MODIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Marco teórico La tirosinasa del champiñón Es la enzima responsable del proceso de melanización en los animales y del pardeo en las plantas; haciendo de esta característica un tema de especial énfasis en procesos de transformación y almacenamiento de productos vegetales. Su actividad modifica el aspecto y sabor de éstos productos, por lo que tiene una favorable importancia económica al evitar o favorecer su actividad en períodos determinados. Posee una actividad catalítica doble, siendo capaz de hidroxilar los mono fenoles a o-difenoles con oxígeno molecular (monofenolasa) además es capaz de oxidar los o-difenoles a oquinonas con oxígeno molecular también (difenolasa).

Procedimiento Materiales y reactivos • • • • • • • • • Espectrofotómetro - colorímetro. Baño termostático. 10 g de champiñones. 1 g de arena de mar lavada. Tampones fosfato 100 mM de pH 6, 7, 7.5 y 8. Tampón acetato 10 mM de pH 3.6, 4 y 5. Catecol 5 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. Catecol 1 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. Catecol 5 mM en agua destilada.

A continuación se añaden 30 ml de tampón de fosfato 100 mM pH 7 y se homogeniza durante 10 minutos. • Cálculo de KM y VMAX Medir la actividad enzimática variando la concentración de catecol en la celda de medición: 50 µM. una con concentración de catecol de 2 mM y otra con 0. • Inhibición enzimática Se realizan dos series de medidas de la actividad. Para el cálculo de la Actividad enzimática se utiliza un Ɛ = 1050 M -1 x cm-1 para obenzoquinona a 390 nm.5 mM y concentración variable de ácido cinámico desde 0 hasta 0. Hacer la representación de Lineweaver-Burk correspondiente y evaluar las magnitudes de K M y VMAX. almacenar a 4 °C. 1 mM y 3 mM. el filtrado es la fuente de enzima. Centrifugar la mezcla a 10000 x g durante 30 minutos.1 ml de extracto enzimático y medir la variación de absorbancia a 390 nm de longitud de onda en el intervalo de 30 a 90 segundos (formación de o-benzoquinona). Representar la actividad frente a la temperatura utilizada en cada caso y evaluar la temperatura óptima. 1 ml de catecol 5 mM con 1 ml de tampón de acetato 10 mM de pH 5. . añadiendo la enzima en el momento de medir. Añadir 0. • Medición de la actividad difenolasa Mezclar en una cubeta de 1 cm de peso óptico. 100 µM. 500 µM.4 mM. El sobrenadante es la fuente de enzima. En un mortero con 1 g aproximadamente de arena de mar lavada triturar 10 g de champiñón durante 10 minutos. Si no se dispone de centrifuga filtrar al vacío con embudo Buchner.• Ácido cinámico 1 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. Métodos • Aislamiento de la enzima Fragmentar el material biológico y centrifugar posteriormente. Representar con el método de Dixon. 200 µM. se almacena a 4 °C. • Efecto de la temperatura Medir la actividad enzimática en medios de reacción previamente atemperados en un baño termostático a temperaturas ente 25 °C y 70 °C durante 10 minutos. 66 µM.

30 ml tampón fosfato 100 mM de pH 7 • Catecol 5 mM en tampón acetato 10 mM pH 5.5 mM 9 ml tampón acetato 10 mM pH 5 • • Catecol 1 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. 1 ml catecol 5 mM 1 ml tampón acetato 10 mM pH 5 1 ml catecol 50 µM 1 ml catecol 66 µM 1 ml catecol 100 µM 1 ml catecol 200 µM 1 ml catecol 500 µM 1 ml catecol 1 mM 1 ml catecol 3 mM 1 ml catecol 2 mM 1 ml catecol 0. 1 g de arena de mar lavada. 5 y de tampones 10 mM en fosfato de pH 6. Micropipetas y micropuntas. Catecol 5 mM en agua destilada. Centrifuga Tubos falcon 10 g de champiñones. Mortero y pistilo. 7 y 8 (utilizar el sustrato disuelto en agua a una concentración 5 mM). • • • • • • • • • Espectrofotómetro . 4. Representar la actividad media frente al pH del tampón utilizado y evaluar el pH óptimo para esta enzima. .• Efecto del pH Medir la actividad enzimática utilizando disoluciones tampones 10 mM en acetato de pH 3.6.colorímetro. Baño termostático.

cinámico 0 mM 1 ml ác. 3 ml catecol 5 mM 3 ml catecol 3 mM 3 ml catecol 1 mM 3 ml catecol 0. cinámico 0.1g/mol .2 mM 1 ml ác.5 mM 3 ml catecol 500 µM 5 ml tampón acetato 10 mM pH 5 a 25 °C 5 ml tampón acetato 10 mM pH 5 a 50 °C 5 ml tampón acetato 10 mM pH 5 a 70 °C datos: • • • n=masa/pm masa=m*pm []=n/v (L) catecol c6h6o2 110.6. 1 ml ác. cinámico 0. • • Tampón acetato 10 mM de pH 3. cinámico 0.1 mM 1 ml ác.4 mM 5 ml tampón acetato 10 mM pH 5.• Ácido cinámico 1 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. Catecol 5 mM en tampón acetato 10 mM pH 5. 4 y 5.3 mM 1 ml ác. cinámico 0.