Western blotting

• Identifica gli antigeni verso cui reagisce un siero • L’ identificazione avviene in base al peso molecolare della proteina • E’ un test molto sensibile e specifico • E’ un test costoso e poco pratico da applicare routinariamente

Principio del test
• L’ antigene (spesso una miscela di antigeni) viene sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide • Il gel viene fissato e le diverse frazioni vengono trasferite su matrice solida (membrana di nitrocellulosa) • Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per ogni striscia) • Gli anticorpi specifici vengono visualizzati mediante anti-IgG di specie marcate e substrato colorimetrico

1 fase: separazione elettroforetica
L’ antigene viene denaturato in presenza di SDS ed agenti riducenti. Le proteine migrano verso il polo + e si separano in base al peso molecolare

Polo Stacking resolving

Polo +

1 fase: separazione elettroforetica Polo -

Marker di peso molecolare

Polo +

1 fase: separazione elettroforetica Polo -

Fronte di corsa

Polo +

1 fase: separazione elettroforetica
NB: Le proteine del campione non sono visibili in questa fase

Polo -

Fronte di corsa

Polo +

2 fase: trasferimento su membrana
gel membrana Tempone tris,glicina metanolo

Polo -

Polo +

Carta assorbente

3 fase: preparazione delle strisce di nitrocellulosa
Si identifica la parte superiore della membrana con un linea colorata

La membrana viene bloccata per saturare i siti attivi

3 fase: preparazione delle strisce di nitrocellulosa

1

2

3

4

5

6

7

8

La membrana viene tagliata in strisce verticali Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine separate mediante elettroforesi

4 fase: immunostaining
a) Gli anticorpi presenti nel siero si legano ai rispettivi antigeni
segue lavaggio

b) Anti-IgG di specie marcati con enzima si legano agli anticorpi

c) L’ aggiunta di un substrato insolubile provoca la colorazione delle bande proteiche rilevate dagli anticorpi

Y Y Y Y Y

Y Y Y Y Y

Y Y Y Y Y

segue lavaggio

Interpretazione dei risultati

1

2

3

4

5

6

7

8

Variante a pozzetto unico
L’ antigene viene denaturato in presenza di SDS ed agenti riducenti. Le proteine migrano verso il polo + e si separano in base al peso molecolare

Polo Stacking resolving

Polo +

separazione elettroforetica
NB: Le proteine del campione non sono visibili in questa fase

Polo -

Fronte di corsa

Polo +

preparazione delle strisce di nitrocellulosa

Si identifica la parte superiore della membrana con un linea colorata

La membrana viene bloccata per saturare i siti attivi

preparazione delle strisce di nitrocellulosa

La membrana viene tagliata in strisce verticali Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine separate mediante elettroforesi

Test rapido per la ricerca della PrPsc

Digestione con Proteinasi K

La PrPc viene degradata mentre la PrPsc viene solo parzialmente catabolizzata

campione

separazione elettroforetica
NB: Le proteine del campione non sono visibili in questa fase M + + - Polo - -

Fronte di corsa

Polo +

Dopo trasferimento elettroforetico la membrana viene bloccata ed incubata con un Ac monoclonale marcato specifico per la PrP (sc o c)

Dopo sviluppo si identifica la PrP proteasi resistente sotto forma di tre bande (glicoforme) di peso molecolare caratteristico
+ + -