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NOMBRE DEL PROYECTO: Caracterización de Bacterias en cultivo y desarrollo del centro de investigación de Macagual para la producción de Biodiesel.

INVESTIGADORES PRINCIPALES: Bolívar-Pineda, Lina Marcela; Gallego-Vargas, Gustavo Adolfo; Gallego-Vargas, Karen Adriana; Quiñones-Murcia, Kiara Zulay. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO 1. Resumen: En el centro de Investigación de Macagual, ubicado a veinte kilómetros (20 km) de Florencia, al sur del departamento de Caquetá y localizada geográficamente a 1°37’N y 75°38’ W, se realizó la recolección de bacterias, para conocer y estudiar las características morfológicas a nivel macro y micro para determinar a largo plazo cual poseen propiedades enzimáticas para la producción de Biodiesel. Para llevar a cabo está recolección se utilizaron cajas de Pétri con medio de cultivo agar BHI, que luego fueron analizadas en el laboratorio de microbiología de la universidad de la Amazonia, en donde se encontraron diversas colonias bacterianas de color amarillo, naranja, blanco, negro, rosadas, beige y café, y la mayoría se presentaron en forma circular, debido a que en las placas o cajas de Pétri las bacterias forman acumulaciones visibles de células (colonias). Para la identificación morfológica a nivel micro de las bacterias, se utilizó la tinción de Gram, que permitió diferenciar los tipos de bacterias Gram + y Gram --, obteniendo cocos Gram + (estafilococos, sarcinas y tétrada), bacilos Gram+ y Estreptobacilos y cocobacilos Gram--. Esto se pudo visualizar en el microscopio debido a que las bacterias Gram + retienen el colorante y permanecen de color violeta (cristal violeta colorante primario) y las células Gram – , no retienen el colorante, son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste Safranina por la cual después aparecen de color rosado, esta diferencia se determina por la estructura de la pared de las bacterias ya que definen la retención o escape de violeta-yodo. Ya identificada la morfología de las bacterias, se realizaron cultivos puros, estafilococos en medio de cultivo agar sal manitol, cocobacilos Gram—en Macconkey sarcinas y bacilos en agar BHI. Palabras claves: Estudio Morfológico, morfotipo, Microorganismos, colorante básico. Abstract In the center of Investigation of Macagual, located to twenty kilometers (20 km) of Florence, to the south of the department of Caquetá and located 1°37'N and 75°38 ' W geographically, it was carried out the gathering of bacteria, to know and to study the morphological characteristics to level macro and micro to determine long term which possess enzymatic properties for the production of Biodiesel. To carry out it is gathering Pétri boxes they were used with half of cultivation agar BHI that then were analyzed in the laboratory of microbiology of the university of the Amazonia where they were diverse bacterial colonies of yellow color, orange, white, black, rosy, beige and brown, and most was presented in form to circulate, because in the badges or Pétri boxes the bacteria form visible accumulations of cells (colonies). For the morphological identification at level micro of the bacteria’s, the tint of Gram was used that allowed to differentiate the types of bacteria’s Gram + and Gram--, obtaining coconuts Gram + (staphylococcus, sarcinas and tetrad), bacilli’s Gram+ and Streptobacillus and coccobacillus Gram--. This you could visualize in the microscope because the bacteria’s Gram + they retain the coloring and they

remain of color violet (primary glass coloring violet) and the cells Gram-, they don't retain the coloring, they are colorless until one adds the contrast coloring Safranina for the one which later appear of rosy color, this difference is determined since by the structure of the wall of the bacteria’s they define the retention or escape of violet-iodine. Already identified the bacteria’s morphology, they were carried out pure cultivations, staphylococcus amid cultivation agar manitol salt, coccobacillus Gram—en Macconkey sarcinas and bacilli in agar BHI. Key words: Morfolophy Study, morphotype, Microorganism , basic dye

2. Introducción (justificación y objetivos inmersos): Los microorganismos son seres vivos pequeños, que no son captados por el ojo humano y se visualizan por medio del microscopio. Estos seres diminutos según Murray (2000) están capacitados para adaptarse en diferentes lugares, debido a su poco peso y cuyas características del ambiente definen cuales especies se pueden multiplicar. Entre los microorganismo se encuentran los mohos, larvas, protozoos, virus, algas y las bacterias, estas ultima son de gran interés para la investigación por ser una de las formas de vida más abundantes en la tierra. Las baterías son microorganismos que carecen de núcleo (células procariotas), es decir son unicelulares y pertenecen al reino mónera. Poseen una estructura, relativamente simple no poseen organelos como mitocondrias, membrana nuclear, aparato de Golgi, retículo endoplasmatico, entre otros y se reproducen por división asexual (Murray, et al. 2000). En el transcurso de la historia los microorganismos han participado en las actividades del hombre, por ejemplo antes de haberse conocido la existencias de estos, ya los utilizaban en la preparación de alimentos (el queso emmenthal es uno de los muchos ejemplos), mejorar las cosechas y eliminar residuos. Por esto se ha ido ampliando el conocimiento acerca de los microorganismos, en la cual se ha mejorado e incrementado sus usos. (Ingraham, et al. 1998). La manipulación de los diminutos seres se convirtió en una ciencia que cambio profundamente la vida del hombre al producir antibióticos, vitaminas, aditivos de alimentos y compuestos químicos industriales (Ingraham, et al 1998). En los procesos de la utilización de microorganismo como fábricas químicas y manipuladas, se tiene como ejemplo las bacterias (del ácido láctico), participando en la creación de productos lácteos, en la conservación de alimentos vegetales, en la fermentación de ciertos alimentos y bebidas. De tal forma las bacterias cumplen diversas funciones ya sean en beneficio de los seres vivos o como la causa de algunas enfermedades. También es importante conocer que los microorganismos son una fuente importante de enzimas que tienen muchos usos comerciales, por ejemplo en la industria de la alimentación se usan para evitar que los caramelos cristalicen, en medicina se utilizan como compuestos digestivos y para tratar los enfermos que han sufrido de un ataque al corazón, los detergentes para el lavado de ropa (rompimiento de enlaces peptídicos), en general. (Ingraham, et al. 1998; Murray, et al. 2000). Por tanto, el propósito del proyecto es conocer y estudiar las características de las diversos tipos de bacterias que se pueden encontrar en el centro de Investigación Macagual de la Universidad de la Amazonia, ubicado en Florencia- Caquetá. Todo esto con el fin de detectar algunas enzimas que producen y su función en la creación de biocombustibles (biodiesel), esta es una meta a largo plazo. A la vez se quiere revelar las destrezas y habilidades de los profesionales de la región de la amazonia y de sus estudiantes. El proyecto se quiere realizar en primer lugar porque tiene una gran importancia a nivel personal de los estudiantes que es investigar, analizar, aprender, conocer y brindar información acerca de los diferentes tipos de bacterias que se logre encontrar en el centro

de investigación de Macagual, y por ultimo por el tema de la contaminación causada en parte por los combustibles relacionados con hidrocarburos y porque hoy se habla del fin de los combustibles, debido al agotamiento de reservas de petróleo. Adicionalmente porque cada día se requiere más el consumo de Combustibles, por la importancia que presenta en la satisfacción de necesidades del ser humano. De esta manera se creara prestigio a la Universidad de la Amazonia en calidad de entidad, con la habilidad en forjar profesionales con conocimientos sólidos, capaces de desarrollar competentemente la ciencia y utilizarla a cabalidad para el progreso del departamento y del país. 3. Marco teórico: BACTERIAS Las bacterias son seres vivientes microscópicos, unicelulares y procariotas, ampliamente diseminadas en todo el planeta. Algunas son saprofitas, otras patógenas para las plantas, los animales o el hombre. Pertenecen al reino de los protistas, tercer reino viviente junto al reino vegetal y el reino animal. Las bacterias poseen una estructura simple, sin embargo se nutren, respiran y se reproducen. Se pueden cultivar (Tortora, et al. 2007). Las bacterias suelen reproducirse mediante la división en dos células iguales; este proceso se conoce a partir de sustancias inorgánicas (Tortora, et al. 2007). La célula bacteriana Morfología.

Fig. 1. Principales tipos de morfológicos de las bacterias (Tortora, et al. 2007) Las bacterias poseen un tamaño muy pequeño, este se expresa con el micrón ( . según

Madigan (2004) la morfología de estos microorganismos es variable y se distinguen:  Cocos: bacterias con forma esférica u ovoide, tienen un aspecto reniforme (en forma de granos de café o de frijol) como los meningococos o los gonococos; o, tener forma oblonga u ovoide, como los neumococos. Los coccidios pueden estar aislados o, por el contrario, agrupados: ya sea de dos en dos (se los denomina entonces diplococos), de cuatro en cuatro (son las tétradas), en racimos tras de otros en cadenetas (estreptococos). Bacilos: bacterias con forma cilíndrica, alargadas. Pueden observarse múltiples formas: bacilos muy delgados o bacilos gruesos. Formas cortas o largas, formas curvas en vírgula (vibriones); bacilos en extremidades redondeadas, deshilados en forma de maza así mismo, el agrupamiento de estas bacterias es también variable: bacilos aislados, agrupados por pares (diplobacilos), en cadenetas (estreptobacilos), unidos en empalmes o reunidos en manojo. Algunos bacilos se curvan en forma espiral, y se llaman espirilos, espiroquetas y treponema.

Estructura. Las bacterias son seres unicelulares, es decir, constituidos por una sola célula. Ésta posee una estructura necesariamente compuesta por un citoplasma, que contiene varios elementos y está rodeado por una membrana, y contiene un aparato nuclear (núcleo). El conjunto está sostenido por un cascaron rígido. Además, la bacteria puede presentar otras características: esporas, cápsula, cilios (Burdin y Lavergne.1966). Las bacterias poseen paredes celulares, que además son las responsables de la forma y rigidez de la célula. La pared celular no se observa fácilmente con el microscopio óptico. Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. La distinción inicial entre estos dos tipos se lleva a cabo mediante una tinción diferencial denominada tinción de Gram; la diferencia entre estas se basan en la estructura de la pared celular. La morfología de las paredes celulares es muy distinta en las células Gram positivas y en las Gram negativas (Fig. 2.). la pared celular en la Gram negativas está compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras que la pared de la Gram positivas está formada fundamentalmente por un solo tipo de molécula y suele ser más ancha (Madigan, et al. 2004)

Fig. 2. Pared celular de las bacterias. (a,b) Diagrama esquemáticos de paredes celulares Gram positivas y Gram negativas. (c,d) micrografía electrónica de la pared bacteriana Gram + Y Gram - (Madigan, et al. 2004). Algunas bacterias producen en el interior de sus células estructuras especiales llameadas endosporas durante un procesos denominado esporulación. Las endosporas son células diferenciales extraordinariamente resistentes al calor y difíciles de destruir, incluso por agentes químicos muy agresivos. Las bacterias que forman endosporas se encuentran habitualemte en el suelo. Entre las bacterias formadoras de endosporas. Los géneros mejor conocidos son Bacillus y Clostridum (Madigan, et al. 2004).

Fig 3. La endospora bacteriana. Macrografía de diferentes tipos de endosporas y su localización. a) Terminal b) subterminal c) Central (Madigan, et al. 2004). Clasificación de las bacterias Una de las clasificaciones más conocida sobre las bacterias es la de Bergey. Esta clasificación tiene en cuenta múltiples criterios: aspectos morfológicos, aspectos estructurales, aspectos tintóreos, tipos tróficos, propiedades metabólicas, caracteres genéticos (Tortora, et al. 1993). Tabla 1. Resumen de algunas características seleccionadas de los grupos bacterianos, según la primera edición del Bergey’s Manual of systematic Bacteriology. (Tortora. Et al.1993) Grupo Espiroquetas Géneros Treponema Borrelia leptospira Spirillun Gram-negativas, aerobias/microaerófilas, Campylobacter móviles, helicoidales / azospigrillum vibroides. Hábitat Acuático; parásitos de animales Suelos y aguas; tracto intestinal humano y cavidad oral. Características Morfología helicoidal, movilidad por filamentos axiales. Morfología helicoidal, movilidad por flagelos sin filamentos axiales; los vibroides no tienen una vuelta completa de hélice. y Raras, la mayoría acuática, no patógena.

Bacterias curvadas, gram-negativas, inmóviles Cocos y bacilos gramnegativos aeróbicos.

Meniscus Spirosoma

Aguas sedimentos

Neisseria Branhamella Francisella Legionella agrobacterium Bacilos Gram- negativos Salmonella anaeróbicos facultativos Klebsiella Yersinia Vibrio Bacilos Gram- negativos Bactoerium

Suelo, aguas y Comprende parásitos de microorganismo de animales interés clínico, industrial y ambiental. Suelo, plantas, Incluye muchos tracto intestinal patógenos importantes. de animales Animales e Anaerobios obligados; la

anaeróbicos, rectos, Fusobacterium curvados o helicoidales.

insectos

Bacterias disimilatorias, Desulfovibrio reductoras de sulfato o azufre. Cocos anaeróbicos Veillonella Gram-negativos

Sedimentos anaeróbicos

Rickettsias y clamidias

Rickettesia Coxiella Chlamydia

Principalmente el tracto intestinal de animales. Párasitos de Bacterias intracelulares artrópodos y obligadas; muchos son animales patógenos importantes; gram-negativos.

mayoría viven en el tracto intestinal, algunos en la boca y tracto genital. Reducen formas oxidadas de azufre hasta SH2 Gram- negativas. Anaerobios inmóviles

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Clasificación por características de tinción de Gram.

La mayor parte de las bacterias que se obtienen de muestras clínicas se identifica en forma inicial haciéndolas crecer en un cultivo puro o en un medio artificial, se observa la forma y color de las mismas mediante la colocación de una muestra del cultivo en un portaobjetos y su tinción. En casi todos los casos el procedimiento inicial clave es la tinción de Gram (Walker. 2000). Procedimiento de tinción de Gram El patólogo danés Christian Gram creó el procedimiento de tinción de Gram en el decenio de 1880. Se coloca una cantidad diminuta de las bacterias que se teñirán en una gota de líquido sobre un porta objetos y se deja secar al aire. La gota seca debe tener apariencia un poco opaca; la tinción no es confiable cuando se emplean demasiadas bacterias. Luego se deja el portaobjetos con calor de baja intensidad, de manera que quede suficientemente tibio como para poderse tocar con el dorso de la mano sin que ello ocasione ninguna quemadura. El portaobjetos se tiñe con Violeta cristal, se lava y se le agrega un mordente llamado solución de lugol ( / KI A 3%) para fijar la tinción. El portaobjeto se lava de nuevo y se decolora un poco con una mezcla de alcohol y acetona. Por último el portaobjetos se vuelve a teñir con safranina, se lava y se seca con absorbente. Al examinar con una lente de inmersión en aceite las bacterias teñidas, las grampositivas se muestran de color azul o púrpura, pero las gramnegativas tienen apariencia roja o rosada. Las muestras teñidas que se toman de cultivos envejecidos de bacterias grampositivas contienen una mezcla de bacterias azules y rosas, y se dice que son gramvariables. El procedimiento de tinción Gram permite diferenciar los dos principales grupos de bacterias, cuyas cubiertas celulares son muy distintas entre sí (Walker. 2000)

Medios de Cultivos Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar diferentes especies bacterianas y proceder a su identificación para llevar a cabo una serie de estudios complementarios. Los sustratos energéticos y la materia orgánica sintética (sustratos como proteínas, derivados de la celulosa, etc.) pueden suministrarse por sustancias nutritivas contenidas en la maceración de carne y vísceras (Montoya, 2008). Clasificación Según Montoya (2008) los medios de cultivo pueden clasificarse según su consistencia, origen, composición y utilización. Consistencia - Líquidos: contienen los nutrientes antes citados a los cuales se les adiciona una sustancia capaz de mantener el pH adecuado. Entre los más empleados están el caldo nutritivo y el caldo pentona. - Sólidos: se obtienen agregando agar. Este debidamente esterilizado se vierte en una caja de Pétri o en un tubo de ensayo. Las exigencias nutritivas y las condiciones fisicoquímicas son similares a las de los medios líquidos. Pero a diferencia de ellos, ofrecen la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la cantidad del inóculo este suficientemente diluida. En este caso se observa la existencias de colonias separadas unas de otras. - Semisólidos: son muy semejantes a los medios sólidos con la diferencia que a estas se les disminuye la concentración del agar. Se utiliza para la conservación de cepas bacterianas y la observación y registro de bacterias móviles. Origen - Los medios sintéticos químicamente bien definidos son medios compuestos por productos químicos conocidos y se usan para estudios metabólicos. Ejemplo: agar nutritivo, agar blanco, caldo nutritivo, etc. - Los medios naturales son aquellos medios preparados a partir de sustancias naturales animales o vegetales, de composición no rigurosamente constante. Ejemplos: la leche, la papa, etc. Composición y utilización - Medios simples: poseen los requisitos nutricionales mínimo para permitir el desarrollo bacteriano en general. Ej.: agar nutritivo, caldo nutritivo, etc. - Medios enriquecidos: son medios simples o comunes a los que se añaden ciertos componentes como sangre, suero, glucosa, etc., que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores del crecimiento, en baterías exigentes nutricionalmente. Son diferentes para cada tipo de bacterias. Ej.: agar de sangre. - Medios selectivos: se consiguen añadiendo agar nutritivo compuestos químicos nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa o también alterando las condiciones físicas del medio. - Medios diferenciales: a estos medios de cultivo se les adicionan sustancias para que sólo crezcan determinadas bacterias y estas al actuar sobre algunas de las

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sustancias adicionadas, permiten observar macroscópicamente ciertas propiedades de crecimiento que ayudan a diferenciar sus colonias de otras especies diferentes. Medios de enriquecimiento: medios líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de bacterias cuando la muestra obtenida es muy pobre. Medios de recuento: se utilizan para determinar el contenido bacteriano de sustancias como leche, agua, carnes, etc. El número de colonias resultantes del sembrado de la muestra se cuentan macroscópicamente y se aplican fórmulas matemáticas. Medios de transporte: se utilizan para asegurar la viabilidad de las baterías y evitar que se reproduzcan alterando el número de bacterias iniciales, desde el momento de la toma de la muestra hasta su posterior siembra en el laboratorio.

Las propiedades de cultivo proporcionarán datos sobre el modo de vida de la bacteria: la temperatura de desarrollo óptima, el crecimiento en aerobiosis o anaerobiosis, el aspecto del cultivo en líquido (cultivo turbio, homogéneo o granuloso), o en medio sólido (Pelczar, et al. 1982). El estudio de las propiedades bioquímicas permite conocer el equipamiento enzimático del germen: sembrado en medios que con contengan azúcares, se observará si se produce una oxidación o una fermentación. Todas estas reacciones indican la presencia o ausencia en la célula de diferentes enzimas activas sobre los glúcidos. De igual forma, las enzimas que intervienen sobre las sustancias proteínicas serán puestas en evidencia mediante siembra en leche, en agua peptonada, en medios con base de fenil-alanina. Como resultado de todas las pruebas, es posible asignar a la bacteria un nombre de especie, caracteres morfológicos en general (Burdin y Lavergne. 1966).

Preparación con los medios Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias naturales comunes. En relación con esto, se usa la leche desnatada y no entera. Los materiales, en su forma natural, no presenta ningún problema para tomarlos como medios de cultivos ya que simplemente se depositan dentro de los envases adecuados tales como tubos de ensayo, o matraces, los cuales deberán ser esterilizados antes de utilizarlos. Los medios que se presentan del tipo agar o caldo nutritivo se hacen mezclando los ingredientes individuales necesarios, o de manera más práctica agregando agua a productos deshidratados que contienen todos los ingredientes. En el comercio podemos encontrar prácticamente todos los medios de cultivo en forma deshidratada (Pelczar, et al 1982). Según Pelczar (1982) en la preparación de medios de cultivo, deben seguir los siguientes pasos: - Cada ingrediente, o medio deshidratado completo, se debe disolver en un volumen adecuado de agua destilada. - Se determina el pH del medio y si es necesario se ajustará. El pH se determina por medio de indicadores.

Identificaciones físicas necesarias para el desarrollo. Además de conocer los nutrientes apropiados necesarios para el cultivo de bacterias, también conviene conocer las condiciones físicas del medio en donde el microorganismo puede desarrollarse mejor. Así como las bacterias varían ampliamente en relación a sus necesidades nutricionales, también muestran respuestas diversas a las condiciones físicas del medio. Dicho de otra manera, para un buen cultivo de las bacterias se necesita combinar apropiadamente (Pelczar. Et al 1982). Algunos factores según Pelczar (1982) son:  Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la velocidad con que se efectúan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrón de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condición. La temperatura puede en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismo. Las variaciones en la temperatura, también puede influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. Cada especie de bacterias crece a temperatura que está dentro de ciertos límites. De acuerdo con esto las bacterias se pueden dividir en los siguientes grupos: Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0°C o menos, aunque crecen mejor a temperatura superiores, cercanas a 15° o 20°C. Mesófilas: Crecen mejor en límite de temperatura que están entre 25° y 40°C. Termófilas: crecen entre 45° y 60° C.

 Necesidades de gases: Los gases principales que afecta el desarrollo bacteriano son el oxígeno y el Co2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre, y sobre esta base se dividen en cuatro: 1. Aerobias: desarrollan en presencia de Oxígeno. 2. Anaerobias: se desarrollan en ausencia de oxígeno. 3. Anaerobias Facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como ausencia de oxígeno. 4. Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñísimas cantidades de oxígeno.  Acidez o alcalinidad En la mayor parte de las bacterias, el pH óptimo de crecimiento está entre 6.7 y 7.5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse a pH extremos, en la mayor parte de las especies los límites mínimo y máximo corresponde a cualquier punto entre pH 4 y pH 9.  Necesidades físicas diversas Para establecer las condiciones adecuadas de desarrollo de la mayoría de las bacterias, conviene considerar como factores físicos principales, la temperatura, ambiente gaseoso y el pH; pero algunos grupos de bacterias tienen necesidades adicionales. Por ejemplo, organismos fotosintéticos y autotróficos deberán ser expuestos a una fuente de energía. El

desarrollo bacteriano también es influido por las condiciones de presión osmótica e hidrostática. Selección de los medios de cultivo y condiciones de incubación Para obtener un buen desarrollo de las bacterias, el trabajador del laboratorio deberá (Pelczar. Et al. 1982): a) Inocular (sembrar) las bacterias en un medio de cultivo que tenga los nutrientes necesarios. b) Incubar el medio ya sembrado en condiciones físicas apropiadas. Para hacer una selección apropiada de los medios de cultivo y de las condiciones físicas, de acuerdo con Pelczar (1982), se tendrá que responder a preguntas como las siguientes: 1. ¿Las bacterias que se van a aislar son aerobias o anaerobias? 2. ¿Contiene el espécimen bacterias autotróficas y heterotróficas? En caso afirmativo, ¿deberán cultivarse los dos tipos? 3. ¿Contiene el espécimen microorganismos termófilos, o aparece que los microorganismos son mesófilos? Cultivos puros y características del cultivo Las bacterias u otros organismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se llaman cultivos. Las diferentes especies de bacterias que se desarrollan en la misma clase de medios de cultivo pueden tener aspectos muy diferentes, y por tanto, el conocimiento de la apariencia, o de las características de cultivo de las especies es útil para reconocer a ciertos tipos de bacterias; así mismo, puede servir como un medio que haga posible identificar especies (Pelczar. Et al. 1982). - Cultivos mixtos. La población microbiana de nuestro ambiente es grande y compleja. El ambiente se compone de toda una diversidad de bacterias y otros microbios. El estudio de los microorganismos de los diferentes hábitats exige que se conozcan los microbios específicos presentes. Para lograr esto es necesario aplicar técnicas que ayuden a desenmarañar las poblaciones mixtas y complejas de microorganismos, o cultivos mixtos, y obtener cultivos puros de distintas especies y separadas. Un cultivo puro está formado de poblaciones de células derivadas de una sola célula (Pelczar. Et al 1982). - Cultivos puros El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio. A pesar de esto, para determinar las características de especies concretas de microorganismos, es imperativo que el organismo se aísle y se desarrolle en el laboratorio y como un cultivo puro. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982).

Métodos para aislar cultivos puros: Técnica de siembra por estrías en placa y técnica de siembra por difusión en placa. Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estrías o por difusión. Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación permite que las bacterias queden separadas unas de otras en la superficie del agar. Cuando se raya adecuadamente el agar con el asa las siembras, las células bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas áreas de la placa lo que permite estar seguros que la colonia que se desarrolla a partir de una célula se junte con la que está desarrollándose a partir de otra célula. Cabe suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola célula, y por tanto, un cultivo puro. Una porción de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. Después de una incubación apropiada, el desarrollo de cada cultivo se puede observar al microscopio o mediante cultivo para verificar que es un cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982). Las técnicas de siembra en placa por estrías y por difusión se pueden hacer convenientemente y con equipo mínimo; éstos son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacterias en cultivo puro. Aunque una de las limitaciones es que sólo pequeñas cantidades de las muestras pueden ser esparcidas sobe la superficie de cultivo (Pelczar. Et al. 1982). Técnica de la placa vertida El principio de la técnica de la placa vertida es la dilución (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio se mantiene al estado líquido a una temperatura a 45 °C para permitir que el inóculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de Petri, se deja solidificar y después se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar, se observarán colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando éste solidifica. Esta técnica se hace de forma cualitativa y cuantitativa. Cuando se emplea el procedimiento cuantitativo, se podrá determinar el número de bacterias (de un tipo particular) en la muestra, así como aislarlas en cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982). Las técnicas de siembra por estrías (o por diseminación) y las de placa vertida para aislar cierta clase de bacterias, pueden mejorarse con medios de cultivo selectivo o diferencial. También es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desea aislar, antes de sembrar en las placas (Pelczar. Et al. 1982).

Fig. 4. La técnica de la placa vertida se usa para el aislamiento de bacterias en cultivo puro. Etapa 1: En el tubo A (agar fundido y enfriado) se pone una parte proporcional de la suspensión original. Este tubo se pone entre las dos manos y se agita por rotación para mezclar el medio con el inóculo. Se hacen transferencias similares del tubo A al B y del B al C. Etapa 2: El contenido de cada uno de los tubos se vacía en cajas de Petri distintas. Etapa 3: Después de la incubación, las placas se examinan para buscar la que tenga colonias aisladas. De esta placa se pueden aislar cultivos puros de bacterias sembrando una porción de colonias aisladas en un tubo con medio estéril (Pelczar. Et al. 1982). Técnica del enriquecimiento del cultivo Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiológicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra en placa deberán de estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. Según Pelczar (1982) el principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseñado (medio de composición conocida y condiciones específicas de incubación) que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que se necesita pero que no sea adecuado para las demás. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que se quiere aislar se encuentra en muy pequeñas cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inóculo (Pelczar. Et al. 1982). Técnica de las diluciones en serie Si el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se encuentra en mayor cantidad de cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la muestra esté muy diluida contendrá solamente la bacteria que se busca. Aunque se recomienda

confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita (Pelczar. Et al. 1982). Mantenimiento y preservación de cultivos puros. Métodos de preservación: - Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. Muchas bacterias se preservan bien cubriendo el agar en que están creciendo con aceite mineral estéril. Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá cubrir más o menos 1.5 cm del pico del agar inclinado. Esta técnica tiene la ventaja particular de que se puede tomar algo del desarrollo bacteriano que está abajo del aceite con un asa de siembra, inocular medios frescos y a un preservar el cultivo inicial (Pelczar. Et al. 1982). - Preservación de cultivos por secado rápido en congelación (liofilización). La liofilización es el procedimiento más eficaz para la preservación de cultivos. Muchas especies de bacterias preservadas por esta técnica han permanecido viables e invariables por más de 20 años. En este procedimiento las células se secan rápidamente, mientras son congeladas, mediante las siguientes etapas: la suspensión de célular se ponen en pequeños frascos que se sumergen en una mezcla de hielo seco y alcohol (-78°C). los frascos se conectan inmediatamente a una línea de alto vacío, y una vez que se terminó el secado cada frasco se sella bajo condiciones de vacío. Las ventajas más significativas de este procedimiento son la gran longevidad, las menores oportunidades de cambio en las características del cultivo y lo pequeño de los recipientes donde se almacenan los cultivos (Pelczar. Et al. 1982). Características del cultivo Una de las características principales de las bacterias es su apariencia (características de desarrollo) seguida del crecimiento en diferentes medios de cultivo. Estas características generales como el color (o cromogénesis), abundancia de crecimiento y aun el olor del cultivo puede servir de guías para la identificación (Pelczar. Et al. 1982). Según Pelczar (1982) para determinar las características de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar los siguientes aspectos del cultivo: 1. Tipos de colonias en agar 2. Desarrollo en agar inclinado 3. Desarrollo en caldo. 4. Desarrollo en gelatina por picadura. Los aspectos más peculiares en cada uno de los medios se resumen así de acuerdo con Pelczar (1982):  Colonias en placas de agar: - Tamaño: los límites de tamaño de las colonias varían desde muy pequeñas, que miden solamente una fracción de mm de diámetro, hasta colonias muy grandes que miden 5 o 10 mm de diámetro. - Margen o borde: los bordes de las colonias bacterianas son de diferentes tipos, según la especie de que se trate. Pueden formar un círculo perfecto, como las orillas de

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una gota, o mostrar gran variedad de irregularidades como salientes redondos, hendiduras irregulares, etc. Elevación: Las colonias puede ser muy finas (planas) o gruesas (elevadas). Pigmentación: Las colonias pueden estar coloreadas o si color. Algunas especies se caracterizan por los matices que presentan de rojo, amarillo, café y violeta. Características ópticas: Las hay opacas, transparentes u opalescentes. Desarrollo en agar (inclinado) por estrías: Cantidad: Escaso, moderado o abundante. Margen o borde: Uniforme o incluso presentando varias irregularidades en cierta manera similares a las irregularidades descritas para las colonias. Consistencia de la masa desarrollada: consistencia mantecosa o de mantequilla, fácilmente removibles con una aguja de siembras, viscosas o filamentosas, secas y brillantes. Pigmentación: Similar a la descrita para las colonias. Desarrollo en caldo nutritivo: Cantidad de desarrollo: Escaso, moderado o abundante. Distribución del desarrollo en el caldo: uniformemente distribuido, desarrollo confinado a la superficie del caldo como nata o pelusa, o desarrollo que se acumula como sedimento, que es granular o viscoso. Olor: Pútrido, a frutas o aromático, o imperceptible. Desarrollo en gelatina por picadura: Desarrollo (sin licuefacción) a lo largo de la línea de inoculación: el desarrollo puede estar limitado a la zona de la picadura o puede haberse expandido más allá de la picadura. Licuefacción de la gelatina: Se puede presentar desde arriba suavemente o adquirir aspectos variados de embudos al licuar la gelatina.

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4. Metodología propuesta: Para el desarrollo del presente proyecto se seguirá los siguientes pasos: 4.1. Recolección de las muestras (bacterias) en el centro de Investigación Macagual. Se llevaran aproximadamente 12 cajas de Petri estériles destapadas y se colocaran en diferentes lugares de la zona, donde hallan árboles. Después de 30 min se recogerán y se llevaran al laboratorio. 4.2. En las cajas de Petri, las bacterias forman acumulaciones visibles de células conocidas como colonias. 4.3. Se realiza un estudio morfológico a nivel macro, para identificar características generales de las colonias de bacterias que se formaron como el color, el olor, el tamaño. 4.4. Traslado y técnica de selección de colonias (medio de cultivo Agar BHI). 4.5. Seleccionadas las colonias se realiza un estudio a nivel micro, para identificar la morfología (cocos, bacilos, etc.) y el tipo de bacteria según la tinción de Gram (Gram + y

Gram -). 4.6. Aislamiento de bacterias según la morfología (cocos, bacilos, etc.), en diferentes medios de cultivos (Macconkey, Agar BHI, etc.)  En los primeros medios de cultivo se prepara un medio de cultivo de 300 ml, compuesto de Agar (4.5 g) y BHI (11.1 g) en un Erlenmeyer, se transfiere a otras 12 cajas de Pétri esterilizadas en una autoclave, cada una contiene 20 ml de medio de cultivo, se deja solidificar a temperatura ambiente. Con la ayuda de un asa metálica estéril, se pasa bacterias de la colonia a otro medio de cultivo de agar, aquí se utiliza el método para aislar cultivos a partir de la siembra por estrías en placa.

Fig.5. Siembra por estrías. (Wistreich.1997)

Fig. 6. Método de hacer una extensión en placa para obtener cultivos puros. a) Se esteriliza el asa y luego se toma una muestra. b) Se realiza una siembra por estría sobre una palca de agar con medio estéril, extendiendo bien los organismos. Después de una estría inicial se hacen estrías subsiguientes en ángulo, y al final se vuelve a esterilizar el asa. c) Aspectos de la palca sembrada tras incubación. De las colonias que crecen aisladas se pueden obtener normalmente cultivos puros (Madigan, et al. 2004).

Cada caja de Pétri debe ir rotulada, con el nombre de la colonia según el morfotipo. Se incuba el medio ya sembrado en condiciones físicas apropiadas.

Fig. 7. Procedimiento para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativos. Tinción de Gram (Madigan, et al. 2004) Procedimiento de la Tinción de Gram (Tortora. Et al. 2007) 1) Un extendido fijado con calor se cubre con un colorante violeta básico (Cristal Violeta). Como el colorante violeta imparte su color a todas las células se le denomina colorante primario. 2) Después de un breve lapso (un minuto) se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se le cubre con lugol . cuando se lava el lugol, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas aparecen de color violeta oscuro o purpura. 3) Se lava el porta objeto con alcohol o una solución de alcohol cetona (8 segundos)

esta solución es un agente de colorante que elimina el color violeta de algunas especies pero no de otras. 4) Se elimina el alcohol con agua y si tiene el porta objeto con safranina, un colorante básico luego se vuelve a lavar el extendido y se deja secar. Luego se mira en el microscopio.

5. Resultados Discusión (conclusiones inmersas): En el Centro de Investigación Macagual, situado a veinte kilómetros (20 Km), departamento del Caquetá, localizado geográficamente en la amazonia colombiana 1o37’N y 75o36’W, a 300 msnm con un clima AF según la clasificación de Copen y con una temperatura de 25.5 °C, se realizó la primera recolección de bacterias, en donde se utilizaron cajas de Pétri con medio de cultivo agar y se colocaron en el bosque de este centro destapadas y después de media hora (30 min) se cerraron; cada caja fue ubicada en un sitio diferente (específicamente debajo de especies diferentes de plantas) a una distancia de seis metros (6 m), para así obtener diversos tipos de bacterias.

Fig.8. Cajas de Pétri destapadas y esterilizadas, colocadas en diferentes sitios del bosque del CIMAZ. Imagen tomada por: Lina Marcela Bolívar Pineda. Después de haber obtenido las bacterias en las cajas de Pétri (con medio de cultivo agar BHI) se llevaron al laboratorio de microbiología de la Universidad de la Amazonia, para detectar que muestras eran útiles para dar inicio a la investigación. Transcurrido dos días se observó en las placas colonias de bacterias. El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido a su tamaño, por lo que fue necesario recurrir a métodos nutritivos artificiales donde se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes poblaciones. En estas condiciones se pueden manipular y efectuar la investigación deseada (Olivas, 2004). Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio (Madigan, Et al. 2004). Los materiales nutritivos en donde se desarrollan y multiplican los microorganismos contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento y se denominan medios de cultivos cuyos componentes son muy variados (Olivas, 2004) y su utilización tiene como objetivo aislar diferentes especies bacterianas para proceder a su identificación, en este caso. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son la temperatura, grado de humedad, acidez entre otros. Los medios para identificar las bacterias contienen sustratos específicos de prueba para diferenciar especies de otras, con base en su capacidad enzimática. Cada especie presenta

un equipo enzimático característico de su especie (Olivas, 2004). Como existen diferentes medios de cultivo según su consistencia, origen, composición y utilización: líquidos, sólidos y semisólidos, en este proyecto se trabajó con medios de cultivos sólidos, la cual se obtiene al manipular agar (sustancia polisacárida e inerte de algas marinas) (Montoya, 2008); Cuando se inocula un medio solidificado de agar contenido en una caja de Pétri (medio en placa), las bacterias pueden esparcirse en la superficie mediante una técnica de rayado (estriado) con el asa, en tal forma que las células queden separadas individualmente, lejos unas de otras. Durante la incubación, cada célula bacteriana se reproduce tan rápidamente que entre 18 y 24 horas se producen masas bacterianas visibles y a simple vista, denominadas colonias (Olivas, 2004). Cada colonia presumiblemente procede de una bacteria progenitora, cuyos individuos son de una sola especie. Una colonia que se desarrolla separada de las otras, al ser transferidas a un medio de cultivo nuevo dará lugar a un cultivo puro, es decir con individuos de una sola especie (Olivas, 2004). Las colonias bacterianas pueden ser de formas y tamaños variable dependiendo del organismo, las condiciones del cultivo, el suministro de nutrientes (como la cantidad de oxigeno presente), y otros parámetros fisiológicos. Algunas materias producen pigmentos que dan color a las colonias independientemente de su posible pigmentación, las colonias permiten reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no fueron sembradas con un cultivo puro (Madigan, Et al. 2004). En el estudio morfológico a nivel macro se visualizó el color, tamaño y olor de las células que se hallaron en acumulaciones. En las siguientes tablas se muestran las características de las colonias de bacterias que se encontraron en las dos cajas de Pétri: Tabla 3. Descripción de las colonias encontradas en la Placa # 2, en la primera observación Caja Pétri 1 Colonias (Color) Número encontradas Forma y tamaño Amarillas 9 Circulares, diferentes tamaños Blancas con punto negro en 6 Circulares, diferentes el centro. tamaños Blancas 5 Redondas

Fig.9. Caja de Pétri # 1. Colonias encontradas después de dos días. Imagen tomada por Lina Marcela Bolívar Pineda. Tabla 4. Descripción de las colonias encontradas en la Placa # 2, en la primera observación Caja de Pétri 2 Colonias (Color) Número encontradas Forma y tamaño Amarilla 14 (12 con hongos y 2 limpias) Circulares y muy pequeñas Negra 7 (5 con hongos y 2 limpias) Puntos

Fig. 10. Caja de Pétri # 1. Colonias encontradas después de dos días. Imagen tomada por Kiara Zulay Quiñones Posteriormente se seleccionaron o aislaron las colonias de bacterias que más sobresalían y se llevaron a otro medio de cultivo de agar BHI (traslado y selección de colonias), es decir que se separaron las colonias de acuerdo a las características que presentaban, aquí se utilizó el método para aislar cultivos a partir de la siembra por estrías en placa. En la fig. 11 y 12, se visualiza las colonias que crecieron en el cultivo.

Muestra 2

Muestra 1

Muestra 3
Fig. 11. Caja Pétri #1 divida en tres secciones, en cada una de estas se encuentra las colonias observadas por primera vez. En la cual aparecen nuevas colonias con diferentes morfotipo. Imagen tomada por Gustavo Adolfo Gallego.

Muestra 5

Muestra 4

Fig. 12 Caja Pétri #2 divida en dos secciones, en cada una de estas se encuentra las colonias observadas por primera vez. En la cual aparecen nuevas colonias con diferentes morfotipo. En esta se puede observar la siembra por estrías. Imagen tomada por Kiara Zulay Quiñones. La siguiente tabla muestra las características macro de las colonias que se formaron después del traslado y selección de las primeras colonias de bacterias.

Tabla 5. Morfotipo de las segundas Colonias. Muestra Color 1 Amarillo café Amarillo claro Blanco Amarillo Naranja 2 3 4 Rosado Café claro Amarillo Amarillo Amarillo claro Beige claro Beige Naranja claro Beige Café claro Amarillo claro Naranja claro Amarillo con naranja

Forma Un ocho (dos circulares unidas) Circular Circular Circular Circular muy pequeña Circular Irregular Circular muy pequeña Circular muy pequeña Circular irregular Irregular Circular con un punto negro en el centro Ovalada Irregular Forma de frijol, Irregular Circular Circular

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Para identificar bacterias se utiliza las tinciones diferenciales que son aquellas que no tiñen del mismo modo todos los tipos de células, como la tinción de Gram. Dependiendo del resultado de esta tinción las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Una vez determinada la tinción de Gram las baterías Gram positivas aparecerán de color morado, violeta, mientras que las Gram negativas presentan color rojo o rosado. Estas diferencias en la tinción se debe a diferencias en la estructura de la pared celular de las bacterias Gram + y Gram --, de tal modo que el alcohol es capaz de decolorar las células Gram – pero no las Gram +. La tinción de Gram es uno de los procedimientos de tinción más útiles para identificar bacterias (Madigan, Et al. 2004). Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de las bacterias Gram + Y Gram – son las responsables del diferente comportamiento de las células a la tinción de Gram. En dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram – puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram +. El alcohol deshidrata las bacterias Gram + que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las bacterias Gram --, el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es rica en lípidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fácilmente (Madigan, Et al. 2004). Como las bacterias Gram – son incoloras después del lavado con alcohol o acetona, dejan de ser visibles. Por ese motivo se aplica el colorante básico Safranina, que las convierte en rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta

con el colorante primario se denominan colorantes de contraste. Dado a que las bacterias Gram + conservan el colorante violeta original y no son afectadas por la safranina (Tortora. Et al. 2007). Para realizar el estudio micro se realizó la tinción de Gram, con una muestra de bacterias de las colonias que se formaron (Tabla 5). Esta tinción permitió detallar los dos tipos de bacterias según la coloración de la pared celular y la forma, aunque la mayoría fueron Gram positivas. A continuación en la fig. 13 se contempla la morfología de las bacterias que se hallaron en las diferentes muestras del cultivo.

Fig.13. morfología de las bacterias obtenidas en la recolección de Macagual y tinción de Gram. Tabla 6. Microorganismos aislados que se observaron en la tinción de Gram. Muestra 1 2 3 4 Microorganismos aislados Estafilococos Tétradas de cocos Bacilos en capsula Bacilos Estafilococos Sarcinas Cocos en paquetes de 8, sarcina Bacilos Cocobacilos Cocobacilos Bacilos con esporas Estreptobacilos Gram + X X X X X X X X X X x x Gram -

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La forma de las células bacterianas depende de la pared celular que les proporciona rigidez y algo de elasticidad. Individualmente las bacterias pueden aparecer como elementos esféricos, elipsoidales, alargadas (cilíndricas) o en espiral (helicoidales). Cada una de estas formas es propia de una especie determinada, por esto las bacterias se clasifican en cocos, bacilos y espirales (Montoya. 2008).

El ordenamiento de las bacterias es un mecanismo por el cual ellas pueden adoptar ciertas formas cuando están en grupos. El ordenamiento puede depender de un factor genético, como ocurre con las células esféricas o cocos, o bien a un al azar como ocurre en las células rectas, cilíndricas o alargadas: bacilos (Montoya. 2008). Los cocos son células bacterianas cuya forma habitual es esférica, pero en algunas ocasiones se pueden presentar en forma lancéolas das u ovoides. Cuando estas aparecen en agrupaciones se organizan en formas diferentes según la especie. Este tipo de ordenamiento obedece a un patrón genético propio de cada especie (Montoya. 2008). Los cocos tienen una clasificación dependiendo de cómo están agrupados, a continuación se explica exclusivamente los que se observaron en las diferentes muestras (Montoya. 2008): - Tétradas: también se llaman tetracocos. Se observan en grupos conformados cada uno, por cuatro unidades celulares y presentan dos planos de división perpendicular, esto se pudo observar en la muestra 1. - Estafilococos: Esta agrupación bacteriana se presenta en forma de masas irregulares que se parecen a los racimos de uvas y posee los 3 planos del espacio, en las muestras 1, 3, 5 se visualizaron. - Sarcinas: esta agrupación bacteriana se ordena en forma bastante regular, donde aparecen ocho o más unidades celulares organizadas en forma de cubos. Los cocos con esta forma de agrupación muestra diferentes divisiones sucesivas en los 3 planos del espacio en forma perpendicular. Raramente todas las células bacterianas de una especie dad, están ordenadas exactamente según el mismo patrón. El ordenamiento predominante es la característica más importante (Montoya. 2008). Los bacilos son formas bacterianas alargadas que pueden ser cortas, rectas o cilíndricas y a veces son tan cortas y difíciles de identificar que se denominan cocobacilos. La agrupación de los bacilos es diferente a la de los cocos, pues al contrario de estos, aquellos casi nunca se agrupan. Algunas especies, sin embargo muestran tendencia a un ordenamiento de sus células, que no obedece a un patrón genético sino que depende de las etapas de desarrollo de las condiciones del cultivo (Montoya. 2008). En algunas observaciones que se realizaron en este proyecto estos aparecieron en forma individual, separados y en cadenas (estreptobacilos).

Estreptobacilos Gram 7% Bacilos en capsulados 7%

Bacilos con esporas 7%

MICROORGANISMO AISLADOS

Estafilococos 33% Bacilos 13%

Cocobacilos Gram 13%

Sarcinas 13%

Tetradas de cocos 7%

Fig. 14. Porcentaje de los microorganismos aislados. Medios de Cultivos Puros: los microorganismos aislados son llevados a cultivos puros, y esto se hizo de acuerdo al tipo de bacteria según la tinción de Gram (G+ y G -), es decir dependen de la morfología. Estafilococos: EL Agar sal manitol Cocobacilos Gram - : Medio de cultivo : Agar Macconkey Bacilos: Agar BHI Sarcina: Agar BHI El método de aislamiento empleado con más frecuencia para obtener cultivos puros es el método siembra por estría en placa (Tortora. Et al. 2007.) Existen varios procedimientos y tipos de equipo empleado de la microbiología para el aislamiento, cultivo e identificación de microorganismo. En donde se requieren cultivos puros para la determinación de actividades biológicas y bioquímicas de microorganismos (Wistreich, 1997). Mantener un cultivo puro es esencial evitar la entrada de los otros organismos. Los organismos no deseados, llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo que se han

diseñado técnicas microbiológicas para evitarlos, un método importante para obtener cultivos puros y asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en cajas de Pétri (Madigan, Et al. 2004). Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria (Wistreich, 1997; Tortora. Et al. 2007). . Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que desea averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabólicos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado (Tortora. Et al. 2007). El agar Manitol sal es un medio de cultivo altamente selectivo, pues tiene una alta concentración de cloruro de sodio, que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias pero, tolerada por el grupo de los estafilococos. Además el medio contiene manitol como único carbohidrato y rojo de fenol como indicador de pH. Cuando hay producción de ácido a causa de la fermentación del manitol, las colonias aparecen rodeadas de un halo amarillo; el medio permanecerá sin cambio de color o acentuará el rojo del medio, cunado las colonias no fermentan el manitol (Rodríguez. Et al. 2005). El agar Macconkey es un medio selectivo de aislamiento primario que habitualmente se emplea para la diferenciación de presuntiva de miembros fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa de la familia; en si se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios. (Rodríguez. Et al. 2005). Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. Las técnicas de coloración son necesarias para el estudio microscopio de las muestras de los microorganismos (bacterias), ya que permiten mirar con detalle la morfología bacteriana y proporcionan información sobre su comportamiento frente algunos o determinados colorantes.

6. Agradecimientos Los autores desean expresar sus más sinceros agradecimientos a la Universidad de la amazonia por prestar las instalaciones (laboratorios) y a los docentes Luis Ortegón (Microbiólogo) y Katherine Valderrama (Quimica) por las asesorías y el trabajo en grupo desarrollado. 7. Referente bibliográfico Burdin J, C. Lavergne, E. 1966. Características de las bacterias. Las Bacterias. París. Francia. 115 pág. Ingraham, J, L. Ingraham, C, A. 1998. Biotecnología microbiana. Introducción a la microbiología. Tercera Edición. Reverté. S.A. Barcelona. España. 733 pág. Madigan, M, T. Martinko, M,J. Parker J. 2004. Nutrición, cultivo y metabolismo. Biología de los microorganismos. Décima Edición. Pearson Prentice Hall. 1096 pág. Montoya, H, H. 2008. Nutrición y metabolismo de las bacterias. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Segunda edición. Universidad de Antioquia. Antioquia. Colombia. 255 pág. Murray, P, R. Rosenthal, K, S. Pfaller, M, A. 2000. Principios básicos de la microbiología médica. Microbiología médica. Quinta Edición. Gea consultoría Editorial S. II. Madrid. España. 473 pág. Olivas, E. 2004. Medios de Cultivo de bacterias y técnicas de aislamiento. Manual de Prácticas de Microbiología I y II y parasitología. Primera edición. Universidad autónoma de ciudad de Juárez. Ciudad Juárez. México. 105 pág. Pelczar, M, J. Reid, R, D. 1982. Características de las bacterias. Microbiología. Segunda Edición en español. Libros McGraw- Hill de México S.A. Naucalpan. México. 803 pág. Rodríguez, E. Gamboa, M. Hernández, F. García, J. D. 2005. Medios selectivos y diferenciales. Bacteriología General: Principios y prácticas del laboratorio 475 pág. Tortora, G, J. Funke, B, R. y Case, C, L. 1993. Bacterias. Introducción a la Microbiología. Tercera Edición. Acribia S.A. Zaragoza. España. 765 pág Tortora, G, J. Funke, B, R. y Case, C, L. 2007. Bacterias. Introducción a la Microbiología. Novena Edición. Medica Panamericana S.A. Buenos Aires. Argentina. 959 pág Walker, T, S. 2000. Clasificación, estructura y funcionamiento de las bacterias. Microbiología. Tercera Edición. McGraw- Hill interamericana editores. S.A. de C.V. México. 532 pág. Wistreich, G. A. 1997. Técnicas de cultivo. Laboratorio microbiología. Prentice-Hal. Estados Unidos. 676 pág.