentos Concentrao inicial sacarose (g/L) - S Taxas iniciais (U
i
) - v
1 5 1,762
2 10 3,351
3 20 5,203
4 30 5,989
5 40 6,069
6 60 6,62
7 70 7,746
8 75 8,02
9 90 8,804
10 150 11,61
11 200 11,82
12 250 10,5
13 350 8,354
14 450 6,392
15 500 6,122
Os resultados experimentais da Tabela 4.16 foram ajustados ao modelo de
inibio pelo substrato (Equao 3.16) e os parmetros determinados por uma regresso
no-linear utilizando o software Statistica 7.0, gerando a Equao 4.19. O ajuste
alcanou um coeficiente de determinao de 0,93 e uma comparao entre os resultados
experimentais e os preditos pelo modelo obtido pode ser observado na Figura 4.31.

Figura 4.31 Perfil da influncia da concentrao de sacarose na atividade da
enzima imobilizada.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________107
2
17, 09.
60, 23
370, 23
S
v
S
S
=
+ +
(4.19)
Sendo:
V
m
= 17,09 U
S
= 17,09 g
aucar redutor
/L. min.g
invertase
= 0,047 M
sac
/min
K
m
= 60,23 g
sac
/L = 176 mM
sac
K
i
= 370,23 g
sac
/L = 1,08 M
sac

Os parmetros cinticos da Equao 4.20 para invertase imobilizada diferiram
significativamente com relao aqueles da enzima livre apresentados na Equao 4.9.
Merece destaque o valor da constante de Michaelis (K
m
), igual a 176 mM para invertase
imobilizada e 45,2 mM para invertase livre, um aumento de 3,9 vezes, fato este que
sugere resistncias difusionais na hidrlise com a enzima imobilizada.
Os resultados da constante de Michaelis para invertase livre e imobilizada
foram prximos aos valores obtidos no trabalho de REBROS et al. (2007), que
encontraram K
m
de 44,8 mM para solvel e 160,5 mM para invertase imobilizada em
cpsulas de polivinil lcool.
TOMOTANI & VITOLO (2006), obtiveram valores prximos da constante de
Michaelis para invertase livre e imobilizada em Dowex 1x4, no sugerindo problemas
difusionais. Os efeitos difusionais ocorrido com invertase adsorvida em Duolite A-568
foi menor quando comparado ao efeito de invertase adsorvida em Montmorillonite K-10
no trabalho de SANJAY & SUGUNAN (2005), pois neste trabalho o valor de K
m
sofreu
um acrscimo de 14 vezes em relao ao da enzima livre. Um aumento de 19 vezes da
constante de Michaelis de invertase adsorvida em um polmero de etileno glicol
dimetacrilato n-vinil imidazol (poly(EGDMA-VIM)) em relao enzima livre foi
observado no trabalho de OSMAN et al. (2005).

4.6.9 Influncia da Concentrao dos Produtos na Cintica da Reao da Enzima
Imobilizada

Os resultados experimentais de taxa de reao de hidrlise da sacarose (v) por
enzima invertase imobilizada em presena de glicose (G) ou frutose (F) so
apresentados na Tabela 4.17. As condies experimentais seguiram o item 3.2.9.9.



Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________108
Tabela 4.17 - Resultados experimentais de taxa de reao em funo das concentraes
iniciais de sacarose, glicose e frutose no meio reacional.
S (g/L) G (g/L) F (g/L) v (U
i
)
20 0 0 2,858
20 5 0 2,522
20 10 0 2,349
20 15 0 1,62
20 20 0 1,31
30 5 0 3,488
30 10 0 3,305
30 15 0 2,99
30 20 0 2,53
40 0 0 4,473
40 5 0 3,798
40 10 0 3,87
40 15 0 1,62
40 20 0 3,29
40 25 0 2,78
60 0 0 5,48
60 5 0 4,882
60 10 0 3,89
60 15 0 4,28
60 20 0 1,95
60 25 0 3,00
20 0 0 2,507
20 0 5 2,208
20 0 10 2,045
20 0 15 1,68
30 0 0 3,99
30 0 5 3,324
30 0 10 3,2
30 0 15 0,266
40 0 5 4,076
40 0 10 3,71
40 0 15 3,63
40 0 25 3,18
60 0 0 4,827
60 0 5 5,076
60 0 10 5,1
60 0 15 5,06
60 0 20 5,05
60 0 25 2,59

Os resultados da Tabela 4.17 foram ajustados por uma regresso no linear,
realizados pelo software Statistica 7.0, utilizando o mtodo de Levenberg-Marquardt
(MOR, 1977), aos modelos cinticos Inibio Competitiva, Inibio No Competitiva,
Inibio Acompetitiva, Inibio Mista Linear e Inibio Parcialmente No Competitiva,
representados pelas Equaes 3.23, 3.34, 3.35, 3.26 e 3.27, respectivamente. Na Tabela

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________109
4.18 esto apresentados os parmetros ajustados com as respectivas anlises de t-
Student, os coeficientes de determinao e a somatria dos quadrados dos desvios, para
o efeito de inibio dado pela glicose.

Tabela 4.18 - Parmetros dos modelos cinticos estudados em presena de glicose como
inibidor
Modelos de
inibio
I = Glicose
V
m
K
m
K
i
(V-V
modelo
)
2
R
^2
Competitiva Parmetros
Valor-p
8,89
0
35,40
0,0017
17,47
0,0005
-
-
-
-
0,012046 0,96
No
Competitiva
Parmetros
Valor -p
10,02
0
49,32
0,003
38,023
0
-
-
-
-
0,02957 0,96
Acompetitiva Parmetros
Valor -p
12,52
0,001
73,89
0,0048
14,78
0,018
-
-
-
-
0,057141 0,95
Mista Linear Parmetros
Valor -p
8
0
35
0
17
0
34.10
4
0,63
-
-
0,012049 0,95
Parcialmente
No
Competitiva
Parmetros
Valor -p
9,98
0,0001
50,19
0,0005
99,49
0,62
-
-
-0,01
0,42
0,02556 0,96

Com base nos resultados da Tabela 4.18, os parmetros com nvel de
significncia menor que 10% na anlise t-Student foram considerados significativos.
Pela anlise dos coeficientes de determinao, pelos valores dos quadrados dos desvios,
pela significncia dos parmetros pela anlise t-Student e pelo significado fsico dos
mesmos, os modelos que melhor se ajustaram foram inibio competitiva e no
competitiva pela glicose.
Analisando os ajustes na determinao dos parmetros do modelo inibio
mista linear verifica-se que o parmetro apresentou um valor muito alto, igual a
34.10
4
. Substituindo este valor na Equao 3.26 o termo (G/(*Ki)) tende a zero,
transformando esta equao na Equao 3.23 do modelo de inibio competitiva,
embora todos os outros parmetros estatstico validem o modelo cintico mista linear.
Os parmetros do modelo parcialmente no competitivo no foram
significativos de acordo com a anlise t-Student, alm disso, o parmetro apresentou
um valor negativo, sem significado fsico, portanto este modelo foi descartado.
Os ajustes dos modelos inibio competitiva (Equao 4.20) e inibio no-
competitiva (Equao 4.21) pela glicose esto apresentados nas Figuras 4.32 e 4.34, na
forma de superfcie de resposta. Nas Figuras 4.33 e 4.35 observa-se que os valores
observados experimentalmente esto prximos aos preditos pelos modelos.

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________110
8,89.
35, 4. 1
17, 47
S
v
G
S
=

+ +


(4.20)

Figura 4.32 Perfil da influncia da concentrao de glicose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio competitiva.


Figura 4.33 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo de
inibio competitiva para a resposta de atividade enzimtica.
10, 02.
49, 32* 1 * 1
14, 78 14, 78
S
v
G G
S
=

+ + +


(4.21)


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________111

Figura 4.34 Perfil da influncia da concentrao de glicose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio no competitiva.


Figura 4.35 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo de
inibio no competitiva para a resposta de atividade enzimtica.

Para o efeito de inibio da frutose esto apresentados na Tabela 4.19 os
parmetros ajustados com as respectivas anlises de t-Student, os coeficientes de
determinao e a somatria dos quadrados dos desvios.




Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________112
Tabela 4.19 - Parmetros dos modelos cinticos estudados em presena de frutose como
inibidor:
Modelos de
inibio
I = Frutose
V
m
K
m
K
i
(V-V
modelo
)
2
R
^2
Competitiva Parmetros
Valor l-p
12,97
0,0001
85,55
0,036
83,72
0,04
-
-
-
-
0,03091 0,97
No
competitiva
Parmetros
Valor -p
13,93
0,003
96,44
0,005
147,90
0,07
-
-
-
-
0,01448 0,97
Acompetitiva Parmetros
Valor -p
14,44
0,021
104,55
0,015
67,19
0,26
-
-
-
-
0,01418 0,95
Mista linear Parmetros
Valor -p
13
0
86
0
84
0
84.10
3
0,59

-
-
0,01436 0,96

Parcialmente
no
competitiva
Parmetros
Valor -p
13,11
0,0007
88,22
0,01
0,659
0,92
-
-
0,90
0,93
0,01436 0,96

Com base nos resultados da Tabela 4.19, os parmetros com nvel de
significncia menor que 10% na anlise t-Student foram considerados significativos.
Pela anlise dos coeficientes de determinao, pelos valores dos quadrados dos desvios,
pela significncia dos parmetros pela anlise t-Student e pelo significado fsico dos
mesmos, os modelos que melhor se ajustaram foram inibio competitiva e no
competitiva pela frutose.
Os ajustes dos modelos inibio competitiva (Equao 4.22) e inibio no-
competitiva (Equao 4.23) pela frutose esto apresentados nas Figuras 4.36 e 4.38 na
forma de superfcie de resposta. Nas Figuras 4.37 e 4.39 observa-se que os valores
observados experimentalmente esto prximos aos preditos pelos modelos.
Alm disso, comparando os valores dos parmetros K
i
alcanados na inibio
pela frutose e pela glicose, conclui-se que a concentrao da frutose no meio de reao
resulta em menor inibio. Ao contrrio dos resultados encontrados no trabalho de
COUTINHO FILHO (1996), que obteve valores de K
i
prximos competio
provocada pela frutose e pela glicose.

12, 97.
85, 55. 1
83, 72
S
v
G
S
=

+ +


(4.22)


Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________113

Figura 4.36 - Perfil da influncia da concentrao de frutose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio competitiva.


Figura 4.37 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo
de inibio competitiva para a resposta de atividade enzimtica

13, 93.
96, 44* 1 * 1
147, 9 147, 9
S
v
G G
S
=

+ + +


(4.23)

Captulo 4 Resultados e Discusso______________________________________114

Figura 4.38 Perfil da influncia da concentrao de frutose na atividade da
enzima imobilizada, pelo modelo de inibio no competitiva.

Figura 4.39 - Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo
de inibio no competitiva para a resposta de atividade enzimtica

Os resultados da inibio da reao de hidrlise pelos produtos da mesma
encontrados por outros pesquisadores no diferem muito dos atuais: COUTINHO
FILHO (1996), concluiu pela anlise das somatrias dos quadrados dos desvios que
tanto a glicose como a frutose comportam-se como inibidores parcialmente no-
competitivo. RIBEIRO (1989), verificou-se que a glicose comporta-se como inibidor
parcialmente no competitivo e a frutose como inibidor no-competitivo. COMBES E
MONSAN (1993), concluram que a glicose comporta-se como inibidor competitivo e a
frutose como inibidor parcialmente no-competitivo.


CAPTULO 5 CONCLUSES E SUGESTES

5.1 Concluses

A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que:

Entre as resinas estudadas a que apresentou melhores resultados na
imobilizao de invertase por adsoro e ligao inica foi a Duolite
A-568. As melhores condies no processo de imobilizao foram:
tempo de imobilizao 24 horas, temperatura 29C, pH 5,0 e
concentrao da enzima no meio 12,5 g/L.
A resina de troca inica Duolite A-568 mostrou-se um bom suporte
para imobilizar invertase, pois 100% regenervel e manteve uma boa
estabilidade de usos.
A temperatura e o pH timos para a atividade de invertase solvel foi
47C e 4,7, respectivamente, j para invertase imobilizada houve uma
reduo da temperatura tima para 40C e no pH timo foi 4,9.
O intervalo de estabilidade da invertase solvel em relao ao pH foi
entre 5,5 a 7,5, enquanto o intervalo para invertase imobilizada foi de
5,5 a 6,0.
A estabilidade trmica de invertase livre ou imobilizada possui
comportamento semelhante, pois em temperaturas mais altas (66 e
63C) a atividade relativa segue a Equao de Arrhenius, decrescendo
rapidamente com o tempo e para temperaturas mais baixas (57 e 54C)
foi possvel ajustar os resultados experimentais pela cintica de
desativao em srie.
O biocatalisador imobilizado apresenta uma maior estabilidade trmica
em baixas temperaturas se comparado com invertase solvel.
A energia de ativao do processo de desativao trmica de invertase
solvel (360 kJ/mol) foi menor do que de invertase imobilizada (415
kJ/mol), demonstrando esta ltima ser mais sensvel variao de
temperatura.
A reao de hidrlise de sacarose catalisada por invertase livre e
imobilizada seguiu o modelo de inibio pelo substrato. O valor de K
m


Captulo 5 Concluses e Sugestes______________________________________116
para enzima imobilizada foi 3,9 vezes maior do que para enzima livre,
sugerindo resistncia transferncia de massa na catlise com invertase
imobilizada.
O mtodo de imobilizao de invertase por adsoro nesta resina
simples e no altera a cintica da reao.
Em relao inibio provocada na velocidade de hidrlise pela
concentrao de produtos no meio reacional, observou-se que a glicose
exerce maior inibio que a frutose. Para os dois aucares redutores,
glicose e frutose, os melhores ajustes dos resultados experimentais aos
modelos cinticos foram de inibio competitiva e no competitiva.

5.2 Sugestes

Estudar os efeitos difusionais na cintica da reao com o
biocatalisador imobilizado;
Estudar a cintica de hidrlise do processo em reator de leito fixo;
Testar outras resinas de troca inica para imobilizar invertase;
Estudar outros mtodos de imobilizao nas resinas trocadoras de ons;
Estudar o processo de imobilizao por adsoro e ligao cruzada
com glutaraldedo em resinas;
Estudar a influncia de ons metlicos na taxa de reao de hidrlise de
sacarose;

















117
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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123
ANEXO 1

Exemplo da anlise cannica para o Planejamento Composto Central da otimizao do
meio de imobilizao, implementado no Maple VIII.
Sendo:
Atividade enzimtica = y1;
T = x1;
pH = x2;
Concentrao de invertase = x3;

Forma cannica para o PCC para imobilio - T, pH e [enzima]
> restart;
> y1:= 4.66 + 0.33*x1
+0.041*x2+0.79*x3+0.18*x1*x2+0.013*x1*x3-0.34*x2*x3-
1.01*x1^2-1,34*x2^2-1.14*x3^2;
y1 3.66 0.33 x1 0.041 x2 0.79 x3 0.18 x1 x2 0.013 x1 x3 0.34 x2 x3 + + + + + :=
1.01 x1
2
34 x2
2
1.14 x3
2
,

Reduzir para a forma cannica o modelo ajustado de ordem 2:
> with(linalg):
War ni ng, t he pr ot ect ed names nor mand t r ace have been r edef i ned and
unpr ot ect ed

> B:=matrix(3,3,[-1.01,0.09,0.0065,0.09,-1.34,-
0.17,0.0065,-0.17,-1.14]);
:= B

-1.01 0.09 0.0065


0.09 -1.34 -0.17
0.0065 -0.17 -1.14

> charpoly(B,lambda);
+ + +
3
3.49
2
3.99535775 1.504595285

> lambda:=[eigenvals(B)]; razes caractersticas
:= [ ] , , -1.452319979 -1.064013256 -0.9736667645

> b:=matrix(3,1,[1.944,0.906,1.069]);
:= b

1.944
0.906
1.069

> x0:=evalm(-0.5*inverse(B)&*b);
:= x0

0.9964083325
0.3514282136
0.4221349630

> for i from 1 to 3 do x:=x0[i,1] od;
:= x 0.9964083325

:= x 0.3514282136


124
:= x 0.4221349630

> x01:=0.058;
:= x01 0.058

> x02:=0.2102;
:= x02 0.2102

> x03:=0.5075;
:= x03 0.5075

> y0:=4.66 + 0.33*x01
+0.041*x02+0.79*x03+0.18*x01*x02+0.013*x01*x03-
0.34*x02*x03-1.01*x01^2-1,34*x02^2-1.14*x03^2;
:= y0 , 4.051592693 1.208643235

Portanto a forma cannica ajustada :
> y:=y0+lambda[1]*w[1]^2 +lambda[2]*w[2]^2
+lambda[3]*w[3]^2;
y ( ) , 4.051592693 1.208643235 1.452319979 w
1
2
1.064013256 w
2
2
:=
0.9736667645w
3
2

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