Curs 5

Compui organici neazotai: glucidele i lipide

Dozarea enzimatic a glucozei Determinarea lipidelor totale, a colesterolului liber i esterificat, a trigliceridelor Corpi cetonici
1

1. Carbohidrai
Definiie, clasificare, analiz Glucoza Hemoglobina glicat Corpi cetonici

Carbohidrai
- polihidroxialdehide sau cetone sau substane ce produc astfel de compui prin hidroliz - surs important de energie pentru organism i modalitate de stocare a energiei; Clasificare: Monozaharide zaharuri simple C4-C8, care conin o funcie aldehidic sau cetonic, sau sunt derivai ai acestor molecule.
Ex. Glucoza: 4 atomi C asimetrici, structurile liniare D i L se refer la poziia gruprii OH care poate fi situat la dreapta (izomer D) sau la stnga (izomer L) fa de C-5. Structura ciclic introduce un carbon asimetric suplimentar la C-1, cu izomerii i pentru gruparea OH la dreapta i respectiv la stnga. Monozaharidele au proprieti reductoare conferite de gruparea aldehidic sau cetonic.

Oligozaharide zaharuri care n urma hidrolizei furnizeaz 2 6 molecule de zaharid.

maltoza (2 molecule de glucoz) lactoza (glucoz + galactoz) sucroza (glucoz + fructoz)

Polizaharide Cei mai muli carbohidrai din natur sunt polizaharide. n urma hidrolizei furnizeaz un numr mare de monozaharide (Ex. glicogen, amidon).

Structuri ale glucozei

Glucoza
Cea mai investigat dintre glucidele serice Valoare de referin: 70 110 mg/100 ml Proba analizat: ser, plasm
Enzimele glicolitice din celulele sngelui pot determina scderea nivelului de glucoz (cu 7 %/h) Procedee de ncetinire a glicolizei:
Adaos de inhibitori (NaF) Rcirea probei Separarea serului de fraciunea celular imediat dup recoltarea probei

Metode de analiz a glucozei

Metoda nespecific bazat pe proprietile reductoare ale glucozei (reacie de culoare). Eroarea metodei: 5 - 15 mg/dl. Metode enzimatice specifice pentru glucoz
Glucozoxidaza Hexokinaza Glucozdehidrogenaza

Dozarea glucozei prin metoda colorimetrica cu o-toluidin

Principiu: Conjugarea aldo- i cetohexozele cu amine aromatice conduce la compui colorai, fotometrabili. Pentru dozarea glucozei, amina cea mai potrivit este o-toluidina care formeaz cu aldohexozele un compus intens colorat n verde, conform reaciei: xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx x
7

Determinarea Glucozei Metoda GOD-POD

Principiu:
Glucoza este oxidat n prezena glucozoxidazei (GOD) la acid gluconic cu formare de H2O2. n reacia cromogen auxiliar cu fenol i 4-amino-antipirina, n prezen de peroxidaz, se formeaz chinonimina, un compus rou, fotometrabil.

Glucoza + O 2 + H 2 O GOD acid gluconic + H 2 O 2

2H 2 O 2 + Fenol + 4 - Aminoantipirin POD Chinona rosie + H 2 O

Fotometrare: A 505 nm ; 37o C

Determinarea Glucozei Metoda cu Hexokinaza

Principiu:
Glucoza n prezen de ATP i hexokinaz este fosforilat la glucozo-6-fosfat. n reacia cromogen auxiliar glucozo-6-fosfatul n prezen de NADP+ i sub aciunea enzimatic a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei (G-6-PDH) se transform n 6-fosfogluconat (6PG) Cantitatea de NADPH rezultat este echivalent cu cantitatea de glucoz intrat n reacie Absorbaa se msoar la 340 nm.

Glucoza + ATP Hexokinaza G 6 P + ADP

6 PDH G 6 P + NADP + G 6 PG + NADPH + H +

Nicotinamid adenin dinucleotid fosfat NADP+

A b s o r b a n t a X 10-3

NADP+ NADPH

Lungime de und, nm

10

ATP

Adenozin-5'-trifosfat (ATP) este o nucleotid multifuncional, important n transferul de energie intracelular. Transport energia chimic necesar metabolismului n cadrul celulelor Este generat ca surs de energie n timpul proceselor de fotosintez i respiraie celular Este consumat de ctre multe enzime i o multitudine de procese celulare. 11

ADP
Adenozin fosfat (ADP) (esterul acidului pirofosforic cu nucleozida adenozinei - alctuit din gruparea pirofosfat, pentoza riboz i adenin - ADP este produsul de defosforilare al ATP sub aciunea ATPazei - ADP este transformat napoi la ATP sub aciunea ATPsintetazei.

12

Determinarea glucozei pe filme multistrat

Prob 10 m
Strat de difuzie i reflexie

Film multistrat

100m

Strat cu reactivi GOD POD Tampon pH=5 Indicator redox Gelatin

Filtru

Suport transparent

Surs

Detector

Seciune transversal prin filmul multistrat pentru determinarea glucozei

Schema unui fotometru de reflectan

Stratul de dispersie (acetat de celuloz +TiO2 ca reflectant) are trei roluri:

reflect radiaia de la sursa luminoas din spatele reactivului i a suportului spre detectorul unui fotometru; foreaz proba s difuzeze ntr-un strat uniform; reine celule, cristale i particule precum molecule mari, cum sunt proteinele.

Proba (10 l) este aplicat pe film, incubat la 37.000.05o C timp de 7 min. Reflectana este msurat la 495 nm. 13

Hemoglobina glicat (GHb)

Glicoproteine - proteine care au ataate covalent oligozaharide, formnd glicoproteine Cea mai important - GHb
Grupare aminic N terminal Baz Schiff Cetonamin

NH2 H-C=O + A H-C-OH HbA + Glucoz

H-C=N-A H-C-OH
RAPID

H2C-NH-A C=O
LENT

pre Hb A1c

Hb A1c

Formarea sa este practic ireversibil Conc.n snge depinde de tvia al hematiilor (~ 120 zile) i de conc. de glucoz Vformare a GHb este d.p. cu nivelul glucozei din snge conc. GHb reprezint o valoare integrat a glucozei pe o perioad anterioar de 6-8 sptmni. Valori de referinta - 4.8-6% (din hemoglobina total)
14

Avantajele pe care le prezint determinarea HbA1c fa de glicemie: Nu sunt necesare condiiile a jeun; Stabilitate preanalitic mai mare; Variaie biologic intraindividual n comparaie cu glicemia; Variaii n condiii de stres i afeciuni intercurente Dezavantaje ale HbA1c: Cost mai ridicat; Lipsa de disponibilitate a testului n unele tari/regiuni; Lipsa de corelaie a HbA1c cu glicemia medie la unele persoane; HbA1c nu este relevant la pacienii cu unele boli de snge

15

2. Lipide
Definiie Clasificare Analiza lipidelor

16

LIPIDE
Lipide
de constituie de depozit circulante

Compui cu structur eterogen, cu unele caracteristici comune

greu solubile n ap

solubile n solveni nepolari rspndii n lumea vie, principala form de depozitare a resurselor de natur energetic

Principalele lipide circulante :

Trigliceride Colesterol Fosfolipide (intr n alctuirea membranei celulare)
17

Lipidele circul n organism sub form de:

LIPOPROTEINE
particule sferice

miez hidrofob ce conine trigliceride (T) i colesterol liber (C) sau esterificat (CE) nveli format din molecule amfotere, situate cu captul hidrofob ctre interiorul lipoproteinei i cu cel hidrofil ctre exterior, n contact cu mediul apos (plasma); conine fosfolipide (PL) i unele proteine numite apolipoproteine (P).
18

Clasificarea lipoproteinelor
n funcie de densitate: chilomicroni transport trigliceride lipoproteine cu densitate foarte joas (very low density lipoproteins VLDL) - transport trigliceride nou sintetizate lipoproteine cu densitate joas (low density lipoproteins LDL) transport colesterol ru lipoproteine cu densitate nalt (high density lipoproteins HDL) transport colesterol bun Fraciunile se pot separa cromatografic.

19

Lipoproteine predictori ai afeciunilor coronariene

Investigarea metabolismului lipidelor se bazeaz pe realizarea tabloului lipidic n snge. Concentraiile de colesterol n HDL, LDL i VLDL sunt predictori importani pentru afeciuni coronariene. HDL funcional (colesterolul bun) ofer protecie prin ndeprtarea colesterolului din celule i ateroame. Concentraii mai mari de LDL i mai mici de HDL funcional sunt strns corelate cu boli cardiovasculare i risc de ateroscleroz. Lipide analizate pentru tabloul lipidic i valorile optime (mg/dL)

Colesterol total LDL colesterol HDL colesterol Trigliceride

Valori optime <200 <100 ~60 <150

Valori de risc >240 160-189 <40

20

Clasificarea lipidelor
D.p.d.v. chimic: lipidele conin legturi C-H nepolare produii de hidroliz: acizi grai i alcooli compleci Unele lipide conin grupri polare ( OH, NH2, SH, fosforil, sialic), ceea ce le confer afinitate att pentru ap ct i fa de solveni organici. Clasificare dup structura chimic (ase categorii):

Colesterol Acizi grai Trigliceride Sfingolipide Prostaglandine Terpene

21

Colesterol C27H46O
(3 OH colestan)
Denumirea provine din grecescul chole (bil) i stereos (solid) plus sufixul ol, fiind identificat n calculii colesterolici n anul 1784 substan alb, caracter hidrofob pronunat steroid, compus specific animalelor superioare se afl n toate esuturile, n cantiti mari n bil n organism se afl att liber ct i esterificat cu acizii grai ca LDL i HDL

22

Acizi grai
Formula general RCOOH; R - rest alchilic. (acizi grai saturai, acizi grai mono- sau polinesaturai) Acizii grai circulani sunt n form liber sau esterificai la trigliceride, fosfolipide, colesterolesteri. prin ruperea acizilor grai liberi rezult corpii cetonici (acetilacetatul, -OHbutiratul i acetona). Analiza corpilor cetonici se face n legtur cu boala diabetic Principalii acizi grai prezeni n esutul uman
Denumire comun Lauric Miristic Palmitic Palmitoleic Stearic Oleic Linoleic (esenial) Linolenic (esenial) Arahidic Arahidonic Denumrea sistematic Dodecanoic Tetradecanoic Hexadecanoic 9-Hexadecenoic Octadecanoic 9-Octadecanoic 9,12-Octadecanoic 9,12,15-Octadecanoic Eicosanoic 5,8,11,14-Eicosatetraenoic

23

Trigliceride (grsimi neutre)

-esteri ai glicerolului cu 3 acizi grai (oleic, palmitic, linoleic, stearic, etc.) -simple (cu un singur acid) sau mixte (cu mai muli acizi) -rol n stocarea energiei i n eliberarea acizilor grai pentru procesele de oxidare din esuturi

Fosfolipide
conin n structur acid fosforic alturi de acizi grai i un alcool, tipic
glicerol. Partea hidrofil i cea hidrofob confer fosfolipidelor posibilitatea de transport.

24

Analiza lipidelor

Lipide totale
- se extrag n CH3OH+CHCl3; se evapor solventul i se cntrete reziduul

Colesterol total
Etape: hidroliza esterului i transformarea n colesterol liber i acid gras

Colesterol ester CHE Colesterol + acid gras

oxidarea colesterolului

Colesterol + O2 CHO Colesten + H 2O 2

Reacia cromogen auxiliar

2H 2O 2 + Fenol + 4Aminonoantipirin POD Chinona rosie + H 2O

25

Determinarea colesterolului HDL

Principiu: Lipoproteinele din plasm, cu excepia HDL, sunt separate sau mascate Separarea celorlalte lipoproteine: la punctul izoelectric cu polianioni, de ex. heparin, acid fosfowolframic, reacie catalizat de prezena cationilor divaleni; centrifugare; HDL rmne n supernatant, unde se determin. Determinarea direct a HDL (n faz omogen): mascarea colesterolului din celelalte lipoproteine

Determinarea colesterolului LDL

Metode indirecte Ecuaia Friedewald Colesterol LDL = [colesterol total]-[colesterol HDL]-[trigliceride]/5 (mg/dL).

LDL sunt precipitate cu heparin la punctul izolectric al acestora (pH 5.12). Dup centrifugare, HDL i VLDL rmn n supernatant i pot fi determinate prin metode enzimatice. Colesterolul LDL se estimeaz prin diferen: LDL colesterol = Colesterol total Colesterol n supernatant Metode directe

Precipitarea LDL urmat de determinarea colesterolui. Ca i n cazul HDL, a ctigat teren metoda direct cu reactivi omogeni, n care msurarea colesterolului LDL se face dup mascarea colesterolului existent n celelalte lipoproteine ori prin solubilizarea selectiv a LDL dup pecipitare. 26

 Trigliceride
Etape:
hidroliza i transformarea n glicerol i acizi grai

Trigliceride Lipaza Glicerol + acizi grasi

transformarea n glicerol fosfat

naza Glicerol + ATP Glicerolki Glicerol 3 fosfat + ADP

Oxidarea la dihidroxiacetona
sfatoxidaza Glicerol 3 fosfat + O2 Glicerolfo Dihidroxiacetona + H 2O2 fosfat

Reactia cromogena cu fenol si 4-aminoantipirin

27

3. Corpi cetonici
Se formeaz n ficat prin oxidarea acizilor grai liberi din depozitele adipoase Acid acetil acetic Acid OH butiric Acetona Creterea concentraiei de corpi cetonici: Cetonemie (n snge) Cetourie (n urin)

28

Determinarea corpilor cetonici

Nu exist reactiv care s dea reacie pozitiv cu toi cei 3 corpi cetonici R. cu nitroprusiat de sodiu Na2[Fe(CN)5NO] de 10 ori mai sensibil pentru acidul acetil acetic (n m. amoniacal, coloraie violet)

29

Prezentai o metod de determinare enzimatic a glucozei din snge. Ce este hemoglobina glicat? Ce avantaj prezint determinarea sa fa de cea a glucozei din snge? Indicai o variant pentru ncetinirea procesului de glicoliz n sngele colectat pentru determinarea glicemiei. Ce sunt lipoproteinele? Explicai acronimele HDL, LDL i semnificaia lor ca predictori ai afeciunilor coronariene. Ce forme ale colesterolului sunt determinate ca i colesterol total n snge? Ce sunt trigliceridele? Ce sunt corpii cetonici i din ce provin n snge?
30