II.

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2. Ciclo de Krebs
La oxidacin de la Acetil-CoA derivada de la glucosa, los cidos grasos y los aminocidos es la funcin primaria del ciclo de Krebs, el cual la procesa en una serie de reacciones que se inician y terminan con el oxaloacetato; en cada vuelta del ciclo de Krebs se produce un ATP por fosforilacin a nivel del sustrato y se liberan cuatro pares de hidrgeno que alimentan la cadena respiratoria con la produccin de 12 ATP en la fosforilacin oxidativa. El ciclo de Krebs se lleva a cabo por enzimas solubles (a excepcin de la succinato deshidrogenasa que es parte integral de la membrana interna) de la matriz mitocondrial, figura 2.1. Adems de su papel central en la oxidacin de la acetil-CoA, el ciclo de Krebs participa en los siguientes procesos metablicos: a) Gluconeognesis: Rene numerosos sustratos que se convierten en oxaloacetato. Este compuesto sale de la mitocondria en forma de malato, citrato o aspartato y se transforma en el citosol, primero en fosfoenol piruvato y despus en glucosa. b) Biosntesis de los cidos Grasos: Aporta la molcula de citrato que, al salir de la mitocondria, es transformada con gasto de un ATP por la citratoliasa en oxaloacetato y acetil-CoA, que es el alimentador inicial de la biosntesis de los cidos grasos. El oxaloacetato se reduce a malato, el cual es oxidado por la enzima mlica para la produccin de NADPH, coenzima indispensable en la biosntesis de los cidos grasos. c) Interconversin de Aminocidos: Numerosos aminocidos entregan sus carbonos al ciclo de Krebs al transformarse por reacciones sucesivas en alguno de los metabolitos clave del ciclo: -cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato y oxaloacetato; una vez ah, mediante las reacciones del ciclo de Krebs, pueden transformarse en algn otro aminocido que se derive de otro intermediario del ciclo. d) Biosntesis de Purinas y Pirimidinas: El ciclo de Krebs alimenta la sntesis de bases pricas y pirimdicas aportando aspartato y glutamina. e) Biosntesis de Porfirinas: El ciclo de Krebs aporta el sustrato inicial: la succinilCoA. Regulacin del ciclo de Krebs. Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a la cadena respiratoria y recibe de ella las mismas coenzimas oxidadas, el ciclo de Krebs funciona bajo el control de la cadena respiratoria y depende en ltima instancia de la fosforilacin oxidativa. Sin embargo, el ciclo de Krebs responde a moduladores alostricos generados en el propio ciclo y tambin en otras vas del metabolismo; son moduladores negativos NADH, ATP, citrato, succinil-CoA y oxaloacetato y modulador positivo ADP.5,19 En la figura 2.2 se muestran estas interrelaciones.

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Figura 2.1 Ciclo del cido ctrico.4

Figura 2.2 Utilizacin de los intermediarios del ciclo del cido ctrico en la sntesis de biomolculas.3

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA PRCTICA No. 3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD SUCCINATO DESHIDROGENASA
NOMBRE:_______________________________GRUPO:__________FECHA:__________

TIEMPO DE PRCTICA: 1 Hora OBJETIVO:

Comprobar el funcionamiento del Ciclo de Krebs por medio de la actividad de una de las enzimas involucradas en dicho ciclo.

son protenas solubles presentes en la matriz mitocondrial, la succinato deshidrogenasa es nica porque est asociada a la membrana y se localiza de modo especfico en la membrana mitocondrial interna. Permitiendo la entrada de electrones en la cadena respiratoria formando parte del complejo II. 2

PREGUNTAS PRELABORATORIO
1.-Qu es la succinato deshidrogenasa y en qu va metablica ejerce su accin? 2.-Cules son los productos de su actividad?

FUNDAMENTO
La conversin de succinato a fumarato, la tercera oxidacin del ciclo del cido ctrico, es catalizada por la succinato deshidrogenasa, una flavoprotena y oxidoreductasa que contiene FAD, figura 2.3. Dicha enzima exhibe una estricta especificidad estereoqumica, eliminando hidrgeno en forma exclusiva por eliminacin trans. No se conocen caractersticas regulatorias in vivo significativas para este paso. La enzima est sujeta a una poderosa inhibicin competitiva por el malonato, lo que constituye una manera de inhibir la actividad del ciclo del cido ctrico en sistemas de laboratorio. Mientras que las otras enzimas del ciclo del cido ctrico

Figura 2.3 Conversin de succinato a fumarato. En este experimento se utiliza el Azul de Metileno como el aceptor final de electrones.27

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MATERIAL Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL DE LABORATORIO: - Bao maria - 1 Mortero - 1 Gradilla - 2 Tubos de ensaye - 2 Pipetas de 5 mL - 1 Pipeta de 1 mL - 1 Termmetro de 0 a 100C - Arena de vidrio. MATERIAL BIOLGICO: - Aceite de vaselina o vegetal, 10 mL - Msculo fresco de res o paloma (pichn), 1g REACTIVOS: (Para su preparacin vase la preparacin de soluciones). - cido succnico al 3% neutralizado con hidrxido de sodio al 10% hasta pH 7.4, 50 ml

- Azul de metileno al 0.001%, 25 mL - cido tricloroactico al 20%, 10 mL MTODO: 1. Triture cuidadosamente con arena de vidrio 1 g de msculo en un mortero, aadiendo de 3 a 4 mL de la disolucin de cido succnico y filtre a travs de una gasa la mezcla. 2. El lquido homogeneizado se reparte en dos porciones iguales, las cuales se pondrn en tubos de ensaye. 3. En el tubo control se aade 1 mL de disolucin de cido tricloroactico para destruir la enzima. 4. Aada a ambos tubos de 1 a 2 gotas de azul de metileno y agtelos. 5. Sobre la superficie del lquido de cada tubo se vierten de 0.5 a 1 mL de aceite con el fin de aislar el oxgeno del aire. 6. Los tubos se incuban en bao Mara a 50 C durante 10 minutos. 7. Una vez transcurrido este tiempo, en el tubo de ensaye experimental se observa la decoloracin del azul de metileno.1

HOJA DE RESULTADOS
NOMBRE:_______________________________GRUPO:__________FECHA:__________ 1.- Anota los cambios de color en los tubos. 2.- Explica Por qu el azul de metileno puede actuar como indicador cuando la enzima est presente y activa?

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

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CUESTIONARIO
1.-Por qu se utiliza msculo como material biolgico de experimentacin? 2.-Nombra las enzimas del ciclo de Krebs e indica el tipo de reaccin que cataliza cada una. Indica cules actan como oxido-reductasas y cul es su cofactor? 3.-En la reaccin en la cual la succinilCoA es convertida a succinato una molcula de GTP es producida. Es sabido que la produccin de GTP es equivalente a la de ATP. Cmo puedes explicar esto considerando los siguientes cambios de reaccin? GTP+ADP = GDP+ATP

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA PRCTICA No. 4 CUANTIFICACIN DE LA RESPIRACIN AEROBIA POR EL MTODO COLORIMTRICO
NOMBRE:_______________________________GRUPO:__________FECHA:__________

TIEMPO DE PRCTICA: 2 Horas OBJETIVO:

Comprobar el evento de la respiracin a travs de la formacin de un subproducto natural como es el bixido de carbono.

PREGUNTAS PRELABORATORIO
1.- Qu es la respiracin? 2.-Bajo que condiciones se da la respiracin aerobia?

FUNDAMENTO
A bajas concentraciones de oxgeno se puede esperar que tengan lugar en la planta reacciones tanto aerobias como anaerobias. En condiciones anaerobias, el CO2 seria uno de los productos. A medida que va aumentando la concentracin de oxgeno, la produccin anaerobia de CO2 desciende rpidamente, mientras que la respiracin aerobia aumenta. Entre lmites amplios de concentracin y oxgeno, es interesante medir tanto la produccin de CO2 como el consumo de O2. El consumo de oxgeno nos proporciona una medida de la respiracin aerobia, al igual que la produccin de CO2 una vez que se ha sobrepasado el punto de extincin.

Sin embargo, por debajo del punto de extincin la produccin de CO2 es debida en parte a la respiracin aerobia y en parte a la respiracin anaerobia, mientras que el consumo de O2 por debajo de ese punto es aun una medida estricta de la respiracin aerobia. La determinacin de la participacin de ambos gases para distintas concentraciones de O2 comprendidas entre amplios lmites nos permite medir la respiracin tanto aerobia como anaerobia. Despus de numerosos estudios sobre la intensidad de respiracin de una amplia variedad de plantas, se puede hacer una afirmacin general: a medida que la concentracin de oxgeno va aumentando a partir de cero, se produce un incremento de la intensidad de la respiracin aerobia. En la mayora de las plantas, este incremento es hiperblico, es decir, el incremento de la intensidad se anula, al hacerlo la intensidad de la concentracin de oxgeno.13

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL DE LABORATORIO: - 4 Frascos de 500 mL con tapa - 4 Vasos de precipitados de 50 mL - 1 Probeta de 50 mL - 1 Bureta de 25 mL - 1 Pipeta de 5 mL - 1 Pipeta de 10 mL - 1 Vaso de precipitados de 500 mL

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- 1 Termmetro de 0 a 100C - Algodn - Manta de cielo o gasa - Cordn de camo MATERIAL BIOLGICO: - Semillas de chcharo o frjol 30 g REACTIVOS: (Para su preparacin vase la preparacin de soluciones). - Cloruro de bario 1 M, 50 mL - Hidrxido de sodio 0.2 N, 200 mL - cido clorhdrico 0.2 N, 200 mL - Fenolftalena a 1%, 25 mL EQUIPO: - Balanza granataria - Estufa - Refrigerador MTODO: 1. Ponga 50 mL de hidrxido de sodio (NaOH) 0.2 N en cada uno de los cuatro frascos de 500 mL y tape inmediatamente. 2. Coloque 30 g de semillas en agua, durante una hora, posteriormente pese tres porciones de 10 g de estas semillas. 3. Coloque cada porcin en un saquito de manta de cielo o de gasa y suspndalo del tapn del frasco utilizando un cordel, para evitar que las semillas estn en contacto con el hidrxido de sodio (NaOH), figura 2.4.

5. Despus de 36 horas, extraiga las semillas y tape rpidamente. 6. Titule para encontrar la cantidad de CO2 respirado por las semillas. Para ello, tome una pipeta y extraiga 10 mL de hidrxido de sodio de cada uno de los frascos y pngalos en un vaso de precipitado de 50 mL. 7. Aada 5 mL de la solucin de cloruro de bario 1 M, el cual precipitara el CO2 absorbido por el lcali. 8. Agregue tres gotas de fenolftalena quedarn un color rosa-violceo y titule con cido clorhdrico 0.2 N hasta que desaparezca el color (pH 8.5) y anote la cantidad de cido necesario para ello. 10. Repita la titulacin con cada uno de los frascos, para calcular la cantidad de CO2 del ambiente que haya sido atrapado al cerrar el frasco. 11. Reste esta cantidad a la cantidad necesaria para cada uno de los tratamientos y multiplique por 5 para obtener la cantidad de cido clorhdrico (HCl) equivalente al CO2 desprendido por las semillas. 1

Figura 2.4 Respiracin aerobia de las semillas de chcharo o frjol. 4. Coloque los otros tres frascos a diferentes temperaturas (5, 25 y 40 C).

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HOJA DE RESULTADOS
NOMBRE:_______________________________GRUPO:__________FECHA:__________ 1.- Anota el volumen de HCl gastado. Temperatura Ambiente Ambiente 25 C 25 C 40 C 40 C 5 C 5 C Volumen de HCl gastado

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO
1.-Defina y explique el concepto de coeficiente respiratorio. 2- Cul es su utilidad prctica?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS