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Introducción Como complemento práctico de la asignatura “Ingeniería de Fermentaciones”, cursada el semestre pasado, se realizarán una serie de experiencias a través

de los meses siguientes, comenzando por un laboratorio en el cual se trabajará con la levadura Kluyveromyces marxianus en un ambiente aerobio, realizando diferentes modificaciones (tanto físicas como químicas) en el medio de crecimiento, todo esto para posteriormente registrar el aumento de la biomasa a través del tiempo. Kluyveromyces marxianus, levadura perteneciente a la familia de las Saccharomycetaceae y cuya forma asexual es llamada Candida kefyr, posee estudios amplios de sus principales características de crecimiento. Entre ellos encontramos: Tabla N°1: Características principales de crecimiento de Kluyveromyces marxianus Característica pH Temperatura (C°) Nutrientes básicos (W. C. Frazier, D. C. Westhoff. 1978) La importancia de este microorganismo radica en la capacidad de producir diferentes metabolitos, tanto aerobia como anaerobiamente. Entre dichos metabolitos el de más renombre y sobre el cual existen muchos estudios es sobre la producción de β-galactosidasa y de etanol a partir de lactosa. Mediante esta experiencia se espera lograr un correcto manejo del biorreactor, así como también un aprendizaje basado en el comportamiento de nuestro microorganismo frente a los distintos estímulos que se le aplicarán en cada uno de los proyectos que se llevarán a cabo. Rango 1,5 – 8,5 5 - 46 Ideal 4,2 36,5 (mesófilo) Glu, Gal, Fru, Suc, Malt, Lac, Rib, vitaminas

1. Descripción general del proyecto En la primera experiencia de la asignatura a realizar estableceremos el comportamiento de la cinética de crecimiento de Kluyveromyces marxianus. con un tiempo de muestreo de una hora.1.19 cuando se encuentra gasificada y 2. En cada muestreo se tomarán seis muestras en total. En dicho equipo se ajustarán los parámetros de control. ésta previamente desgasificada.2 Objetivos específicos: Diseñar el medio de cultivo utilizando como base 7 up Obtener crecimiento del microorganismo en un biorreactor controlando los parámetros cinéticos establecidos Registrar y analizar los resultados obtenidos . El proceso se realizará en el fermentador Biostat A plus® de 1 litro de volumen utilizable. partiendo de tiempo cero hasta tiempo 7. Los procedimientos para realizar cada análisis serán mencionados más adelante. y un pH se 3.47 cuando se ha desgasificado [1]. de las cuales tres son para análisis de azúcares reductores y las otras tres serán para el recuento de biomasa. se realizará un análisis de la cinética utilizando una bebida gaseosa comercial (7up) como fuente de carbono.2 Temperatura: 40°C Agitación: 200 rpm Se estima una duración del proceso aerobio de 7 horas.4 gr/L. analizando dicho factor mediante varios cambios en los parámetros físicos que afectan directamente en el desarrollo de la ya mencionada levadura.1 Objetivo general: Establecer los parámetros cinéticos del crecimiento de Kluyveromyces marxianus utilizando la bebida gaseosa 7up como fuente de carbono. Cabe destacar que dicha bebida posee una concentración de azúcar de 114. 1. como lo son: pH: 4. Específicamente.

en cada muestreo se extraerá un triplicado para cada análisis. se seguirán distintos protocolos. todo esto en un vaso precipitado de 1 L.Trasladar el medio preparado a un matraz aforado de 1000 mL y 500 mL.Agitar el medio de cultivo .Levar a autoclave y esterilizar a 121°C por 15 minutos a 1 atm . diluir los nutrientes en 250 mL de bebida desgasificada.Calcular masas de nutrientes para 1 L y para 500 mL . los cuales serán: Tabla N°2: Volúmenes estimados del medio que serán destinados para análisis cuantitativos de azúcar y biomasa presentes. En cada muestreo se extraerán distintos volúmenes del caldo. Análisis Cuantificación de azúcares reductores Cuantificación aumento de biomasa Volumen por muestra 3 mL 2 mL Cantidad de muestras extraídas en cada muestreo 3 3 Volumen total 72 mL 48 mL Según lo señala la Tabla N°2.2.Desgasificar 1.1. para obtener gráficas de mejor entendimiento general.Diluir los nutrientes en 500 mL de bebida desgasificada.Dejar enfriar y almacenar hasta su uso .5 L de bebida gaseosa 7 up . los datos también serán procesados en Excel. donde se observará de mejor manera la variación de los valores que se buscan cuantificar a través del tiempo. 3. con sus respectivos intervalos de confianza. por medio de un embudo . Adicionalmente. . Repetir operación con 500 mL . por lo cual los datos obtenidos serán analizados utilizando el programa informático Statgraphics Centurion IV.1 Metodología experimental: Con el fin de realizar correctamente esta experiencia.Masar los nutrientes que serán agregados al medio en una balanza analítica de alta precisión. Para el volumen menor.Enrasar a 1000 mL con bebida 7 up desgasificada. Diseño experimental Como ya se mencionó anteriormente. los que serán mencionados a continuación 3. todo esto en un vaso precipitado de 500 mL . respectivamente. la toma de muestras está programada para ser realizada con una diferencia de hora entre una y otra.Trasvasar dicho contenido a un frasco Schott de 1 L y 500 mL .1 Preparación del medio de cultivo . Métodos: 3.

006 0.8 32.71 0.044 0.18 0.0005 0.000004 3.012 0.8 0.1 Diseño de medio de cultivo Medio definido Elemento Fuente PM % Celular C N Mg P K S Ca Na Fe Cu Mn Zn Mo C6H1206 (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O K2HPO4 K2HPO4 MgSO4*7H2O CaCl2 NaCl Fe SO4*7H2O Cu SO4*5H2O Mn Cl2*4H2O Zn Cl2 MoO3 180 132 246.12 0.44 0.000006 .11 0.5 2.5 0.6 6935.8 3995.2 89.32 20.5 277.5 0.09 2.09 25.67 Yx/s So So* 1.1 Formulación del medio de cultivo: - Masar los diferentes componentes del medio según la tabla con sus componentes.6 3.4 66. - Tabla Error! No text of specified style in document.2 9.033 0.9 58.8 249.5 0.049 0.3 0.6 0.95 66.1 174.3 174.074 0.02 0.3 110.16 39.98 1.98 0.67 16.00028 0. Esterilizar matraz y pipetas a través de autoclave (121ºC a 1atm por 15minutos).1.13 0.4 144 48 7.061 1.004 0. Inocular con 10ml del cultivo de Kluyveromyces marxianus utilizando las pipetas graduadas de 10ml previamente esterilizadas.*Nota: Los 500 mL restantes serán 2.5 197.4 13 36.74 47.1 0.00071 0.9 136.022 0.78 11.9 4241.1.8 444466.00047 0.00042 0.00075 0.16 2.03 0.00015 % Elemento 40 21.6 1.9 0.45 27.1 246..029 0. Trasladar los nutrientes cuantitativamente a un matraz Erlenmeyer y adicionar agua destilada y aforar hasta 1000mL.3 0.18 100 40.

llevar a espectrofotómetro y medir a 540nm. 0.4.1 M (base) Agregar 29. .2 (pH óptimo K. 0. Anotar resultados y graficar.5 Obtención de la curva de calibración de DNS Preparar una solución patrón de glucosa en concentraciones conocidas.5 dinitrosalicílico agitando bajo calor Aforar hasta alcanzar un volumen de 1000mL con agua destilada Conservar en un shott ambar 2. llevar a baño maria por 20 minutos.4 Preparación del reactivo DNS: - Disolver 8g de NaOH en 500mL de agua destilada en un vaso precipitado Agregar 150g de Tartrato de sodio y potasio Cubrir el vaso precipitato con papel aluminio y agregar lentamente 5g de Ácido 3.6.5ml B 2.1.5 ml A + 18.2.41g de citrato de sodio en 1000mL de agua destilada Preparación Buffer a pH 4. Se desarrollara la reacción con el reactivo DNS agregando en un tubo de ensayo 1mL de la muestra patrón y 3mL de reactivo DNS.1. dejar enfriar y añadir 6 mL de agua destilada.5 8 2. 0. marxianus) X ml A+ X ml B Diluido en 100mL de agua destilada 31.01g de ácido cítrico en 1000ml de agua destilada Preparación Citrato sódico 0.1 M Agregar 21. 0.8 y 1.3 Preparación solución tampón Preparación Ácido cítrico 0.1. en las cuales se utilizara 0.

6 Obtención de la curva de calibración de biomasa FALTAAA L O HABIA EXO MAL XD PERDOON .1.2.

marxianus Curva de calibración de Biomasa Muestra 12mL de muestra Determinación Biomasa Determinación Sustrato Peso seco Turbidimetría DNS Concentración de celulas Concentración de sustrato Análisis de Datos .2.2 Diagrama de flujo de la metodología experimental: Esterilización 121º x 15 min Preparación del Medio de cultivo Preparación Reactivo DNS Esterilización 121º x 15 min Preparación Reactor Curva de calibracio de DNS Inoculación K.

2/5. independiente del tamaño celular del microorganismo. 3/5. La diferencia de peso entre el capacho sin muestra y aquel que si posee muestra se obtendrá el peso o la masa seca de células presente en el caldo de cultivo.1 Determinación de la concentración celular: Peso seco: La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen. posteriormente se realizara una centrifugación a 6000rpm durante 10minutos.2 Determinación de la concentración de sustrato: .3 Metodología analítica: 2. El pellet obtenido se volverá a resuspender con una cantidad minima de agua destilada y se llevara a un capacho de aluminio de peso conocido. La principal desventaja de esta técnica es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos. dividiendo la masa por el volumen de muestra utilizado se obtendrá la concentración celular. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que las soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias. Se utilizara una celda con agua como blanco. polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Hasta obtener un peso constante en el conjunto capacho-biomasa.2. 1/30. Para realizar la turbidimetría se realizaran diluciones (4/5. 1/10. 1/100) hasta obtener una muestra de dilución 1/100. sino también microorganismos muertos. 1/50. Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a las partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. el cual debe estar vigorosamente agitado.3. ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Para el practico. la absorbancia es proporcional al peso seco. A esta muestra se le retirara el sobrenadante y se resuspenderá el pellet con agua destilada. independientemente del tamaño celular. se tomara una muestra de 10ml de caldo de cultivo. este se introducirá a una estufa a 110ºC para su secado. tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. para volver a repetir el paso durante 2 ocasiones. 2. en soluciones diluidas. Esto quiere decir que. Las células se separan del líquido por centrifugación o por filtración. Con todas estas diluciones y la muestra original se colocaran una por una en las celdas para leer la absorbancia en el espectrofotómetro.3. material inerte.

poner en tubos de ensayo. centrifugando y llevando las muestras a matraces. EL método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3. Esta técnica sirve para cuantificar azúcares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La concentración se obtiene a partir de la recta obtenida al realizar la curva de calibración. agregar 3 mL de reactivo DNS. Para realizar la medición. Se tomara 1 mL de cada muestra diluida. seguido de determinación espectrofotométrica a 540 nm de los azucares reductores. dejar enfriar y añadir 6 mL de agua destilada.4 Diagrama de flujo analítico Determinación de Biomasa Determinación de Sustrato Turbidimetria Peso seco Método DNS Curva de Crecimiento Celular Curva de Consumo de Sustrato 3 Materiales Para método DNS Reactivo Unidad de Cantidad Análisis Objetivo asociado .5 ácido dinitrosalisílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. se prepararan diluciones. 2. llevar a baño maria por 20 minutos.Método DNS: la determinación del consumo de sustrato en el tiempo puede realizarse mediante este método. que correlaciona la Absorbancia medida a 540 nm con la concentración de Glucosa. Llevar a espectrofotómetro para medir a 540 nm. Se realizaran duplicados para cada muestra. tomando 1 mL de muestra del medio de cultivo.

5 dinitrosalicilico Hidróxido de sodio Tartrato de sodio y potasio gramos gramos gramos 5 gramos 8 gramos 150 gramos asociado DNS DNS DNS Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Materiales Unidad de medida Cantidad Análisis asociado Objetivo asociado Espátula Vaso precipitado Matraz aforado Embudo de vidrio Papel aluminio Agua destilada Piseta mL mL 1 1 DNS DNS DNS Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores Determinación de azucares reductores 1 DNS DNS 1000 mL 1 DNS DNS Equipo Balanza analitica Descripción Instrumento para medir la masa . da datos exactos y específicos Análisis asociado Objeivo asociado Para medio de cultivo .medida Acido 3.

Reactivo Unidad de medida g/L g/L g/L Cantidad Análisis asociado Objetivo asociado glucosa Sulfato de amonio Sulfato de magnesio heptahidratado Diofosfato de potasio Cloruro de calcio Cloruro de sodio Sulfato ferroso heptahidratado Sulfato cúprico pentahidratado Cloruro de manganeso tetrahidratado Cloruro de zinc Trióxido de molibdeno 3.033 g 0.044 g 0.074 g 0.1 g 0.09 g g/L g/L g/L g/L g/L g/L 16.00071 g 0.00075 g 0.98 g 1.00042 g g/L g/L 0.0000068 g materiales Unidad de medida Cantidad Análisis asociado Objetivo asociado Vidrio reloj Espátula Matraz aforado Vaso precipitado 1 1 1 1 .6 g 0.

Universidad de Colombia. Ingeniería Química. . Análisis asociado Objeivo asociado Autoclave Reactor Para peso seco materiales Unidad de medida Cantidad Análisis asociado Objetivo asociado 4 Carta Gantt Bibliografía [1] José Ángel Beleño Alcázar. datos exactos y específicos Recipiente metálico. Department of biological and Agricultural Engineering. Louisiana State University. “Determinación de la acidez en una gaseosa convencional (7up) a través de titulación potenciométrica”. Abril 2011.piseta 1 Equipo Balanza analítica Descripción Instrumento para medir la masa. trabaja a presión sirve para esterilizar con vapor de agua. Mayo 2004. “Kinetic analysis of Kluyveromyces marxianus yeast strain”. Erika Madeira Reeves.