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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DE SÃO PAULO

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS APÓS LASERTERAPIA

SÃO PAULO 2013

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS APÓS LASERTERAPIA

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica, Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Profa. Dra. Maria Aparecida da Silva Pinhal

SÃO PAULO 2013

Almeida, Maria Carolina Leal

Avaliação de alterações da matriz extracelular em cultura de células após Laserterapia / Maria Carolina Leal Almeida - São Paulo, 2013. – 68 f. Dissertação de Mestrado – Universidade Federal de São Paulo. Campus São Paulo. Programa de Pós graduação em Ciências Biológicas (Biologia Molecular). Orientador: Maria Aparecida da Silva Pinhal

1. Laserterapia 2. Matriz extracelular 3. Glicosaminoglicanos

mesmo diante das dificuldades. Vitor e Telma por sempre apoiarem e respeitarem as minhas escolhas.Aos meus pais. sempre servindo de exemplo e inspiração para que eu pudesse me tornar alguém melhor e que lutasse pelos meus sonhos. Amo vocês!!! .

em especial a minha madrinha Maria. preocupação e paciência. carinho. Amo vocês!!! . amizade. minha sobrinha Isadora e meu primo Vinicius. minha irmã Ana. descontração. minha avó Hilda. pelos momentos de alegria.A toda minha família.

pela honestidade. Muito obrigada!!!! . amizade. puxões de orelha e por toda a atenção dispensada para que este projeto fosse realizado. pelo exemplo de paixão e dedicação à pesquisa. conselhos.E por fim e não menos importante dedico este trabalho a Professora Cida. ética e sinceridade. Obrigada pelo voto de confiança.

festas de aniversários e risadas e lágrimas! Aos meus colegas de plantão que eu adotei como parte da minha família Sandra. quando minha vontade era desistir. Eloah. pela paciência e por toda a ajuda que você me deu. não tenho palavras para descrever o quanto sou grata por ter conhecido vocês e pelo convívio diário no laboratório. Dr. Giselle Zenker Justo por me ceder às células HaCaT. regado de muitas risadas e conversas. Leny Toma. Bethania. Hugo Pequeno Monteiro por ceder às células A431. Thama. e a Maria Alice por sempre estarem comigo nos momentos bons. possibilitando uma experiência única. lanchinhos da tarde. Aos professores do departamento. Juan. Ivarne Tersariol.AGRADECIMENTOS Vamos lá no decorrer desses quatro anos de faculdade conheci muita gente boa. Teka. Muito obrigada por fazerem parte de mais 2 anos da minha vida!!! A Lilian pela amizade. Yara Michellaci e profa. João Roberto Martins por ceder as enzimas condroitinases AC e ABC. sempre com seus conselhos sábios. Dr. Risa. Leandro. Obrigada!!! As amigas Eliete. Aos meus colegas da bio mol do Laboratório da Faculdade de Medicina do ABC e da Unifesp à galera do quinto andar em especial à Tatiana (Tati). prof. Beth. Cintia. Carina e Bethania. me ensinando a cultivar células e por fazer praticamente todos os experimentos deste projeto comigo! Muito obrigada! . a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e pela convivência diária. Teka. Tati. Maria Alice (mais uma vez). profa. Carina. aos técnicos do laboratório pela ajuda prestada. Eloah. pelas pipocas. prof. profa. prof. ao pessoal da enfermagem. Luciano. pessoas que indiretamente ou diretamente fizerem parte dessa história: Ao nosso grupo de trabalho orientado pela professora Cida. mas principalmente nos momentos difíceis.

Dra. Á Profa. CAPES – Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. Helena Nader pela oportunidade de fazer parte da equipe de biologia molecular. pelas palavras de incentivo e por entenderem a minha dificuldade de participar das atividades. Muitíssimo obrigada a todos. Carol . pelo apoio financeiro concedido ao laboratório na forma de Auxílios à Pesquisa. FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa de Estado de São Paulo. À Universidade Federal de São Paulo e Faculdade de Medicina do ABC.Aos meus amigos da Gakkai pelo apoio. pela bolsa de mestrado. Agradeço o apoio das agências de fomento que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho. CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.

“ Daisaku Ikeda . tudo realmente era impossível. Se falasse em dificuldades.. Somente quando o conhecimento alia-se a sabedoria é que uma pessoa pode atingir a vitória na vida. Quando o ser humano regride em sua decisão os problemas que se erguem em sua frente acabam parecendo maiores e confundemno como uma realidade imutável. A derrota encontra-se exatamente nisso.“A causa da derrota não se encontra no obstáculo ou no rigor das circunstâncias. tudo realmente era difícil. está no retrocesso na determinação e na desistência da própria pessoa.. Se falasse em impossibilidades. Somente o conhecimento não é suficiente.

promove aumento na geração ATP entre outros efeitos. após laserterapia. e o comprimento de onda utilizado. Os GAG sulfatados foram analisados por marcação metabólica utilizando sulfato radioativo. fotofísicos e/ou fotobiológicos. O ácido hialurônico aumentou na fração celular. após laserterapia em células HaCaT. Alguns estudos demonstram o efeito de terapias de luz laser de baixa intensidade em determinadas afecções da pele como manchas. enquanto. que representam dois tipos distintos de linhagens celulares da pele. Ensaios de PCR em tempo real foram realizados para análise da expressão das enzimas HAS (ácido hialurônico sintases) HYAL (Hialuronidases) e HPSE-1 (Heparanase). Os resultados obtidos no demonstraram diminuição significativa na viabilidade celular em ambas as linhagens (HaCaT e A431). enzimas que participam da degradação de heparam sulfato (heparanase) e enzimas envolvidas na degradação e biossíntese de ácido hialurônico (hialuronidases e ácido hialurônico sintases). degradação enzimática e eletroforese. Dentre os componentes da matriz extracelular foram analisados glicosaminoglicanos sulfatados (GAG). não foi observado alteração nas células A431.Resumo A pele corresponde ao órgão de maior exposição a radiação por diferentes tipos de luz. Houve alteração no perfil de GAG após tratamento com luz no comprimento de onda associado (470 e 660 nm). ácido hialurônico. sem a produção de calor. sendo que as células HaCaT apresentaram aumento significativo de heparam sulfato e condroitim sulfato. As alterações dos componentes da matriz extracelular foram avaliados comparando-se células submetidas ao tratamento com laserterapia de baixa potência e células não tratadas (controle). Os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram que o tratamento com laserterapia de baixa intensidade altera componentes da matriz extracelular e tais alterações diferem com relação ao tipo celular (células não neoplásicas ou células de carcinoma epidermóide humano). . processos inflamatórios e em diferentes tipos de tumores. respectivamente. Portanto. estimulando a proliferação celular. A laserterapia quando utilizada em tecidos e células provoca efeitos fotoquímicos. A viabilidade celular de células HaCaT e A431 também foi avaliada. ativação de linfócitos e mastócitos. o presente estudo tem por objetivo investigar as possíveis alterações de componentes da matriz extracelular em células HaCaT (queratinócitos humanos) e A431 (carcinoma epidermóide humano). A analise por qPCR demonstrou diminuição da expressão em células HaCaT e das células A431. Poucos artigos relacionam a laserterapia com as alterações de componentes da matriz extracelular em cultura celulares. O ácido hialurônico foi quantificado por método de ELISA indireto. O laser de baixa potência tem sido utilizado na prática clínica há aproximadamente 20 anos.

guanosina trifosfato HaCaT – Linhagem estabelecida de queratinócitos humano HAS .Dermatam sulfato EBSS – Solução salina balanceada de Earl sem cálcio e sem magnésio EGF – Fator de crescimento epidérmico F-12 – Meio de cultura contendo mistura de nutrientes com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio FGF – Fator de crescimento de fibroblastos FGF-2 .Heparanase .Fator de crescimento de queratinócitos GAG – Glicosaminoglicano Gal – Galactose GlcNac:N-acetilglucosamina GlcUA: ácido glucurônico GPI .LISTA DE ABREVIATURAS. SIGLAS E SÍMBOLOS A431 – Linhagem estabelecida de carcinoma epidermóide humano AH – Ácido hialurônico ATP – Adenosina Trifosfato AU .glicosilfosfatidilinositol GTP .Carbono CBC – Carcinoma basocelular CEC – Carcinoma espinocelular CO2 .dimetilsulfóxido DS .Fator de crescimento básico de fibroblastos FGF-7 .Ácido Urônico BSA – Albumina sérica bovina C .Ácido Hialurônico Sintase HCl – Ácido Clorídrico HEP – Heparina HPSE .Gás Carbônico CS – Condroitim sulfato Da – Dalton DMEM – Meio Eagle Modificado por Dulbecco DMSO .

Proteoglicanos PGHS – Proteoglicanos de heparam sulfato PGKS – Proteoglicanos de queratam sulfato RNA – Ácido ribonucléico ROS – Espécies reativas de oxigênio RT-PCR .5-difeniltetrazólio NaCl – Cloreto de sódio nm – Nanômetro PBS – Tampão Fosfato-Salino PCR .Joule KDa – Kilodalton KS – Queratam sulfato LASER – Amplificação da luz por emissão estimulada de radiação MEC .reverse transcriptase polymerase chain reaction SFB – Soro Fetal Bovino TGF-β .5-dimetiltiazol-2-il)-2.polymerase chain reaction PDA – 1.3-(4.Matriz Extracelular MTT .Hialuronidase J .3-Diaminopropano-acetato PDT – Terapia Fotodinâmica PG .Fator de Crescimento Transformante Beta .HS – Heparam sulfato Hx – Hexosamina HYAL .

.. 4................... 3............................................. 4......................................................... 4..................... 19 REAGENTES GERAIS E OUTROS MATERIAIS .............. 23 TRATAMENTO DA CULTURA DE CÉLULA COM RADIAÇÃO A LASER .................................... 44 .......................3................... DOSAGEM DE ÁCIDO HIALURÔNICO ....................................................... VIABILIDADE CELULAR EM CÉLULAS HACAT E A431 ..... 31 OBTENÇÃO CDNA A PARTIR DO RNA TOTAL ...................1.................... 1.... 31 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................ 4.............................. Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato ......1......... 22 Contagem das células em Câmara de Neubauer .......................................... 1....... 27 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR ................................. 4 MATRIZ EXTRACELULAR ........3.................................................18 3.....3..............................ÍNDICE 1.............. 1 1.......... 18 ENZIMAS ........3...........................6........................................................................................................... 4............................. 28 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL ....1...........3........................ 4... 28 DOSAGEM DE ÁCIDO HIALURÔNICO ............................................................................................................................... EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR EM TEMPO REAL DAS ENZIMAS DE BIOSSÍNTESE E DEGRADAÇÃO DO ÁCIDO HIALURÔNICO ..........1...1.......................5....................4................................................1.... 4............................................................................................................................................ 25 Eletroforese em gel de agarose com tampão PDA ................................................ 20 4.. 18 CULTURA DE CÉLULAS .1................................................................................................................... CULTURA DE CÉLULAS .............................3........3..................... 18 LÍQUIDO DE CINTILAÇÃO .................. 4........ 4................. 1 Efeitos da laserterapia nos tecidos biológicos ............................................... 4............... 1................................ 1..... ............. 22 Subcultivo das células .............. 10 Condroitim Sulfato.3................ 4. INTRODUÇÃO .. 1.................................................................. LINHAGEM CELULAR .................................................. 3.......5..........................7.... 3............. 4.............................................................2......1.... 26 Dosagem de proteínas por método de Coomassie Blue .............................................................................................3.........22 4............................................................................2.............................................. 1............2.................................................................... 3................................. 32 5...........................................1..................... 3............................................................................33 5..........................2......................................................3..... 23 QUANTIFICAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS SINTETIZADOS POR CÉLULAS.......................... 3.................................... 8 GLICOSAMINOGLICANOS...........9...............................................................................2.............................................................................................................................................................1................................... 26 Análise e quantificação dos GAG marcados metabolicamente ...................................................1............................................................................ 4...........................................................7.........4................ 31 ANÁLISE DA EXPRESSÃO POR PCR EM TEMPO REAL (QPCR) ................................................................4...............................3.............. 33 5.....................................................1......................................................................................17 MATERIAIS .............................. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................1..............................4................................................................................7...... 19 EQUIPAMENTOS .. 9 Ácido Hialurônico ... 14 2........................... 8 Proteoglicanos ................................................ 4................................................1............4................................................................7.............. 22 Descongelamento de células ..........................4............................ 3...................... 25 Extração de GAG marcados metabolicamente .................... LASERTERAPIA OU TERAPIA COM LUZ LASER DE BAIXA INTENSIDADE .. 25 Marcação metabólica ..... 42 5. 19 RADIOISÓTOPO ..................................................... 4.......... 1.....................5................................................................................................. 13 Heparam Sulfato ....6.................................. 22 Manutenção das células ...........4..4..........1.............................. 30 QUANTIFICAÇÃO DO RNA TOTAL ......................... OBJETIVOS ......................................... 4... 1..4......................... MÉTODOS ............................................................... 4............ 27 DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA ... 4.............................8..............2.............................................................. 2 PELE ............................3.............5.....................2................... 4...............................................

........................................................... 7.......................48 ........................ÍNDICE 6........................................................................................................47 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA .......................... CONCLUSÕES ..

Quantificação de Ácido Hialurônico --------------------------------------------------------------------------43 Figura 13. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431 ----------------------------------------------36 Figura 11.3 Figura 2: Espectro de absorção dos cromóforos da pele.4 Figura 3. ----------------------------------------------------------. -----------------------------------------------------------41 Figura 12.ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetração dos diferentes tipos de luz em função do comprimento de onda ---------------------------------------------------------------------------------------------------------. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico para quantificação de ácido hialurônico --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------30 Figura 8. Expressão relativa de Heparanse-1 (HPSE-1). Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ação dos oligossacarídeos gerados na MEC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15 Figura 6. Expressão relativa de Ácido Hialurônico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases (HYAL1-2) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------45 . Representação esquemática das camadas estruturais da pele ----------------------------------.6 Figura 5.5 Figura 4: Processo de diferenciação de queratinócitos -------------------------------------------------------------.

.............................................. .................................11 Tabela 3..................................................................24 Tabela 4...............32 .. Características estruturais dos glicosaminoglicanos ...................10 Tabela 2.............ÍNDICE ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1......................... Parâmetros de Irradiação .................. Sequências de Oligonucleotídeos iniciadores ................................................ Proteoglicanos presentes no tecido epitelial....................

Portanto.. 2003). são utilizados para acelerar processos de coagulação sanguínea e causam vaporização devido à produção de calor. apresentam ação anti-inflamatória e podem diminuir o edema. a literatura sugere que lasers de baixa intensidade de energia são estimulatórios. Laserterapia ou Terapia com luz laser de baixa intensidade A laserterapia de baixa potência é investigada e utilizada na prática clínica há aproximadamente 20 anos. monocromática e paralela (TANZI. As características especiais do laser diferenciam totalmente da luz natural e é definida como luz coerente. LUPTON. Defini-se Irradiância como sinônimo de densidade de . 1987. pois como pode ser verificadas em diversos estudos as doses utilizadas no tratamento deve levar em consideração estas propriedades físicas a fim de padronizar e obter resultados satisfatórios do tratamento. TANZI. LIN et al. Sinclair e Knoll adaptaram esta radiação à prática terapêutica. Outro fator importante diz respeito aos conceitos físicos de irradiância.INTRODUÇÃO 1 1. 2010. na Europa (FUKUDA T Y. Theodore H. o tratamento com laser de alta intensidade de energia (HILT. visto que.. Os lasers são classificados em duas famílias. Maiman construiu o primeiro emissor de laser de rubi em 1960 e. a irradiância influência no efeito biológico. LUPTON. LIN et al. Assim definimos laser como onda eletromagnética não ionizante com características especiais (KARU. Por outro lado. 1967). conforme sua potência e capacidade de interação com os tecidos. O tratamento com laser de baixa intensidade de energia (LILT ou Low Intensity Level Treatment) causa efeitos como bioestimulação. fluência e energia depositada. 2003). enquanto os de alta intensidade de energia possuem efeito inibitório e grande parte de sua utilização são para fins terapêuticos (HARRIS. ALSTER.1. TOTA. A palavra laser advém da abreviação de seu próprio significado (Light Amplification by Stimulated Emisson of Radiation). 2010). 2010. ou seja. 2008. Hight Intensity Laser Treatment) pode causar desnaturação de proteínas. LIN et al. INTRODUÇÃO 1.. em 1965. amplificação da luz por emissão estimulada de radiação. 1988. ALSTER. Um dos pioneiros na aplicação do laser de baixa intensidade nas áreas biomédicas foi Endre Mester no início da década de 70. MESTER. analgesia.

1. antiinflamatório e de regeneração tecidual (HARRIS. LUPTON. é expressa por: Irradiância (W / cm2) x tempo de exposição = densidade de energia (fluência) ou dose de energia (DE) expressa em joule (J / cm2). Então temos: Irradiância = potência óptica laser (W) / Área irradiada (cm2). dividida pela área irradiada. ainda existe muita divergência com relação aos resultados obtidos de diferentes estudos que descrevem os efeitos da utilização do laser. ALSTER. Efeitos da laserterapia nos tecidos biológicos Há um crescente interesse tem sido demonstrado na utilização do laser. pois a irradiância vai determinar se há dano térmico ou não.600 (infravermelho) (CARROLL. Enquanto a fluência define a taxa de energia aplicada no tecido biológico. como por exemplo intensidade da luz. sendo de grande importância a utilização de uma dose adequada. ALSTER. Na área dermatológica os lasers mais utilizados vão de 308 (UV-B) até 10. Entretanto.1. HUMPHREYS. Quando a luz interage com as células e tecidos. podendo ser absorvida. é necessário observar que lasers no espectro visível possuem pouca penetração nos tecidos.INTRODUÇÃO 2 potência (DP) e esta define a potência óptica útil do laser e expressa em watts (W). Estes dados refletem de forma direta o efeito da irradiação em tecidos biológicos. refletida. TANZI. LIN et al. 1988. transmitida ou espalhada (HARRIS. 2003). LUPTON. 2006). 2003). o protocolo de tratamento de pele típico envolve a irradiação do local afetado com a luz laser de baixa intensidade e o efeito da luz aparentemente cumulativo é repetido em intervalos de dias. A Figura 1 ilustra o poder de penetração das diferentes camadas que compõem a pele. expressa em centímetros quadrado (cm2). tempo de aplicação e distância. porém. utilizando diferentes tipos de luz de acordo com o seu comprimento de onda. existe também deficiência nos métodos de padronização para utilização da laserterapia. [S. onde certas funções celulares . 2010. Os dispositivos da bioestimulação estão sendo usados sem o conhecimento suficiente dos mecanismos de ação do tipo de luz em cada tecido.1.]).d. TANZI.. Ainda. 1988. (LOPES. Existem inúmeros relatos sobre a eficácia da laserterapia no efeito analgésico. muitos dos relatos são controversos por diferenças significativas na metodologia aplicada.

proliferação celular e apoptose. GAO. estímulo da liberação do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e estímulo no processo de cicatrização de feridas (BASSO et al.]) A utilização de lasers no comprimento de onda de 470 nm (luz azul).INTRODUÇÃO 3 podem ser estimuladas.d. [S.. apresenta ação importante no processo bactericida e antifúngico. 2012. WILLIAMS.]. 2004. aumento na produção de ATP mitocondrial. 2010. ativação de mastócitos.. LUPTON. (LOPES.. [S. TANZI. BHATNAGAR. XING.. Também foi observado efeito da luz sobre componentes da matriz extracelular como estimulo da proliferação de fibroblastos. causando fotoexcitação de porfirinas endógenas de bactérias fotossensíveis e posterior produção de espécies reativas de oxigênio (LUCCA. aumento da migração celular de queratinócitos. ALSTER. 2009. 1998). 2012) A laserterapia promove estresse nos tecidos por promover a formação de espécies reativas de oxigênio e também induz diversas respostas como proliferação celular e processos de cicatrização (GROSSMAN et al. A utilização da luz azul pode ser realizada em associação com fotossensibilizadores. estímulo da síntese de fibras elásticas e colágenas. Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetração da radiação em função do comprimento de onda. . LIN et al. LOPES. 2003). HOPKINS et al. tais como ativação de linfócitos.d.

2008. protoporfirina e hemoglobina. 2007.INTRODUÇÃO 4 A formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) causado pela laserterapia induz proliferação. XING. Na a pele. os principais cromóforos endógenos são a riboflavina. HUNG. 2009).. Terapia Fotodinâmica (PDT). como representado na Figura 3. melanina. onde se utiliza fotossensibilizador capaz de absorver a luz em comprimento de onda específico (CASTRO et al. sendo associados a diferentes técnicas. . HSU. FUJIMOTO et al.. 2008). Pele A pele é o maior órgão do corpo humano e representa 16% do peso corpóreo. está dividida em camadas denominadas epiderme. como por exemplo. como demonstrado na Figura 2 (MAHMOUD et al. produção de moléculas inflamatórias e aumento na produção de ATP (CHEN. derme e hipoderme.. bilirrubina. Lasers de baixa potência são frequentemente empregados no tratamento de patologias..2. GAO. Figura 2: Espectro de absorção dos cromóforos da pele. WAGNER et al. 2012. 2008) 1.. Adaptado de (MAHMOUD et al. 2012). sendo assim a laserterapia difere da PDT por utilizar cromóforos endógenos.

]). A integridade e resistência da pele se deve à presença de uma extensa camada de filamentos de actina no citoesqueleto dos queratinócitos e interações célula-célula (desmossomos) e célulamatriz (hemidesmossomos) (SIMPSON. A estrutura e função da pele dependem de um equilíbrio entre a proliferação e diferenciação de queratinócitos. A epiderme representa a camada mais superficial da pele e é composta de camadas estratificadas denominadas estrato basal.” [S. . bem como proteção contra a invasão de patógenos. estrato granuloso e estrato córneo (Figura 4). 2012). GREEN. Representação esquemática das camadas estruturais da pele. Adaptado de (“Cancer Information.d. conferindo rigidez e força ao tecido epitelial. que sofrem alterações morfológicas e bíoquímicas importantes. estrato espinhoso.INTRODUÇÃO 5 Figura 3. agressões físicas e químícas. PATEL.

melanócitos responsáveis pela síntese de melanina e células de Merkel. 2002). A camada basal germinativa garante a renovação dos queratinócitos e renovação da pele.INTRODUÇÃO 6 Figura 4: Processo de diferenciação de queratinócitos. Neste estrato estão presentes queratinócitos com aspecto cubóide. responsável por formar uma barreira de proteção que surge a partir da . achatadas e queratina. que ocorre em até 21 dias. Adaptado de PROKSCH. JENSEN. responsáveis pela sensação do tato. num processo denominado queratinização (KANITAKIS. 2008. O estrato basal representa a porção mais interna da epiderme em contato com a membrana basal. Os queratinócitos representam cerca de 90% da epiderme e são as células responsáveis pela produção da queratina. constituída por células anucleadas. BRANDNER. que compreende a camada mais externa. As camadas suprabasais da epiderme subdividem-se em estrato córneo.

2003). que participam das reações imunológicas da epiderme. PROKSCH. inibição de apoptose e invasão tumoral (RODUST. inicia-se um programa complexo de reestruturação que promove reepitelização.d.. como. SADOWSKI et al. hiperpigmentação e sarda (lentigo). reproduzindo todas as camadas constituintes da epiderme. MÜLLER. Sua principal origem é a presença de queratose actínica causada pela exposição solar. Cumpre ser observado que trabalhos recentes demonstram claramente que o meio de cultura é importante para o processo de diferenciação das diversas camadas da epiderme. Tais processos são coordenados pela interação de fatores de crescimento. como fator de crescimento epidérmico (EGF). fatores de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento transformante β (TGF-β) (IRIYAMA et al. WILLHAUCK et al. 2012). A pele está sujeita a diferentes tipos de estresse. sendo classificado de acordo com grau o diferenciação dos queratinócitos e a invasão epidérmica (KIM.. O crescimento do tumor é controlado pela interação das células tumorais com o microambiente. angiogênese. migração e proliferação intensa de queratinócitos. WU et al. este último inclui o carcinoma espinocelular (CEC) e carcinoma basocelular (CBC). 2007). por exemplo. STOCKFLETH.. como lesão da epiderme. 2012. 2003. LUKIC D et al. Em diferentes situações patológicas. visto que as células HaCaT possuem a capacidade de se diferenciar in vitro. SEPPÄNENPASONEN et al.INTRODUÇÃO 7 diferenciação específica dos queratinócitos da camada espinhosa e granulosa. 2008. BRANDNER. O carcinoma espinocelular (CEC) é uma lesão das células epiteliais originada a partir da transformação de queratinócitos. 2011.. queratose actínica. O estudo com células HaCaT demonstra um grande potencial na investigação da fisiologia e patologias da pele. além de queratinócitos com formato mais achatado encontram-se células de Langerhans. MEISS. envolvendo ativação de fibroblastos.. FECKER. e o segundo câncer não-melanoma mais frequente na população branca. 2013. a frequente exposição à luz UV. ARMSTRONG.. 2012. células endoteliais e inflamatórias e interações com diversos componentes da matriz extracelular. que representam respectivamente 25% e 70% dos casos de câncer de pele não-melanoma (“INCA. NASHAN.]. 2012).” [S. No estrato granuloso. e sua alteração pode facilmente progredir ao aparecimento de tumores classificados como melanomas malignos e tumores nãomelanomas. Dentre as diferentes variáveis do meio de cultura . JENSEN. promovendo proliferação celular.

a concentração ideal de cálcio e tempo de cultura permitem a presença de todas as camadas epidérmicas em cultura de células HaCaT. YU. em média 13 dias para chegar ao estágio final de diferenciação (BORANIC et al. citocinas e modulação de processos como proliferação. WILSON. HSIEH. 1. JACKSON. DEYRIEUX. HAUSSER. 2000). glicoproteínas.. KRESSE. HAUSSER. Os efeitos dos proteoglicanos em vários mecanismos celulares em geral são modulados por interações com as cadeias de glicosaminoglicanos (GAG) ou por interações entre o esqueleto protéico dos proteoglicanos. 2007). Matriz Extracelular 1. família do CD44 e proteoglicanos de MEC (versicam) e lâmina basal (perlecam). manutenção e organização da MEC (SCHONHERR. fibras elásticas. Os PG de baixo peso molecular. LYU. reservatório para fatores de crescimento.3. 2010). A MEC desempenha diversas funções como participação em mecanismos de sinalização celular. SCHONHERR. Os proteoglicanos são macromoléculas constituídas por um esqueleto protéico ligado a cadeias de glicosaminoglicanos e encontram-se presentes na superfície celular. 2001. biglicam e fibromodulina . proteoglicanos (PG) e ácido hialurônico (AH) (KRESSE. No tecido epitelial são frequentemente encontrados proteoglicanos de superfície celular. 2009.1. JIANG. adesão e migração celular (BAUER. HAUSSER. SCHONHERR. 2001. 2007. Os proteoglicanos modulam a ação de citocinas. são frequentemente utilizadas como modelo in vitro de estudos (DEYRIEUX. SCHÖNHERR. A linhagem não neoplásica de queratinócitos humanos imortalizada (HaCaT).3. glipicans. em grânulos intracelulares e na MEC. fatores angiogênicos e fatores de crescimento. bem como células de carcinoma epidermóide humano (A431). WILSON. como PG da família dos sindecans.INTRODUÇÃO 8 celular. 1999. SCHÖNHERR. Os proteoglicanos também possuem importante papel na organização de fibras de colágeno e participam de fenômenos biológicos como diferenciação. 2000). Proteoglicanos A matriz extracelular (MEC) é constituída por uma rede complexa de macromoléculas composta por colágenos. 2000). ricos em resíduos de leucina como decorim.

dermatam sulfato. Com exceção do ácido hialurônico. constituídos por um resíduo de hexosamina (glucosamina ou galactosamina). Os GAG sulfatados incluem o condroitim sulfato (CS). todos os GAG encontram-se ligados a um esqueleto protéico formando os proteoglicanos. 2008) Os GAG participam de mecanismos de sinalização em vários processos fisiológicos e patológicos como angiogênese. metástases tumorais e mecanismos de coagulação. queratam sulfato (KS). progressão de tumores. Enquanto o ácido hialurônico (AH) representa a classe de GAG não sulfatado. migração e proliferação celular (GALLO. 2013). dermatam sulfato (DS). incluindo quimiocinas. 1. PAREKH. fatores de crescimento. heparam sulfato e queratam sulfato. GANDHI. MANCERA. crescimento axonal.4. 1988). RADEMACHER. ligada a um resíduo de açúcar não aminado. A massa molecular dos glicosaminoglicanos pode variar entre 10-100 kDa. que pode ser ácido urônico (D-ácido glucurônico ou L-ácido idurônico) ou D-galactose. A pele apresenta grande quantidade de ácido hialurônico. . Glicosaminoglicanos Os glicosaminoglicanos (GAG) são heteropolissacarídeos lineares. a Tabela 1 representa a nomenclatura proposta por Jeanloz e unidades dissacarídicas constituintes (JEANLOZ. citocinas. 1960). DWEK. 2000. Os GAG podem interagir com proteínas distintas. MALMSTRÖM et al. MANCERA. A Tabela 1 evidencia os diferentes tipos de PG encontrados na pele. formados por unidades dissacarídicas repetitivas. 2000.. ZHAO et al. heparina (HEP) e o heparam sulfato (HS). enzimas e moléculas de adesão.INTRODUÇÃO 9 também são característicos da MEC da pele. que modulam processos de adesão. promovendo a regulação de diversas funções biológicas (GALLO. 2012.. já mencionados (GANDHI. 2008.

INTRODUÇÃO 10

Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial*.
Proteoglicano Sindecam GAG CS HS HS Proteína (KDa) 31 82-88 62 Tecido Epitélio e fibroblasto Epitélio e fibroblasto Atividade Morfogênese, adesão celular Endocitose

Glipicam

Perlecam

CS/HS

400 Membrana basal

Estrutural

Versicam

CS

265

Fibroblasto

Suporte mecânico, migração celular Adesão celular, fibrilogênese

Decorim

CS/DS

36

Conjuntivo Membrana basal, epitélio Conjuntivo

Colágeno XVIII

HS

150

Adesão celular Adesão celular, fibrilogênese

Fibromodulina

KS CS facultativo

42

CD44

32-38

Epitélio e linfócitos

Interação célula-célula

* Adaptada de (ESKO, 1991; SARRAZIN; LAMANNA; ESKO, 2011)

1.4.1. Ácido Hialurônico

O ácido hialurônico (AH) é um GAG não sulfatado, formado por unidades repetidas de β-D-1,3-N-acetilglicosamina e β-1,4-ácido D-glucurônico, com peso molecular que varia entre 105 a 107 Da (BRIMACOMBRE; WEBER, 1964; MEYER, 1958). Na MEC o ácido hialurônico encontra-se associado à proteoglicanos como o agrecam e versicam, formando agregados unidos por domínios de ligação, conhecidos como proteína de ligação ou link protein, proporcionando estabilidade à molécula e dificultando a degradação do AH (RODRIGUEZ; ROUGHLEY, 2006; SEYFRIED et al., 2005).

INTRODUÇÃO 11

O AH encontra-se altamente expresso em células epiteliais, desempenha importante papel no remodelamento, reparo e regeneração do tecido, participando também em processos patológicos como inflamação e desenvolvimento tumoral (FRENKEL, 2012; KASTNER; THOMAS; JENKINS, 2007; NEUMAN et al., 2011; PAIVA et al., 2005).

Tabela 2. Características estruturais dos glicosaminoglicanos
GAG Ácido Hialurônico Condroitim sulfato Dermatam sulfato Queratam sulfato Heparam sulfato Açúcar não nitrogenado Ácido β-DGlucurônico Ácido β-DGlucurônico α-L-idurônico Ácido β-D-Glucurônico β-DGalactose Ácido β-DGlucurônico Ligação glicosídica β (1-3) Hexosamina (Hx) β-D-NAcetilglucosamina β-D-NAcetilgalactosamina β-D-NAcetilgalactosamina β-D-NAcetilglucosamina α-D-NAcetilglucosamina α-D-Glucosamina N-Sulfato α-D-Glucosamina N-Sulfato Ligação glicosídica β (1-4) *Sulfato (s)

-

β (1-3)

β (1-4)

C4 ou C6 (Hx) C4 (Hx) C6 (Hx) C6 (Gal) C6 (Hx)

β (1-3) α (1-3) β (1-4)

β (1-4)

β (1-3)

β (1-4)

α (1-4)

Heparina

α-Lidurônico

α (1-4)

α (1-4)

C6 (Hx) C2 (AU)

*Posições de sulfatação: GAG, glicosaminoglicanos; Hx, Hexosamina; AU, Ácido urônico; N, grupamento amino; C, carbono; Gal, galactose.

O AH apresenta-se distribuído no estrato basal e espinhoso da epiderme, enquanto, os estratos granular, córneo, bem como a membrana basal são negativos para a marcação do AH (TAMMI et al., 1988). A associação do AH com diferentes tipos de receptores, como por exemplo na superfície de células tronco e em células neoplásicas apresenta correlação com a progressão de tumores. Dentre os receptores de AH encontramos CD44, RHAMM e ICAM (BOURGUIGNON et al., 2012). Três isoformas de enzimas participam da biossíntese do AH, denominadas ácido hialurônico sintases (HAS-1, HAS-2 e HAS-3). As ácido hialurônico sintases encontram-se ancoradas na membrana plasmática, onde o AH é sintetizado e liberado para o espaço extracelular, em geral são pouco expressas, mas produzem

INTRODUÇÃO 12

uma grande quantidade de AH (KOSUNEN et al., 2004). As HAS-1 e HAS-2 produzem AH de alto peso molecular, entre 2-4 x106 Da, enquanto, a HAS-3 produz fragmentos de AH de baixo peso molecular, entre 0,4-2,5 x 105 Da (AVERBECK; GEBHARDT; VOIGT, 2006). Os genes que codificam as diferentes ácido hialurônico sintases humanas estão presentes em diferentes cromossomos, porém, possuem homologia entre si. O gene da enzima HAS-1 está localizado no cromossomo 19q13.3-q13.4. O gene da HAS-2 encontra-se no cromossomo 8 e o gene da HAS-3 encontra-se no cromossomo 16q22.1 (NOBLE; LIANG; JIANG, 2011; NYKOPP et al., 2009). Estudos mostram que a inibição de HAS-2 na fase embrionária causa letalidade e/ou anormalidades no desenvolvimento embrionário (CAMENISCH et al., 2000). Já as enzimas HAS-2 e HAS-3 são importantes no processo de diferenciação e proliferação da epiderme (SEPPÄNEN-PASONEN et al., 2003). As enzimas que participam da degradação do AH são denominadas hialuronidases (HYAL). Existem seis isoformas conhecidas, HYAL1-4, PH 20/SPAM1 e HYALPI, sendo que as isoformas HYAL1 e HYAL2 são mais expressas em células somáticas. A HYAL1 apresenta atividade em pH ácido e pode degradar AH de alto ou baixo peso molecular, gerando tetra- e hexassacarídeos. A HYAL2 cliva moléculas de AH de alto peso molecular, sendo encontrada em baixas concentrações (CSOKA; FROST; STERN, 2001; GEORGE; STERN, 2004). A

HAYL3 apresenta-se expressa na medula óssea e testículo, enquanto a HAYL4 é encontrada no músculo esquelético e placenta (CSOKA, ANTONEI BENJAMIN SCHERER STEPHEN; STERN, 1999). A enzima PH 20/SPAM1 localiza-se no cromossomo 7q31 e encontra-se expressa nos testículos (JONES et al., 1995; PRIMAKOFF; HYATT; MYLES, 1985). A presença e ação das HAYL apresenta um importante papel tanto na fisiologia quanto em processos patológicos e conforme descrito na literatura sua presença é tecido-dependente. O AH também pode ser degradado de forma não enzimática por mecanismo que envolve radicais livres, em presença de agentes redutores, como ácido ascórbico, tióis e íons cobre (STERN; MAIBACH, 2008).

. 1992. 1994). RUDISILL. Condroitim Sulfato. GALLO. O DS é o GAG mais abundante na pele e talvez seja o principal GAG associado ao colágeno. 2006). 1979. na posição C4. WEBER. principalmente do condroitim-6-sulfato (DIETRICH et al. O CS pode ser sulfatado na posição C6 ou C4 dos resíduos de N-acetilgalactosamina. desacetilação e epimerização cria uma diversidade de famílias de CS com funções específicas de acordo com sua estrutura. apresentam um papel regulador na manutenção da estrutura córnea em um grande número de espécies. ambos dessulfatados (MALMSTRÖM et al. Acredita-se que os PGKS formam a arquitetura da córnea através de interações com as fibras colágenas (BLOCHBERGER et al. Outras formas de CS têm sido descritos. 1980). O condroitim ocorre em processos de crescimento. também denominada CS-A ou CS-C quando apresenta sulfatação em C6. keratocam e osteoglicina. O padrão de sulfatação. MALMSTRÖM et al. como FGF-2 e fator de crescimento de queratinócitos (FGF-7) (TAYLOR. 1976). 2012). WEBER. FUNDERBURGH et al.. 1997).. pois a hexosamina constituinte é a galactosamina. tais como CS-D e CS-E.. O KS é um componente importante de vários tecidos ricos em colágeno e representa um dos principais GAG presentes na córnea (HAYASHIDA et al. . ossificação e manutenção da cartilagem normal (MICHELACCI et al.. estando inclusive envolvido com a organização e fibrilogênese...2. O DS difere do CS por apresentar resíduos de ácido L-idurônico. 1996. como lumicam. MOURÃO et al. 1964). O CS é composto por unidades dissacarídicas repetitivas de ácido D-glucurônico e Nacetilgalactosamina unidas por ligações β1-4 e β1-3.INTRODUÇÃO 13 1. Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato O condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) pertencem à classe de galactosaminoglicanos. 2012). 1964. Em mamíferos. através da interação com o cofator II da heparina e ativação de fatores de crescimento.. TOLLEFSEN.4. além de ácido D-glucurônico (BRIMACOMBRE. ligada a Nacetilglucosamina por ligação do tipo β1-4 e β1-3 (BRIMACOMBRE. Os proteoglicanos de queratam sulfato (PGKS).. a unidade mais frequente de galactosamina é a forma monosulfatada. 2005. CORPUZ et al. O DS também participa de processos de cicatrização. Estudos em diversos tecidos neoplásicos mostram um aumento de CS na matriz extracelular. O queratam sulfato (KS) é composto por D-galactose.

Os PGHS ligam-se especificamente a uma variedade de proteínas (IOZZO. 2010).. DIETRICH. O . A estrutura do HS é composta por resíduos de ácido L-idurônico e ácido Dglucurônico ligados a N-acetilglicosamina (ligação β1-4) (NADER et al. O HS faz parte dos GAG sulfatados e ocorre geralmente associado a um esqueleto protéico formando proteoglicanos (PGHS). 2012. O padrão de sulfatação do HS influencia a interação e consequente modulação e ativação de diferentes proteínas. o lumicam desempenha um papel central no colágeno da pele fibrilogênese e cicatrização de feridas (YEH et al. sindecam-4 e perlecam (BEHRENS et al. 1989).. e sua presença foi detectada em células de melanoma humano. 2000).3.. Sua ação como modulador positivo da proliferação celular deve-se à capacidade de ligar-se e agir como um co-receptor para fatores de crescimento (PORCIONATTO..4. DIETRICH. ou como responsável por estímulos mitogênicos. possuindo as mais variadas funções e interações na MEC (DIETRICH et al. O HS participa do processo de divisão celular de duas maneiras diferentes: como modulador positivo ou negativo. suas funções biológicas até hoje são alvo de extensiva investigação. Somente a presença de um receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGF) funcional na célula não basta. (BRÉZILLON et al. NADER. NADER. 1987.. JUNG et al.INTRODUÇÃO 14 Na pele. adesão e migração celular. 2001). 1998). Observou-se que a epiderme e membrana basal apresentam respectivamente sindecam-1. 1999). PARISH. tais como laminina. Heparam Sulfato O heparam sulfato (HS) foi descoberto há 50 anos por Jorpes e Gardell. 1999). Algumas funções biológicas do HS envolvem o reconhecimento célula-célula. mas não em células de melanócitos normais. interação com componentes da MEC. além da ativação de enzimas (IRIE et al. SIFAKI et al.. 2008.. fibronectina e colágeno. PORCIONATTO. 2012). o complexo só se torna ativo quando o HS está presente (ORNITZ. 2006.. As células não podem responder ao fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) na ausência de HS. 2007. 2006). 1. O HS é amplamente distribuído no reino animal. no entanto. WILEY.

propiciando a formação de oligossacarídeos que apresentam alta afinidade por fatores de crescimento. angiogênese e rugas (IRIYAMA. Foi evidenciado que a exposição à luz UV promove aumento na expressão e atividade da enzima heparanase (KURDYKOWSKI et al. Figura 5. de processos biológicos como proliferação celular. 2010).. 2011). 2011). 2005).INTRODUÇÃO 15 HS parece ser essencial na constituição do complexo de ancoragem entre derme e epiderme (IRIYAMA et al. uma endo-beta-glucuronidase que cliva cadeias intrassacarídicas do heparam sulfato. 2012). 2001).. Estudos recentes evidenciam o importante papel da heparanase na fisiologia da pele e demonstra que a ativação desta enzima induz hiperplasia da epiderme. sendo tal fato decorrência da perda de heparam sulfato essencial para a junção dermeepiderme (IRIYAMA et al. portanto. ZCHARIA et al. 1999. citocinas e fatores angiogênicos. A hiperpigmentação da pele em humanos causada por exposição solar é induzida por heparanase. Pacientes com . FRIEDMANN.. Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ação dos oligossacarídeos gerados na MEC. Adaptado de (VLODAVSKY. Os oligossacarídeos gerados por ação da heparanase participam. AMANO. como mostra o esquema da Figura 5 (VLODAVSKY et al. MATSUNAGA. angiogênese e invasão tumoral.. O heparam sulfato é degradado endogenamente pela enzima heparanase (HPSE-1). inflamação.. vascularização.

. Em tais estudos decidimos utilizar a linhagem celular característica de queratinócitos humanos (HaCaT) e comparar os possíveis efeitos da laserterapia com células neoplásicas de carcinoma epidermóide humano (A431). Este estudo poderá elucidar o efeito da laserterapia em células não neoplásicas e células tumorais da pele. 2012). bem como cultura de células de melanoma. . 2012. Diante do exposto resolvemos investigar possíveis alterações do perfil de glicosaminoglicanos e da expressão da heparanase causadas pela irradiação com laser de baixa freqüência (laserterapia) em modelo experimental in vitro.INTRODUÇÃO 16 melanoma. Sabemos que a laserterapia ou aplicação do laser de baixa frequência é bastante utilizada em tratamentos de pele com a finalidade de remover manchas em geral e acne. É evidente o papel dos glicosaminoglicanos e da enzima heparanase (HSPE1) para a integridade e manutenção das funções da pele.. demonstraram aumento na expressão da heparanase (CHEN et al. auxiliando o entendimento dos efeitos e alterações moleculares proporcionados por este tipo de terapia. WAGNER et al.

. OBJETIVOS  Avaliar o efeito da irradiação de baixa frequência (laserterapia) na viabilidade celular em células não neoplásicas (HaCaT).  Analisar possíveis alterações do perfil de GAG em queratinócitos humanos (HaCaT) e em células de carcinoma epidermóide humano (A431) após irradiação de baixa frequência (laserterapia).OBJETIVOS 17 2. comparativamente com linhagem tumoral (A431). ácido hialurônico sintases e hialuronidases em células HaCaT e A431 após a utilização de irradiação de baixa frequência (laserterapia).  Investigar possíveis alterações da expressão gênica da heparanase.

Dra. 3. Darmstadt.4. Giselle Zenker Justo e de Carcinoma epidermóide humano (A431). Na2HPO4 4. EUA). KH2PO4 1.01% (Sigma Chemical Co. Brasil.1. MA. Alemanha). KH2PO4 1.® (Rio de Janeiro. PBS (tampão fosfato salino) 0. Cultura de células - Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) baixa glicose da Nutricell. 1H2O 1 mM. SP.3 mM.5% da Cultilab® (Campinas. . KCl 5 mM. Dr. Billerica. Tris-HCl 50 mM. Placas para cultura de poliestireno P35 (35x10 mm) e P60 (60x10 mm) falcon® (Lincon Park. Soro fetal bovino (SFB) da Cultilab® (Campinas. Campinas SP. pH 7. D-glucose 1% e vermelho de fenol 0. Enzimas - Maxatase (protease alcalina P126) foi adquirida da Biocon do Brasil Indústria Ltda. gentilmente cedida pelo Prof. MO. NaHCO3 8 mM (Merck®. Brasil). St. SP. gentilmente cedida pela Profa. Hugo Pequeno Monteiro. EUA). Solução EBSS (solução salina balanceada de Earl sem cálcio e sem magnésio). Tampão para proteólise. Linhagem celular Para a realização deste trabalho foram utilizadas linhagens de células estabelecidas de queratinócitos humanos (HaCaT). EUA).2. NaH2HPO4. Brasil). MA.MATERIAL E MÉTODOS 18 3. New Jersey. Campinas SP. contendo NaCl 137 mM. Antibióticos: Estreptomicina e Penicilina. Tripsina 2. RJ.8 mM e KCL 2. NaCl 116 mM. MATERIAIS 3.®. Louis. Brasil.7 mM em água destilada e filtrada em sistema Milli-QTM (Millipore®.46 mM. Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) alta glicose da Nutricell. 3. EUA) em um litro de água destilada e deionizada em sistema Milli-QTM (Millipore®. Na2HPO4 8 mM. Brasil).5 M uréia. Billerica.1M.3. contendo 3.

MO. (Corning. MO. Louis. EUA). CA. Alemanha). Albumina sérica bovina (BSA) da Sigma Chemical Co. Darmstadt. etanol 4. (Millwaukee.®.kit ImProm-IITM Reverse Transcription System Oligo (dT)12-18 da Invitrogen® (Life Technologies™ Corporation). DMSO (dimetilsulfóxido) da Aldrich Chemical Company. Solução de Coomassie Brilliant Blue G. - 3.® (Fair Lawn. Madison. USA). NY. Darmstadt.4. - Jersey). EUA). . USA). SP. Louis.® (St. MO. Transcriptase Reverse . Wisconsin).5. Louis. Inc. Alemanha). Azul de toluidina da Fisher Scientific Co. Wellesley. Radioisótopo Sulfato de sódio (Na2[35S]O4) do Instituto de Pesquisas Energéticas e - Nucleares (IPEN.® (St. WI. St. (Promega. 3. contendo corante Coomassie Brilliant Blue G 117μM (Sigma Chemical Co.MATERIAL E MÉTODOS 19 - Condroitinase AC e ABC da Sigma Chemical Co. Brasil). NY. Darmstadt. Reagentes gerais e outros materiais Todos os reagentes foram utilizados de acordo com as normas técnicas: Agarose da Bio Laboratories (Richmond. Cloreto de Sódio (Merck®. Tris da Gibco® (Grand Island. 3. EUA). São Paulo. EUA). EUA). Garrafas de cultura. 75. Inc.8% e ácido fosfórico 8. MO.5% (Merck®. 100 ou 150cm 2 da Corning Laboratory Sciences Co.6. Uréia ultra pura da Sigma Chemical Co. - MA. EUA). New Cetavlon (brometo de cetiltrimetilamônia da Merck®..® Placas “multiwell” para cultura com 96 poços da Falcon® (Lincon Park. NY. EUA). Alemanha). Louis. EUA).® (St. Líquido de cintilação Ultima Gold™ (PerkinElmer Life And Analytical Sciences®.

Inc. com software OptiQuant™. EUA).000 rpm modelo 5415. Brasil) EUA).5 x 43. SP. TRIzol da Invitrogen® (Life Technologies Corporation. Brasil). Banhos de temperatura constante FANEM Ltda.0) da Packard Instruments Co.2 e 12. Carlsbad. SP. Microplacas de 96 poços MaxiSorp/FluoroNunc™. EUA). (Highland Park.® (Meriden. WI. Microscópio invertido de campo claro e contraste de fase. da Packard Instrument Company (Meriden. Microcentrifuga 14. Equipamentos EUA). EUA). NY. modelo Coolpix 990. (Fremont. Nippon Kogakuk® (Tóquio. (São Paulo. CT. 12. SP. Brasil). Cyclone™ Sistema de estoque de fósforo.2. Eppendorf® (Hamburg. acoplada a torpedos de CO2 pelo Gás Guard Leitor de Elisa modelo ELX 800 (Universal microplate reader) da Bio-tek modelo 3030 da Forma Scientific® (Marietta.5 x 25. Scientific Industries® (Bohemia. Incubadora de CO2. Life Sciences) 3. Maxima ® SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Fermentas®. NY. Autoclave vertical e horizontal da FABBE® (São Paulo.5 x 19. EUA). EUA).MATERIAL E MÉTODOS 20 New Jersey. EUA). NanoDrop® 1000 Spectrophotometer da Thermo Fischer Scientific INC pHmetro modelo 420ª da Orion Research Incorporated® (Boston. para análise de imagem. . Fluxo Laminar vertical da Vecco® (Campinas. CA. OH. Câmaras para eletroforese em gel de agarose. - instruments Inc. CT. manufaturado pela Técnica Permatron Ltda. da Bauch&Lomb® (Rochester.7. Brasil). Japão). (1968). CA). - Agitador Vortex-Genie 2 modelo G250. modelo TE-100. Alemanha). Filmes radiossensíveis Multipurpose (12. modelo 315. MA.® (São Paulo. com câmera fotográfica digital acoplada. SP. ambos da Nikon. modelo desenvolvido por Jaques e col. Espectrofotômetro modelo Spectronic 2000. Contador de cintilação Micro Beta Jet® da Perkin Elmer. EUA).

CA) . Carlsbad. EUA). MA.MATERIAL E MÉTODOS 21 - Purificador de água Milli-Q™ ZD2. Termociclador ABI Prism 7500 da Applied Biosystems (Life Technologies Corporation.115 84 da Millipore Corporation® (Bedford.

1. o meio de cultura foi aspirado e a placa foi lavada com tampão EBSS para remover qualquer resíduo de SFB. Este meio foi preparado acrescentando-se 10% de SFB e antibióticos (100 μg/mL de estreptomicina e 100 Ul/mL de penicilina). próximo a 7. contendo meio de cultura estéril DMEM.1. Descongelamento de células Para o descongelamento das células.3. para . Cultura de células 4. A cada dois dias o meio de cultura foi trocado. MÉTODOS 4. indicando. As células. tornando o meio de cultura amarelo. a necessidade de trocar o meio. foram descongeladas em banho-maria a 37ºC.1. Subcultivo das células Quando as células apresentaram semi-confluência. O sobrenadante desta centrifugação foi descartado e as células foram ressuspensas em 1mL de meio DMEM baixa glicose com 10% de SFB para a linhagem estabelecida HaCaT e DMEM alta glicose com 10% de SFB para a linhagem estabelecida A431 e plaqueadas em garrafas plásticas específicas para cultura. portanto. Devido ao metabolismo celular o pH tende a acidificar. 4.2.MATERIAL E MÉTODOS 22 4. armazenadas em nitrogênio líquido.1. o fluxo laminar vertical foi previamente limpo com álcool 70% e tratado com luz ultravioleta por 20 minutos seguido por equilíbrio da ventilação por 10 minutos. ressuspensas em 5 mL de meio de cultura estéril e centrifugadas para eliminação dos eventuais resíduos dos reagentes de congelamento. O pH ideal para o cultivo das células é neutro.4. por aspiração com o auxilio de uma pipeta Pasteur acoplada à bomba de vácuo. O meio de cultura contém o indicador de pH vermelho de fenol que apresenta coloração vermelha em pH neutro e amarela em pH ácido. Manutenção das células A linhagem estabelecida de queratinócito (HaCaT) e Carcinoma epidermóide (A431) foram cultivadas em garrafas/placas de cultura.1. 4.

a partir das células ressuspensas e homogeneizadas em 5 mL de DMEM com 10% de SFB. Contagem das células em Câmara de Neubauer A contagem foi realizada para determinar a quantidade de células a ser distribuída em cada placa (2. manchas na pele.0x105 células/placa). A câmara de Neubauer é composta de quatro quadrantes laterais maiores.1. Foram contados os quatro quadrantes e foi calculada a média de células por quadrante. A contagem foi feita em câmara de Neubauer. Tratamento da cultura de célula com radiação a laser O equipamento utilizado para a irradiação foi o Quasar Esthétique (DMC equipamentos Ltda. mantendo-se a placa na estufa a 37ºC. utilizado comumente no tratamento de acne. . 4. Diodo Laser Vermelho 660 – 685 nm. Este resultado foi multiplicado por 1.2. Brasil). A contagem foi feita com o auxílio do microscópio óptico invertido. que são subdivididos em dezesseis quadrantes cada. contendo 5% de CO2 até tornarem-se 70% confluentes. para que as células aderidas se soltassem da garrafa/placa de cultura. Emissor Visível comprimento de Onda 460 – 480 nm.0x10 4 e o resultado final correspondeu ao número de células por mililitro de suspensão de células. Após essa etapa as células foram removidas da placa e colocadas em tubo de plástico de 15mL contendo 3 mL de meio DMEM com 10% SFB. O SFB apresenta inibidores de proteases e foi usado para inativar a tripsina.500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante descartado. olheiras e marcas de expressão. Este tubo foi centrifugado a uma velocidade de 2. por aproximadamente 10 minutos. Para a remoção das células utilizou-se da enzima tripsina. As células foram ressuspensas em 5 mL de meio de cultura para serem plaqueadas novamente. A tripsina diluída 1:10 foi adicionada a cada placa. As células foram incubadas a 37ºC. evitar lise celular. e assim.MATERIAL E MÉTODOS 23 que este não inative a enzima proteolítica utilizada na remoção das células na placa. Este equipamento utilizado para irradiar nas diferentes células em cultura apresenta as seguintes especificações: Tensão de Operação 90V ~ 240V. Potência Útil 70 mW. colocou-se 10 μl do volume total de células na câmara..4. 4.

MATERIAL E MÉTODOS 24 O equipamento possui um feixe de LED no comprimento de onda de 470 nm.5 cm 10 cm 6 minutos 2 2 470 + 660 nm 180 + 112 mW 2. foi realizada a 10 cm de distância da cultura celular. totalizando 6 aplicações no período de 3 dias. área do feixe de 78. Após a irradiação as células foram submetidas aos testes e incubadas por 18 horas a 37ºC. sendo a aplicação da luz de 470 nm em cultura de células. por 3 minutos. área do feixe de 78. utilizando ambos os comprimentos de onda (470 nm por 3 minutos e 660 nm por 1 minuto). As células foram submetidas a 2 aplicações diárias. numa densidade de energia de 0. 1988). e a potência abaixo de 400 W/cm 2. com 180 mW de potência.5 cm 2. Para o tratamento associado. aplicação a 10 cm de distância da cultura celular. Tabela 3. foi aplicado nas culturas celulares com 112 mW de potência. (HARRIS.5 cm 2. A Tabela 3 esquematiza os parâmetros de irradiação utilizados para o tratamento das diferentes linhagens celulares (HaCaT e A431) em cultura. no entanto densidades acima 10 J/cm2 disto exercem efeito oposto. ajudam a identificar os efeitos não-térmico da laserterapia.4983 J/cm 2 .5 cm 10 cm 18 minutos 2 2 660 nm 112 mW 0. em estufa umidificada contendo 5% de CO2. numa densidade de energia de 0.5136 J/cm 78. O feixe de diodo no comprimento de onda de 660 nm.05-10 J/cm2 ocasionam estímulo. considerando um intervalo de 5 horas entre cada aplicação.4762 J/cm 78. por 1 minuto numa densidade de energia de 0. seguindo as condições de irradiação para cada comprimento de onda descritas na Tabela 3. Parâmetros de Irradiação PARÂMETROS DE IRRADIAÇÃO Comprimento de onda Potência Densidade de energia total Área do feixe Distância da cultura Tempo Total 470 nm 180 mW 2.5 cm 10 cm 18 min + 6 min 2 2 .417 J/cm2.0856 J/cm2. os parâmetros utilizados foram os mesmos descritos anteriormente. Doses de 0.9898 J/cm 78.

foram adicionados 200 µCi/mL de [35S]-sulfato ao meio de cultura em meio F12 na ausência de soro fetal bovino (SFB). As células foram submetidas à irradiação com laser a 470 nm. contendo uréia 7 M.2. Após o terceiro dia de tratamento das culturas celulares nas diferentes condições. A incubação foi realizada durante 18 horas. 4. Marcação metabólica As culturas de células de queratinócitos (HaCaT) e Carcinoma epidermóide (A431) foram submetidas ao crescimento até atingirem aproximadamente 70% de confluência e foram subcultivadas em placa de 6 poços (35 mm). Às células aderidas foram adicionados 500 μl do tampão Tris HCl 25 mM. foi homogeneizada e dividida em dois tubos contendo 250 μl cada.3.1. em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino. seguindo eletroforese em gel de agarose em tampão PDA.0 (alíquota do meio de cultura e fração celular) e incubando-se o material a 60ºC por 24 horas em banho-maria. pH 7. em estufa sob atmosfera de 5% de CO2. 4. esfrego u-se o fundo da placa para remoção das células e matriz extracelular. 37ºC. 660 nm e 470 nm + 660 nm.3. A fração celular (células + matriz extracelular). contendo sulfato radioativo. Extração de GAG marcados metabolicamente Após o período de incubação das células irradiadas. Quantificação de glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por células. As células foram incubadas por 18 horas a 37ºC em estufa umidificada contendo 5% CO2. e com auxílio de um “scrapper”.2). conforme descrito na metodologia (item 4. A proteólise da fração celular e meio de cultura foi realizada com adição de 125 μl de Maxatase (1 mg/mL) em presença de Tris-HCl 0.3. o meio de cultura foi removido e uma alíquota de 500 μl foi submetida à proteólise e outra alíquota de 500 μl foi armazenada para posterior análise de ácido hialurônico.15 M pH 8.MATERIAL E MÉTODOS 25 4. Este ensaio permitiu a marcação das moléculas de GAG sintetizadas e secretadas pelas células.05 M e NaCl 0. .5.

3. foi submetida à eletroforese em gel de agarose 0. uma alíquota de 5 µL do meio de cultura e da fração celular. Após a secagem. no equipamento Cyclone® (Storage Phosphor System. com o auxílio de uma pinça e quantificadas em 5 mL de solução de líquido de cintilação. foi obtido a quantificação dos GAG sintetizados pelas linhagens estabelecida de queratinócitos e de carcinoma epidermóide mantidas em cultura. As bandas referentes aos GAG foram recortadas do gel desidratado. o gel foi submetido à eletroforese (100 V). Em seguida. Assim.3. . Após a corrida eletroforética. Os dados foram analisados utilizando-se o software OptiQuanti. Esta solução intensifica a radiação emitida pelo sulfato radioativo e permite a quantificação dos GAG expressa em cpm (contagem por minuto). A revelação do filme radiosensível foi realizada em câmara escura. durante 1 hora em câmara refrigerada a 4°C. Eletroforese em gel de agarose com tampão PDA Finalizada a proteólise. Ultima Gold™. O excesso de corante foi removido com uma solução descorante contendo ácido acético 1% e etanol 50%. Packard Instr.05 M. As bandas correspondentes à migração dos GAG tiveram como referência a migração de GAG padrão. em valores expressos em cpm/µg de proteínas totais.1% em ácido acético 1% e etanol 50%. 4.3diaminopropano acetato (PDA) 0. o gel foi totalmente desidratado sob calor e ventilação. Análise e quantificação dos GAG marcados metabolicamente A lâmina de eletroforese marcada radioativamente foi posicionada para impressão em filme radiossensível (Multipurpose.). Em seguida. o gel foi corado com azul de toluidina 0.4.55% em tampão 1. por 15 minutos.3.1% por 2 horas. Packard Instruments Co).MATERIAL E MÉTODOS 26 4.0. pH 9. os GAG foram precipitados por imersão do gel em solução de cetiltrimetilamônio (Cetavlon®) 0. dosada em cada experimento antes da proteólise pelo método convencional de Coomassie Blue. A quantificação de cada GAG foi corrigida por proteína total.

4. HORTON e POBLACIÓN.8% de etanol e 8.MATERIAL E MÉTODOS 27 4.6S) e dissacarídeo insaturado não sulfatado (ΔDi-0S). Dosagem de proteínas por método de Coomassie Blue Este método utiliza um reagente que apresenta afinidade por proteína e possui diferente intensidade de coloração dependendo da quantidade de proteínas presentes. A quantificação relativa à leitura das amostras foi determinada por equação da reta de uma curva padrão de albumina. 4.sulfatados (ΔU-GalNAc.5M. pH 7. 1987). ligações glicosídicas do tipo β(1 -4). Degradação enzimática O ensaio de degradação enzimática foi realizado para certificar-se que as bandas marcadas no pulso de sulfato correspondiam aos GAG condroitim sulfato e dermatam sulfato. A dosagem foi realizada diluindo-se 5 e 10 μl de cada amostra da fração celular sem proteólise das células irradiadas.5.6S) (MICHELACCI. especificamente. A condroitinase B é uma enzima que degrada ligações glicosídicas do tipo β(1-4).e 6. A condroitinase ABC é uma liase que atua por meio de uma . assim o resultado apresentado demonstra apenas a influência da irradiação na síntese e secreção dos GAG. uma vez que esta enzima quebra. produzindo dissacarídeos insaturados 4. A leitura da absorbância é proporcional a quantidade de proteínas presente na fração celular. 4.3.e 6.9 mL do reagente Coomassie Blue.5% de ácido fosfórico preparado em nosso laboratório. em 100 μl do tampão Tris-HCl 25 mM com uréia 3.4S e ΔU-GalNAc. A dosagem de proteínas da fração celular de cada placa foi realizada com o intuito de corrigir a quantidade de proteínas produzidas pela célula.4S e ΔU-GalNAc.sulfatados (ΔU-GalNAc.6sulfatado. O reagente contém 117 μM de Coomassie Blue G250. entre resíduos de N-acetil-hexosamina que podem ou não apresentar sulfatação em C-4 ou C-6 e resíduos de ácido glucurônico (GlcUA). A condroitinase AC é uma enzima que atua degradando condroitim 4.5 e adicionou-se 2. Cada mistura foi homogeneizada e a leitura foi efetuada em espectrofotômetro com comprimento de onda ajustado a 595 nm. envolvendo N-acetil-hexosamina e ácido-L-idurônico degradando dermatam sulfato. gerando dissacarídeos insaturados 4.

Após esse período foi feita eletroforese em gel de agarose e impressão do gel em filme conforme já descrito. a 37ºC. 4. As células foram subcultivadas em uma microplaca de 96 poços. sendo que cada amostra foi semeada em nove poços e incubada por 24 horas. 4. Em seguida. A proteína de ligação compreende à porção globular da proteína que promove a ligação do agrecam (proteoglicano de queratam sulfato e .MATERIAL E MÉTODOS 28 reação de β-eliminação. e 5% de CO2.5)-dimetiltialzolil-2. O teste foi realizado com as amostras de proteólise do pulso de sulfato. a leitura foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm. Ensaio de viabilidade celular O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando-se o “kit Vybrant MTT Cell Proliferation Assay”. Após a incubação as células foram submetidas ao tratamento com irradiação a laser com luz de 470 nm. Dosagem de ácido hialurônico Utilizamos um método fluorimétrico para a determinação do AH. O ensaio de redução do MTT (brometo de 3-(4. em estufa a 37°C. Após incubação de 10 minutos. isolada de cartilagem nasal bovina.5-difeniltetrazólio) é um ensaio colorimétrico para medir a atividade da redutase mitocondrial em células vivas.. O sobrenadante foi removido e adicionado 100 μL de MTT. O ensaio de viabilidade celular foi determinado pela média da absorbância. A sonda corresponde à proteína de ligação. que se utiliza de sondas de ligação do AH.6. de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. seguida de desvio padrão. A microplaca foi protegida por papel alumínio e incubada por 3 horas. sendo utilizado como controle do ensaio células não tratadas com laserterapia. Esta metodologia baseia-se na redução do sal de tetrazólio em cristais de formazan por células metabolicamente ativas. a solução foi removida e foram adicionado 50 μL de DMSO em cada poço. Incubou-se as amostras em banho Maria a 37ºC por 24 horas. em estufa umidificada contendo 5% de CO2. Em diferentes tubos colocou-se 20 μl da enzima condroitinase AC e condroitinase ABC e acrescentou-se 5 μl de cada amostra. 2012). condroitim-6sulfato (C6S) e dermatam sulfato (DS) (ROBAT et al. 660 nm ou a associação (470 + 660 nm). sobre sulfato de condroitim-4-sulfato (C4S).5.

seguindo três lavagem consecutivas com tampão Tris-HCl 0.05 M. à cada poço foram adicionados 100 μl da proteína de ligação (1mg/ml) conjugada com biotina. após agitação por cinco minutos. diluídas 1:100 no mesmo tampão.75. pH 7.05 M.MATERIAL E MÉTODOS 29 condroitim sulfato) ao AH. . por 12 horas. diluídas no tampão de ensaio Tris-HCl 0. Como a estreptavidina tem afinidade pela biotina conjugada à proteína de ligação forma-se um complexo (sanduíche). A Figura 6 representa o esquema das etapas descritas. A incubação foi realizada a 4°C. pH 7. A quantificação de ácido hialurônico de cada amostra foi determinada em valores expressos por ng de AH / ug de proteína total. Após a adição da proteína de ligação conjugada com biotina foi realizada agitação por 2 horas. Após várias lavagens foi adicionado uma solução de “enhancement” (280 μl em cada poço) e. seguindo lavagens exaustivas com tampão de lavagem. o európio foi deslocado do complexo com estreptoavidina. ou alíquotas de meio de cultura celular e fração celular. foram adicionados 100 μl de estreptavidina marcada com európio (diluição 1:10000) em tampão de ensaio durante 30 minutos. Em cada poço da placa contendo a sonda adsorvida foram adicionados 100 μl de solução de diferentes concentrações de AH padrão (0 a 500 μg/L). A fluorescência emitida pelo európio livre foi quantificada em um fluorímetro. A proteína de ligação é imobilizada em microplacas de 96 poços MaxiSorp/FluoroNunc™. Após lavagem. Cada ensaio foi realizado em triplicata.75 e BSA 1% (albumina bovina sérica). Em seguida.

2 mL de clorofórmio.5 mL de isopropanol para a precipitação do RNA. Este método foi padronizado por Martins e colaboradores (MARTINS et al. misturando gentilmente por 3 minutos em temperatura ambiente. B . Extração de RNA total As células foram cultivadas e plaqueadas em placas de 60 mm e tratadas conforme metodologia já descrita. as células foram removidas com tripsina. as amostras foram centrifugadas a 10. Em seguida. Após incubação de 18 horas.MATERIAL E MÉTODOS 30 A B C D E Figura 6.Após a liberação do európio com solução "enhancement" a fluorescência final foi quantificada em fluorímetro. O clorofórmio promove a extração do RNA na fase aquosa. durante 15 minutos. D – Revelação com estreptavidina marcada com európio E .5 mL e foi adicionado 0. A . 4ºC. A amostra foi transferida para um eppendorf de 1. O sobrenadante foi aspirado utilizando a bomba a vácuo e ao precipitado foi adicionado 1 mL de TRIZOL ® e homogeneizado por 5 minutos em temperatura ambiente. C – Adição de biotina conjugada com a proteína de ligação. As amostras foram incubadas por mais 10 .As amostras da fração celular e meio de cultura de células HaCaT e A431 ligada a proteína de ligação.7.Placas 96 poços MaxiSorp/FluoroNunc™ foram revestidas com a proteína de ligação (proteína ligante de proteoglicanos ao ácido hialurônico). A solução contendo RNA foi transferida para outro tubo e acrescentou-se 0..000 x g. 2003). 4. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico para quantificação de ácido hialurônico.

previamente calibrado. Finalmente. ácido hialurônico sintases (HAS1. o RNA total foi quantificado por espectrofotometria.500 x g. HAS2 e HAS3) e hialuronidases (HYAL1 e HYAL2) foram realizadas em amostras coletadas das culturas de células HaCaT e A431.5 μM). O etanol foi desprezado e as amostras submetidas a banho seco (55°C por 3 minutos). em seguida. 6 μl da enzima DNA polimerase SYBR Green® e 0. 4. por 60 minutos. Na primeira etapa da reação foi adicionado de 1 μg de RNA total e 10 μM de Oligo dT ou oligonucleotídeo iniciador (incubação 70°C. por 5 minutos e 4°C por 5 minutos). Quantificação do RNA Total A dosagem foi realizada por espectrofotometria. As amostras foram homogeneizados em tubos cônicos de 0. após o tratamento com irradiação a laser. A reação de transcrição reversa ocorreu a 42°C.2 . 4 μl do tampão de reação 5X e 1 μl da enzima transcriptase reversa. 4ºC. A partir do cDNA obtido pela reação de transcrição reversa.000 x g. anteriormente descrito. 4. Obtenção cDNA a partir do RNA Total A obtenção do cDNA foi realizada utilizando-se o kit de RT Improm II®. temperatura ambiente e. a 10. O precipitado obtido foi lavado com 1 mL de etanol 75%.8.7.2. Os valores obtidos foram expressos em ng / μl. 4. comparando-se com o controle (células não submetidas ao tratamento).MATERIAL E MÉTODOS 31 minutos. por 10 minutos. Análise da expressão por PCR em tempo real (qPCR) A expressão do RNAm da heparanase (HPSE).025 μl de Rox (normalizador de fluorescência para reação de qRT-PCR). aproximadamente 1μg/μL das amostras de cDNA foram incubadas com oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense (1.4 μl de MgCl2 (25 mM).1. Em seguida. por 5 minutos. As reações foram armazenadas à -20°C para posterior amplificação do cDNA com oligonucleotídeos iniciadores específicos. homogeneizado e centrifugado a 7. 2. As amostras de RNA foram solubilizadas em 25 µL de água milliQ tratada com DPEC (livre de RNAse).7. em aparelho NanoDrop. centrifugadas a 4ºC. foi adicionado ao tubo 10 μM de dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatados).

9. entre 60ºC a 95ºC. . Todos os oligonucleotídeos iniciadores utilizados apresentavam temperatura de desnaturação (Tm). 15 minutos. GAPDH e RPL13A. Para verificar a ocorrência de diferenças significativas entre os grupos estudados foi utilizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis. Análise Estatística A analise estatística foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prism 5. Os resultados obtidos da reação de qRT-PCR representam valores relativos obtidos por média geométrica considerando a expressão de ambos os genes endógenos constitutivos. 60ºC. Sequências de Oligonucleotídeos iniciadores mRNA HPSE1 HAS1 HAS2 HAS3 HAYL1 HAYL2 RPL13a GAPDH Foward 5' TGG CAA GAA GGT CTG GTT AGG AGA 3' 5' CAA GGC GCT CGG AGA TTC 3’ 5’ CAG ACA GGC TGA GGA GGA CTT TAT 3’ 5’ GGC GAT TCG GTG GAC TAC AT 3’ 5’ TAA CCC TGC CAG TTT CTC CAT CCA 3’ 5’ AGG ACA AAG ATG TGT ATC GCC GGT 3’ 5´ TTG AGG ACC TCT GTG TAT TTG TCA A 3´ 5´ TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT 3´ Reverse 5' GCA AAG GTG TCG GAT AGC AAG GG 3' 5’ CCA ACC TTG TGT CCG AGT CA 3’ 5’ GGA TAC ATA GAA ACC TCT CAC AAT GC 3’ 5’ CGA TGG TGC AGG CTG GAR 3’ 5’ ACA GCC ATC TGT GCC TGA TCT TCA 3’ 5’ GAA CTG CTG TGC TGC GAA CTC AAA 3’ 5´ CCT GGA GGA GAA GAG GAA AGA GA 3´ 5´ GCC CAA TAC GAC CAA ATC CGT TGA 3´ 4. Tabela 4. Os valores foram expressos em 2-ΔΔCt.0 (La Jolla. USA). CA.MATERIAL E MÉTODOS 32 mL específicos para qPCR.05). (-ΔCt). Em todas as foram considerados valores estastiticamente significantes p < 0. Os genes endógenos utilizados como controle foram da enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e da subunidade 60S da proteína ribossomal L13A (RPL13A). As amostras foram submetidas à reação de qPCR numa ciclagem de 95ºC por 10 minutos iniciais e 40 ciclos (95ºC. 60 segundos). Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados no presente estudo estão mostrados na Tabela 4.

Resultados semelhantes ao encontrado em nosso estudo. 2012). após irradação com laser de 660 nm e 780 nm (EDUARDO et al. 2012).RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 5. após laserterapia utilizando os comprimentos de onda 470 nm. A utilização de luz UVC (200-290nm).. também demonstrou inibição da proliferação celular (TAI et al. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5. apresentando relevância estatística nos dois tipos celulares (* < 0. quinase dependente de ciclina 6 (CDK6) e proteínas da família BCL-2 (JUAN et al.. demonstraram aumento da proliferação celular. bem como a associação de ambos os tipos de luz. em células A431. XING. O resultado encontra-se expresso em porcentagem de células viáveis. O tratamento das células HaCaT e A431 com luz UVB evidenciou alteração do ciclo celular.. quando utilizada a luz UVB 280315 nm (JUAN et al. No presente estudo decidimos investigar o efeito da irradiação em diferentes comprimentos de onda sobre a proliferação de células epiteliais normais (HaCaT) e células tumorais (A431). 2009). Viabilidade Celular em células HaCaT e A431 O uso da laserterapia está frequentemente associado ao aumento da proliferação celular e resposta inflamatória (GAO. 67 e 55 % (células HaCaT) e 35. Este dado contrário ao obtido no presente estudo pode ser explicado pelo fato de que a densidade de energia utilizada em tais estudos foi menor àquela utilizada em nossos experimentos (3 e 5 J/cm2). respectivamente. A escolha da dose e quantidade de aplicações foi determinada conforme o protocolo utilizado em ambulatório médico. 2012). Outros estudos utilizando cultura primária de células epiteliais humanas.05).. .1. demonstraram diminuição da viabilidade de células HaCaT e A431. 47 e 28 % (Células A431). 2012). aumentando o número de células em G1-S e diminuição da viabilidade celular dose dependente (JUAN et al. 2007). Ainda. A viabilidade celular foi analisada utilizando o teste MTT descrito na metodologia.. Observamos na Figura 7 diminuição da viabilidade celular. tais efeitos sobre o ciclo celular e viabilidade celular parecem ser mediados pelo fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-κB). Em células HaCaT e A431 foi observado diminuição da viabilidade celular de aproximadamente 32. 660 nm.

05 utilizando-se o teste não paramétrico KruskalWallis. 2012). em estudos com S. Entretanto. HSU. HUNG. como indicado em métodos. que explica o efeito bactericida. coli. BAYAT. frequência de aplicações. cultura primária de fibroblastos humano (ESMAEELINEJAD. evidenciaram grande diversidade nos protocolos experimentais que utilizam laserterapia. 2010). Os valores obtidos expressam a média e desvio padrão de ensaios realizados em quintuplicata para células HaCaT e nonoplicatas para células A431. evidenciando diminuição da viabilidade em bactérias E. 2008). área.RESULTADOS E DISCUSSÃO 34 Viabilidade Celular 120 % de células viáveis 100 80 * * * * * 60 40 20 0 nm nm nm nm C 66 0 C nm 47 0 66 0 47 0 47 0+ HaCaT A431 Figura 7. As células HaCaT e A431 foram submetidas a seis irradiações com diferentes comprimentos de onda. 2013. potência e tempo. * representa p < 0. mostrando também aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). ABRAHAMSE. Estudos realizados com outros tipos celulares como células endoteliais HUVEC (CHEN. Efeito oposto pôde ser observado em estudos com laser de 400-500 nm em bactérias S. SEKHEJANE. aureus (LIPOVSKY et al.. distância. variando a intensidade de energia. aureus e utilização de laser de 500-800 nm foi observado menor 47 0+ 66 0 66 0 nm TR TR .. gerando diferentes efeitos biológicos. 2011) e pré-osteoblastos (PAGIN et al. HOURELD. Vale salientar que a utilização do laser de 400-500 nm apresenta atividade bactericida. Viabilidade Celular após laserterapia. que dificilmente podem ser comparados.

. 2012. DIETRICH. THEODORO et al. pouco se conhece sobre os efeitos da utilização da terapia de laser de baixa potência na matriz extracelular. 1998. porém. PAVÃO. Tal diversidade estrutural das cadeias de glicosaminoglicanos está diretamente relacionada com a função que desempenham (DIETRICH et al.2. Ainda. PECCHI et al. são conhecidos os benefícios da laserterapia no tratamento de processos inflamatórios e cicatrização de feridas. TEIXEIRA et al. Observamos que as células HaCaT e A431. doenças degenerativas e em processos de cicatrização (KOZLOWSKI. o estudo de componentes da matriz extracelular. após o tratamento laserterapia. A análise desses resultados demonstrou a presença de DS sintetizado e secretado para o meio de cultura de ambas linhagens celulares. NADER... 1999). podem elucidar alterações moleculares diretamente relacionadas com o desenvolvimento de tais doenças (MOSCATELLO et al. PORCIONATTO. doenças inflamatórias. A confirmação dos galactosaminoglicanos sulfatados (CS e DS).. . 2012. como proteoglicanos. De acordo com o tipo celular existe grande variabilidade estrutural dos glicosaminoglicanos sulfatados. PECCHI et al. Alterações dos glicosaminoglicanos sulfatados estão relacionadas com o desenvolvimento de várias doenças como câncer. 2007). Atualmente.. metaloproteases e glicosidases. proteínas fibrosas. apresentaram CS/DS e HS por análise eletroforética (Figura 8).. TAYLOR..RESULTADOS E DISCUSSÃO 35 produção de ROS. GALLO. HaCaT e A431 (Figura 9). Efeito da laserterapia na síntese de glicosaminoglicanos sulfatados em células HaCaT e A431 Os glicosaminoglicanos sulfatados exercem um importante papel na sinalização celular e no remodelamento de matriz extracelular. 2011. 1998. 5. 2012). BORSIG. sugerindo que o efeito bactericida é mais eficiente em comprimentos de onda menor (LIPOVSKY et al. glicoproteínas. 2005. RUDISILL. foi determinada após degradação enzimática com condroitinase AC e condroitinase ABC (Figura 9). Diante de tais observações é interessante investigar se existe alteração do perfil de glicosaminoglicanos em cultura celular. 2010).

indicam amostras submetidas ao tratamento 470 nm. que envolvem o acúmulo de componentes da MEC. os números 3 e 4. como fibrose. não existem trabalhos na literatura que caracterizem os glicosaminoglicanos sulfatados de células HaCaT e A431. Após a eletroforese em gel de agarose.RESULTADOS E DISCUSSÃO 36 HaCaT A B A431 C D Figura 8. Painel C e D análise da linhagem A431. indicam amostras submetidas ao tratamento 660 nm. representam amostras submetidas ao tratamento 470+660 nm. Portanto. exceto o grupo controle (como indicado em métodos). Painel A e B análise da linhagem HaCaT. os resultados aqui apresentados são importantes para o melhor entendimento das alterações de tais componentes após laserterapia. que sabidamente são requeridos para os mecanismos de reparo . os números 1 e 2. É importante ser observado que até o presente. os glicosaminoglicanos sulfatados foram quantificados e os valores obtidos estão representados na Figura 10. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431. os números 5 e 6. É importante observar que a irradiação induz alterações cutâneas. representam amostras não sem tratamento (controles). os números 7 e 8. Este emsaio representa a radioautografia da eletroforese realizada para identificação e quantificação dos GAG sulfatados. As 35 células HaCaT e A431 foram marcadas com [ S]-sulfato e analisadas após 6 aplicações de laserterapia. como proteoglicanos de heparam sulfato.

8 e 11 representam as amostras digeridas com condroitinase AC e os números 3. Radioautografia da eletroforese após degradação enzimática dos GAG sulfados 35 sintetizados por HaCaT e A431. . 5.7 e 10.4. O extrato obtido da fração celular e meio condicionado foram submetidos à degradação com condroitinases AC e ABC. Painel A e B. como descrito em métodos. não foi observado alteração expressiva do heparam sulfato após aplicação com os diferentes comprimentos de onda (Figura 10). como descrito detalhadamente em métodos. indicam amostras quenão foram submetidas à degradação enzimática (controle). No meio de cultura não houve alterações significativas na secreção de HS e DS após o tratamento (Figura 10). Células. HaCaT A B A431 C D Figura 9. Painel C e D. visto que tais compostos interagem e modulam a função de uma variedade de outras moléculas como exemplo fatores de crescimento. os números 1.RESULTADOS E DISCUSSÃO 37 tecidual. As células HaCaT e A431 foram marcadas com [ S]-sulfato e submetidas a seis aplicações de laserterapia. Céçulas A431. análises estatísticas não confirmam que tal diferença seja significativa. Nas células tumorais A431. como mostra a Figura 10. Considerando a linhagem tumoral A431. observamos claramente que houve diminuição significativa do HS na fração celular em relação ao controle e o DS não apresentou alterações. A avaliação do perfil de glicosaminoglicanos sulfatados em células HaCaT após o tratamento com a associação de 470 nm e 660 nm.9 e 12 representam as amostras digeridas com condroitinase ABC. os números 2.6. sugere um aumento do heparam sulfato de aproximadamente três vezes. Entretanto.

quantificação de glicosaminoglicanos sintetizados por células e matriz extracelular. após seis aplicações do laser com 470 nm. controle (células sem tratamento com laser). após seis aplicações com laser de 660 nm. A avaliação da biossíntese do heparam sulfato em células HaCaT foi investigada em estudos de transfecção que promovem a superexpresão de enzimas C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 n 6 m 47 60 0+ nm 66 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm DS Meio . 470 nm. Meio. HaCaT HS Fração Celular 100000 80000 cpm/ g proteína cpm/ g proteína HaCaT HS Meio 25000 20000 15000 10000 5000 2500 2000 1500 1000 500 0 DS Fração Celular DS Meio 60000 40000 20000 8000 6000 4000 2000 0 C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm A431 HS Fração Celular 200000 cpm/ g proteína A431 HS Meio 40000 cpm/ g proteína DS Fração Celular 150000 100000 50000 0 C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm 30000 20000 10000 0 Figura 10. heparam sulfato. observamos que a associação (470 nm e 660 nm). HS. CTR. DS. após aplicação dos diferentes comprimentos de onda. Os ensaios foram realizados em triplicatas e os valores expressam a média e desvio padão. análises estatísticas não comprovam significância para este aumento (Figura 10). 470 + 660 nm.RESULTADOS E DISCUSSÃO 38 Considerando a quantificação do DS na linhagem HaCaT. Quantificação dos glicosaminoglicanos sintetizados por células HaCaT e A431. glicosaminoglicanos secretados para o meio de cultura. 660 nm. Novamente. repectivamente para a fração celualr e meio de cultura. Dermatam sulfato. desencadeou um aumento de aproximadamente duas e três vezes. após seis aplicações com associação do laser de 470 + 660 nm. Fração celular.

1991). evidenciando diminuição da expressão de perlecam (JUNG et al. Mais uma vez fica evidente a importância do heparam sulfato na organização da estrutura da pele e no potencial metastático após sua clivagem. após o tratamento com laserterapia. 1997). pode explicar a diminuição acentuada na viabilidade de células A431 (Figura 7). demonstrou baixa intensidade de marcação de heparam sulfato (MORI et al. como fator de crescimento de hepatócitos (HGF)... alterações da estrutura de tal composto também pode estar relacionada com o desenvolvimento de tumores. 2011).RESULTADOS E DISCUSSÃO 39 anti-oxidantes. glicosiltransferase-2 (EXTL2). quando se associa comprimentos de onda (470 e 660 nm). É importante observar que além das alterações na quantidade de heparam sulfato. Portanto. Foi demonstrado em carcinoma epidermóide de pulmão que as cadeias de heparam sulfato apresentam diferenças estruturais no padrão de dissacarídeos.. Em tais estudos. iduronosil-2-O-sulfotransferase e 6-O-sulfo transferase (NAKAYAMA et al. 2008). Um dado que corrobora com esta hipótese foi descrito na literatura demonstrando um efeito anti-proliferativo em células A431 mediado por heparina (VANNUCCHI et al. promovendo o aumento da ligação de fatores de crescimento. O presente estudo claramente mostra aumento do HS com o tratamento de laserterapia.. Deve ser lembrado que heparina e heparam sulfato compartilham a mesma via de biossíntese e também apresentam semelhança estrutural. Foi observado em estudo de biópsias de pele humana que ocorrem alterações na síntese de HS e perlecam até 72 horas após a exposição com luz UV. transferindo e estimulando a melanogênese (processo bioquímico de formação do pigmento de melanina) (IRIYAMA et al. D-glucuronosil-C5- epimerase. xilosiltransferase II.. 2012). após laserterapia pode favorecer a adesão estrutural . comparativamente com tecido não tumoral (NACKAERTS et al. A análise de carcinoma espinocelular oral bem diferenciado. O aumento da síntese de heparam sulfato. foi observado que houve um aumento significativo no nível de expressão de cinco enzimas envolvidas na biossíntese do heparam sulfato. a diminuição do heparam sulfato presente na fração celular em células A431.. 1998). O perlecam é um proteoglicano de HS de membrana basal conhecido por impedir a difusão descontrolada de diversos fatores da epiderme para a derme e sua degradação pode afetar a junção dermo-epidérmica. fator de crescimento de queratinócitos (KGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2).

comparativamente com o controle de células A431 não tratadas (Figura 11). promovendo aumento da migração e proliferação de queratinócitos e aceleram o processo de reparo de feridas (RADEK. Expressão gênica por PCR em Tempo Real da HPSE-1 Após o tratamento à laser. outros estudos demonstraram em carcinoma de células escamosas de esôfago que a alta expressão de CS/DS e das enzimas epimerase-1 (DS-epi1). somente após o tratamento associado (470 nm + 660 nm).e 4-O-sulfotransferases estavam significativamente aumentadas nestes tumores.3. Estudos sobre a importância do DS associado ao FGF-10 (Fator de crescimento fibroblástico-10). 2012). após laserterapia poderia estar relacionado com menor probabilidade de desenvolvimento de carcinoma epitelial.RESULTADOS E DISCUSSÃO 40 dermo-epidérmica e ainda. 5. No entanto. visto que os ensaios foram realizados nas mesmas condições (mesma quantidade de RNA total e cDNA nas reações de amplificação. Podemos observar na que a expressão relativa de HPSE-1 é maior nas células A431. Porém. comparativamente às células HaCaT. o que pode sugerir que a laserterapia pode efetivamente desempenhar um papel importante na diferenciação de tais células. este grupo estudou células deficientes em dissacarídeos de DS que continham ácido idurônico em sua estrutura. estimulam o receptor de FGF-10. Estes resultados corroboram . contendo ácido idurônico. e foi observado que houve uma diminuição da capacidade de migração e invasão tumoral in vitro. Com a finalidade de investigar melhor o papel do ácido idurônico em células tumorais. Os dados obtidos em nosso estudo demonstram estímulo da síntese de DS em queratinócitos normais (HaCaT). tal diminuição não foi estatisticamente significante quando foi avaliada a expressão de HPSE-1 em células tumorais A431. comparativamente com o controle de células HaCaT não tratadas. GALLO. foi observado diminuição significativa da expressão de HPSE-1 em células HaCaT. associada à redução da ligação com fatores de crescimento de hepatócitos (HGF) (THELIN et al. TAYLOR.. demonstram que a presença de 10 ou 20 dissacarídeos. podemos sugerir que o aumento do heparam sulfato. devido ao estímulo da quantidade de dermatam sulfato. 6-O. 2009). como descrito em métodos).

0 0. este dado poderia ser explicado por maior expressão de HPSE-1 na linhagem tumoral A431 (Figura 10). Sabendo-se que a irradiação com luz UVB é prejudicial à pele e sua ação pode desencadear o aparecimento de câncer de pele. comparativamente com células HaCaT (Figuras 8 e 9). comparativamente com células não neoplásicas (BRUN et al.. demonstrou-se aumento da expressão e atividade da HPSE-1 em cultura de queratinócitos (KURDYKOWSKI et al.0 * * * TR nm nm C 47 0 66 0 HPSE-1 Figura 91...3 0. 2012). Consequentemente.RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 com dados da literatura. 2009. 2012).2 0.HaCaT e A431 1.8 0. após laserterapia. tratadas com seis aplicações do laser de baixa potência como descrito em métodos. que evidenciam aumento da HPSE-1 em células tumorais. Sabe-se que a HPSE-1 está frequentemente aumentada em tumores. Outro estudo que utilizou aplicação tópica de heparanase recombinante. VLODAVSKY et al.2 Expressão Relativa HaCaT A431 1. demonstrou que a HPSE-1 acelerou significativamente a cicatrização de feridas. devido à epitelização e maturação dos vasos sanguíneos. obtidos em ensaios realizados em triplicatas. É evidente a menor quantidade de heparam sulfato.05. e confere um caráter invasivo e metastático a essas células.1 0. Controle. Os valores expressos são referentes a média e desvio padrão. 47 0+ 66 0 nm . Barras brancas indicam a expressão do RNA mensageiro da HPSE-1 em células HaCaT e Barras pretas indicam a expressão de RNA mensageiro em células A431. qPCR . Expressão relativa de Heparanase-1 (HPSE-1). células HaCaT e A431 sem tratamento. da fração celular em células A431. * p < 0. CTR. aumentando a angiogênese da ferida.

. Portanto. sintetizam e secretam quantidades maiores de AH. A diminuição da imunomarcação de AH mostrou uma correlação direta com menor sobrevida dos pacientes (KOSUNEN et al. É importante ser observado que a administração concomitante dos comprimentos de onda 470 e 660 nm promoveu um aumento de aproximadamente 3 vezes na secreção de ácido hialurônico em células HaCaT. 2005). a ativação da HPSE-1 na pele induz hiperplasia da epiderme.. comparativamente com células tumorais A431 (Figura 12). sendo que tais mecanismos são mediados pela degradação das cadeias de heparam sulfato presentes na pele (IRIYAMA. Foi descrito na literatura que a redução do AH em amostras de biópsias de pacientes com carcinoma oral espinocelular está diretamente relacionada a um prognóstico desfavorável. independente do comprimento de onda utilizado (Figura 12B). comparativamente ao controle (sem tratamento). comparativamente com células não neoplásicas HaCaT.. a maior intensidade de angiogênese no processo de reparação do tecido sugere um efeito direto mediado por ação da HPSE-1 (ZCHARIA et al. Dosagem de Ácido Hialurônico A análise da dosagem de ácido hialurônico (AH) em células HaCaT demonstrou aumento na fração celular e na secreção deste composto. aumento dos vasos linfáticos e formação de rugas. As células A431 não apresentaram alterações na concentração de AH presente na fração celular e secretado para o meio de cultura. 5. AMANO. MATSUNAGA. após os diferentes tratamentos com laserterapia (Figura 12A). Um resultado bastante interessante de ser observado foi o fato de que células não neoplásicas (HaCaT).4.RESULTADOS E DISCUSSÃO 42 possivelmente por gerar oligossacarídeos de heparam sulfato que apresentam alta afinidade por fatores angiogênicos e intensificam sua ação. Consequentemente. 2010). Ainda. a diminuição da quantidade de AH em células A431. corrobora com a hipótese de que células menos diferenciadas apresentam menor quantidade de AH. 2004).

O ácido hialurônico foi quantificado na Fração celular (células e matriz extarcelular). reforçando a teoria de que laserterapia poderia contribuir com mecanismos de reparo e cicatrização da pele mediada pelo aumento de AH. VOIGT. pode sugerir que o tratamento favoreça mecanismos de diferenciação celular e manutenção da homeostase celular. A dosagem de ácido hialurônico está expressa em ng/μg de proteína total. Os resultados mostraram que após laserterapia. utilizando laser diodo de 660 nm (100 mW.. associado ao aumento do ácido hialurônico nas células HaCaT.RESULTADOS E DISCUSSÃO 43 Dosagem de Ácido Hialurônico em células HaCaT Fração Celular Meio de Cultura A B AH ng/ug proteína total AH ng/ g proteína total Dosagem de Ácido Hialurônico em células A431 Fração Celular Meio de Cultura 400 350 300 250 200 100 80 60 40 20 0 C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 * * C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm Figura 10. após sofrerem injúria no fêmur. tais mecanismos celulares não são afetados em células tumorais. A concentração de AH foi avaliada em ratos. células HaCaT. A. Estes resultados corroboram com a análise do nosso experimento em células HaCaT. células A431. 2012). Os valores representam a média e desvio padrão de ensaios realizado triplicata para células HaCaT e nonoplicata para células A431. C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm . 2006). B. bem como no meio de cultura. ocorre aumento de AH no tecido ósseo (DE SOUZA MERLI et al. 240 J/cm-2). GEBHARDT. A constante síntese e degradação do AH é mediada por ação de ácido hialurônico sintases e hialuronidases. Quantificação de Ácido Hialurônico. O aumento na quantidade de AH. após laserterapia. observado somente nas células não neoplásicas (HaCaT). porém. O ácido hialurônico é o componente mais abundante da pele e possui um turnover de 1-2 dias no conteúdo epidermal (AVERBECK.

nos tratamentos de 470 nm e associado. No entanto estatisticamente só pode ser observado significância nas células HaCaT na expressão do gene HAS2 durante o tratamento de 660 nm e no gene HAS3. foi observado diminuição da expressão de RNAm de ácido hialurônico sintases e hialuronidases. verificamos que a expressão da HYAL-2 aumentou após os tratamentos com 470 nm e 660 nm.5. Expressão gênica por PCR em Tempo Real das enzimas de biossíntese e degradação do ácido hialurônico A análise por PCR em tempo real demonstrou diferenças na expressão de ácido hialurônico sintases e hialuronidases entre as células HaCaT e A431. O fato da quantidade de ácido hialurônico ter aumentado em células HaCaT. Esta hipótese pode justificar a necessidade de altos níveis de ácido hialurônico em queratinócitos não neoplásicos para manutenção da viscosidade. como mostra a Figura 13B. resiliência e permeabilidade. Curiosamente o tratamento com laser promoveu aumento da expressão das ácido hialurônico sintases em células A431. mesmo com diminuição da taxa de transcrição das enzimas envolvidas com a síntese e degradação do AH. independente do tipo de tratamento com laserterapia (Figura 13A). após laserterapia.RESULTADOS E DISCUSSÃO 44 Diante dos resultados obtidos até o momento decidimos investigar a expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronodases em células HaCaT e A431. . após laserterapia. Nas células HaCaT. funções essenciais na manutenção do epitélio. enquanto houve diminuição da expressão da HYAL-1. a atividade das sintases encontra-se significativamente aumentada. Com relação às hialuronidases (HYAL). em células não neoplásicas (HaCaT). reflete que possivelmente. 5.

poderíamos sugerir que em células A431 preferencialmente existe tal composto.04 0.2 0.RESULTADOS E DISCUSSÃO 45 A 1. como descrito em métodos..08 0.5 0.5 3.8 0. Ainda.. 1998).6 0.0 3.0 2 TR 3 1 1 AS AS L AS C YA H H H 470 nm 660 nm 470+660 nm Expressão Relativa H H Figura 113.0 1.0 4. Sabendo que a HYAL-2 degrada especialmente o AH de alto peso molecular (NOBLE. Expressão relativa de Ácido Hialurônico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases (HYAL1-2).5 2. JIANG. sem tratamento.5 4.05. 2011). Células HaCaT tratada com seis aplicações do laser de baixa potência.5 1.5 1. LIANG. 2011).0 5. obtidos em triplicata. Os valores expressos são referentes a média e desvio padrão. B. Células A431. * p < 0.4 0. enquanto a HYAL-1 não sofre tal regulação (FLANNERY et al.0 4. tratada com seis aplicações do laser de baixa potência.0 0.00 2 3 1 TR 1 A S A S L A S C YA H H H YA H L 2 * * * B A431 6.02 0. H YA L 2 .06 0.0 Expressão Relativa HaCaT 470 nm 660 nm 470+660 nm 0. A. A diminuição da expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronidases foi observada em células HaCaT tratadas com radiação UVB (280 nm) (HAŠOVÁ et al. Controle (CTR).0 2.5 5. é descrito na literatura que a HYAL-2 pode ser regulada por citocinas inflamatórias.

principalmente se ao utilizarmos a laserterapia com doses inadequadas. e poderiam modificar a resposta ao tratamento. pode-se causar alterações irreversíveis as células epiteliais e facilitar uma progressão tumoral. que os testes in vitro não representam em sua totalidade o tecido epitelial devido a ausência de interação com outros moléculas.RESULTADOS E DISCUSSÃO 46 O estudo evidenciou alterações no perfil e expressão de moléculas da matriz extracelular. entanto vale observar. respectivamente constituintes de melanócitos e hemácias circulantes no tecido epitelial. como por exemplo a melanina. . e hemoglobina. visto que a luz também exerce efeito sobre tais moléculas. sendo de grande relevância para o estudo dos efeitos do laser de baixa freqüência em tratamentos dermatológicos.

 Foram verificadas diferentes respostas com relação à quantidade de ácido hialurônico nas diferentes linhagens estudadas.  A utilização do laser de baixa frequência alterou o perfil de glicosaminoglicanos sulfatados das células HaCaT e A431. Porém. após laserterapia em ambas as linhagens celulares estudadas. Entretanto. após laserterapia. quando utilizado o tratamento de associação entre os comprimentos de onda 470 nm e 660 nm. . mas não na expressão de hialuronidase 1. na linhagem tumoral A431. sendo observado aumento na expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronidase 2.CONCLUSÃO 47 6. uma diminuição mais acentuada da expressão do RNA mensageiro da HPSE-1 foi observada na linhagem HaCaT. Após irradiação com laser de baixa potência ocorreu aumento da quantidade de ácido hialurônico na linhagem HaCaT. CONCLUSÕES  A utilização do laser de baixa frequência diminuiu a viabilidade celular de ambas as linhagens celulares não neoplásicas (HaCaT) e tumoral (A431). Nas células HaCaT observamos aumento do HS.  Foi observado diminuição da expressão do RNA mensageiro da enzima HPSE-1.  Na linhagem HaCaT foi demonstrado diminuição da expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronidases. Porém. houve diminuição do HS na fração celular em todos os tratamentos. a linhagem A431 o efeito foi oposto. não ocorrendo nenhuma alteração para a linhagem tumoral A431. Tal resultado possivelmente corrobora com o aumento do HS observado para a linhagem HaCaT.

v. 687-697. v. CARROLL. v. Modern Pathology. 106. LASER-tissue interactions. 22. et al.. CAMENISCH. 2012. v. L.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 48 7.. n. 22. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AVERBECK. 267. 32. BRÉZILLON. 347-352. 1. Clin.or Collagen IV-containing Networks Connected by Aggregated Perlecan . BEHRENS. cDNA to Chick Lumican ( Corneal Keratan Sulfate Proteoglycan ) Reveals Homology to the Small Interstitial Proteoglycan Gene Family and Expression in Muscle and Intestine. Skin cell culture: utilization in plastic surgery and laboratory studies. Lijec Vjesn. S. 18700-18709. BORANIC. C. S. J. A. BRIMACOMBRE. 1992. et al. T. Topography of Extracellular Matrix Mediates Vascular Morphogenesis and Migration Speeds in Angiogenesis. 1-18. 24. L. et al. BLOCHBERGER. v. p. p. in human malignant melanoma. J. p. 2000. T. Expression of lumican . a small leucine-rich proteoglycan with antitumour activity . 1999.. C. BAUER.. Experimental Dermatology. Y. HUMPHREYS. p. 2006. 405-416. 181 BRUN. 1548-1554. n. J. Differential regulation of hyaluronan metabolism in the epidermal and dermal compartments of human skin by UVB irradiation. v. WEBER. T. M. 2-7. p. BOURGUIGNON. S. 2012. n. The Journal of biological chemistry. W. 2009. et al. Mucopolysaccharides . 287. et al. v. et al. 2012.chemical structure. Invest. Y. distribuition and isolation. BASSO. T. ed. 349-360.. Plos Computacional Biology. . 2. 3. but Not by Nidogens. 2006. n. L. JIANG. p. n. 2009. G. 5. The Journal of biological chemistry. 1964. R. The Society for Investigative Dermatology. n. 137-43. T. M. D. Stem Cell Marker (Nanog) and Star-3 Signaling Promote MicroRNA-21 Expression and Chemoresistance in Hyaluronan/CD44activated Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cells. International Journal of Dentistry.. v. Clinics in Dermatology. New York: Elsevier Publishing Company. GEBHARDT. 1-6. F. 121. p. 7. 6. 31. M. 2007. L. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Oncogene. v. p. D. n. Heparanase expression by Barrett ’ s epithelium and during esophageal carcinoma progression. p. p. p. R. VOIGT. 4-5. p. et al. The Epidermal Basement Membrane Is a Composite of Separate Laminin. et al. JACKSON. In Vitro Wound Healing Improvement by Low-Level Laser Therapy Application in Cultured Gingival Fibroblasts. 149-160. 12.

v. 88. 5. J. 2007. 1998. Y. 417-29.org/cancersummary/cdr0000552637>. DIETRICH. S. et al. Migration . 365-372. CORPUZ. p.. Lasers in Surgery and Medicine. 39. v. C. 499-508. et al. v. The Journal of Dermatology. p.. 9759-9763. 52. 1130-1141. Acesso em: 16 abr. 1996. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2008. 5. 39. n. R. C. n. ESMAEELINEJAD. v. 1980. D. and eNOS Gene Expression Possibly Via PI3K Signal Pathway. D. CSOKA. Matrix Biology. 3. M. 271. 1999. 2007. p. 2012. Lasers in Surgery and Medicine. n. Cancer Information. STERN. ANTONEI BENJAMIN SCHERER STEPHEN. 2007. v. I. p. Curr Opin Cell Biol. CHEN. 179-86. Evaluation of heparanase and matrix metalloproteinase-9 in patients with cutaneous malignant melanoma. FROST. Cultured Epithelial Cells Response to Phototherapy With Low Intensity Laser. em: DE SOUZA MERLI. et al.. The effects of low-level laser irradiation on cellular viability and proliferation of human skin fibroblasts cultured in high glucose mediums. G. Low-Energy Laser Irradiation Increases Endothelial Cell Proliferation . 805-16. R. et al. Photochemistry and photobiology.. 339343. Disponível <www. CSOKA. v. L. 2001. v. L. 46-54. 3. P. 2013. v. 20. 1991. et al. n. 60. p. v. Cytotechnology. Genomics. Structure of heparan sulfate: identification of variable and constant oligosaccharide domains in eight heparan sulfates of different origins. A. p. et al. 356–361. DEYRIEUX. 44. function and metabolism. Expression Analysis of Six Paralogous Human Hyaluronidase Genes Clustered on Chromosomes 3p21 and 7q31. V. p. A. ESKO. H. Cell Mol Biol. M. M. n.ccsb. lasers med Sci. The Journal of biological chemistry. . EDUARDO. Role of sulfated mucopolysaccharides in cell recognition and neoplastic transformation. p. WILSON. p. W. Molecular Cloning and Tissue Distribution of Keratocan.. BAYAT. DIETRICH. v. v. 2013. 1.. v. p. p. p. 1293301. The low level laser therapy effect on the remodeling of bone extracellular matrix. F. G.. C. STERN. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. 40. HUNG. et al. F. In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. An Acad Bras Cienc. B. CHEN. 16. Genetic analysis of proteoglycan structure. 77-83.. M. 39. 2012.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 49 CASTRO. 54. Putative role of heparan sulfate proteoglycan expression and shedding on the proliferation and survival of cells after photodynamic therapy. HSU. A.

p. HAŠOVÁ. 2008. 72. T. p. S. 455-482. 348. 9-14. 55-60. p. XING. Hyaluronan minimizes effects of UV irradiation on human keratinocytes. Induction of Different Reactive Oxygen Species in the Skin During Various Laser Therapies and Their Inhibition by Fullerene. 70-4. L. p. 303. 53. 1997. 829. n. 2011. R. The role of hyaluronan in wound healing. Mimecan .REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 50 FLANNERY. MANCERA. Journal of Investigative Dermatology Symposium …. 824-829. 22. et al. L. N. 16. maio.A. 3. GALLO. 2004. A. Lasers in Surgery and Medicine. 3. S. n. FUKUDA T Y. 212-218. J. GANDHI. FUNDERBURGH. Clinica Chimica Acta. 31-37. 780 nm Low Power Diode Laser Irradiation Stimulates Proliferation of Keratinocyte Cultures : Involvement of Reactive Oxygen Species. J. 1998. et al. Z. International Wound Journal. p. et al. 277-84. 2007. 1. GEORGE.. Archives of dermatological research. Serum hyaluronan and hyaluronidase : very early markers of toxic liver injury. p. Journal of Biomedical science. 261-266. 352-358. p. GROSSMAN. STERN. 189-197. C.. M. 44. v. et al. 4.. et al. L. R. v. Biochemical and biophsycal research comunications. Lasers in Surgery and Medicine. GOMES. 2008. R. 2012. 1988. J. R. n. p. p. 28089-28095. T. GAO. Rev Assoc Med Bras. p. X. Molecular mechanisms of cell proliferation induced by low power laser irradiation. M. 12. N. C. v. HAN. 2008. . 1998. ORL. 1-7. p. Expression and Activity of Articular Cartilage Hyaluronidases. Perfil de Glicosaminoglicanos Sulfatados no Útero de Camundongas Durante o Ciclo Estral. p. Is a Product of the Gene Producing Osteoglycin. v. 10. FRENKEL. p. 2000. v. 44. v. v. n. The Relationship between the Extracellular Matrix and the Angiogenesis and Metastasis of Laryngeal Carcinoma. C. 685-694. Analysis of low-level laser therapy doses in Brazilian equipment. 70. M. 2012. R. Revista Brasileira de Fisioterapia. Laser Topics. Laser Biostimulation: Review and Hypothesis. D. et al. 2009. The Journal of biological chemistry. v. v. 272. n. D. v. the 25-kDa Corneal Keratan Sulfate Proteoglycan . FUJIMOTO. v. The Structure of Glycosaminoglycans and their Interactions with Proteins.I. p. Chem Biol Drug Des. v. et al. Proteoglycans and cutaneous vascular defense and repair. HARRIS.

Journal of Athletic Training. Journal of cellular biochemistry. THOMAS. KANITAKIS. 2013. HSIEH. 25. genomic structure. Anatomy. H. V. Acesso em: 1 abr. Characterization of photodynamic therapy responses elicited in A431 cells containing intracellular organelle-localized photofrin. 2010. p. et al. P. JUAN. Y.. Expression analysis. 223-229. angiogenesis . 223–228. 2010. R. I.. v. 821-833. 2. Low-Level Laser Therapy Facilitates Superficial Wound Healing in Humans: A Triple-Blind. 6. p. Heparanase activation induces epidermal hyperplasia . p. R. Hyaluronan induces the selective accumulation of matrix-and cell-associated proteoglycans by mesangial cells. v. F. The Nomenclature of mucopolysaccharides. 12307-12312.. 165-167. S. YU. p. 1995. J. 2004. 4. M. 111. lymphangiogenesis and wrinkles. Genomics. v. G. p. QE-23. IOZZO.gov. JUNG. v. Sham-Controlled Study.. p. v. R. 1703-1717. n. 300-306. v. J. 2001. Hyperpigmentation in human solar lentigo is promoted by heparanase-induced loss of heparan sulfate chains at the dermal–epidermal junction. Journal of Dermatological Science. et al. et al. 171. Y. Heparan sulfate proteoglycans : intricate molecules with intriguing functions. PNAS. J. Photobiological Fundamentals of Low-Power Laser Therapy. n. p. JENKINS. Z. 583-589. 2002. KASTNER. IRIE. Differential Responses to UVB Irradiation in Human Keratinocytes and Epidermoid Carcinoma Cells. n. The Journal of Clinical Investigation. v. 27. 2008. IEEE Journal of Quantum Electronics. n. 29.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/pele_nao_mela noma>. 19.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 51 HOPKINS. p. 233-237. v. Disponível em: <http://www2. et al.inca. 1811-1821. T. 12. 108. KARU. IRIYAMA. 5. INCA. M. 390-401. 2011. 2007. Biomed Environ Sci. Eur J Dermatol. et al. v. 796–800. Heparan sulfate regulates ephrin-A3 / EphA receptor signaling. Acute UV Irradiation Increases Heparan Sulfate Proteoglycan Levels in Human Skin. n. v.. 64. S. 105. Experimental Dermatology. v. p. et al. 3. v. IRIYAMA. p. . 34.. JEANLOZ. 3. 3. LYU. 1960. 1987. The american Journal of Pathology. JONES. S. S. 2012. 39. AMANO. W. 965-972. Arthritis Rheum. MATSUNAGA. n. p. 2012. and mapping to 7q31 of the human sperm adhesion molecule gene SPAM1. J. Journal Korean Med Sci. p. n. histology and immunohistochemistry of normal human skin. T. p. v.

A. BORSIG. p. Journal of Photochemistry & Photobiology. p. Biology Ultraviolet-B irradiation induces epidermal upregulation of heparanase expression and activity. 107-112. Laserterapia: conceitos e aplicações. KOSUNEN. 1807-1815.br/Revista_port/introducao.com. 266-274. Visible Light-Induced Killing of Bacteria as a Function of Wavelength : Implication for Wound Healing. A. 8. Proteoglycans of the extracellular matrix and growth control. LOPES. R. Journal of cellular physiology. Effects of Visible Light on the Skin. Disponível em: <http://www. inflammation and thrombosis by inhibition of P-selectin. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. p. 30. L. 460466. p. July. et al. LUKIC D et al. Iduronic Acid in Chondroitin/Dermatan Sulfate: Biosynthesis and Biological Function. M. Acesso em: 23 jun. 257-263. p. WILLIAMS. Med Arh. LIN. Acesso em: 14 abr. MALMSTRÖM. v. 319. et al. 106. H. 65-72. n.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 52 KIM. A. BHATNAGAR. v. Analytical Biochemistry. LIPOVSKY. H.. 3. A. et al. 2008. The results of treatment of basoceltular carcinomas of the head skin. journal of Thrombosis and Haemostasis. Laserterapia Conceitos e aplicações. Lasers in Surgery and Medicine. p. 2012. H.nupen. Reduced expression of hyaluronan is a strong indicator of poor survival in oral squamous cell carcinoma. 467-472. 2013a. KURDYKOWSKI. n. D. p. 84. v. Practical determination of hyaluronan by a new noncompetitive fluorescence-based assay on serum of normal and cirrhotic patients. L. R. F. p. 169-72. W. and COPD.. 66. Oral Oncology. v.. 40. Nonmelanoma Skin Cancer. Dermatologic Clinics. KRESSE. A. J. n. 2010.. n. E. Letters Applied microbiology. M. et al.php>. B. Lasers .com. . et al. A. 2012. 916-925. K. v. Ascidian dermatan sulfates attenuate metastasis . 2012. 1-10. stem cells . KOZLOWSKI. Disponível em: <http://www. p. PAVÃO. 16. 55. 2012. E. 450-462.nupen.br/Revista_port/fund_fisicos4_2. 2001. p. LUCCA.php>. et al. SCHÖNHERR. p. 2003. LOPES. v. p. 42. A.. Blue light ( 470 nm ) effectively inhibits bacterial and fungal growth. B: Biology. L. 1. et al. MAHMOUD. A. 2012. Photochemistry and Photobiology. 60. v. v. ARMSTRONG. 2004. v. v. MARTINS. D. 9. 274. Journal of Translational Medicine. 2011. v.. v. 125-139. S. 2010. 2013b.

Fed Proc. p. heparan sulfate and FGFRs : complex interactions essential for development. A novel evaluation system of metastatic potential of oral squamous cell carcinoma according to the histopathological and histochemical grading. K. v.. J Cell Physiol. 19. 1967. Decorin Suppresses Tumor Cell Growth by Activating the Epidermal Growth Factor Receptor. 1997. 1958. The distribution of chondroitin sulfates in articular and growth cartilages of human bones. 2008. 406-412. Oral Oncology. p. 1-9. n. T. v. 91. 9. 221-264. 140. Y. 2000. p. NAKAYAMA. Biochim Biophys Acta. et al. NOBLE. BioEssays. 1976. Kiserl Orvostud. et al. Heparin sequences in the heparan sulfate chains of an endothelial cell proteoglycan. 335–345. Effect of laser on hair growth of mice. A. 14. Physiol Rev. P.. 305-10. J. NADER. NYKOPP. M. p. MÜLLER. Cellular & Molecular Biology Letters. p. ( HYAL1 – 2 ) in Serous Ovarian Carcinomas : Inverse Correlation between HYAL1 and Hyaluronan Content. 13. D. D. P. 19. et al.. 2009. M. K. 74. JIANG. v. S. J. 23. p. n. 628-631. J. WILEY. p. 14-32. v. K. Connect Tissue Res. D. 101. W. TOTA. Heparan Sulfate Proteoglycan Expression in Human LungCancer Cells. 1. MEISS. 1979. D. MOURÃO. 549-557. Hidrogen Peroxide as a Potential Mediator of the Transcriptional Regulation of Heparan Sulphate Biosynthesis in Keratinocytes. H. 17. p. Int. 4. LIANG. J. F.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 53 MESTER. BMC Cancer. v. v. NASHAN. v. J. MICHELACCI. M.. v. 475-492. n. J Pharm Pharmaceut Sci. et al. et al. et al.. 29. et al. 2. 3. v. p. E. Eur J Dermatol. v. n. et al. Damage in Skin Cells In vitro Anti-Inflammatory Effects of Hyaluronic Acid in Ethanol-Induced. 84. Chemical structure of hyaluronic acid. 1998.. et al. 1989. v. Therapeutic strategies for actinic keratoses a systematic review. 425437. v. NADER. 22. FGFs . Hyaluronan as an Immune Regulator in Human Diseases. NACKAERTS. v. ORNITZ.. 2013. 1. et al. v. n. 2011. p. G. p. Clin. Chondroitin sulfates and proteoglycans from normal and arthrosic human cartilage. Cancer. 7. p. p. p. 428. 34. MORI. 1987. 108-112. . M. MOSCATELLO. Invest. H. 1998. Proc Nat Acad Sci USA. 1075-7. v. F. MEYER. p. 3565-9. K. Heparin stimulates the synthesis and modifies the sulfatation pattern of heparan sulfate proteoglycan from endothelial cells. 2011. NEUMAN.

The skin : an indispensable barrier. v. P. E. HYATT. MYLES. 5. INAZARI.. 1985.. hyaluronan synthases and hyaluronidases indicate a role for hyaluronan in the progression of endometrial cancer. p. D. 2239–2244. 520-525. et al. n. The Journal of biological Chemistry. RÖCK. P. Osteoarthritis Cartilage. 823-829. DWEK. . L. ROUGHLEY. K. p. 2. 50.. Annu Rev Biochem. v. PAIVA. R. Glycobiology. et al. RADEMACHER. n.. M. .. et al. Gynecologic Oncology. Wound Repair and Regeneration. T. p. H. 1999. G. 287. p. v. R. v. E. TAYLOR. M. p. C. T. RODUST.. . 98. . 1063-1072. 20. 101. 221. 2006. E. E. 32. 2008.et al. J. DIETRICH. Te role of heparan sulphate in inflammation.. PORCIONATTO. JENSEN. M. 127-35. v. 8. International Journal of Biological Macromolecules. Osteoarthritis and Cartilage. Heparan sulfate and cell division. 785-838. 2012.. n. 2012. NADER. BRANDNER. 17. K.. PROKSCH. Link protein can retard the degradation of hyaluronan in proteoglycan aggregates. 118126. lasers med Sci. Co-solvent mediated thermal stabilization of chondroitinase ABC I form Proteus vulgaris. ROBAT. v.. C. 539-44. v. 487–492. et al.. K. 24. p. M. P. 633-43. FGF-10 and specific structural elements of dermatan sulfate size and sulfation promote maximal keratinocyte migration and cellular proliferation. Braz J Med Biol Res. PAREKH. RADEK. 2012. PARISH. 14. Estradiol Protects Dermal Hyaluronan / Versican Matrix during Photoaging by Release of Epidermal Growth Factor from. Experimental Dermatology. FECKER. v. H.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 54 PAGIN. 17. 2005. Nat Rev Immunol. p. PRIMAKOFF. R. A. 2009.. Experimental Dermatology. n. Cell. v. p. PECCHI. p. J. F. GALLO. 57. Activation of mitochondrial apoptosis pathways in cutaneous squamous cell carcinoma cells by diclofenac / hyaluronic acid is related to upregulation of Bad as well as downregulation of Mcl-1 and Bcl-w. A potential role of chondroitin sulfate on bone in osteoarthritis: inhibition of prostaglandin E₂ and matrix metalloproteinases synthesis in interleukin1β-stimulated osteoblasts. RODRIGUEZ.. p. L.. Biol. STOCKFLETH. v. 2006. 1988. v. p. 20056-20069. Laser and light-emitting diode effects on pre-osteoblast growth and differentiation. p. 2012. Expression patterns of hyaluronan . 2012. A role for the migrating sperm surface antigen PH-20 in guinea pig sperm binding to the egg zona pellucida. v. 6.. 193-202. P. M. R.

R. H. Ultraviolet C Irradiation Induces Different Expression of Cyclooxygenase 2 in NIH 3T3 Cells and A431 Cells: The Roles of COX-2 Are Different in Various Cell. 7. 2003. p. v. 4351-4366. TANZI. LAMANNA. L.. p. TAMMI. n. p. M. 12. S. I. R. N. R. 120. n. 2003. P. 2006. 1038-1044. 106-22. 9. PATEL. 1-34. Lasers in dermatology : Four decades of progress. J. L. n. MAIBACH. 565-580. IUBMB Life. 8.. p. SIMPSON..REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 55 SADOWSKI. Molecular Biology of the Cell. Migration ... 1988. 7. 26. v. Matrix Metalloproteinase 19 Regulates Insulin-like Growth Factor-mediated Proliferation . HOURELD. ABRAHAMSE. n. Whereas TGF-b Downregulates. 2011. Lumican . 2-4. SEKHEJANE. T. p. aggrecan and versican: formation of ternary complexes with defined hyaluronan oligosaccharides. C.. n. v. v. and Adhesion in Human Keratinocytes through Proteolysis of Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3. SCHONHERR. 7. J. the Hyaluronan Synthases Has2 and Has3 in Organotypic Keratinocyte Cultures: Correlations with Epidermal Proliferation and Di¡erentiation. n. E. The Journal of biological chemistry. 58. jul. Deconstructing the skin: cytoarchitectural determinants of epidermal morphogenesis. et al. EGF Upregulates. n.. Heparan sulfate proteoglycans. ALSTER. Clin Dermatol. p. SARRAZIN. GREEN. v.. Photomedicine and Laser Surgery.. p. R. Expression and purification of functionally active hyaluronanbinding domains from human cartilage link protein. 18 fev. Developmental Immunology. Localization of epidermal hyaluronic acid using the hyaluronate binding region of cartilage proteoglycan as a specific probe. W. The Society for Investigative Dermatology. M. HAUSSER. 89-101. p. Extracellular Matrix and Cytokines: A Functional Unit. p. 5435-48. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 412-4. et al. v. Irradiation at 636 nm Positively Affects Diabetic Wounded and Hypoxic Cells in Vitro. 3. 2000.. 606-610. J. et al. N. S. et al. Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. SEYFRIED. j Invest dermatol. 49. 1. Nat Rev Mol Cell Biol. v. n. 2005. 14. SEPPÄNEN-PASONEN. 29. E. v. T. 2012. p. H. a small Leucine-rich Proteoglycan substituted with Keratan Sulfate Chains is expressed and secreted by Human Melanoma Cells and not normal Melanocytes. C. H. T. 10. v. J Am Acad Dermatol. LUPTON. 90. v. p. R. 2008. et al. 521-530. STERN. International Journal of Molecular Sciences. 4569-4580. K. . 2011. ESKO. et al. 280. 13. 2003. November. TAI. S. v. N. D. M. 2012. v.. SIFAKI. D.

p. Cancer Res.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 56 TAYLOR. K. Clinical and Experiemental Dermatology. et al. 1174-1180. 595-610. Structural and sequence motifs in dermatan sulfate for promoting fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and FGF-7 activity. 37. n. et al. The interaction of glycosaminoglycans with heparin cofactor II. Experimental and Therapeutic Medicine. 7. Heparanase accelerates wound angiogenesis and wound healing in mouse and rat models. VLODAVSKY. 19. v... 163. et al. p. I. M. T. 1036-1040. v. 2012. VLODAVSKY. I. 2012. Reversion of tumor phenotype in surface transplants of skin SCC cells by scaffold-induced stroma modulation. p. expression and function in tumor progression and metastasis. et al. J. 280. v. 19. THELIN. Impaired skin wound healing in lumican-null mice. p. 2010. v. 2001. 28. carcinogenesis. R. The FASEB Journal. 15. 9. Heparanase expression and glycosaminoglycans profile in renal cell carcinoma. n. v. 504-510. J. v. 1999. I. FEBS. 1994. Heparin inhibits A431 cell growth independently of serum and ECF mitogcnic signalling. The Journal of biological chemistry. Cancer Microenvironment. et al. M. Heparanase Expression in Circulating Lymphocytes of Breast Cancer Patients Depends on the Presence of the Primary Tumor and / or Systemic Metastasis 1. Dermatan sulfate is involved in the tumorigenic properties of esophagus squamous cell carcinoma. International Journal of Urology. n. p. v. L. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. 3. R. 1991. L. 2005. 793-802. FRIEDMANN. 5300-6.. 714. 341-347. et al. A. THEODORO. TEIXEIRA. 2007. 2007. D. 8. Neoplasia. J. v. 281. Methylene blue photodynamic therapy in malignant melanoma decreases expression of proliferating cell nuclear antigen and heparanases. RUDISILL. p. 2012. R. 7. Y.. WAGNER. 1943-52. p. GALLO. p. v. M. YEH. v. p. WILLHAUCK. v. The Journal of Clinical Investigation. et al. et al. et al. 5. 5. 3. TOLLEFSEN. p. et al. 527-533. 3. VANNUCCHI. n. Nature Med. p. VLODAVSKY. Mammalian heparanase: gene cloning. E. Upregulation of TCTP expression in human skin squamous cell carcinoma increases tumor cell viability through anti-apoptotic action of the protein. p. p. Ann N Y Acad Sci. ZCHARIA. v. v. 2012. 108. 2005. S. p. 437-442. 2012. v. WU. Significance of Heparanase in Cancer and Inflammation. 6. 211-221. 141-144. 18 fev. British Journal of Dermatology. 115-132. . et al. 21-31. n. D. n.

92269237. X. . 2013. v. 288. n. Sequence Analysis and Domain Motifs in the Porcine Skin Decorin Glycosaminoglycan Chain. 13.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 57 ZHAO. Journal of Biological Chemistry. et al. p.