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Purificação de Carboidratos

Profa Dra Marisa A. Nogueira Diaz

Disciplina: Bioquímica de Carboidratos

Análise de Carboidratos
Polissacarídeos Oligossacarídeos

 Hidrólise ácida total, derivatização e Cromatografia gasosa

 Composição de monossacarídeos
 Metilação  Posição das ligações glicosídicas  Hidrólise enzimática com glicosidases específicas  Sequência de monossacarídeos  Posição das unidades monossacarídicas  RMN e espectrometria de massa

 Confirmação dos dados de metilação
 Posição e configuração das ligações glicosídicas

eletroforese) 3. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção. fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica. que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica. gel-filtração) 2. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação.Métodos de Isolamento de Biomoléculas Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. diálise. disponível comercialmente) .

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ? Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular géis são porosos. funcionando como peneiras ou filtros Cromatografia de troca iônica: separação de moléculas pela carga elétrica géis apresentam grupos carregados positiva ou negativamente Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem caráter hidrofóbico Cromatografia de afinidade: separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina .

Purificação de Carboidratos Oligo e polissacarídeos podem ser purificados por métodos cromatográficos como: Exclusão ou gel filtração Troca iônica HPLC Eletroforese Eletroforese capilar .

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banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. . A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão/solvente).Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico.

forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de solvente Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina. como o gráfico ao lado. com base em propriedades moleculares como: • massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade Coletor de frações Um cromatograma. Concentração Tempo ou volume .Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: Tempo zero Amostra com diferentes componentes Resina embebida em solvente Tempo 1 Tempo 2 Tempo n Mais solvente é colocado na coluna. é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

Amostra Tampão poroso Compostos separados .

pequenas colunas e HPLC.Cromatografia Centrínfuga (Chromatroton) Chromatotron É uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Com dimensiões ~ 30 cm. . Substitui as CCD preparativas.

A amostra a ser separada é aplicada como uma solução no centro do disco giratório umedecido com o solvente. .

.A eluição com solvente gera bandas circulares de separação dos componentes que são removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepção.

Cromatografia de exclusão ou gel filtração .

Compostos menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de solvente correspondente ao volume interno (Vi. conforme suas massas moleculares. Compostos maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco solvente. maior o volume necessário para sua saída. percorrendo os canais internos dos grãos. . Quanto maior o número de grãos que cada molécula entra durante o percurso através da coluna. também chamado de volume morto (Vo). volume total menos o volume do próprio gel).Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular amostra grande Moléculas com massas diferentes amostra pequena Solvente “empurra” moléculas através da resina Fluxo do solvente grão da resina poroso tubos grãos (beads) da resina com poros Na gel-filtração. correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos. os carboidratos que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de solvente para saírem da coluna.

Cromatografia de troca iônica .

como o carboxi-metil (CM)-celulose . em uma ampla faixa de pH. como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa). positiva ou negativa.Cromatografia de troca iônica A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica. DEAE Trocadora de ânions CM Trocadora de cátions Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva).

o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10. enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4.Cromatografia de troca iônica --- - - O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. . Assim. condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1) adsorção das amostras com carga contrária à resina. 2) eluição das amostras adsorvidas. e saída da coluna das amostras com a mesma carga. . Para a eluição. as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as amostras e a resina.

como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions. ou sem carga. . não interagem com a resina.No exemplo. sendo as primeiras a sair da coluna. como o DEAE-celulose): Adsorção + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Moléculas com a mesma carga.

+ + + + + + Eluição + + + Na+Cl.Na+Cl. .+ Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

20 M _ = _ = Não retidas + + + Não retidas Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions) . 15 M CM (-) (-) (-) + + + DEAE (+) (+) (+) _ = 0. 10 M 0. 10 M ++ (-) 0. 20 M = 0.Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Eluição NaCl + Eluição NaCl _ (+) 0. 15 M 0.

HPLC .

Característica diferencial da cromatografia convencional: • partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) • aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos de resina em um mesmo volume da coluna • fase móvel . fluorescência. Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa Coletor de frações bombas Injetor de amostra Coluna e forno . hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna Desenho básico de um HPLC Detector Controle e análise dos dados Duas bombas gradiente permitem eluição em Detector: índice de refração. absorbância UV ou Vis.HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna. etc.

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Automático Manual .

metanol.Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C Absorbância a 214 nm Moléculas não retidas Moléculas retidas 100 Tempo ou volume de retenção Cromatograma de uma coluna de fase reversa. com eluição por um gradiente de acetonitrila Fase estacionária Função C18 C8 tC2 Aminopropyl Cyanopropyl Diol CN Fenil –Si (CH3)2 C18 H37 –Si (CH3)2 C8 H17 –Si C2 H5 –Si (CH2)3 NH2 –Si (CH3)2 (CH2)3CN –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH NH2 C4 C8 C18 Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas) Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água .acetonitrila. propanol Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia % de acetonitrila .

Fases Estacionárias .

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Colunas .

6 X 250 mm Partículas de 5 10 20µ Tamanho de poro 50 a 10^6 Fases: C5 C18 C8 CN SILICA PHENYL NH2 SCX Para processos analíticos Preparativas Diâmetros 15 21.Tipos de Colunas Analíticas e semi-preparativas Diâmetros 4.2 30 50 mm Tamanho de 50 à 600 mm Partículas de 10 e 15 µm Várias fases disponíveis Para processos de Purificação .

Bombas Quando se usa um só eluente Isocrática Quando se usa mais de um eluente Gradiente .

Detectores UV/VIS Fluorescência Índice de Refração Eletroquímico Condutividade .

Cromatografia Líquida/Espectrômetro de Massas LC/MS .

Cromatografia Líquida/Espectrômetro de Ressonância LC/RMN .

Chromatographic separation of oligosaccharides .

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(C) sample B spiked with tetraose (3 mg/L) and (D) sample B spiked with pentaose (3 mg/L).HPLC RI chromatograms: (A) standard 100 mg/L. . (B) sample B.

Eletroforese Capilar .

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Envolve a aplicação de alta voltagem. tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de diâmetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. .

devido ao sinal de sua carga. Este fluxo pode reduzir significativamente o tempo de análise ou forçar um íon a reverter a sua tendência de migração em direção a um eletrodo. denominado fluxo eletroosmótico (FEO). . um fenômeno eletroforético que gera o fluxo da solução dentro do capilar. que faz com que os solutos se movimentem em direção ao detector.As separações em EC são baseadas na presença de um fluxo eletricamente induzido. pelo qual está sendo atraído.

+ H+) quando em contato com soluções tampão com pH altos. Esta dissociação produz uma superfície carregada negativamente. . Uma camada de contraíon (cátions) é então formada próxima à parede do capilar a fim de manter a eletroneutralidade. Isto forma a dupla camada e cria uma diferença de potencial muito próxima à parede e este fenômeno é conhecido como potencial zeta.Fluxo Eletroosmótico A parede do capilar de sílica contém grupos silanóis (SiOH) os quais se ionizam (SiO.

Gera o movimento das espécies apesar da carga para a mesma direção Figura .Este movimento de íons resulta no movimento das espécies em direção ao detector e pode ser considerado como um fluxo eletricamente dirigido.Migração dos íons metálicos em direção ao cátodo .

A dependência do fluxo eletroosmótico em função do pH .Abaixo de pH 4. a ionização dos grupos silanóis é pequena e o FEO não é significante. enquanto que acima de pH 9 os silanóis ficam completamente ionizados e portanto o FEO é alto.

são atráidos pelo cátodo Saem mais lento. são atráidos pelo ânodo Exemplo de um eletroferograma .Saem mais rápido.

CLAE EC Figura .Perfil do fluxo eletroosmótico. comparado com o do fluxo pressurisado .

a amostra não é injetada e sim introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector. . diferentemente das técnicas cromatográficas (Cromatografia GasosaCG e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE).EC.

Esquemas para a introdução de amostras

ao passo que solutos carregados irão migrar para dentro do capilar.Injeção eletrocinética Inserção do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicação de uma voltagem. por causa do FEO e também da migração eletroforética. sendo que solutos neutros são arrastados pelo FEO. .

submetido ao vácuo ou erguido (efeito sifão) provocando a entrada de um certo volume de amostra no capilar . onde o capilar é mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual é em seguida pressurizado.Volumes típicos de injeção são de 10 a 100 nL. O modo de injeção mais empregado em EC é o denominado hidrodinâmico.

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A separação em ECSL Baseia-se nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão.Eletroforese Capilar em Solução Livre (ECSL) A separação de íons é a forma mais simples de EC e é denominada eletroforese capilar em solução livre. contido dentro do capilar. .

Eletrocromatografia Capilar Micelar (ECCM) A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resolução de compostos neutros. As micelas de SDS têm carga negativa e migram contra o FEO. A separação é baseada na partição das moléculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionária) e o tampão aquoso. Dodecil-sulfato de sódio . os quais não podem ser separados usando simplesmente a ECSL.

ou seja. pode ser aplicado na detecção de várias classes de substâncias .Detectores O detector mais frequentemente utilizado em EC é o espectrofotométrico de absorção no UV/Vis devido à sua natureza quase universal.

Complexação das hidroxilas vicinais ou das hidroxilas alternadas com grupos boratos. Derivatisação com ionizáveis. reagentes que possui grupos .Capillary electrophoresis has emerged as a highly promising technique for the analysis of mono.and oligosaccharides Para carboidratos neutros é necessário fazer a ionização dos grupos hidroxilas.

glucose and fructose with a concentration of 5.Electropherograms of a standard solution containing sucrose. under the optimal CZE-AD conditions: (a) sucrose. (c) fructose.0 × 10−5 mol L−1. . (b) glucose.

Electropherograms of the honey (sample 1) being diluting 10. (c) fructose.000 times under the optimal CZE-AD conditions: (a) sucrose. . (b) glucose.

6. arabinose. injection pressure 0. galactose. mannose. 2. detection at 270 nm with direct mode.6). xylose. 5.Peak identification: 1. separation temperature 20 °C. 3. Separation conditions: +17 kV. rhamnose. glucose. 4. capillary 50/60 cm (Ldet/Ltot). The peak of methanol indicates the electroosmotic flow (EOF). . Electrolyte solution: 130 mM NaOH–36 mM Na2HPO4·2H2O (pH 12.5 psi for 6 s.