DIRECCIÓN DE EDUCACIÓN TÉCNICA SUPERIOR

Área: Química Industrial


Carrera: Técnico Superior en Química.
Asignatura: Microbiología.




Autor: MSc. Nelson Zamora Rodríguez.








Unidad 1:
Introducción a la microbiología

UNI DAD 1: I NT R ODUCCI ÓN A L A MI CR OBI OL OGÍ A.

Objeti vo General :

1. Destacar l a i mportanci a del estudi o de l a mi crobi ol ogí a como una forma
de comprender el papel que juegan l os mi croorgani smos en l a natural eza, así
como l as di ferentes técni cas uti l i zadas en su estudi o, aprovechando l os
di ferentes medi os que permi tan su cul ti vo, observaci ón y conservaci ón.

Conteni do:

1 General i dades.
1.1 Defi ni ci ón y objeto de estudi o de l a mi crobi ol ogí a.
1.2 Rel aci ón de l a mi crobi ol ogí a con otras ci enci as.
1.3 Importanci a de l a mi crobi ol ogí a.
2 Equi pos e i nstrumentos uti l i zados en el l aboratori o de mi crobi ol ogí a.
2.1 El mi croscopi o compuesto.
2.2 Cri stal erí a: caj a petri , portaobjetos, cubreobj etos, cuna de ti nci ón.
2.3 Equi pos: autocl ave, baño marí a, centri fuga, i ncubadora.
3 Medi os y técni cas de cul ti vo.
3.1 Cl asi fi caci ón de l os medi os de cul ti vo.
3.2 Preparaci ón de l os medi os de cul ti vo.
3.3 Al macenami ento de l os medi os de cul ti vo.
3.4 Si embra de mi croorgani smos y obtenci ón de un cul ti vo puro.
3.5 Métodos de ai sl ami ento y recuento mi crobi ano.
4 Técni cas de observaci ón.
4.1 Preparaci ón de muestras mi croscópi cas.
4.2 Inocul aci ón.
4.3 Técni cas de Ti nci ón.
4.4 Preparaci ón de reacti vos y col orantes.








Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
MSc. Nelson Zamora Rodríguez
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1. GE NE R AL I DADE S :

La definición clásica de la Microbiología como “la ciencia que trata de los organismos cuyo
tamaño es demasiado pequeño para ser observados a simple vista” es intelectualmente corta y
puramente metodológica, y refleja claramente las limitaciones humanas para desentrañar la
realidad natural. La tecnología es a la vez la principal herramienta para el conocimiento y el
principal factor limitante, pues los hechos naturales no han sido “diseñados” teleológicamente
para que el hombre los comprenda. En otras palabras, y aunque nos pese, la Naturaleza no
está construida empleando escalas humanas.

Esto se refleja en la falta de homogeneidad estructural de los organismos tradicionalmente
estudiados en Microbiología. Toda la Biología podría abordarse tomando a los
microorganismos como excusa y esto, aunque sirva para dar importancia al trabajo con
microorganismos, impone serias restricciones prácticas para el trabajo diario del microbiólogo.

Está claramente demostrado que los microbios sirven de banco de prueba para la elaboración y
aplicación de todas las teorías y tecnologías biológicas, y la inmediatez con que puede pasarse
de la bioquímica a la biología celular y a la genética utilizando microorganismos es quizás la
razón por la cual hay tantos biólogos trabajando y estudiando microorganismos, desde los más
diversos puntos de vista.

Resulta difícil imaginar que el microbiólogo pueda acumular el conocimiento necesario para
saber todo de todos los microorganismos (como representantes de los seres vivos en general),
por lo que se impone una aproximación más “humilde” al trabajo con microorganismos, para
individualmente aportar pequeñas piezas al puzzle de lo biológico.

Muchos descubrimientos importantes son a veces puramente accidentales y tienen lugar
cuando se trabaja en áreas muy alejadas de aquella en la que se está investigando. Eduard
Buchner descubrió la fermentación en extractos de levadura cuando, haciendo estudios
inmunológicos, añadió azúcar a un extracto para conservarlo. Alexander Fleming descubrió
accidentalmente la penicilina cuando su placa de estafilococos se contaminó con Penicillium. F.
Griffith descubrió la transformación cuando trabajaba en la epidemiología de los neumococos.

Por tanto, el azar juega también un importante papel en la investigación en general, y en la
microbiología en particular. Muchos descubrimientos se llevan a cabo en varios sitios diferentes
y no relacionados, y muchos investigadores individuales cooperaron en la solución de un
mismo problema, por lo que la distribución de honores y méritos no deja de ser
frecuentemente injusta. Personajes rascendentales como Pasteur, Cohn, Beijerinck,
Winogradsky o Koch, contribuyeron a muchos aspectos diferentes del conocimiento
microbiológico y se encuentran en la base de la estructura microbiológica actual.






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Desarrollo histórico de la microbiología:

La Microbiología, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del
siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodológicos que se
habían empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisión
de ideas y prejuicios seculares sobre la dinámica del mundo vivo.

Siguiendo el ya clásico esquema de Collard (l976), se puede distinguir cuatro etapas o periodos
en el desarrollo de la Microbiología:

1. Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigüedad hasta
llegar a los primeros microscopistas.

Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debió aguardar hasta
el último tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy
antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la
producción de bebidas alcohólicas, pan y productos lácteos, como las perjudiciales, en forma
de enfermedades infecciosas.

Diversas fuentes escritas de la antigüedad griega y romana hablan de gérmenes invisibles que
transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De rerum natura" hace
varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento europeo, Girolamo
Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice que las enfermedades
contagiosas se deben a "gérmenes vivos" que pasan de diversas maneras de un individuo a
otro. Estos inicios de explicación que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron
probablemente catalizados por la introducción en Europa de la sífilis, una enfermedad en la
que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la "cosa" que se transmite en
la enfermedad siguió siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo.

2. Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde l675 aproximadamente
hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos
por Leeuwenhoek (l675).

Ya en el siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió una
cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los objetos. En el siglo
XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física óptica de las lentes de aumento, pero no
encontraron una aplicación inmediata. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones
"microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en
cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna repercusión.

La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a
Constantijn Huygens, quien relata que el inglés Cornelis Drebbel tenía en su
taller un instrumento magnificador, que recibió el nombre de microscopium
en l625, en la Accademia dei Lincei, de Roma.

El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante
holandés de tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su









Leeuwenhoek
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Robert Hooke
Louis Pasteur
pasión por pulir y montar lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a
descuidar sus negocios. Fabricó unos cuatrocientos microscopios simples, con los que llegó a
obtener aumentos de casi 300 diámetros. En 1675 descubrió que en una gota de agua de
estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó
"animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la
Microbiología".

Durante varias décadas Leeuwenhoek fue comunicando sus descubrimientos a la Royal Society
de Londres a través de una serie de cartas que se difundieron, en traducción inglesa, en las
"Philosophical Transactions". Sus magníficas dotes de observador le llevaron asimismo a
describir protozoos (como Giardia, que encontró en sus propias heces), la estructura estriada
del músculo, la circulación capilar, a descubrir los espermatozoides y los glóbulos rojos (por lo
que también se le considera el fundador de la Histología animal), así como a detallar diversos
aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percató de la
abundancia y ubicuidad de sus animálculos, observándolos en vinagre, placa dental, etc.

Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron interés al ser comunicados, pocos
intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Además, la fabricación de lentes sencillas de
gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso.

Simultáneamente el inglés Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios
compuestos, describió los hongos filamentosos (1667), y descubrió la
estructura celular de las plantas (Micrographia, 1665), acuñando el término
célula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de
los "animálculos" languideció durante casi 200 años, debido a sus
imperfecciones ópticas, hasta que hacia 1830 se desarrollaron las lentes
acromáticas.

3. Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales
del siglo XIX, donde las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de
cristalizar a la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.

En 1857 demostró que los agentes de la fermentación láctica eran
microorganismos, trabajando sobre un problema que había surgido
entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación
alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica.
Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habría de durar
hasta 1876, en los que Pasteur identificó distintos microorganismos
responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. Así, en
1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos
tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus
hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las
primeras derivaciones prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX
eminentes biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su
actividad en industrias y destilerías.

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Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la presencia de
microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual desmentía la creencia de
que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acuñó los términos aerobiosis y
anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de
oxígeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas
implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en presencia y en
ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como
crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradación total de las
correspondientes sustancias.

Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner obtuvo,
a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformación de "fermentación" que las células vivas. Este descubrimiento, que evocaba las
propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y
biológico: las fermentaciones eran procesos químicos catalizados por enzimas presentes dentro
de células vivas, que podían ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica,
nacida como una rama de la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología,
encontró una alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología.

4. Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros días), en el que los
microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiológica, bioquímica, genética,
ecológica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiología, el
surgimiento de disciplinas microbiológicas especializadas (Virología, Inmunología, etc), y la
estrecha imbricación de las ciencias microbiológicas en el marco general de las Ciencias
Biológicas.

Investigue ¿cuáles fueron los principales aportes de Pasteur y Buschner en la comprensión de
los microorganismos?

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Defi ni ci ón:

La Mi crobi ol ogí a se puede defi ni r, sobre l a base de su eti mol ogí a, como l a
ci enci a que trata de l os seres vi vos muy pequeños, concretamente de aquel l os
cuyo tamaño se encuentra por debaj o del poder resol uti vo del ojo humano.
Esto hace que el objeto de esta di sci pl i na venga determi nado por l a
metodol ogí a apropi ada para poner en evi denci a, y poder estudi ar, a l os
mi croorgani smos.

Objeto de estudi o:

Todos l os aspectos y enfoques desde l os que se pueden estudi ar l os
mi croorgani smos conforman l o que denomi namos objeto formal de l a
Mi crobi ol ogí a: caracterí sti cas estructural es, fi si ol ógi cas, bi oquí mi cas, genéti cas,
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taxonómi cas, ecol ógi cas, etc., que conforman el núcl eo general o cuerpo bási co
de conoci mi entos de esta ci enci a. Por otro l ado, l a Mi crobi ol ogí a tambi én se
ocupa de l as di sti ntas acti vi dades mi crobi anas en rel aci ón con l os i ntereses
humanos, tanto l as que pueden acarrear consecuenci as perjudi ci al es (y en este
caso estudi a l os ni chos ecol ógi cos de l os correspondi entes agentes, sus modos
de transmi si ón, l os di versos aspectos de l a mi crobi ota patógena en sus
i nteracci ones con el hospedador, l os mecani smos de defensa de éste, así como
l os métodos desarrol l ados para combati rl os y control arl os), como de l as que
reportan benefi ci os (ocupándose del estudi o de l os procesos mi crobi anos que
suponen l a obtenci ón de materi as pri mas o el aboradas, y de su modi fi caci ón y
mejora raci onal con vi stas a su i mbri caci ón en l os fl uj os producti vos de l as
soci edades).

Fi nal mente, l a Mi crobi ol ogí a ha de ocuparse de todas l as técni cas y
metodol ogí as desti nadas al estudi o experi mental , manej o y control de l os
mi croorgani smos, es deci r, de todos l os aspectos rel aci onados con el modo de
trabajo de una ci enci a empí ri ca.

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Investi gue l a rel aci ón que guarda l a mi crobi ol ogí a con l as ci enci as si gui entes:
bi oquí mi ca, Tecnol ogí a ambi ental , Tecnol ogí a de l os al i mentos y l a Quí mi ca de
l os al i mentos. Presente un esquema en cl ase y establ ezca un conversatori o con
el grupo.

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La microbiología es una ciencia que tiene amplia aplicación en diferentes campos de la
actividad humana, entre ellas la medicina, histología, ecología, en la industria, en los alimentos,
etc.

En el caso de la transformación de la materia prima en la industria de los alimentos, estos
pueden ser vehículos potenciales para la Transmisión de diversos microorganismos y de
metabolitos de origen microbiano, muchos de los cuales son patógenos para el hombre,
motivo por el cual se hace indispensable disponer de metodologías que permitan garantizar la
inocuidad de los productos destinados al consumo humano y animal. Esta metodología es
proporcionada por la Microbiología de los Alimentos, la cual entre otros aspectos, abarca dos
campos bien definidos: a) Salud Pública, cuando se usa para proteger al consumidor frente a las
enfermedades de origen microbiano y b) Conservación del Alimento, cuando se emplea en la
prevención de las alteraciones de estos productos debidas a los microorganismos.

Cuando es la salud del consumidor la que está expuesta a riesgo, la legislación sobre la calidad
microbiológica de los alimentos debería ser exigente y muy severa. Por otro lado, las industrias
de alimentos de cualquier origen, están expuestas a sufrir grandes pérdidas económicas como
consecuencia de la descomposición de las materias primas y/o de los productos terminados,
por acción de diversos agentes microbianos.

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En ambos casos, dichas industrias deberían cumplir con las normas microbiológicas establecidas
y si éstas no existen, adoptar prácticas adecuadas de manipulación, fabricación y distribución, a
fin de evitar en lo posible, brotes de intoxicaciones alimentarías. Las mismas les podrían
acarrear graves repercusiones y responsabilidades que, por su propia naturaleza, son difíciles de
afrontar.

La delimitación de las áreas antes señaladas, determina tres situaciones esenciales en
Microbiología de los Alimentos:

1) Los alimentos que contienen microorganismos patógenos o niveles altos de toxinas
microbianas capaces de causar cuadros clínicos en el consumidor, por lo general no presentan
signos de alteración que contraindiquen su consumo;

2) generalmente, las medidas que se toman para controlar el crecimiento de agentes
patógenos, no son las mismas que se emplean para evitar el desarrollo de los microorganismos
causantes de las alteraciones organolépticas del producto y

3) en otros casos, las medidas tomadas para reducir o inhibir el crecimiento de
microorganismos alterantes e infecciosos de naturaleza bacteriana y micótica no sanean el
alimento, por cuanto las mismas no previenen la presencia de patógenos como virus,
protozoos y helmintos, los cuales aunque no se multipliquen en los alimentos, pueden
conservar su poder infectivo. Aún más, algunas toxinas provenientes de bacterias pueden
resistir los tratamientos conducentes a la eliminación de microorganismos alterantes y
patógenos y en consecuencia, persistir en los alimentos.

Como se puede apreciar de lo expuesto anteriormente, la contaminación de los alimentos es
difícil de evitar. El verdadero peligro ocurre cuando las bacterias patógenas logran multiplicarse
en el alimento y causan trastornos en la salud del consumidor. He aquí la responsabilidad del
microbiólogo de alimentos, quien debe detectar a tiempo la anomalía, identificar los agentes
infecciosos y velar porque ese producto no salga al mercado hasta tanto se tenga la seguridad
de que está apto para el consumo.

Con este fin, debe llevarse un control periódico de la población microbiana deseada en
aquellos alimentos fermentados o madurados, para distinguir entre microorganismos alterantes
y la flora propia del aumento; así mismo, es necesario controlar la influencia de ciertos
factores, tales como los ambientales, que pueden ser fuente de contaminación de los alimentos.
En el caso de productos enlatados, se debe controlar el proceso industrial de esterilización para
determinar con exactitud el grado térmico requerido y el tiempo óptimo de exposición al
calor, además de controlar periódicamente la efectividad de la máquina selladora a fin de
evitar el sellamiento deficiente de las latas, pues éste permite la formación de grietas o poros, a
través de los cuales se produce la contaminación del producto terminado.

En términos generales, puede decirse que se cuenta con suficientes conocimientos científicos y
tecnológicos para producir alimentos de excelente calidad microbiológica pero, sin embargo,
siguen apareciendo brotes de infecciones e intoxicaciones alimentarías y los industriales
continúan teniendo pérdidas cuantiosas por la alteración microbiana de sus productos.

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El problema parece residir, fundamentalmente, en que no se cumplen a cabalidad las normas
sanitarias establecidas para la manipulación de la materia prima con la cual se elabora el
alimento, y en que los industriales siguen considerando erróneamente, que el control de la
calidad microbiológica de sus productos, les resulta muy dispendioso tanto en tiempo como
ecónomamente.

2 EQUI P OS E I NS T R UME NT OS UT I L I Z ADOS E N E L L AB OR AT OR I O DE
MI CR OBI OL OGÍ A.

La observaci ón y el estudi o de l os mi croorgani smos requi eren de l a uti l i zaci ón y
debi do manejo de una seri e de equi pos e i nstrumentos que permi tan l a
magni fi caci ón, preparaci ón de medi os de cul ti vo, esteri l i zaci ón y otra seri e de
acti vi dades.

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El mi croscopi o es un i nstrumento ópti co que ampl i fi ca l a i magen de un obj eto
pequeño, si endo el i nstrumento más uti l i zado en l os l aboratori os donde se
estudi an mi croorgani smos. Si bi en l as l entes de aumento han si do conoci das
desde muy temprano en l a hi stori a, sól o se l e uti l i zó en bi ol ogí a con el
adveni mi ento del mi croscopi o de l uz moderno. Desde su i nvenci ón, el
mi croscopi o ha si do una herrami enta val i osa en el desarrol l o de l a teorí a
ci entí fi ca (Hei dcamp, 1995).

En general , un mi croscopi o está compuesto de dos el ementos, l os cual es
consti tuyen un si stema si mi l ar a un tel escopi o: a) l entes pri mari as
ampl i fi cadoras y b) l entes secundari as. Estos si stemas se denomi nan obj eti vos y
ocul ares, respecti vamente, y están montados en l os extremos opuestos de un
tubo cerrado, de forma que el pri mero se encuentra en el punto focal del
segundo.

Entonces, l a l uz que pasa por un obj eto es focal i zada por ambos si stemas de
l entes (Hei dcamp, 1995), de manera que cuando se mi ra a través del ocul ar se
ve una i magen vi rtual aumentada de l a i magen real .

Ti pos de mi croscopi o

Actual mente exi sten muchos ti pos de mi croscopi os, entre l os que se cuentan el
mi croscopi o ópti co, el el ectróni co, el de sonda de barri do y el l aser. No
obstante, el mi croscopi o más uti l i zado es el ópti co, el cual se si rve de l a l uz
vi si bl e para crear una i magen aumentada del objeto.

El mi croscopi o ópti co:
Los mi croscopi os ópti cos pueden cl asi fi carse en si mpl es y compl ej os,
di ferenci ándose en su capaci dad ampl i fi cadora y en l a compl ej i dad del si stema
de l entes asoci ado. La pri nci pal ventaja de un mi croscopi o ópti co es que
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permi te observar organi smos vi vos y tej i dos. Su pri nci pal desventaja, es que su
potenci a ampl i fi cadora está l i mi tada por l a l ongi tud de onda de l a l uz vi si bl e.

Mi croscopi o ópti co si mpl e:
El mi croscopi o ópti co más si mpl e es l a l ente convexa dobl e, cuya di stanci a focal
es corta. Estas l entes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Tambi én se l es
denomi na mi croscopi os de bajo poder. Exi sten al menos dos ti pos de
mi croscopi os de bajo poder: monocul ares y bi nocul ares (Fi gura 2). Los
mi croscopi os monocul ares ti enen muy bajo poder ampl i fi cador, si endo uti l i zado
esenci al mente por ni ños. Los mi croscopi os bi nocul ares, estéreo mi croscopi os o
l upas, en cambi o, proveen un aumento mayor. Se caracteri zan, porque
presentan dos obj eti vos, de modo que el objeto se puede ver en forma
estereoscópi ca o tri di mensi onal .

Mi croscopi o ópti co compl ejo:
Los mi croscopi os compl ejos
di sponen de vari as l entes con
l as que se consi guen aumentos
mayores, pudi endo i ncl usi ve
aumentar un objeto más de
2.000 veces. Estos
mi croscopi os son, en general ,
l os más uti l i zados (Fi gura 2).
En este caso, el objeti vo está
compuesto de vari as l entes
que crean una i magen real
aumentada del objeto
exami nado. El aumento total
del mi croscopi o depende de
l as l ongi tudes focal es de l os
dos si stemas de l entes.

Fi gura 2. Dos ti pos de mi croscopi o ópti co: a) estereoscópi co bi nocul ar; b)
ópti co bi nocul ar.

Mi croscopi os ópti cos especi al es:
Hay di versos mi croscopi os ópti cos para funci ones especi al es. Entre éstos se
ti ene l os mi croscopi os de ul travi ol eta, petrográfi co, de campo oscuro, de fase,
de campo cercano e i nverti do.


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Componentes de un mi croscopi o ópti co bi nocul ar

Como se observa en l a
Fi gura, un mi croscopi o
ópti co bi nocul ar consta de:
base, pedestal , cabeza. En
l a base se ubi ca l a fuente de
l uz. En el pedestal se ubi can
macro y mi crométri co y l a
pl ati na; sobre l a pl ati na se
ubi can l as pi nzas, y el foco
coaxi al , mi entras que bajo
ésta se ubi ca el di afragma.
En l a parte superi or del
pedestal se ubi ca el
revól ver, pi eza que porta
l os objeti vos. En l a cabeza
se ubi can l os ocul ares y el
si stema regul ador de l a
di stanci a focal .

 Base: Corresponde a l a parte i nferi or del i nstrumento, uti l i zada como
soporte.
 Pedestal o brazo: pi eza que soporta al tubo que conti ene el si stema de l entes
y que l e conecta con l a base.
 Cabeza: pi eza, general mente móvi l , sobre l a que se ubi can l os ocul ares y el
si stema regul ador de l a di stanci a focal .
 Fuente de l uz: corresponde a una ampol l eta u otra fuente l uz acti vada por
corri ente o pi l a. Anti guamente se uti l i zaba un espej o que concentraba l a l uz
ambi ental .
 Macrométri co: torni l l o que permi te el ajuste grosero de l a muestra a
observar. Se compl ementa con el uso del mi crométri co.
 Mi crométri co: torni l l o que permi te un ajuste fi no de l a muestra a observar.
 Pl ati na: pi eza di spuesta hori zontal mente y sobre l a cual se ubi can l as pi nzas y
el foco coaxi al . Pl ati na, pi nzas y foco coaxi al permi ten ubi car una muestra para
ser observada. La muestra debe estar di spuesta sobre un portaobj eto y
protegi da por un cubreobj eto). Bajo l a pl ati na se encuentran el di afragma y el
fi l tro.
 Pi nzas: Pi ezas prensi l es que permi ten suj etar l a muestra, conteni da en un
portaobj eto, contra l a pl ati na.
 Foco coaxi al : Si stema compuesto por dos ejes de despl azami ento hori zontal ,
l os cual es, di spuestos perpendi cul armente entre sí , permi ten ajustar una muestra
para ser observada al mi croscopi o. Un ej e despl aza l a muestra en senti do l ateral
(i zqui erda - derecha del observador) y el otro en senti do frontal (al ejando -
acercando l a muestra del observador). Ambos movi mi entos se real i zan en el
pl ano que defi ne l a pl ati na.
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 Di afragma: Si stema que control a l a canti dad de l uz que l l ega al obj eto. El
di afragma permi te control ar i ntensi dad de l uz y el tamaño del cono de l uz
proyectado sobre l a muestra.
 Condensador: Conj unto de l entes que focal i zan l a l uz sobre l a muestra. Las
l entes condensadoras más úti l es poseen poderes superi ores a l os 400x y más. El
uso de condensador permi te mej orar l a observaci ón de l a muestra. Cuando está
presente en el i nstrumento, el condensador se ubi ca general mente bajo l a
pl ati na (Fi gura 3).


Fi gura 3. a) Obj eti vos di spuestos sobre el revól ver de un mi croscopi o ópti co
bi nocul ar. Detal l e de l os objeti vos: l a banda col oreada i ndi ca el aumento del
l ente conteni do en el objeti vo: rojo i ndi ca que el aumento es de 4X, amari l l o,
que es de 10X; azul que es de 40X y bl anco, que el aumento es de 100X; b)
detal l e del condensador. Fuente: Mi croscopeworl d

 Fi l tro: Al gunos mi croscopi os portan fi l tros o un si stema de éstos, l os que
corresponden a l entes de di sti nto col or que permi ten enfati zar l a observaci ón
de determi nadas partes de l a muestra, general mente destacadas con ti nci ones.
 Revól ver: Mecani smo gi ratori o sobre el cual se di sponen l os obj eti vos. El
revól ver permi te cambi ar el aumento con que se observa una muestra
determi nada. Un revól ver general mente porta cuatro obj eti vos: 4x, 10x, 40x y
un obj eti vo de i nmersi ón (100x) (Fi gura 3).
 Objeti vos: Conjunto de l entes responsabl es de aumentar y resol ver (di sti ngui r
l as di sti ntas partes) de l a muestra a observar.
 Objeti vo de i nmersi ón: El objeti vo de i nmersi ón permi te l ograr una mej or
resol uci ón en un mi croscopi o ópti co medi ante el uso de l as propi edades de
refracci ón de l uz del acei te de i nmersi ón. Requi ere de l a di sposi ci ón de una
gota de este acei te sobre l a muestra fresca o sobre el cubreobj eto, en el caso de
preparaci ones fi jas; el objeti vo de i nmersi ón debe acercarse a l a muestra de
modo que toque l a gota de acei te.

Aumento y resol uci ón de un mi croscopi o
La funci ón de cual qui er mi croscopi o es mej orar l a resol uci ón, muchas veces
confundi da con l a ampl i fi caci ón (aumento). Como el mi croscopi o es uti l i zado
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para crear una vi sta aumentada de un objeto tal que se observen detal l es no
vi si bl es al oj o humano, se confunde resol uci ón con l a ampl i fi caci ón o aumento
de tamaño de l a i magen de l a muestra u objeto. En general , a mayor aumento,
mayor resol uci ón, pero esto no si empre es verdad, pues exi sten l i mi taci ones
prácti cas en el di seño de l as l entes, l as cual es permi ten mejorar el aumento si n
mejorar l a resol uci ón.

El poder resol uti vo de un mi croscopi o es una propi edad i mportante, pues l a
resol uci ón o poder resol uti vo es l a capaci dad de di sti ngui r separados dos
puntos muy cercanos. Cuanto mayor es el poder resol uti vo, mayor es l a
defi ni ci ón con que se observa l a i magen de un obj eto. De este modo, l os
mi croscopi os de gran poder resol uti vo son adecuados para ver pequeñas
estructuras.

En un mi croscopi o compuesto o compl ejo, el poder resol uti vo depende de l a
l ongi tud de l a onda uti l i zada y de una propi edad ópti ca de l a l ente conoci da
como apertura numéri ca. Como l os mi croscopi os ópti cos uti l i zan l uz vi si bl e, l a
l ongi tud de onda está predefi ni da. Esta es l a razón por l a cual l a resol uci ón de
un obj eto es funci ón de l a apertura numéri ca; cuanto mayor es l a apertura, el
obj eto resuel to u observado es más pequeño. Un factor que afecta a l a apertura
numéri ca, además de l a construcci ón de l a l ente, es el medi o a través del cual
pasa l a l uz. Mi entras que el obj eti vo esté separado del obj eto por el ai re, su
apertura numéri ca nunca será mayor de 1,0; para consegui r aperturas numéri cas
mayores que ésta, el obj eti vo debe estar i nmerso en un l í qui do de mayor í ndi ce
de refracci ón que el ai re. A estos l í qui dos se l es denomi na acei tes de i nmersi ón,
l os cual es se uti l i zan con l os objeti vos de i nmersi ón obteni endo una apertura
numéri ca entre 1,2 y 1, 4. Aún así , al uti l i zarse l a l ongi tud de onda de l a l uz
vi si bl e, estos mi croscopi os l l egan a tener un poder de resol uci ón de
aproxi madamente 0,25 μm, l o que si gni fi ca que l as partí cul as con un tamaño
más pequeño que 0,25 μm no pueden di sti ngui rse unas de otras.

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La cri stal erí a desempeña un papel i mportante en el l aboratori o de
mi crobi ol ogí a, especi al mente l a de ti po Pi rex, resi stente a l a temperatura.
Debi do a que el cul ti vo de mi croorgani smo requi ere el uso de medi os estéri l es
que evi ten l a contami naci ón de l os medi os de cul ti vo y l as muestras, se requi ere
que l a cri stal erí a a uti l i zar sea esteri l i zado ya sea por cal or húmedo o seco, así
como el uso de guantes de l átex que evi ten el contacto de l os dedos con l as
superfi ci es de l os portaobjetos y cubreobj etos. Entre l a cri stal erí a más uti l i zada
se encuentra l a si gui ente:

 Caja petri : cápsul a formada por dos di scos de cri stal
que pueden adaptarse entre sí . En el di sco que forma el
fondo de l a caja se deposi ta cal do gel osado y el conjunto
puede ser fáci l mente esteri l i zado, sembrado y col ocado en
l a estufa. La caja de Pétri , se uti l i za general mente para l a
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separaci ón de l os mi crobi os cuyas col oni as se desarrol l an ai sl adamente y
pueden ser estudi adas con faci l i dad.

 Portaobjeto: pl aca rectangul ar de 70 mm de l ongi tud por 22 mm de ancho y
2 a 4 mm de espesor, puede ser l i sa o presentar una o dos cavi dades cóncavas,
si es l i sa se uti l i za para muestras secas, l as cual es se fi jan medi ante cal or y
adi ci ón de col orantes que faci l i tan l a observaci ón de muestras mi croscópi cas,
mi entras que l as cóncavas se uti l i zan para observar muestras húmedas.

 Cubreobj etos: pl aca cuadrada de aproxi madamente 22 x 22 mm, con un
espesor de 1 mm, que se col oca sobre el portaobjeto a fi n de evi tar el contacto
del objeti vo con l a muestra, evi tar l a contami naci ón de l a l ente y faci l i tar l a
observaci ón de l a muestra, sobre todo cuando se uti l i za el l í qui do de i nmersi ón.

 Cuna de ti nci ón: ti ene l a apari enci a de una cuna, de donde deri va su nombre,
se uti l i za para col ocar vari os portaobj etos y faci l i tar de esta manera l a ti nci ón
de múl ti pl es muestras y agi l i zar l a preparaci ón de l as muestras que han de
observarse en el mi croscopi o.

2.3 Equi pos: autocl ave, baño marí a, centri fuga, i ncubadora.

El estudi o de l os mi croorgani smos requi ere de l a preparaci ón de ci ertas
condi ci ones que faci l i ten el creci mi ento y desarrol l o de l os mi smos. Dado que
son prol i feros, es necesari o control ar di chas condi ci ones a fi n de favorecer el
creci mi ento de unos y evi tar l a apari ci ón de otros no deseados, que reci be el
nombre contami naci ón de l a muestra, para el l o se requi eren l os equi pos
si gui entes:

 Autocl ave: es un di sposi ti vo que si rve para esteri l i zar
materi al de l aboratori o, uti l i zando vapor de agua a al ta
presi ón y temperatura para el l o, evi tando con l as al tas
presi ones que el agua l l egue a ebul l i r a pesar de su al ta
temperatura. El fundamento del autocl ave es que coagul a l as
proteí nas de l os mi croorgani smos debi do a l a presi ón y
temperatura, aunque reci entemente se ha l l egado a saber de
al gunos mi croorgani smos, así como l os pri ones, que pueden
soportar l as temperaturas de autocl ave.

Las autocl aves funci onan permi ti endo l a entrada o generaci ón de vapor de agua
pero restri ngi endo su sal i da, hasta obtener una presi ón i nterna de 103 kPa, l o
cual provoca que el vapor al cance una temperatura de 121 grados centí grados.
Un ti empo tí pi co de esteri l i zaci ón a esta temperatura y presi ón es de 15-20
mi nutos. Las autocl aves más modernas permi ten real i zar procesos a mayores
temperaturas y presi ones, con ci cl os estándares a 134 ºC a 200 kPa durante 5
mi n para esteri l i zar materi al metál i co; l l egando i ncl uso a real i zar ci cl os de vací o
para acel erar el secado del materi al esteri l i zado.

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El hecho de contener fl ui do a al ta presi ón i mpl i ca que l as autocl aves deben ser
de manufactura sól i da, usual mente en metal , y que se procure construi rl as
total mente herméti cas.
Las autocl aves son ampl i amente uti l i zadas en l aboratori os, como una medi da
el emental de esteri l i zaci ón de materi al . Aunque cabe notar que debi do a que el
proceso i nvol ucra vapor de agua a al ta temperatura, ci ertos materi al es no
pueden ser esteri l i zados en autocl ave, como el papel y muchos pl ásti cos (a
excepci ón del pol i propi l eno).

El funci onami ento del autocl ave
El proceso compl eto de esteri l i zaci ón en un autocl ave se compone de di ferentes
fases:
• Fase de purgado: A medi da que l a resi stenci a cal i enta el agua del fondo
del cal derí n, se va produci endo vapor que despl aza el ai re, haci éndol o sal i r por
l a vál vul a de purgado que está abi erta. Esta fase termi na cuando se al canza l a
temperatura de esteri l i zaci ón.
• Fase de esteri l i zaci ón: Una vez cerrada l a vál vul a de purgado y al canzada
l a temperatura de esteri l i zaci ón previ amente sel ecci onada se i ni ci a el proceso
de esteri l i zaci ón.
• Fase de descarga: Termi nado el proceso de esteri l i zaci ón, dej a de
funci onar l a resi stenci a cal efactora, con l o que deja de produci rse vapor y l a
presi ón y temperatura del cal derí n empi eza a baj ar poco a poco.

Al gunas consi deraci ones para una correcta esteri l i zaci ón del materi al
• Para que l a esteri l i zaci ón de medi os de cul ti vo sea efi caz, l a temperatura y
el ti empo sel ecci onados deben al canzarse en todo el l í qui do. Como qui era que
l a transmi si ón del cal or en el l í qui do de l os reci pi entes se real i za de fuera haci a
dentro, es evi dente que l a efi caci a del proceso dependerá del vol umen de
l í qui do.
• En general , no convi ene esteri l i zar juntos reci pi entes grandes y pequeños.
En todo caso l a sel ecci ón de l a temperatura y ti empo se efectuará según sea el
vol umen de l os reci pi entes.
• Los reci pi entes con ci erre herméti co deben ser i ntroduci dos en el
autocl ave si n cerrar total mente el tapón, para faci l i tar l a entrada del vapor
durante el proceso. Al vaci ar el autocl ave después de l a esteri l i zaci ón
procederemos a cerrar total mente estos reci pi entes.
• Los reci pi entes vací os preci san de un ti empo de esteri l i zaci ón mayor que
l os reci pi entes con l í qui do en su i nteri or.

 Baño marí a: El baño Marí a o baño de Marí a es un método empl eado en l as
i ndustri as (farmacéuti ca, cosméti ca, de al i mentos y conservas), en l aboratori o
de quí mi ca y en l a coci na, para conferi r temperatura uni forme a una sustanci a
l í qui da o sól i da o para cal entarl a l entamente, sumergi endo el reci pi ente que l a
conti ene en otro mayor con agua que se l l eva a o está en ebul l i ci ón.

El concepto fundamental es el de baño que i mpl i ca el cal entami ento i ndi recto,
por convecci ón térmi ca del medi o (agua del baño) y por conducci ón térmi ca de
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l a sustanci a; ese medi o (baño) puede ser de acei te mi neral , de agua pura o
sol uci ones sal i nas de agua de concentraci ones y sol utos di ferentes, etcétera,
según l a temperatura a que se requi era l l evar l a sustanci a. De este modo, l o que
se cal i enta en pri mer l ugar es el agua conteni da en el reci pi ente de mayor
tamaño y ésta es l a que poco a poco va cal entando el conteni do del reci pi ente
menor, de un modo suave y constante.

Centrí fuga: Una centrí fuga es una máqui na que pone en
rotaci ón una muestra para separar por fuerza centrí fuga
sus componentes o fases (general mente una sól i da y una
l í qui da), en funci ón de su densi dad.

Exi sten di versos ti pos de centrí fugas, comúnmente para
obj eti vos especí fi cos.

Una apl i caci ón tí pi ca consi ste en acel erar el proceso de
sedi mentaci ón, di vi di endo el pl asma y el suero en un
proceso de anál i si s de l aboratori o. Tambi én se uti l i za
para determi nar el grupo sanguí neo medi ante una toma
de muestra capi l ar. En este caso l a máqui na uti l i zada se
denomi na mi crocentrí fuga.

Incubadora: Se denomi na i ncubadora a di sposi ti vos de di ferente ti po que ti enen
l a funci ón común de crear un ambi ente con l a humedad y temperatura
adecuadas para el creci mi ento o reproducci ón de seres vi vos.

En mi crobi ol ogí a una i ncubadora es un equi po cerrado
que permi te control ar l a temperatura, humedad y otras
condi ci ones necesari as para el desarrol l o de un cul ti vo
mi crobi ol ógi co.

Las i ncubadoras más si mpl es son cámaras ai sl adas con
temperatura ajustabl e que tí pi camente va de 60 a 65º
C, aunque pueden al canzar temperaturas mayores,
general mente hasta 100º C. Los model os mas
sofi sti cados i ncl uyen l a posi bi l i dad de refri gerar el
conteni do, control ar l a humedad, y el ni vel de di óxi do
de carbono.

La mayorí a de l os equi pos i ncl uye un tempori zador programabl e, para real i zar
ci cl os de temperaturas vari abl es al i gual que de l os otros factores ambi ental es.
El tamaño de l as i ncubadoras puede vari ar desde un tamaño para usar sobre una
mesa, hasta cámaras del vol umen de una habi taci ón.

Otra capaci dad de l as i ncubadoras de este ti po es control ar l a vel oci dad de
vi braci ón, medi da en revol uci ones por mi nuto.

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La temperatura de cul ti vo para l as bacteri as más comunes, como por ejempl o
Escheri chi a col i es de 36 a 37ºC. Para otros organi smos como el de l a l evadura
de cerveza (Saccharomyces cerevi si ae) se requi eren temperaturas del orden de
30ºC.

3 ME DI OS Y T É CNI CAS DE CUL T I VO.

Uno de l os si stemas más i mportantes para l a i denti fi caci ón de mi croorgani smos
es observar su creci mi ento en sustanci as al i menti ci as arti fi ci al es preparadas en el
l aboratori o. El materi al al i menti ci o en el que crecen l os mi croorgani smos es el
Medi o de Cul ti vo y el creci mi ento de l os mi croorgani smos es el Cul ti vo. Se han
preparado más de 10.000 medi os de cul ti vo di ferentes.

Para que l as bacteri as crezcan adecuadamente en un medi o de cul ti vo arti fi ci al
debe reuni r una seri e de condi ci ones como son: temperatura, grado de
humedad y presi ón de oxí geno adecuado, así como un grado correcto de aci dez
o al cal i ni dad. Un medi o de cul ti vo debe contener l os nutri entes y factores de
creci mi ento necesari os y debe estar exento de todo mi croorgani smo
contami nante.

La mayorí a de l as bacteri as patógenas requi eren nutri entes compl ej os si mi l ares
en composi ci ón a l os l í qui dos orgáni cos del cuerpo humano. Por eso, l a base de
muchos medi os de cul ti vo es una i nfusi ón de extractos de carne y Peptona a l a
que se añadi rán otros i ngredi entes.

El agar es un el emento sol i di fi cante muy empl eado para l a preparaci ón de
medi os de cul ti vo. Se l i cúa compl etamente a l a temperatura del agua hi rvi endo
y se sol i di fi ca al enfri arse a 40 grados. Con mí ni mas excepci ones no ti ene efecto
sobre el creci mi ento de l as bacteri as y no es atacado por aquel l as que crecen en
él .

La Gel ati na es otro agente sol i di fi cante pero se empl ea mucho menos ya que
bastantes bacteri as provocan su l i cuaci ón.

En l os di ferentes medi os de cul ti vo se encuentran numerosos materi al es de
enri queci mi ento como hi dratos de carbono, suero, sangre compl eta, bi l i s, etc.
Los hi dratos de Carbono se adi ci onan por dos moti vos fundamental es: para
i ncrementar el val or nutri ti vo del medi o y para detectar reacci ones de
fermentaci ón de l os mi croorgani smos que ayuden a i denti fi carl os. El suero y l a
sangre compl eta se añaden para promover el creci mi ento de l os
mi croorgani smos menos resi stentes.

Tambi én se añaden col orantes que actúan como i ndi cadores para detectar, por
ej empl o, l a formaci ón de áci do o como i nhi bi dores del creci mi ento de unas
bacteri as y no de otras (el Roj o Fenol se usa como i ndi cador ya que es roj o en
pH bási co y amari l l o en pH áci do. La Vi ol eta de Genci ana se usa como
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i nhi bi dor ya que i mpi de el creci mi ento de l a mayori a de l as bacteri as Gram-
posi ti vas).

La evol uci ón de l os medi os de cul ti vo

Podemos deci r que l a mi crobi ol ogí a empi eza su verdadero desarrol l o como
ci enci a en el momento en que se descubre el mi croscopi o y comi enza l a
observaci ón de l os pri meros mi croorgani smos, pero es i ndudabl e que l a puesta
a punto de l os medi os de cul ti vo y l a uti l i zaci ón del agar como sol i di fi cante,
marcan dos i mportantes puntos de i nfl exi ón en su evol uci ón.

La pri mera noti ci a de l a uti l i zaci ón de medi os de cul ti vo nos l l ega del mi cól ogo
Brefel d, que consi gui ó ai sl ar y cul ti var esporas de hongos en medi os sól i dos
real i zados a base de gel ati na.

Si n embargo este si stema no era adecuado para l as bacteri as (por su menor
tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Li ster popul ari zó un método
enfocado al cul ti vo puro basado en di l uci ones seri adas en un medi o l í qui do.

Koch real i zó sus i nvesti gaci ones uti l i zando en un pri mer momento rodaj as de
patata como soporte nutri ti vo sól i do, pero no tardó en recurri r al cal do de
carne l í qui do, di señado por Loeffl er, al que, en 1881, añadi ó gel ati na, l ogrando
un medi o sól i do transparente i deal para l a observaci ón de l a morfol ogí a
macroscópi ca de l as col oni as mi crobi anas.

En el año 1882 ti ene l ugar uno de l os grandes avances de l a mi crobi ol ogí a en
rel aci ón con l os medi os de cul ti vo: el médi co al emán Wal ter Hesse i ntroduce el
agar-agar (pol i sacári do extraí do de al gas rojas) como sol i di fi cante.

En 1887 un ayudante de Koch l l amado Petri , comi enza a uti l i zar pl acas de
cri stal pl anas, que se l l aman desde entonces pl acas de Petri , para susti tui r a l as
cl ási cas bandejas de vi dri o cubi ertas con campanas que se usaban hasta
entonces.

Bei jeri nck y Wi nogradsky, que desde de 1888 real i zaron sus i nvesti gaci ones
sobre l as bacteri as qui mi oautótrofas (uti l i zaci ón de ni trógeno y azufre sobre
todo) tuvi eron gran i mportanci a en el desarrol l o de l os medi os sel ecti vos y de
enri queci mi ento. Di señaron este ti po de medi os de tal forma que su especi al
composi ci ón quí mi ca favorecí a el creci mi ento de ci ertos ti pos de
mi croorgani smos que, en funci ón de sus procesos metaból i cos, eran l os úni cos
capaces de uti l i zar para su desarrol l o ci ertos nutri entes del medi o.

En 1892 Würtz i mpul só el uso de l os medi os di ferenci al es, i ncorporando
i ndi cadores de pH a l a composi ci ón de ci ertos medi os con l o cual se podí a
observar l a producci ón de áci dos en l a fermentaci ón en ci ertos
mi croorgani smos.

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En l os l aboratori os de mi crobi ol ogí a se uti l i zan di ferentes ti pos de medi os de
cul ti vo que pueden ser preparados en forma l í qui da o en forma sól i da.
Usual mente para preparar un medi o sól i do se parte de un medi o l í qui do al que
se l e añade un agente sol i di fi cante como el agar, l a gel ati na o l a sí l i cagel .

Los medi os de cul ti vo se pueden cl asi fi car de acuerdo a l a natural eza de sus
consti tuyentes en:

 Medi os natural es o compl ejos: consti tui dos por sustanci as compl ejas de
ori gen ani mal o vegetal , l as que son usual mente compl ementadas por l a adi ci ón
de mi neral es y otras sustanci as. En el l os no se conocen todos l os componentes
ni l as canti dades exactas presentes de cada uno de el l os.

 Medi os defi ni dos o si ntéti cos: son l os medi os que ti enen una composi ci ón
quí mi ca defi ni da cual i y cuanti tati vamente. General mente se usan en trabajos de
i nvesti gaci ón. Ll evan fuente de carbono, fuente de ni trógeno, sal es que supl an
i ones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros el ementos como son esti mul adores del
creci mi ento (eri tri tol para Bruci l l a abortus) pero si empre a concentraci ones
conoci das.

De acuerdo al uso del medi o de cul ti vo, éstos se cl asi fi can en:

 Medi os de enri queci mi ento: son medi os l í qui dos que favorecen el creci mi ento
de un ti po de mi croorgani smo en parti cul ar. Permi ten aumentar el número de
mi croorgani smos de ese ti po. Usual mente conti enen una o más sustanci as
i nhi bi doras del creci mi ento de l os mi croorgani smos con excepci ón de l os que se
qui eren cul ti var. Ej empl o: adi cci ón de sangre, suero o extractos de tej i dos de
ani mal es y pl antas.

 Medi os sel ecti vos: son pareci dos a l os de enri queci mi ento, se di ferenci an por
ser medi os sól i dos y están di señados para el ai sl ami ento de mi croorgani smos
especí fi cos.

Ej empl o: CO
2
como fuente de carbono es sel ecti vo para autótrofos;
adi ci onando cri stal vi ol eta se i nhi be el creci mi ento de l os Gram. (+); uti l i zando
mal tosa como úni ca fuente de carbono sól o crecerán l os que usen mal tosa.

 Medi os di ferenci al es: son medi os que conti enen i ndi cadores de productos
deri vados de l a acti vi dad mi crobi ana de l os mi croorgani smos, esta desti nados a
faci l i tar l a di scri mi naci ón de mi croorgani smos de una mezcl a por sus
propi edades di ferenci al es de creci mi ento en di chos medi os. No conti enen
ni ngún ti po de sustanci a con acti vi dad anti mi crobi ana. Permi ten revel ar
caracterí sti cas fi si ol ógi cas de l os mi croorgani smos.

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Ej empl o: Agar sangre di ferenci a hemol í ti cos de no hemol í ti cos; McConkey
di ferenci a l actosa (+) de l actosa (-).

Los medi os de cul ti vo se pueden preparar en el l aboratori o a parti r de cada uno
de sus consti tuyentes bási cos o por si mpl e rehi drataci ón de productos asequi bl es
comerci al mente (medi os de cul ti vo deshi dratados). General mente se prefi ere el
uso de l os medi os de cul ti vo deshi dratados porque, además de si mpl i fi car el
trabajo, con el l os se ti ene mayor probabi l i dad de obtener resul tados
reproduci bl es.

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Para su preparaci ón se deben tener en cuenta l os si gui entes aspectos:

1. Prepararl os sól o a parti r de productos que provengan de fabri cantes o
proveedores que sumi ni stren productos de cal i dad.
2. Uti l i zar agua desti l ada o desmi neral i zada con una cal i dad mi crobi ol ógi ca y
fi si coquí mi ca adecuada.
3. Uti l i zar materi al es de vi dri os bi en l avados y enjuagados con agua desti l ada o
desmi neral i zada.
4. Control ar el ti empo y l a temperatura recomendada durante su esteri l i zaci ón.
Nunca se deben exceder l as condi ci ones señal adas por el fabri cante.

Agar nutri ti vo:
Medi o de cul ti vo uti l i zado para propósi tos general es, para el ai sl ami ento de
mi croorgani smos poco exi gentes en l o que se refi ere a requeri mi entos
nutri ti vos. Su uso está descri to en muchos procedi mi entos para el anál i si s de
al i mentos, aguas y otros materi al es de i mportanci a sani tari a.


Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada.
Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar
suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su
disolución. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15
minutos
Extracto de carne 3.0
Cloruro de sodio 8.0
Agar 15.0
pH final: 7.3

Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos
nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente
de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Características del medio: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.
Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
MSc. Nelson Zamora Rodríguez
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Base agar gel osa sangre:
Medi o para propósi tos general es,
para el ai sl ami ento y cul ti vo de
numerosos mi croorgani smos. Con
l a adi ci ón de sangre, el medi o es
úti l tanto para el ai sl ami ento y
cul ti vo de mi croorgani smos
aerobi os y anaerobi os
nutri ci onal mente exi gentes a parti r de una gran vari edad de muestras, como
para l a observaci ón de reacci ones de hemól i si s.

Tambi én, este medi o de cul ti vo, puede uti l i zarse como medi o base para
preparar el medi o agar chocol ate.


Fundamento:
La i nfusi ón de múscul o de corazón y l a peptona, otorgan al medi o un al to val or
nutri ti vo, que permi te el creci mi ento de una gran vari edad de mi croorgani smos,
aún de aquel l os nutri ci onal mente exi gentes.

El cl oruro de sodi o manti ene el bal ance osmóti co.
El agregado de sangre al medi o de cul ti vo, en concentraci ón fi nal de 5-10%,
aporta nutri entes para el creci mi ento bacteri ano, y permi te detectar hemól i si s.

Caracterí sti cas del medi o:
Medi o preparado: ámbar.
Medi o preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

Mac Conkey Agar
Este medi o se uti l i za para el ai sl ami ento de baci l os Gramnegati vos de fáci l
desarrol l o, aerobi os y anaerobi os facul tati vos. Permi te di ferenci ar bacteri as que
uti l i zan o no, l actosa en muestras cl í ni cas, de agua y al i mentos. Todas l as
especi es de l a fami l i a Enterobacteri aceae desarrol l an en el mi smo.

Fórmul a (en gramos por l i tro) Instrucci ones
Peptona 17.0 Suspender 50 g del pol vo por l i tro de
agua desti l ada. Reposar 5 mi nutos y
mezcl ar hasta uni formar. Cal entar
suavemente y hervi r 1 a 2 mi nutos hasta
di sol ver. Esteri l i zar en autocl ave a 121C
durante 15 mi nutos.

Pl uri peptona 3.0
Lactosa 10.0
Mezcl a de sal es bi l i ares 1.5
Cl oruro de sodi o 5.0
Agar 13.5
Roj o neutro 0.03
Cri stal vi ol eta 0.001
pH fi nal : 7.1


Fórmul a (en gramos por l i tro)
Infusi ón de múscul o de corazón 375.0
Peptona 10.0
Cl oruro de sodi o 5.0
Agar 15.0
pH fi nal : 7.3
Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
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Los medi os de cul ti vo deshi dratados se deben al macenar en envases sel l ados
bajo l as condi ci ones que señal e el fabri cante. General mente se al macenan en un
l ugar fresco (entre 15 y 25ºC), con poca humedad y protegi dos de l a l uz sol ar
di recta. Nunca se deben al macenar cerca de autocl aves, hornos, ni otra fuente
de cal or o vapor.

Los medi os de cul ti vo deshi dratados se deben descartar cuando se hi draten o
decol oren.

Una vez que el medi o de cul ti vo ha si do preparado y esteri l i zado se debe
al macenar entre 2 y 8ºC, a menos que el medi o requi era al guna condi ci ón
di ferente. Se deben mantener en reci pi entes bi en cerrados para evi tar su
deshi drataci ón. Cuando se usa tapón de al godón se debe col ocar por enci ma
una envol tura de papel (Craft).

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El cul ti vo de mi croorgani smos consi ste en proporci onarl es l as condi ci ones
fí si cas, quí mi cas y nutri ti vas adecuadas para que puedan mul ti pl i carse de forma
control ada. En general , podemos di sti ngui r cul ti vos l í qui dos y sól i dos en
funci ón de l as caracterí sti cas del medi o y cul ti vos di sconti nuos y conti nuos en
funci ón de l a di sponi bi l i dad de nutri entes en el medi o.

Durante el creci mi ento mi crobi ano se produce un aumento del número de
mi croorgani smos a l o l argo del ti empo. Por tanto, no nos referi mos al
creci mi ento de un úni co mi croorgani smo que denomi naremos ci cl o cel ul ar, si no
al demográfi co de una pobl aci ón.

Se denomi na ci cl o cel ul ar al proceso de desarrol l o de una bacteri a ai sl ada. A l o
l argo del ci cl o ti ene l ugar l a repl i caci ón del materi al genéti co, l a sí ntesi s de
componentes cel ul ares, l a el ongaci ón de l a bacteri a para al canzar un tamaño
dobl e del i ni ci al y su di vi si ón por bi parti ci ón para dar l ugar a dos cél ul as hi jas.
La duraci ón del ci cl o cel ul ar coi nci de con el ti empo de generaci ón y depende,
en general , de l os mi smos factores de l os que depende este.

Creci mi ento mi crobi ano en medi o l í qui do: Si l a bacteri a crece en un medi o
l í qui do, en l a mayorí a de l os casos l as cél ul as que se producen en cada di vi si ón
conti núan su vi da i ndependi entemente formándose una suspensi ón de cél ul as
l i bres.

En un cul ti vo di sconti nuo de bacteri as en medi o l í qui do, se pueden di ferenci ar
cuatro fases en l a evol uci ón de l os parámetros que mi den el creci mi ento
mi crobi ano:

Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
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a.- Fase l ag o de adaptaci ón durante l a que l os mi croorgani smos adaptan su
metabol i smo a l as nuevas condi ci ones ambi ental es (abundanci a de nutri entes y
condi ci ones de cul ti vo) para i ni ci ar l a fase de creci mi ento exponenci al .

b.- Fase exponenci al o l ogarí tmi ca: en el l a l a vel oci dad de creci mi ento es
máxi ma y el ti empo de generaci ón es mí ni mo. Durante esta fase l as bacteri as
consumen a vel oci dad máxi ma l os nutri entes del medi o. La evol uci ón del
número de cél ul as durante esta fase se expl i ca con l os model os matemáti cos que
descri bi remos a conti nuaci ón.


c.- Fase estaci onari a: en el l a no se i ncrementa el número de bacteri as (ni l a
masa u otros parámetros del cul ti vo). Las cél ul as en fase estaci onari a
desarrol l an un metabol i smo di ferente al de l a fase exponenci al y durante el l a se
produce una acumul aci ón y l i beraci ón de metabol i tos secundari os que pueden
tener i mportanci a i ndustri al .

Los mi croorgani smos entran en fase estaci onari a porque se agota al gún
nutri ente esenci al del medi o o porque l os productos de desecho que han
l i berado durante l a fase exponenci al hacen que el medi o sea i nhóspi to para el
creci mi ento mi crobi ano.

La fase estaci onari a ti ene gran i mportanci a porque probabl emente represente
con mayor fi del i dad el estado metaból i co real de l os mi croorgani smos en l os
ambi entes natural es.

d.- Fase de muerte: se produce una reducci ón del número de bacteri as vi abl es
del cul ti vo.

Creci mi ento mi crobi ano en medi o sól i do: Las fases, parámetros y ci néti ca de
creci mi ento di scuti das para el caso de l os cul ti vos l í qui dos se presentan tambi én
en cul ti vos sól i dos. La ci néti ca de creci mi ento, en este caso, se puede estudi ar
Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
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si gui endo l a evol uci ón del número de cél ul as vi abl es por uni dad de superfi ci e o
por uni dad de masa.

Cuando una cél ul a ai sl ada e i nmóvi l comi enza a crecer sobre un substrato
sól i do, el resul tado del creci mi ento al cabo del ti empo es una col oni a. Por
consi gui ente, se denomi na uni dad formadora de col oni a (UFC) a una cél ul a
bacteri ana vi va y ai sl ada que si se encuentra en condi ci ones de substrato y
ambi ental es adecuadas da l ugar a l a producci ón de una col oni a en un breve
l apso de ti empo. Si el número i ni ci al de bacteri as por uni dad de superfi ci e es
muy al to, l a confl uenci a de l as col oni as da l ugar a l o que se l l ama un césped
cuando se real i zan l os cul ti vos en pl acas de l aboratori o.

En el caso de mi croorgani smos móvi l es (desl i zantes) o en el de l os hongos
fi l amentosos que ti enen un creci mi ento trófi co no se producen col oni as ai sl adas
si no formaci ones más di fusas o mi cel i ares.

Concepto de muerte de un mi croorgani smo: Desde el punto de vi sta
mi crobi ol ógi co, un mi croorgani smo muere cuando pi erde de forma i rreversi bl e
l a capaci dad de di vi di rse. Como consecuenci a de esta pérdi da, no se produce
aumento en el número de mi croorgani smos y, por tanto, no hay creci mi ento.

Si n embargo, un mi croorgani smo puede estar muerto desde el punto de vi sta
mi crobi ol ógi co y conti nuar desarrol l ando una acti vi dad metaból i ca que se
traduzca, por ejempl o, en l i beraci ón de toxi nas. Por otra parte, hay que
consi derar que l a capaci dad de mul ti pl i caci ón (creci mi ento) de un
mi croorgani smo puede verse transi tori amente afectada por l esi ones o por l as
condi ci ones fí si cas o quí mi cas del entorno. En estos casos, podrí amos consi derar
como muertos mi croorgani smos que pueden reanudar su creci mi ento si l as
condi ci ones son de nuevo favorabl es.

Condi ci ones general es para el cul ti vo de mi croorgani smos

El desarrol l o adecuado de l os mi croorgani smos en un medi o de cul ti vo se ve
afectado por una seri e de factores de gran i mportanci a y que, en al gunos casos,
son aj enos por compl eto al propi o medi o.

a- di sponi bi l i dad de nutri entes adecuados: Un medi o de cul ti vo adecuado para
l a i nvesti gaci ón mi crobi ol ógi ca ha de contener, como mí ni mo, carbono,
ni trógeno, azufre, fósforo y sal es i norgáni cas. En muchos casos serán necesari as
ci ertas vi tami nas y otras sustanci as i nductoras del creci mi ento. Si empre han de
estar presentes l as sustanci as adecuadas para ej ercer de donantes o captadores
de el ectrones para l as reacci ones quí mi cas que tengan l ugar.

Todas estas sustanci as se sumi ni straban ori gi nal mente en forma de i nfusi ones de
carne, extractos de carne o extractos de l evadura. Si n embargo, l a preparaci ón
de estas sustanci as para su apl i caci ón a l os medi os de cul ti vo provocaban l a
pérdi da de l os factores nutri ti vos l ábi l es.
Unidad 1: Introducción a la microbiología / material de estudio
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Actual mente, l a forma más extendi da de aportar estas sustanci as a l os medi os es
uti l i zar peptona que, además, representa una fuente fáci l mente asequi bl e de
ni trógeno y carbón ya que l a mayorí a de l os mi croorgani smos, que no suel en
uti l i zar di rectamente l as proteí nas natural es, ti enen capaci dad de atacar l os
ami noáci dos y otros compuestos más si mpl es de ni trógeno presentes en l a
peptona.

Ci ertas bacteri as ti enen necesi dades nutri ti vas especí fi cas por l o que se añade a
muchos medi os, sustanci as como suero, sangre, l í qui do ascí ti co, etc. Igual mente
pueden ser necesari os ci ertos carbohi dratos y sal es mi neral es como l as de cal ci o,
magnesi o, manganeso, sodi o o potasi o y sustanci as promotoras del creci mi ento,
general mente de natural eza vi tamí ni ca.

Muy a menudo se añaden al medi o de cul ti vo ci ertos col orantes, bi en como
i ndi cadores de ci ertas acti vi dades metaból i cas o bi en por sus capaci dades de
ej ercer de i nhi bi dores sel ecti vos de ci ertos mi croorgani smos.

b- consi stenci a adecuada del medi o: Parti endo de un medi o l í qui do podemos
modi fi car su consi stenci a añadi endo productos como al búmi na, gel ati na o agar,
con l o que obtendrí amos medi os en estado semi sól i do o sól i do.

Los medi os sol i di fi cados con gel ati na ti enen el gran i nconveni ente de que
muchos mi croorgani smos no se desarrol l an adecuadamente a temperaturas
i nferi ores al punto de fusi ón de este sol i di fi cante y de que otros ti enen l a
capaci dad de l i cuarl a.

Actual mente l os medi os sól i dos son de uso uni versal , por su versati l i dad y
comodi dad, pero hay tambi én gran canti dad de medi os l í qui dos cuyo uso está
ampl i amente extendi do en el l aboratori o.

c- presenci a (o ausenci a) de oxí geno y otros gases: Gran canti dad de bacteri as
pueden crecer en una atmósfera con tensi ón de oxí geno normal . Al gunas
pueden obtener el oxí geno di rectamente de vari ados sustratos. Pero l os
mi croorgani smos anaerobi os estri ctos sól o se desarrol l arán adecuadamente en
una atmósfera si n oxí geno ambi ental . En un punto i ntermedi o, l os
mi croorgani smos mi croaerófi l os crecen mejor en condi ci ones atmosféri cas
parci al mente anaerobi as (tensi ón de oxí geno muy reduci da), mi entras l os
anaerobi os facul tati vos ti enen un metabol i smo capaz de adaptarse a cual qui era
de l as ci tadas condi ci ones.

d- condi ci ones adecuadas de humedad: Un ni vel mí ni mo de humedad, tanto en
el medi o como en l a atmósfera, es i mpresci ndi bl e para un buen desarrol l o de
l as cél ul as vegetati vas mi crobi anas en l os cul ti vos. Hay que prever el
manteni mi ento de estas condi ci ones mí ni mas en l as estufas de cul ti vo a 35-37ºC
proporci onando una fuente adecuada de agua que mantenga l a humedad
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necesari a para el creci mi ento de l os cul ti vos y evi tar así que se deseque el
medi o.
e- Luz ambi ental : La mayorí a de l os mi croorgani smos crecen mucho mej or en l a
oscuri dad que en presenci a de l uz sol ar. Hay excepci ones evi dentes como serí a
el caso de l os mi croorgani smos fotosi ntéti cos.

f- pH: La concentraci ón de i ones hi drógeno es muy i mportante para el
creci mi ento de l os mi croorgani smos. La mayorí a de el l os se desarrol l an mej or
en medi os con un pH neutro, aunque l os hay que requi eren medi os más o
menos áci dos. No se debe ol vi dar que l a presenci a de áci dos o bases en
canti dades que no i mpi den el creci mi ento bacteri ano pueden si n embargo
i nhi bi rl o o i ncl uso al terar sus procesos metaból i cos normal es.

g- Temperatura: Los mi croorgani smos mesófi l os crecen de forma ópti ma a
temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como l os psi crófi l os crecen a 0ºC y l os
temófi l os a 80ºC o i ncl uso a temperaturas superi ores (hi pertemófi l os). En l í neas
general es, l os patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más
cortos, al rededor de 37ºC, y l os saprofí tos ti enen rangos más ampl i os.

h- Esteri l i dad del medi o: Todos l os medi os de cul ti vo han de estar
perfectamente estéri l es para evi tar l a apari ci ón de formas de vi da que puedan
al terar, enmascarar o i ncl uso i mpedi r el creci mi ento mi crobi ano normal del o
de l os especi menes i nocul ados en di chos medi os. El si stema cl ási co para
esteri l i zar l os medi os de cul ti vo es el autocl ave (que uti l i za vapor de agua a
presi ón como agente esteri l i zante)

Concepto de cul ti vo puro: Se denomi na cul ti vo puro (axéni co) al que conti ene
sól o un ti po de mi croorgani smos. Los cul ti vos puros se i ni ci an a parti r de
col oni as ai sl adas, de manera que todos l os i ndi vi duos del mi smo tengan l a
mi sma composi ci ón genéti ca. Los cul ti vos puros son esenci al es para poder
estudi ar l as caracterí sti cas de l os mi croorgani smos y para poder i denti fi carl os
con seguri dad.

Si n embargo, cada vez se va conoce más sobre el funci onami ento de l as
comuni dades bacteri anas l o que debe hacernos refl exi onar sobre el hecho de
que un cul ti vo puro supone unas condi ci ones no natural es y que, por
consi gui ente, l a fi si ol ogí a de l os mi croorgani smos en ambi entes natural es puede
ser di ferente de l a que presentan en condi ci ones de cul ti vos puros.

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Métodos de ai sl ami ento: El ai sl ami ento de bacteri as a parti r de muestras
natural es se real i za, en l a mayorí a de l os casos, medi ante l a producci ón de
col oni as ai sl adas en cul ti vos sól i dos. El creci mi ento expl osi vo de l as bacteri as
permi te produci r un gran número de el l as a parti r de una úni ca cél ul a i ni ci al de
forma que, tras un peri odo de i ncubaci ón en l as condi ci ones ambi ental es
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adecuadas, se produce una col oni a observabl e a si mpl e vi sta y formada por
i ndi vi duos i gual es (un cl on bacteri ano).

Si n embargo, no todos l os mi croorgani smos presentes en l as muestras
ambi ental es son cul ti vabl es (mi croorgani smos no cul ti vabl es). Esto es debi do a
di fi cul tades i ntrí nsecas en el cul ti vo (mi croorgani smos parási tos de otros), al
desconoci mi ento de l os requeri mi entos especí fi cos de cul ti vo, y a l a exi stenci a
de grupos de mi croorgani smos que deben mantenerse en equi l i bri o para poder
sobrevi vi r (casos de si ntrofí a por ejempl o).

Se esti ma que en sól o en torno al 1% de l as bacteri as del suel o al 0,1 - 0,01 %
de l as bacteri as mari nas son cul ti vabl es. Exi sten procedi mi entos de
enri queci mi ento del número de bacteri as de ambi entes natural es para faci l i tar su
ai sl ami ento. Uno de el l os es l a Col umna de Wi nogradski que crea un
mi crocosmos para enri quecer el número de ci ertos ti pos de mi croorgani smos
presentes en ambi entes natural es con obj eto de faci l i tar su ai sl ami ento.

Medi da del creci mi ento y enumeraci ón de mi croorgani smos: Exi sten di ferentes
si stemas para detectar y medi r el creci mi ento de mi croorgani smos. Los
pri nci pal es, se enumeran a conti nuaci ón:

a.- Recuento di recto: consi ste en l a observaci ón al mi croscopi o de vol úmenes
muy pequeños de suspensi ones de bacteri as. Se usan unos portaobj etos
especi al es denomi nados cámaras de Petroff-Hausser. Para que l a medi da sea
correcta es necesari o que l a densi dad de cél ul as sea del orden de 105 por ml .
b.- Medi da de l a masa de cél ul as: el si stema se basa en que l as cél ul as en
suspensi ón di spersan l a l uz causando l a turbi dez del cul ti vo. La turbi dez
depende de l a masa en suspensi ón y, por tanto, mi di endo esta se puede esti mar
aquel l a. Este es el parámetro de medi da más fáci l de usar en l os cul ti vos de
l aboratori o. La densi dad de cél ul as debe ser del orden de 105 por ml .
c.- Recuento de vi abl es: consi ste en sembrar un vol umen determi nado de
cul ti vo o muestra sobre el medi o de cul ti vo sól i do adecuado para esti mar el
número de vi abl es contando el número de col oni as que se forman puesto que
cada una de estas deri va de una cél ul a ai sl ada. Para que l a medi da sea correcta
desde el punto de vi sta estadí sti co, es necesari o contar más de 300 UFC.

En ci ertas ocasi ones en l as que l a densi dad de mi croorgani smos es demasi ado
baja, éstos se pueden recol ectar por fi l traci ón a través de una membrana (de
0.2 μm de tamaño de poro) y posteri or col ocaci ón de l a membrana en un
medi o de cul ti vo adecuado para que se formen l as col oni as.

d.- Medi da del número de partí cul as usando contadores el ectróni cos de
partí cul as. Estos si stemas no nos i ndi can si l as partí cul as corresponden a cél ul as
vi vas o muertas; pero nos pueden dar una i dea del tamaño de l as partí cul as.
e. - Medi da de parámetros bi oquí mi cos tal es como l a canti dad de ADN, ARN,
proteí nas, pepti dogl i cano, etc. por uni dad de vol umen de cul ti vo.
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f.- Medi da de acti vi dad metaból i ca de l as bacteri as como que respi ran producen
una di smi nuci ón del potenci al redox del medi o en que se encuentran como
consecuenci a del consumo de oxí geno (uti l i zaci ón de col orantes sensi bl es a
oxi daci ón-reducci ón tal es como el azul de meti l eno).

4 TÉ CNI CAS DE OBS E R VACI ÓN.

El examen mi croscópi co es el pri mer paso para el estudi o de l as muestras
mi crobi ol ógi cas. Es un examen ori entati vo que proporci ona datos como l a
presenci a de bacteri as, su morfol ogí a, movi l i dad y caracterí sti cas ti ntori al es y
estructural es. Los mi croorgani smos obteni dos a parti r de una muestra cl í ni ca
pueden verse vi vos o muertos, aunque para l a i nvesti gaci ón de al gunas
caracterí sti cas bi ol ógi cas como l a movi l i dad, es necesari o observarl os vi vos.

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La observaci ón de l os mi croorgani smos requi ere de su respecti va preparaci ón
para su observaci ón, si endo l as más comunes l as si gui entes:

A. Examen en fresco (preparaci ones si n teñi r). Preparaci ón entre porta y
cubre objeto.

B. Examen de preparaci ones col oreadas:
-de gérmenes vi vos -> col oraci ón vi tal
-de gérmenes muertos -> ti nci ones

C. Estudi o de l a movi l i dad bacteri ana o de gota pendi ente

A. Examen en fresco (preparaci ones si n teñi r)
Consi ste en observar l os mi croorgani smos vi vos que puede haber en el producto
exami nado, si n fi jaci ón ni ti nci ón, en suspensi ón acuosa, pudi endo obj eti var su
canti dad, sus caracterí sti cas morfol ógi cas y su movi l i dad.

Es una técni ca de fáci l real i zaci ón, en l a que el producto a exami nar se si túa
entre porta y cubre. Si el materi al procede de una toma en medi o sól i do o de
una toma di recta, se emul si onará en una gota de agua desti l ada o sol uci ón
sal i na. Si el materi al es l í qui do se deposi tará di rectamente entre porta y cubre.

El vol umen de l a gota debe ser adecuado a l as di mensi ones del cubreobjetos ya
que, en caso contrari o, un exceso de l í qui do se traduci rá en un desbordami ento
de éste baj o l os l í mi tes del cubre, o un cubre "fl otante" que di fi cul tará l a
observaci ón por l a formaci ón de corri entes l í qui das.

Si el producto va a permanecer mucho ti empo en el portaobj etos, es
conveni ente preveni r l a desecaci ón medi ante l a apl i caci ón de parafi na en l os
bordes i nferi ores del cubreobj etos.
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La observaci ón se real i za, en general , con objeti vo de 40x en mi croscopi o de
campo cl aro. La mi croscopí a de contraste de fases y de campo oscuro faci l i ta
mucho l a vi si ón en fresco. Los exámenes en fresco permi ten, además, observar
l a presenci a de otros el ementos formes, como l eucoci tos, cri stal es, etc., que
pueden ser de gran ayuda en l a val oraci ón de l as muestras.

B. Examen de preparaci ones col oreadas:
Las técni cas de col oraci ón permi ten l a observaci ón morfol ógi ca con un mej or
contraste que en el examen en fresco, así como l a observaci ón de estructuras
cel ul ares. El examen mi croscópi co de preparaci ones teñi das ti ene una seri e de
pasos comunes previ os a l a ti nci ón, que son:

Preparaci ón del froti s:
a. La extensi ón del materi al sobre el portaobjetos se hará de di ferentes formas,
en funci ón de l a procedenci a del producto a exami nar. Si el producto es
l í qui do, se deposi tará una pequeña (muy pequeña) canti dad de materi al en el
centro del porta objeto, extendi éndol o con el asa hasta consegui r una capa
fi na y homogénea.
b. Si l a extensi ón debe hacerse a parti r de un cul ti vo en medi o sól i do, l a
col oni a que vayamos a estudi ar se mezcl ará con una goti ta de agua desti l ada
estéri l col ocada en el centro del porta objeto. Convi ene recordar que no es
necesari o deposi tar una gran canti dad de producto, pues se di fi cul tarí a l a
vi sual i zaci ón, y que un exceso de agua sol o contri buye a
aumentar el ti empo en secar l a preparaci ón.
c. Por úl ti mo, si el producto se ha recogi do con una torunda
(exudados) debe extenderse di rectamente sobre el
portaobj etos, procurando que el al godón "ruede", en vez de
"frotar" el porta; de esta manera se consi gue preservar
mejor l os el ementos cel ul ares que pudi esen acompañar a l as
bacteri as, a l a vez que se conserva l a agrupaci ón de éstas,
en caso de que l as hubi ere. Froti s en caja
Froti s en pl aca

Secado:
a. Una vez efectuada l a extensi ón del froti s debemos dej ar secar al ai re l a
preparaci ón.
b. Cuando l a preparaci ón está seca l a superfi ci e del froti s pasa de ser bri l l ante a
mate.
c. El secado se puede acel erar cal entando l i geramente l a parte i nferi or del
porta objeto (si n quemar).


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Fi jado:
a. El úl ti mo paso antes de proceder a l a ti nci ón es l a fi jaci ón de l a preparaci ón
al portaobj etos, medi ante l a coagul aci ón rápi da de l as al búmi nas
ci topl asmáti cas. Con esto consegui mos que el producto adheri do al
portaobj etos no sea el i mi nado, ni vea al teradas sus caracterí sti cas
morfol ógi cas y estructural es en l os procedi mi entos de ti nci ón posteri ores.
b. La fi jaci ón puede hacerse por cal or suave, pasando el portaobj eto sobre una
l l ama o medi ante l a uti l i zaci ón de pl acas cal efactoras especi al es a 37ºC.
c. Tras l a fi jaci ón por cal or es muy i mportante esperar a que l a preparaci ón se
enfrí e antes de proceder a real i zar cual qui er procedi mi ento de ti nci ón.
d. Si el materi al que se va a teñi r puede poseer abundante materi al cel ul ar
(l eucoci tos, cél ul as epi tel i al es, etc.) que convi ene vi sual i zar tambi én, es
preferi bl e recurri r al al cohol metí l i co para fi jar l a preparaci ón
e. Una vez cubi erta de al cohol l a preparaci ón, se deja actuar durante un
mi nuto, el i mi nando después el exceso y dejando secar a temperatura
ambi ente.

Col oraci ón o ti nci ón:
a. La ti nci ón consi ste en cubri r l a preparaci ón con uno o vari os col orantes de
forma secuenci al durante un ti empo determi nado.
b. La adi ci ón de un col orante a un froti s si n enfri ar puede provocar l a
preci pi taci ón del col orante y l a vi sual i zaci ón de artefactos que pueden
confundi rnos en el proceso de observaci ón al mi croscopi o.
c. Tras l a ti nci ón, l a preparaci ón se l ava con agua, procurando que el chorro
no cai ga con fuerza sobre l a preparaci ón y fi nal mente se seca al ai re o
medi ante absorci ón con papel .

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El térmi no “i nocul aci ón” se refi ere a l a i ncorporaci ón de una sustanci a en un
organi smo. Puede real i zarse para trasmi ti r una enfermedad o proporci onar
medi os de defensa o i nmuni dad a di cho organi smo.

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La ti nci ón es una técni ca uti l i zada para resal tar rasgos estructural es de l os
mi croorgani smos, como l a presenci a de ci l i os o fl agel os, resal tar organel os
cel ul ares como el núcl eo o bi en para di ferenci ar a l os mi croorgani smos.

Ti pos de preparaci ones col oreadas:

A. Ti nci ones si mpl es
-Azul de meti l eno
-Cri stal vi ol eta
-Fucsi na
C. Ti nci ones estructural es
-Ti nci ón de cápsul as
-Ti nci ón de fl agel os
-Ti nci ón de esporas
-Ti nci ón de corpúscul os
metacromáti cos

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B. Ti nci ones dobl es, compuestas o
di ferenci al es
-Ti nci ón de Gram
-Ti nci ón de Zi ehl -Ni el sen
-Ti nci ón de Tam-Thi am-Hok
D. Ti nci ones especi al es:
-Ti nci ón negati va
-Ti nci ones fl uorescentes
-Ti nci ón de aurami na-rodami na
-Ti nci ón con naranj a de acri di na


A. Ti nci ones si mpl es:
Las ti nci ones si mpl es se uti l i zan para observar l a morfol ogí a y el agrupami ento
bacteri anos. Cual qui er col orante es vál i do para este ti po de ti nci ón, aunque l os
más uti l i zados habi tual mente son: Azul de meti l eno, Cri stal vi ol eta, Fucsi na

El método para real i zar una ti nci ón si mpl e es bi en senci l l o:
1) hacer un froti s sobre un portaobj eto, secar y fi jar,
2) cubri r l a preparaci ón con el col orante el egi do, durante el ti empo
especi fi cado,
3) l avar con agua, arrastrando todo el exceso de col orante,
4) secar al ai re o al cal or suave,
5) observar al mi croscopi o a 1000x con objeti vo de i nmersi ón (y acei te)

Las bacteri as se verán teñi das del mi smo col or que el col orante que se uti l i zó.

B. Ti nci ones di ferenci al es:
Se uti l i zan para poner de mani fi esto di ferenci as estructural es entre bacteri as

Ti nci ón de Gram:
Es l a col oraci ón di ferenci al más uti l i zada en Mi crobi ol ogí a, ya que di ferenci a a
l as bacteri as en dos grandes grupos: Gram posi ti vas y Gram negati vas, según
retengan o no el cri stal vi ol eta uti l i zado en l a ti nci ón.

Prácti camente todos l os autores están de acuerdo en uti l i zar esta ti nci ón como
pri mer paso en l a i denti fi caci ón bacteri ana. Su i mportanci a resi de en que una
i ncorrecta i nterpretaci ón puede hacer vari ar el número de pruebas subsi gui entes
desti nadas a efectuar l a i denti fi caci ón, al ejándonos consi derabl emente del
género y especi e verdaderos.

El fundamento de esta ti nci ón se basa en l a i ncapaci dad de l as bacteri as Gram
negati vas para retener el cri stal vi ol eta cuando son decol oradas por una mezcl a
de al cohol y acetona. Las bacteri as Gram posi ti vas, que no son decol oradas por
el al cohol acetona, reti enen el col orante i ni ci al (cri stal vi ol eta) y mostrarán esa
col oraci ón al fi nal de l a técni ca. Las bacteri as Gram negati vas cogerán el
segundo col orante (safrani na) y se mostrarán como bacteri as de col or roj o.

Resul tados:
Bacteri as Gram posi ti vas: se verán de col or vi ol eta o azul i ntenso.
Bacteri as Gram negati vas: se observarán de col or rojo.

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Observaci ones:
El l ugol se uti l i za como mordi ente (no como col orante), para favorecer l a
retenci ón del cri stal vi ol eta por parte de l as bacteri as Gram posi ti vas.

Los cul ti vos vi ej os (más de 24 horas) pueden hacerse más sensi bl es a l a
decol oraci ón, pudi endo aparecer como Gram negati vas bacteri as que no l o son.

Ti nci ón de Zi ehl Neel sen
Se uti l i za para objeti var l a presenci a de baci l os áci do-al cohol resi stente en una
muestra o preparaci ón.

El método uti l i za un procedi mi ento si mi l ar al de l a ti nci ón de Gram, es deci r:
col oraci ón i ni ci al , decol oraci ón y adi ci ón de un contra col orante o col orante de
contraste.

Tras l a preparaci ón del froti s, secado y fi jaci ón se procede como si gue:
1. Cubri r l a preparaci ón total mente con carbol -fucsi na o fucsi na feni cada
2. Cal entar l a preparaci ón hasta l a emi si ón de vapores tres veces, dej ando que
se enfrí e.
3. Lavar y decol orar con al cohol cl orhí dri co al 3% hasta que no suel te más
col orante rojo.
4. Lavar y cubri r con azul de meti l eno durante unos mi nutos.
5. Lavar, secar y observar con obj eti vo de i nmersi ón. Las bacteri as áci do
al cohol resi stentes quedan teñi das de rojo y l as que no l o son, de azul .

Ti nci ón de Tan-Thi am-Hok
Esta col oraci ón permi te una ti nci ón más rápi da que el cl ási co procedi mi ento de
Zi ehl -Neel sen y evi ta l a necesi dad de cal entami ento. El resul tado es el mi smo
que en l a ti nci ón anteri or, observándose l os mi croorgani smos áci do al cohol
resi stente de col or rojo.

C. Ti nci ones estructural es:

Ti nci ón de esporas
Se real i zan para poner de mani fi esto l as formas de resi stenci a de l as bacteri as
(esporas) y su l ocal i zaci ón en l a cél ul a. Suel en uti l i zarse col orantes muy
concentrados y ti nci ón forzada por cal entami ento hasta emi si ón de vapores.

Uno de l os métodos más uti l i zados es el método de Wi rtz o del verde de
mal aqui ta, que consi ste en l a uti l i zaci ón de este col orante en cal i ente y
posteri or uti l i zaci ón de fucsi na di l ui da como contracol orante.
Tras l a ti nci ón l as esporas, si exi sten, se observan de col or verde, mi entras que
l as formas vegetati vas aparecen de col or rojo.

Ti nci ón de fl agel os
La observaci ón de fl agel os en preparaci ones teñi das es muy di fí ci l , debi do a que
se retraen con mucha faci l i dad y se adhi eren a l a pared cel ul ar. Se deben
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uti l i zar cul ti vos jóvenes (de menos de 24 horas), sembrados en agar semi sól i do,
empl eándose técni cas que engruesan l os fl agel os para faci l i tar su observaci ón.

Tras l a real i zaci ón de l a del i cada técni ca (extensi ón por i ncl i naci ón -si n asa-,
secado si n cal or, fi j aci ón con vapores de óxi do de osmi o) l os fl agel os aparecen
vi si bl es al mi croscopi o debi do al preci pi tado de pl ata formado a su al rededor.

Ti nci ón de cápsul as
La cápsul a es una capa gel ati nosa, de espesor vari abl e, si tuada al rededor de l a
pared cel ul ar bacteri ana. Como es di fí ci l teñi rl as, se consi guen mej ores
resul tados uti l i zando métodos que, col oreando el fondo de l a preparaci ón y el
mi croorgani smo, hacen resal tar l as cápsul as si n teñi r.

El método más uti l i zado es el de Burri o de l a ti nta chi na, en el que se ti ñen
pri mero l os mi croorgani smos con fucsi na di l ui da y posteri ormente se cubre l a
preparaci ón con ti nta chi na.

Tras el procedi mi ento de ti nci ón, se observan sobre un fondo negro l os
mi croorgani smos teñi dos de rojo y l a cápsul a como un hal o bl anco que l os
rodea.

Ti nci ón de corpúscul os metacromáti cos:
Los corpúscul os metacromáti cos son gránul os de reserva de fosfato del
mi croorgani smo, que al teñi rl os dan el col or compl ementari o al col orante
uti l i zado. Sol o aparecen en el género Corynebacteri um. Se uti l i zan vari os
métodos para su vi sual i zaci ón (Nei sser, Loeffl er y Al bert), dependi endo el
resul tado fi nal del método uti l i zado.

D. Ti nci ones especi al es:

Ti nci ón negati va:
Es una técni ca i ntermedi a entre l as ti nci ones propi amente di chas y l a
observaci ón en fresco, ya que carece de l as etapas de fi j aci ón y col oraci ón. Se
uti l i za, sobre todo, para estudi os de ti po morfol ógi co. Tras l a ti nci ón con
ni grosi na, l os mi croorgani smos aparecen i ncol oros sobre un fondo negro.

Ti nci ón de aurami na -rodami na
Estos dos fl uorocromos se fi jan sel ecti vamente sobre el áci do mi cól i co de l a
pared cel ul ar de l as mi cobacteri as, por l o que l a i nvesti gaci ón de éstas es su
pri nci pal apl i caci ón.

Tras l a ti nci ón, l os mi croorgani smos aparecen como puntos amari l l os o
amari l l o-verdosos bri l l antes sobre fondo negro. Es una ti nci ón equi val ente a l a
de Zi ehl -Neel sen, aunque mucho más sensi bl e y especí fi ca.



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Ti nci ón de naranja de acri di na:
Se basa en l a ti nci ón sel ecti va y di ferenci al de l os áci dos nucl ei cos por parte del
fl uorocromo naranj a de acri di na. Se uti l i za en l a i nvesti gaci ón de muestras con
escaso número de mi croorgani smos.

Tras l a ti nci ón, l os mi croorgani smos se observan con un col or rojo-anaranjado,
mi entras que otras cél ul as o restos de teji dos presentes en l a muestra aparecen
con una fl uorescenci a amari l l o-verdosa.

Estudi o de l a movi l i dad bacteri ana:

Las bacteri as pueden tener l a capaci dad de despl azarse en suspensi ones l í qui das
graci as a l os fl agel os. La observaci ón de esta caracterí sti ca puede ser muy
i mportante en el proceso de i denti fi caci ón bacteri ana.

El estudi o de l a movi l i dad real i zado medi ante l a observaci ón entre porta y
cubre de una gota de cal do de cul ti vo de vari as horas de creci mi ento puede
i nduci r a error al confundi r el movi mi ento bacteri ano con el "arrastre" de
bacteri as que se produce por l as corri entes l í qui das que se generan hasta que se
equi l i bra el componente l í qui do entre porta y cubre.

Técni ca de l a gota pendi ente:
La técni ca de l a gota pendi ente consi ste en l a observaci ón de una pequeña
canti dad de suspensi ón de mi croorgani smos en fase de creci mi ento exponenci al
en medi o l í qui do, pero exenta de l as fl uctuaci ones provocadas por l as
corri entes l í qui das que se generan entre porta y cubre.

Para l a real i zaci ón de l a técni ca de observaci ón medi ante el método de l a gota
pendi ente, se uti l i zan unos portas especi al es con una o dos excavaci ones que
permi ten col ocar un cubreobjetos i nverti do del que pende una pequeña gota de
l a suspensi ón bacteri ana que vamos a observar.

El tamaño de l a gota debe ser l o sufi ci entemente pequeño como para evi tar su
contacto con el portaobj eto y l o sufi ci entemente grande para evi tar una rápi da
desecaci ón durante el ti empo de observaci ón.

Es i mportante saber di ferenci ar el movi mi ento browni ano de partí cul as en
suspensi ón con el movi mi ento real produci do por l os mi croorgani smos. Las
repeti das observaci ones prácti cas de di ferentes mi croorgani smos permi ti rán
di sti ngui r perfectamente estos movi mi entos.


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I. TINCION SIMPLE.

a) Safrani na b) Cri stal vi ol eta c) Azul de meti l eno.
Safrani na........ 0.5 g
Agua desti l ada.100 mL
Cri stal vi ol eta..1 g
Agua desti l ada.100 mL
Azul de meti l eno... 3 mL
Etanol de 96%.....20 mL
Agua desti l ada....100 mL
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en
el agua
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en
el agua.
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en
al cohol .
Agregar el agua y fi l trar.

II. TINCION DE GRAM.

a) Cri stal vi ol eta y oxal ato de amoni o. (Reacti vo de Hucker)

Sol uci ón A:

Cri stal vi ol eta (pureza del col orante de por l o menos, el 90%)........ 2 g
Etanol (95%)................................................................................... 20 mL
Sol uci ón B:

Oxal ato de amoni o.............................................. 0.8 g
Agua desti l ada..................................................... 80 mL

Preparaci ón:
Mezcl ar cada uno de l os sol utos en su di sol vente respecti vo.
Dej ar l a sol uci ón de oxal ato de amoni o en reposo durante una noche o cal entar
l i geramente hasta que se sol ubi l i ce.
Mezcl ar l as dos sol uci ones y fi l trar.

b) Sol uci ón de yodo yodurado. (Lugol )

Yodo (quí mi camente puro).............. 1 g
Yoduro de potasi o. .......................... 2 g
Agua desti l ada............................ 300 mL

Preparaci ón:
Combi nar el yodo y el yoduro de potasi o con l a ayuda de un mortero.
Lavar el conteni do de éste con pequeñas al í cuotas de agua desti l ada.
Agregar agua sufi ci ente para obtener un total de 300 mL.
Agi tar fuertemente.
Al macenar l a sol uci ón en una botel l a oscura y con tapón de vi dri o.



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c) Al cohol acetona.

Al cohol etí l i co (95%)................................ 500 mL
Acetona.................................................... 300 mL

Preparaci ón:
Mezcl ar l os i ngredi entes respecti vos de cada combi naci ón para su uso.

d) Safrani na.

Safrani na (pureza del col orante, 90%). ... ... 0.25 g
Al cohol etí l i co (95%)...................................... 10 mL
Aforar con agua desti l ad .................................. 1000 mL

Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en el al cohol .
Agregar el agua desti l ada.
Fi l trar.
Al macenar en frasco con tapón de vi dri o.

III. TINCION DE ESPORAS. (Método de Schaeffer y Ful ton)

a) Verde de mal aqui ta al 5%. b) Safrani na al 0.5%.
Verde de mal aqui ta................. 5 g
Agua desti l ada..................... 100 mL
Safrani na.............................. 0.5 g
Agua desti l ada..................... 100 mL
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en el agua y
dej ar en reposo durante una hora y
medi a. Fi l trar. Guardar en frasco
oscuro.
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante y fi l trar.


IV. TINCION PARA FLAGELOS. (Método de Lei fson)

Col orante de Lei fson*.

Di sol uci ón acuosa saturada de Al K(SO
4
)
2
·12H
2
0 ó
Al NH
4
(SO
4
)
2
· 12H
2
O.................................................. 20 mL
Di sol uci ón acuosa al 20% de Aci do táni co................. 10 mL
Agua desti l ada....................................................... . 40 mL
Al cohol etí l i co al 95%.............................................. 15 mL
Di sol uci ón saturada en al cohol etí l i co al 95% de fucsi na bási ca 3 mL

Preparaci ón:
Mezcl ar l os i ngredi entes en el orden ci tado.
Guardar en un frasco bi en tapado.

* Se encuentra en el comerci o en forma de pol vo.
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V. TINCION DE FLAGELOS. (Al ternati va)

Sol uci ón A: Sol uci ón B: Sol uci ón C:
Fucsi na bási ca.... 1.2 g
Etanol (95%)..... 100 mL
Aci do táni co....... 3 g
Agua desti l ada... 100 mL
Cl oruro de sodi o.....1.5 g
Agua desti l ada....100 mL
Preparaci ón:
Di sol ver el col orante.
Fi l trar y tapar
perfectamente para
evi tar l a evaporaci ón.
Preparaci ón:
Di sol ver el reacti vo.
Si l a mezcl a no se usa
pronto adi ci onar fenol al
0.2% para preveni r el
desarrol l o de hongos.
Preparaci ón:
Di sol ver el reacti vo.
Esta sol uci ón es establ e a
temperatura ambi ente.

Preparaci ón:

Mezcl ar canti dades i gual es de l as sol uci ones A, B y C.
Guardar en frasco de vi dri o y mantener bi en tapado.

NOTA: La sol uci ón es establ e por 5 semanas a temperatura ambi ente y en
refri geraci ón dura vari os meses.

Col orante de contraste.

p-rosa ani l i na o azul de meti l eno................... 1 g
Agua desti l ada........................................... 100 mL

Preparaci ón:
Di sol ver el col orante en el agua.

VI. LACTOFENOL AZUL DE ALGODON.

Agua desti l ada................... 20 mL
Cri stal es de fenol Q. P........20 g
Áci do l ácti co......................20 mL
Gl i ceri na........................ 20 mL
Azul de al godón................... 0.05 g
Preparaci ón:
Di sol ver el fenol en el agua.
Agregar el áci do y l a gl i ceri na.
Cal entar a 70 °C.
Adi ci onar el col orante.
Guardar en frasco de vi dri o.

Bibliografía:

http://es.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADfuga
http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora
Gustavo A. Díaz Martín. 2 008. Técnicas de observación de microorganismos. 8 p.
Microbiología aplicada. Manual de Laboratorio
Gema Martínez Peral. 2 004. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológicos. 33 p.
Sanz, J. L. 2 003. Microbiología Ambiental. UAM. 4 p.