Problemas de Enzimologa

Hoja 1
1."
Vol = 0,1 ml
Pm (NR) = 500.000 Da
Vmax = 20 mol/5ml
[E] = 0,5 mg/ml (de ella sola al estar en homogeneidad)
Vfinal de reaccin = 1 ml
a)
Para definir la actividad de la reaccin, en este caso para una enzima purificada a homogeneidad, se
parte siempre de un dato de velocidad, Vmax. Este parmetro es la condicin en la que normalmente se
define la cantidad de enzima que hay en una preparacin, midiendo la velocidad en condiciones de
saturacin por sustrato. Por esto se sobrentiende que el dato que nos da el problema de velocidad es el
de Vmax.
Por lo tanto, para definir la actividad (Act) en U/ml, partimos de la equivalencia de los apuntes:
Lo que nos piden con la actividad es la cantidad de enzima que hay en la preparacin de NR. Lo que
nosotros hacemos es ensayar en un volumen total de reaccin de 1 ml un volumen de enzima de 0,1 ml,
con lo que 1/10 del volumen ser enzima. Lo que nos piden es la cantidad de enzima en 1ml, que es la
misma que hay en los 0,1 de preparacin de enzima homognea.
Para calcular el dato comenzamos con la Vmax expresada en min"1:
Esta velocidad, es la que presentan 0,1 ml de la muestra de enzima. Como nos piden las Unidades por
mililitro de la reaccin, no hay ms que realizar una regla de tres:
b)
En este caso nos piden la actividad especfica (Ae), que se trata de la actividad referida a la cantidad total
de protena. La forma habitual de expresar la Ae es en U/mg de protena. Como ya sabemos la actividad,
y nos dan la concentracin de protena. En este caso, al encontrarse la enzima purificada a
homogeneidad, los mg de protena que nos dan estn referidos nicamente a la NR. Ya que la Ae nos
define un valor de concentracin de enzima, y toda la protena es ella misma, el dato de Ae que nos da,
es el mximo alcanzable.
El valor mximo que obtenemos es:
c)
Los Katales son una medida de actividad, definida por los moles transformados por segundo. Po lo tanto,
no se trata ms que de transformar las unidades:
d)
En este apartado se nos pide la actividad molecular de la enzima, o lo que es lo mismo, Kcat. Como ya
vimos en teora, la constante cataltica sale de la expresin de Vmax, siendo la constante de
proporcionalidad que multiplica a [E]T para darnos Vmax. Ya que tenemos el dato de Ae mxima,
podemos calcular directamente Kcat, sin ms que multiplicar por el peso molecular.
Esto se debe al hecho de estar purificada a homogeneidad, de modo, que la Ae que hemos hallado es
velocidad de transformacin por mg de protena, y como toda la protena es enzima queda en moles al
multiplicarlo por el peso molecular. Hay que tener en cuenta que este dato solo es aplicable en el caso de
tener un dato de Ae de la enzima pura. Esto se demuestra fcilmente, mediante las unidades.
Esto puede ser til en muchas ocasiones, pero siempre hay que tener en cuenta que necesitamos un
dato de Vmax obtenido de la enzima purificada. Una vez sabido esto, calculamos Kcat.
e)
Si nos confirman que la enzima presenta dos centros activos, sabramos que la Kcat hallada es Kcat
molecular, al haber utilizado en la expresin del apartado anterior el peso del oligmero. De modo que,
como vimos en teora, lo nico que hay que hacer para calcular Kcat C.A. es dividir por el n de C.A.. En
este caso Kcat C.A.= 666,6 s"1/2 = 333,3 s"1.
f)
El tiempo del ciclo cataltico (tcc) no es ms que la inversa de Kcat. Ya que tenemos una Kcat C.A. es
preferible utilizar este valor, al garantizarnos un tiempo de catlisis por C.A. tcc = 1/333,3 s"1 = 310"3 s =
3 milisegundos.
En esta segunda parte del ejercicio se nos dan unos datos de purificacin, a travs de los cuales
debemos hallar el grado de purificacin alcanzado. En esta tabla se nos dan los valores de Volumen,
Actividad y Cantidad de protena, suficientes para calcular el resto de la siguiente forma:
Actividad Total: Se define como las Unidades totales del extracto crudo. Para calcularla se multiplica
la actividad por el volumen (U/ml ml totales = unidades totales). Ejemplo: 1,72 U/ml 14,080 ml = 24,217
U totales
Actividad especfica: Actividad del extracto crudo. Como ya hemos mencionado muchas veces, no
implica ms que dividir la actividad entre la cantidad de protena (U/ml mg/ml = U/mg). Ejemplo: 1,72
U/ml 31,4 mg/ml = 0,0547 U/mg
Rendimiento: Se trata de comparar el paso con el extracto crudo. El parmetro a comparar es la
actividad total, de modo que efectuamos un clculo de tanto por ciento haciendo que la actividad total del
extracto crudo sea el 100%. Ejemplo:
Grado de purificacin: a diferencia del anterior, esta comparacin se realiza con la actividad especfica
y no se da en tanto por ciento, sino en veces, resultado de dividir Aedel paso entre Aecrudo. Ejemplo: Ae
(paso )/Ae (crudo) = 0,3615 Umg"1/0,0547 Umg"1= 6,6 veces
El resultado de calcular esto para todos los pasos se presenta en la siguiente tabla.
N
Cromatografa
DEAE celulosa
Paso de purificacin
V V
Filtracin en gel
de agarosa
Cromatografa
DEAE c
N Extracto crudo
(NH4)2SO4
(30"45 %)
Calentamiento a 62
C
1 Volumen (ml) 14080 1600 163 188 94
2 Actividad (U/ml) 1,72 11,10 52,58 29,60 41,37
3 Protena (mg/ml) 31,40 30,70 7,31 1,43 1,58
4 Actividad total 12 24217 17760 8570 5564
5 Rendimiento (%)
UT V
UTcrudo
100 73,3 35,3 22,9
6
Actividad e!ec"ica
(U/mg)
2# 0,0547 0,3615 7,19 20,7
7
$rado de !uri"icaci%n
(vece)
Ae V
Aecrudo
" 6,6 131,5 378 478
[penicilina]
Velocidad [S]/V
0,1 0,11 0,91
0,3 0,25 1,2
0,5 0,34 1,47
1 0,45 2,22
3 0,58 5,17
5 0,61 8,19
Evidentemente, a simple vista parece asemejarse bastante a una hiprbola cuadrangular, con una Vmax
que debe rondar 0,6 nmol min"1. Para asegurarse, lo que se hace es representrar la linearizacin de los
datos, y si estos se ajustan a una recta, es que efectivamente estamos ante una cintica M&M.
Los datos a representar se encuentran en la tabla anterior, ya que utilizaremos la linearizacin H"W.
El Excel no nos representa el corte en el eje X, pero nos da la ecuacin de la recta, con la que podemos
calcular todos los parmetros:
Km: Cuando [S]/Vel = 0.
. Km = 0,5 nM; Km = 0,5 10"9 M . Si nos fijamos, este dato encaja con lo que se obtendra en la grfica
anterior.
Vmax: Dato que se puede averiguar por el corte en el eje Y, adems de por la pendiente. Lo haremos
por los dos mtodos.
Pendiente: Ya nos la dan en la ecuacin de la recta: tg = 1,4858. Su inversa ser Vmax. Vmax = 0,673
nmol min"1.
&rdenada en el origen: Se trata del valor de y cuando x = 0.
Con estos dos datos, hacemos la media para obtener que Vmax = 0,6735 10"9 mol min"1.
Kcat: Definimos esta constante como la constante de proporcional para [E]T de la ecuacin de la
veloc idad mxima. Por esto, podemos definirla como
. Podemos definir Kcat porque tenemos nuestra protena purificada y podemos hallar la concentracin
total, de otra forma sera imposible. Pero, ya definimos otra forma de calcular Kcat, a travs de la
actividad especfica. El clculo de Ae lo efectuamos dividiendo el valor de Vmax (mol min"1) por los mg
de protena. Esta actividad ya es la actividad de la enzima pura, por haberla hallado con el dato de Vmax
del extracto puro.
3."
Respuesta Explicacin
a) Verdadero
Porque aunque la expresin de Km incluye las concentraciones (como Ks aparente),
se trata de una razn, con lo que si aumenta [E] libre, disminuye [ES] y viceversa,
manteniendo a Km constante.. Km slo depende de las constantes cinticas de los pasos de
unin, disociacin y transformacin de sustrato, que sern funcin de la energa libre que se
libere. Vmax si depende de la cantidad de enzima.
b) Falso
Esto se comprueba matemticamente llegando a la misma expresin de dos formas
diferentes. Decamos que la constante de especificidad es la razn ente Km y Kcat, y que se
trata la constante de la unin entre la enzima y el sustrato. Ahora, tratamos de llegar a la
misma expresin partiendo de la ecuacin de Km y de la velocidad genrica (independiente
de [E]). Sustituyendo [ES] en la ecuacin de velocidad obtenemos la misma ecuacin, ahora
con la certeza de su independencia de [E].
c) Verdadero
Hablamos de condiciones saturantes, con lo que implica, pero lo demostramos calculando al
porcentaje de Vmax que llegamos con una [S] de 100 Km.
Si V/Vmax = 0,99 esta relacin es igual a Kcat[ES]/Kcat [E]T (recordemos las ecuaciones).
Esto nos dice que [ES]/[E]T = 0,99, con lo que la enzima libre tiende a 0.
d) Falso
Ya que definimos Kcat como la relacin de las constantes implicadas en transformacin. En
el caso de una reaccin monosustrato Kcat sera '2 , sin incluir '1 y '"1, que formaran parte
de Km y Ks.
Prcticas de Metodologa Y Bioqumica estructural
(romatogra"a de cam)io ionico
Se basa en el proceso de intercambio de iones, en disolucin, de la misma naturaleza, sobre una matriz o
resina cargada con iones de signo contrario. El intercambio puede ser entre aniones o entre cationes,
dando nombre a las resinas que promueven uno y otro proceso. Las fuerzas que actan son de tipo
electrosttico y, por tanto, la preferencia de la resina por el contrain (aquel in de la misma naturaleza,
signo, que el inicial que rodeaba las cargas de la matriz), ser la base para la separacin diferencial.
Los dos tipos de resinas pueden ser dbiles o fuertes dependiendo del equilibrio de disociacin de los
grupos unidos covalentemente a las mismas, como se muestra en la tabla.
FUERTES DBLES
(AT*+,*(&- SO3* H+ COO* H+
A,*+,*(&- +NH3*(CH3) X* NH3 X*
ones a intercambiar. Fijado covalentemente
La gran utilidad de esta tcnica es el poder separar compuestos cargados selectivamente, dependiendo
de la naturaleza de los mismos en distintas condiciones (pH, fuerza ionica, tamao, posicin de los
grupos cargados, temperatura).
La cromatografa de intercambio ionico se realiza en dos partes:
Retencin estable de los componentes a separar por parte de la resina. Hay que aadir la muestra a
la columna, de modo que la muestra presente ms o menos las mismas probabilidades de quedar
retenida en la columna.
Cambio selectivo de las condiciones del medio. Con lo que eluirn los componentes de forma
diferencial.
1.1.Separacin de la muestra
Una de las mayores utilizaciones que se le dan e este tipo de cromatografa es la separacin de
aminocidos. Esta separacin se basa en las propiedades de stas molculas, sobre todo en que son
anfipticos, lo que implica que presentan diferente carga a valores de pH diferentes.
Los tres tipos de aminocidos son los reflejados arriba, de los cuales exponemos sus equilibrios de
disociacin, haciendo hincapi en la carga que flanquea a cada uno de ellos. En este tipo de
cromatografa utilizaremos el equilibrio entre la forma cargada +1 y la neutra o ./itterion 0, de modo que
en el paso que definimos antes como 1 todos estaran cargados positivamente, y por lo tanto a un pH
inferior al menor de los puntos isoelctricos (p) de los aminocidos de la muestra. Recordemos que el p
es aquel pH para el cual la molcula (aminocido o protena) se encuentra en toda su concentracin con
carga neta 0. Al estar en un principio cargados positivamente, todos los componentes de la muestra
quedarn retenidos por la resina (utilizaremos una resina intercambiadora de cationes). En el paso 2
iremos variando el pH, de modo, que se valla acercando a los p de los aminocidos, y como stos son
distintos irn eluyendo a diferentes pH, lo que implica que podremos recogerlos en distintas fracciones.
En ste experimento contamos con una muestra a separar compuesta por un azcar y dos aminocidos
con p distintos. Las variaciones del medio, las realizaremos con tampones citrato a distinto pH y
finalmente con hidrxido sdico (NaOH). Se irn recogiendo fracciones y analizando para localizar, en
primer lugar la salida del azcar, con carga 0 y, por tanto, no retenido por la resina en el paso 1. Para ello
utilizaremos el ensayo con licor de Fehling. Para la deteccin de los aminocidos a distintos pH
utilizaremos la ninhidrina.
Material
Resina Dowex 50
Tampn citrato 50 mM, pH = 3
Tampn citrato 50 mM. pH = 5
Solucin de ninhidrina (0,2 % p/v de ninhidrina en 95 % de etanol)
Papel indicador de pH
NaOH 2M
HCl 2M
Mezcla problema
Mezclar 0,5 ml de glucosa 4 %, 1ml de lisina 2% y 1 ml de asprtico 2%. Todas estas sustancias se
disuelven inicialmente en HCl 0,1 M. Aadir 2,5 ml de tampn citrato 50 mM (pH = 3), con lo que
finalmente tendremos un volumen de 5 ml. Utilizar 0,25 ml de la muestra por columna.
Preparacin de la columna
Pesar 7 g de resina Dowex 50 y disolverla en 25 ml de ClH 2M. agitar y dejar decantar.
Retirar la fase acuosa superior y lavar la resina con 25 ml de H2O(destilada), tantas veces como sea
necesario para que el pH sea igual al del agua (* 6). Obtuvimos unas medidas de:
0avado 1er 21 #er 21
pH medido * 1 * 2 4 - 5 * 6
Una vez con el pH del agua aadir 25 ml de NaOH 2M, agitar y dejar decantar.
Retirar la fase acuosa superior y aadir agua destilada igual que antes, hasta que el pH vuelva a ser
el del agua. Las medidas obtenidas fueron:
0avado 1er 21 #er 21 31
pH medido * 10 * 9 * 8 * 7 - 8 * 6
Finalmente resuspender la resina en 25 ml de tampn citrato 50 mM (pH = 3).
Una vez preparada la resina (se trataba de limpiarla de posibles contaminantes de anteriores
experimentos y de calibrarla), se aade en una columna de vidrio, en la cual habamos aadido un tapn
de lana de vidrio en el fondo, para evitar la elucin de la resina. El vertido de la resina en la columna
implica que esta se encuentra con la salida cerrada por la presin de la pinza sobre la goma, y ste debe
de hacerse con cuidado. En el caso de necesitar eliminar tampn para terminar de echar la resina, se
abre la pinza, dejando que eluya el tampn, teniendo en cuenta que la resina nunca debe estar seca.
Cerrar la salida de la columna cuando quede aproximadamente 1 cm de tampn sobre el frente de
empaquetado de la resina.
Separacin de los componentes de la muestra.
Del mililitro de muestra que tenemos (compuesta de glucosa, asprtico y lisina), cogemos 250 l y los
aadimos con cuidado en la columna, donde previamente hemos dejado con 1 mm de tampn sobre la
resina, dejamos que entre y con mucho cuidado vamos aadiendo tampn citrato pH 3 para que no se
seque la resina.
Una vez aadida la muestra debemos recoger las fracciones, cinco exactamente, que sern de unos 2ml.
Cuando tengamos las cinco fracciones, procederemos al anlisis de las mismas. Ya que el nico
componente que no tiene carga es el azcar (Glucosa), no quedar retenido al no entrar en el
intercambio de cationes, donde s estarn los aminocidos.
Deteccin de la glucosa
La deteccin se realiza mediante el licor de Fehling.
Aadir a los 2 ml de fraccin 2 ml de oluci%n A.
Agitar en el vortex.
Aadir 2 ml de oluci%n 4.
Agitar en el vortex.
Poner en un bao a 80 C y esperar 10 minutos.
Se espera ver un precipitado rojo ladrillo en aquella fraccin que contenga la glucosa. Si no aparece en
las 5 fracciones habr que seguir eluyendo hasta que aparezca. Hay que realizar un control, y para ello
cogeremos 250 l y les aadiremos los 2ml de solucin A y de la B, al igual que las fracciones dejaremos
que reaccione en el bao a 80 C.
Princi!io del licor de 5e6ling !ara la detecci%n de a.7care reductore
8uc6o reactivo o9idan el gru!o alde6do (reductor) de lo a.7care: ;n eto e )aa la reacci%n o
!rue)a de 5e6ling !ara ditinguir lo a.7care reductore:
;l tartrato< al unire al co)re "ormando un com!lejo olu)le< im!ide la "orma de 6idr%9ido c7!rico inolu)le =ue tendra lugar i
e9itiee co)re li)re en la oluci%n: 0a o9idaci%n de la glucoa !or ete m>todo e m? intena =ue en el etado de ?cido gluc%nico
de)ido al a!orte de cantidade a!recia)le de (u2& a !artir de lo gru!o alde6do di!oni)le: (omo criterio de !oi)ilidad de la
reacci%n e utili.a la "ormaci%n de %9ido cu!roo rojo inolu)le: 0a !rue)a de 5e6ling no e e!ec"ica: &tra utancia dan reacci%n
!oitiva on@ "enole< amino"enole< )en.ona< ?cido 7rico< catecol< ?cido "%rmico< 6idra.o)enceno< "enil6idracina< !irogalol A
reorcinol:
(om!oici%n
-oluci%n A: sulfato de cobre
-oluci%n 4: tartrato sdico-potsico, hidrxido sdico.
Reultado
Control F1 F2 F3 F4 F5
+ +
Deteccin de los aminocidos
Una vez eluda la glucosa, hay que entrar en la fase 2, separar los aminocidos selectivamente de la resina. Para ello aadimos ahora
tampn citrato a pH 5, abriendo la pinza y recogiendo fracciones. Al aadir el tampn se forma en la columna un gradiente de pH que
har que eluya aquel de los dos aminocidos que nos quedan retenidos que tenga el p ms cercano a 3 y menor que 5.
a? Abr. -R pK1 pK2 pKR p
0iina: Lys, K -CH2-CH2-CH2-CH2-+NH3 2,18 8,95 10,53 2,77
A!?rtico: Asp, D -CH2-COO- 1,88 9,60 3,65 9,74
En esta tabla se reflejan los puntos isoelctricos de los dos aminocidos, y en ellos resalta el del asprtico, con 2,77, no podra ser
que hubiera eludo a pH 3?. Tericamente tendra que haberlo hecho, y posiblemente algo halla salido, pero hay que tener en cuenta
que se trata de un equilibrio y, por tanto, para que el asprtico tenga carga neta 0 en gran concentracin, el pH de la solucin debe ser
algo mayor de 3, algo que demostramos hacindolo eluir cuando aadimos citrato a pH 5, eso si en las primeras fracciones.
4ae de la reacci%n de detecci%n de amino?cido con nin6idrina
;l m>todo e )aa en la reacci%n entre la nin6idrina A el gru!o Bamino de amino?cido< !>!tido A !rotena< dando un com!ueto
coloreado a.ul o a.ul B violeta:
(alentar en !reencia de nin6idrina !roduce la deaminaci%n o9idatva de lo gru!o amino en < lo =ue im!lica la reducci%n aociada
de la mol>cula de nin6idrina:
0a nin6idrina reducida reacciona con el amonio A con otra nin6idrina o9idada !ara dar ligar a un com!ueto coloreado llamado azul -
violeta de Ru6ermann:
0a !rolina A la o9i!rolina reaccionan con la nin6idrina< !ero dan un !oitivo de color amarillo: 0a reacci%n de la nin6idrina !uede dar
!oitivo con cierta amina< amina ?cida A alguno otro com!ueto:
Una vez eludas tres fracciones se aaden a 250 l de cada una otros 250 de citrato 5, se agita en el vortex y se aaden 500 l de
ninhidrina. Se dejan los tubos en un bao a 80 C durante 10 minutos.
*ncidencia
Segn las indicaciones del guin, al comenzar a aadir el citrato a pH 5, no recogimos fracciones, sino que medimos el pH de lo que
elua sin recogerlo, esperando a que fuera de 5 para comenzar a recogerlo. Evidentemente, y como ya hemos dicho el asprtico tiene
un p de 2,77 y, por tanto, coge carga 0 en cuanto el pH sube algo por encima de 3, lo que ocurre nada ms aadir el citrato a pH 5
porque se forma un gradiente de pH en la columna.
El resultado fue que no pudimos detectar de forma fiable la salida del asprtico en las fracciones, pero si en el lquido que se recogi
en un vaso de precipitados y sobre el que efectuamos la deteccin. El resultado fue un intenso azul-prpura, que indicaba la presencia
de "algo en gran cantidad, pero que la escasa limpieza del recipiente no permite afirmar que fuera asprtico.
Segn los resultados de otras parejas y de acuerdo con la teora expuesta, el asprtico eluy en la primera fraccin recogida, y por
supuesto el control dio positivo.
Una vez sabido que ya haba eludo al asprtico hay que continuar con la fase 2, lo que implica variar de nuevo el pH de la columna,
esta vez lo haremos con sosa, ya que el p de la lisina es de 9,74. Al igual que con los dems tampones, vamos aadiendo el NaOH a
la vez que recogemos las fracciones y con cuidado no se seque la resina.
Recogidas 4 fracciones se efecta la deteccin de aminocidos mediante el mtodo de la ninhidrina, con las mismas cantidades de
componentes que con el asprtico, salvo que ahora hay que medir el pH con un papel medidor para asegurarnos que no supera las 8
unidades, ya que la ninhidrina se desactiva por encima de ese pH. En nuestro caso ninguna sali con un pH superior.
Reultado
Control F1 F2 F3 F4
+
Algo
verdoso
Marrn muy
clarito
Marrn muy
oscuro
Marrn
claro
Como se ve en la grfica, la lisina no eluye en una sola fraccin, pero si mayoritariamente en la F3. La razn es similar a la explicada
para el asprtico, consistente en la formacin del gradiente de pH en la columna, que implica el paso de pH 5 a pH 10, por eso tarda
en eluir.
Limpiado de la columna
Para ello hacemos eluir secuencialmente por la misma 5 ml de HCl, de H2O, de NaOH y de nuevo de H2O, con el fin de eliminar
posibles restos y dejar un pH lo ms cercano a 7.
2: (romatogra"a de "iltraci%n molecular:
En este tipo de cromatografa los componentes de una muestra se separan de acuerdo a su tamao y forma molecular. La base de
esta cromatografa es el "reparto que sufren las molculas entre un solvente y una fase estacionaria contenida en una matriz de
porosidad definida (esto es lo que dice el guin, pero en teora dimos que era de exclusin). La columna se prepara con partculas de
una sustancia inerte que contienen poros pequeos. Al pasar una disolucin con molculas de distintas dimensiones a travs de la
columna, las molculas con un tamao mayor que el de los poros se movern slo en el espacio que queda entre las partculas, y, por
tanto, no sufrirn retraso en su recorrido a travs del material de la columna. Sin embargo, las molculas con un tamao menor que el
de los poros difunden hacia el interior y el exterior de las partculas con una probabilidad que aumenta a medida que disminuye el
tamao molecular. Por lo tanto, las molculas son eludas de la columna por orden de tamaos decrecientes.
Para un determinado tipo de columna o matriz se puede calcular un parmetro Kav de elucin de una determinada molcula. Este
parmetro es caracterstico de cada molcula y es diferente para cada columna. La representacin grfica de Kav con respecto al
logaritmo del peso molecular da una lnea recta. Este parmetro se define como:
Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) donde,
Ve = volumen de disolvente necesario para eluir las molculas de inters.
Vo= volumen vaco o volumen necesario para eluir una molcula que nunca entra en la fase estacionaria.
Vt = volumen total de columna.
-o!orte A !artcula
0a !artcula em!leada re=uieren@
;ta)ilidad =umica@ Para =ue no varen la condicione durante la cromatogra"a:
4ajo contenido en gru!o i%nico@ Para =ue no entren en juego !roceo de intercam)io:
$ran uni"ormidad de !oro A tamaCo@ ,o de)e 6a)er 6eterogeneidad !ara mantener el !rinci!io de e!araci%n:
Due !odamo elegir una am!lia galera de tamaCo de e"era A !oro:
0o gele o o!orte m? utili.ado on@
(olumna =ue derivan del de9trano -;PHAE;F@ -e trata de mol>cula de glucoa unida !or e!icloridrina: Preentan un rango de
e!araci%n =ue ocila entre lo GHH A lo IHH:HHH< aun=ue ete de!ende del ti!o: (ada ti!o de reina e nom)ra como $BF< iendo F
lo mililitro de agua =ue e ca!a. de a)or)er 1 gr de reina eca: 0a reina -e!6ade9 on de gran reitencia A eta)ilidad<
!reentando "lujo lento:
Eerivado de agaroa -6e!6aroa@ ;n !rinci!io no e di"erencia muc6o de la derivada del de9trano< alvo en el rango de tamaCo
a e!arar< a6ora u!erior a lo IHH:HHH< (maAor =ue lo viru !e=ueCo) A< !or tanto< com!leta a la anteriore: ;l 7nico !ro)lema e
=ue on meno reitente< Aa =ue no o!ortan tem!eratura u!eriore a lo #H 1( ni !H "uera del intervalo 2 B 1H:
Poliacrilamida 4iogel P@ ;te o!orte !reenta como gran ventaja el am!liar muc6imo el rango de !H< de)ido a la gran eta)ilidad
de la acrilamida =ue Aa comentamo en la electro"orei< !udiendo o!ortar !H del orden de 1 o 1H unidade:
Vidrio@ e trata de e"era de vidrio con !oro: -u maAor ventaja e la maAor reitencia mec?nica< eguido de u evidente inercia
=umica< la reitencia a alta tem!eratura (1HH 1()< =ue no !reentan 6inc6amiento< A !or 7ltimo =ue o!orta tratamiento ?cido:
5actore =ue condicionan la reoluci%n
TamaCo de !oro:
TamaCo de !artcula:
5lujo de eluci%n:
Material de la prctica.
Tampn PBS (0,1 M de tampn fosfato; 0,15 M de NaCl pH 7.2).
Sephadex G-100.
Azul dextrano (10 mg/ml). 2.106 Da
Rojo fenol (10 mg/ml). 345 Da
Lana de vidrio.
Columnas de vidrio.
2.1.Preparacin de la columna de Sephadex G-100.
Nombre comercial de una matriz comercial constituida por polmeros de dextrano entrecruzados por epiclorihidrina. El grado de
entrecruzamiento va a determinar el tamao poro y ste va a determinar el rango de fraccionamiento de tamaos moleculares. Esta
resina permite separar protenas globulares cuyo peso molecular est entre 4.000 y 150.000 Da. Esto ltimo quiere decir que
molculas mayores de 150.000 Da sern incapaces de entrar en el poro de la matriz.
Preparacin de la columna en la prctica.
Previamente, a 1,5 gramos de resina sephadex G-100 se le aaden 50ml de tampn PBS y se deja esponjar 72 horas. Paso
realizado por los profesores de prcticas.
El esquema de la columna es:
Los pasos que se siguen para preparar la columna para la filtracin molecular son:
Se aaden a la columna, con la pinza cerrada, 25 ml de PBS y se hace una seal de la altura a la que llegan en la columna esos
25 ml. Esta marca ser la altura hasta la que debe llegar la resina en la columna.
Poner lana de vidrio en la parte de debajo de la columna, para que, al aadir la resina, esta ltima quede retenida por la lana.
El sephadex suspendido en PBS se echa en la columna, al principio en grandes cantidades y despus poco a poco con pipeta
Pasteur, hasta que la resina llegue a la marca anteriormente mencionada. Hay que tener extremo cuidado de que la columna no
pierda demasiado PBS y se seque, de modo que siempre tiene que haber algo de PBS por encima del frente de compactacin de la
resina. Tambin hay que tener cuidado al echar la suspensin de la resina para que no se formen burbujas en la columna, ya que
estas burbujas dificultaran la elucin de la muestra a travs de la columna.
Lo que sucede al echar la resina en suspensin y abrir la pinza es que el PBS pasa a travs de la lana de vidrio y se pierde, mientras
que la resina queda retenida por la lana y se va empaquetando poco a poco.
Terminado el empaquetamiento, siempre poniendo ms PBS por encima del frente del empaquetamiento para que la resina no se
seque, se aaden unos ml de PBS por encima de la marca que hicimos. Despus se pone parafilm y se deja hasta el da siguiente.
ncidencias.
Rotura de una pipeta Pasteur. Fragmento de unos 4 5 cm que qued incluido en la resina, por debajo de la mitad de la columna.
A la altura de ese fragmento de la pipeta hay unas burbujas no demasiado grandes y no en demasiada cantidad.
En la parte superior de la columna se observan algunas burbujas pero muy separadas y pequeas. Creemos que no estaban en un
nmero suficiente ni tenan un tamao suficiente para que la separacin de protenas se viera muy perturbada.
Suciedades y partculas, (pelillos o fibras), podran haber entrado en la columna por falta de limpieza en el material del que
disponamos.
2.2. Equilibrado de la columna.
Despus del empaquetamiento tenemos que equilibrar la columna. Calibrar la columna es definir los valores de Vo y Vt.
Procedimiento.
Abrimos la llave para que salga el PBS sobrante hasta que queden 1 2 mm por encima del frente de la resina.
Se procede a la colocacin en la superficie de la resina de 200 l de una mezcla con 40 gr de azul dextrano, cuyo peso molecular
es 2 millones g/mol, y 20 gr de rojo fenol, cuyo peso molecular es de 345 g/mol.
Se abre la pinza para que entre la muestra en la resina pero teniendo cuidado de que no se seque la resina, puesto que al eluir la
muestra estamos eluyendo tambin el PBS. Tenemos que aadir PBS para que la resina no se seque, pero esperando a que hallan
entrado los colorantes. Esta adicin de PBS se debe realizar poco a poco, pues si echamos mucho PBS o lo echamos a destiempo
podemos diluir la muestra de colorantes, de modo que no entre todo a la vez en la resina y, como consecuencia, la elucin no sera
correcta.
Una vez que se abre la pinza y la muestra ha entrado en la resina comenzamos a recoger fracciones de 1,5 ml en tubos de ensayo
hasta que salga la fraccin con el rojo fenol. En el caso de que el rojo salga en varias fracciones se coje la que tenga ms cantidad de
rojo. Esto ltimo fue lo que nos pas.
Despus se cuenta el nmero de fracciones hasta que salga el azul, que debera salir en una sola fraccin (que fue lo que nos
pas), y se multiplica ese nmero de fraccin por 1,5, obtenindose as el volumen de elucin del azul dextrano, que tomaremos como
el volumen inicial, Vo, el que nos marcar el volumen a partir del cual podremos obtener protenas al eluir la muestra problema.
La misma operacin se hace con el rojo fenol, con la nica diferencia de que el rojo se recoge en un volumen de elucin mucho
mayor que el del azul, puesto que al ser el rojo una molcula mucho menor pasa por la columna ms despacio. Al multiplicar por 1,5 el
nmero de la fraccin con ms cantidad de rojo fenol tenemos el volumen de elucin del rojo, que nos dice el volumen total, Vt, que
nos marcar el volumen hasta el que las protenas problema pueden eluir, por encima del cual no deberan eluir protenas.
Los colorantes nos sirven para delimitar el intervalo de volmenes entre los que deben eluir nuestras protenas, puesto que sus pesos
moleculares se encuentran entre los del azul y los del rojo, y la columna separa las protenas en funcin de su peso molecular.
Aunque cogimos 2 ml por encima y por debajo de esos Vo y Vt para estar seguros de que recogemos las protenas, esto no debera
ser necesario si la elucin es correcta.
Resultados del equilibrado de la columna.
VeA= Vo= 6 x 1,5 ml = 9 ml, pues recogimos el azul en la fraccin 6.
VbR= Vt= 16 x 1,5 ml = 24 ml, pues recogimos el rojo en la fraccin 16.
Segn estos datos tendremos que recoger 15+2+2 ml de nuestra muestra para recoger las protenas.
2.3.Separacin de protenas.
Procedimiento.
Despus de recoger el rojo, hay que lavar con PBS la columna para eliminar el resto de rojo y limpiar la columna. La teora deca
que tenamos que lavar con 20 ml de PBS, pero no lo hicimos as, simplemente lavamos con lo que bamos echando para eluir el rojo
y luego aadimos slo algunos ml de PBS (por indicacin del profesor).
La metodologa para la separacin de protenas es la misma que para el equilibrado. Dejamos eluir el PBS que quedaba despus
del equilibrado hasta que queden 1 2 mm por encima del frente de la resina. Despus aplicamos 200 l de la muestra problema con
protenas. Abrimos la pinza y dejamos que entre la muestra en la resina sin que esta ltima se seque y sin echar demasiado PBS que
diluya mucho la muestra.
De esta muestra hay que recoger fracciones de 1 ml en tubos ependorf, estos ltimos debidamente marcados con su nmero de
fraccin y pareja de prcticas. La columna separar las protenas en funcin de su tamao, de modo que las de mayor tamao eluirn
antes y estarn en las primeras fracciones, y las menores estarn en las ltimas. Esto ltimo siempre dentro del intervalo Vo-Vt.
Segn los volmenes calculados en el equilibrado nosotros tenamos que recoger la primera fraccin 7 ml despus de aplicar la
muestra en la columna, con lo que recogimos 19 fracciones de 1 ml en el intervalo de volmenes 7-26 ml.
Una vez que recogimos estas 19 fracciones, los ependorf se colocaron en una gradilla y se llevaron las fracciones al frigorfico. El
dejar las protenas a 4C se realiza para evitar que las protenas se desnaturalicen y pierdan su actividad, ya que la filtracin molecular
separa las protenas en su estado nativo. El que las protenas estn en su estado nativo y que conserven su funcionalidad nos sirve
para poder identificar en las fracciones determinadas actividades enzimticas.
Con los volmenes de elucin de las fracciones ms caractersticas, y con los valores de Vo y Vt podemos hallar los valores Kav de
las principales fracciones. Con los valores log Pm del azul y el rojo y sus Kav, 0 y 1 respectivamente, hacemos una recta en la que
interpolar los valores de log Pm de las protenas de nuestras fracciones. Las fracciones caractersticas fueron escogidas despus de
realizar todas las pruebas.
Las grficas estn en papel milimetrado al final de los apartados 2 y 3.
Valores de Kav
A 0 F6 0,2 F12 0,6
F3 0 F7 0,27 F13 0,67
F4 0,066 F10 0,48 F14 0,733
F5 0,133 F11 0,533 R 1
ncidencias.
Quedo algo de rojo fenol entre la lana de vidrio y eluy junto con las primeras fracciones de la muestra. Como consecuencia de esto
en las dos primeras fracciones recogidas haba algo de rojo, pero este colorante al no tener naturaleza proteica no interfiere o falsea
los datos de la absorbancia obtenida en la prueba de Bradford.
La elucin del rojo y del azul se hizo bien, pero el rojo al llegar a la altura del trozo de Pasteur rota difundi un poco y no iba tan junto
o compacto que al principio, en cambio el azul no sufri ninguna difusin. No sabemos si la punta pudo influir negativamente en la
separacin de las protenas por la columna de resina.
2.4.Regeneracin de columna.
Paso realizado por los profesores, consistente en vaciar la columna con ayuda de PBS, para que la resina no se seque, para ser
reutilizada. Despus se quita la lana de vidrio y se lava la columna.
#: Eeterminaci%n de !rotena A actividade en.im?tica:
8>todo de 4rad"ord
;te e uno de lo m>todo con maAor eni)ilidad !ara la determinaci%n de !rotena:
Una de la cuetione =ue e no !edan !ara ete !unto e la de encontrar el "undamento de ete m>todo< !ero a !ear de di!oner
del artculo original de 4rad"ord A del li)ro de intruccione del reactivo de 4rad"ord comerciali.ado !or 4ioBRad< no 6a ido im!oi)le
a)er cu?l e el ti!o de interacci%n =ue le !ermite al a.ul )rillante de (oomaie unire a la !rotena< lo cual e a)e en lo otro
m>todo de ete ti!o conocido (0o/rA< 4iuret): ;t? claro =ue al unire a la !rotena< ete reactivo< u"re un cam)io en u m?9imo de
a)or)ancia =ue e el =ue medimo con el e!ectro"ot%metro< A =ue e !ro!orcional< !or tanto< a la cantidad de !rotena: A< cu?nto
m? !rotena 6alla en la dioluci%n m? cam)io en la a)or)ancia 6a)r?< e decir< m? a)orci%n 6a)r? en el nuevo m?9imo =ue e
3J3 nm: ;l cam)io e de 2K3 a 3J3 nm:
-eg7n lo encontrado en la )i)liogra"a utili.ada< !odemo decir de ete m>todo =ue@
; un enaAo de uni%n !rotena colorante )aado en el di"erencial cam)io de color de un colorante en re!ueta a varia
concentracione de !rotena: ;te e un m>todo de determinaci%n de !rotena =ue im!lica la uni%n de A.ul 4rillante de (oomaie $B
23H con la !rotena: ;ta uni%n del colorante con la !rotena !rovoca un cam)io en el m?9imo de a)orci%n del colorante dede
2K3 a 3J3 nm: Por lo tanto< e )aa en la o)ervaci%n de =ue el A.ul 4rillante de (oomaie $B23H e9ite en do "orma con colore
di"erente< rojo A a.ul: 0a "orma roja e convierte en a.ul cuando e une el colorante a la !rotena:
;l com!lejo coloranteB!rotena tiene un alto coe"iciente de e9tinci%n lo cual e im!recindi)le aumentar la eni)ilidad en la medici%n
de !rotena:
0a uni%n coloranteB!rotena e un !roceo muA r?!ido (2min) A el com!lejo !ermanece eta)le durante un tiem!o relativamente largo<
una 6ora: Haciendo de ete un !roceo muA r?!ido< A =ue no re=uiere un tiem!o crtico !ara el enaAo:
-e !ueden utili.ar un gran n7mero de muetra (muA re!roduci)le) A e ada!ta)le a la automati.aci%n:
; un enaAo =ue elimina cai todo lo !ro)lema =ue 6a)a anteriormente con e ti!o de enaAo:
0a inter"erencia o no e9iten o on mnima !or catione tanto odio como !otaio A car)o6idrato como la acaroa: &tra
utancia =ue inter"ieren en el enaAo on lo agente "uertemente alcalino (cueti%n "?cilmente olventa)le con la utili.aci%n de
tam!one): 0o 7nico com!onente encontrado =ue dan una e9ceiva inter"erencia en el color del enaAo< on grande cantidade
de detergente como el -E-< Triton FB1HH< etc:
Pre!araci%n del colorante: A.ul 4rillante de (oomaie $B23H (1HHmg) e diuelto en 3H ml de etanol J3%: A eta dioluci%n e le
aCade 1HHml de ?cido "o"%rico I3% !/v: 0a oluci%n reultante e diluAe llev?ndola 6ata un litro de volumen "inal: 0a concentraci%n
en la dioluci%n "inal e H<H1% !/v de a.ul< 2<G% !/v de etanol A I<3 % !/v de ?cido "o"%rico:
Una di"icultad o)ervada en la reali.aci%n del enaAo e la tendencia del com!lejo coloranteB!rotena a unire a la cu)eta: ;to
reulta en una cu)eta coloreada de a.ul@ la cantidad de uni%n e !oco im!ortante en lo =ue e re"iere al reultado del enaAo: -e
uele lavar el tu)o o cu)eta con agua detilada entre medida de di"erente muetra: ;te a.ul e !uede =uitar A la cu)eta e
reutili.an in !ro)lema:
0a eni)ilidad del enaAo de!ende de la naturale.a de la !rotena< A en muetra com!leja (aun=ue no e nuetro cao)< en la
cuale la !rotena e di"erencian am!liamente en u re!ueta al enaAo< !uede er di"cilmente cuanti"ica)le: -in em)argo<
reciente modi"icacione en el enaAo 6an mejorado u e"icacia en eta a!licacione: -e a!lica una cierta cantidad de -E-< el cual
!or i mimo caua una "alta de dearrollo de color< e aCadido a la muetra o al colorante: ;l -E- iguala la reactividad de la
ditinta !rotena< a =ue el enaAo !uede er utili.ado !ara me.cla de !rotena: ;ta igualdad !roduce tanto una diminuci%n de
la reactividad de !rotena con alta re!ueta< como la al)7mina< como un incremento en la reactividad en la !rotena con )aja
re!ueta:
A!licacione@ (romatogra"a< electro"orei< olucione de !rotena com!leja< =umica clnica< ada!ta)le a la automati.aci%n:
Material de la prctica.
Reactivo de Bradford
PBS
Albmina bovina.
Fracciones de protena.
Espectrofotmetro.
Tubos de espectrofotmetro.
Procedimiento.
Preparar las muestras que tenemos que medir para la determinacin de protenas. Tenemos que tomar alcuotas de 500 l de cada
fraccin.(5).
Aadir a esas alcuotas 3,5 ml de PBS.
Aadir 1ml de reactivo de Bradford. (6). Despus de esto tenemos en cada tubo 5 ml. Esto ltimo es importante, ya que todos los
tubos deben tener la misma concentracin para que la medida de la concentracin de protena sea correcta.
Ee!u> >ta dioluci%n e me.cla )ien en el vorte9:
Pre!arar una curva !atr%n en la =ue conocemo la cantidade de !rotena =ue !onemo A medimo u a)or)ancia: ;ta no
ervir? !ara inter!olar< a !artir de la curva< lo valore de concentraci%n de !rotena en la "raccione< a)iendo u valore de
a)or)ancia: 0a curva e !re!ara a !artir de una dioluci%n toc' =ue tiene 1HH gr/ml< de modo =ue !re!aramo ei tu)o con
cantidade creciente de al)7mina(uno in nada =ue utili.aremo como nuetro cero)< A lo llevamo a 2 ml con P4- A de!u> le
aCadimo 1 ml de reactivo 4rad"ord:
; muA im!ortante aCadir el 4rad"ord a la ve. en todo lo tu)o< tanto en lo tu)o de la curva !atr%n como en lo de la
"raccione: A todo lo tu)o e di!aran a la ve. A la medici%n de la a)or)ancia e "ia)le A correcta: ;te 6ec6o e una
conecuencia de la cin>tica caractertica de eta reacci%n< Aa =ue cuanto m? tiem!o trancurre m? inteno e el color de la
dioluci%n: Por eo< e !re!aran todo lo tu)o A de!u> e aCade a todo lo tu)o el reactivo:
8edir lo valore de a)or)ancia de lo ditinto tu)o: ;ntre medida A medida al cam)iar de "racci%n o muetra 6aA =ue lavar el
tu)o de e!ectro"ot%metro con agua detilada: ;to no 6aA =ue 6acerlo al medir la recta !atr%n !ueto =ue vamo en orden creciente
de concentraci%n de !rotena:
Re!reentar con lo dato de E:&:@ 1: E:&: "rente n1 "racci%nL 2: E:&: "rente M!rotNL #: M!rotN "rente n1 "racci%n:
Resultados del patrn obtenidos a partir de la mesa 3D.
Tu)o (oncentraci%n Al)7mina A4-3J3
1 H H
2 2H g/ml< 2HHl de toc' H<##K
# 2H g/ml< 2HHl de toc' H<322
2 KHg/ml< KHHl de toc' H<KK2
3 IH g/ml< IHH l de toc' H<GH1
K 1HHg/ml< 1HHHl de toc' 1<H2
Reultado de a)or)ancia de la muetra:
Tu)o A)or)ancia Tu)o A)or)ancia
1 BH<12# 11 H<#GH
2 BH<212 12 H<#1#
# H:GI# 1# H<2G2
2 BH<1J2 12 H<1GI
3 BH<1I2 13 BH<H12
K BH<1JG 1K BH<HK2
G H<I2 1G BH<123
I BH<H11 1I BH<13I
J H<HG2 1J BH<1I#
1H H<2IH
ncidencias.
Problemas con los espectrofotmetros, pues algunos no funcionaban (incomprensiblemente) y otros daban medidas extraas e
ilgicas. Adems de la falta de aparatos disponibles. Al final medimos en uno que meda perfectamente, aparentemente.
Fallo al preparar las muestras de las fracciones 4,5, y 6. Este fallo nos impidi ver si tenan protena esas fracciones y complic mucho
la realizacin del cuaderno. Deducimos que deban tener protenas a partir de la grfica D.O. frente al nmero de fraccin, pues estas
fracciones quedaban dentro del primer pico que apareca en esta grfica. Despus comprobamos que si tenan protenas al correr el
gel de acrilamida.
Entendimos mal la aclaracin del profesor, en la que deca que haba que diluir 1/10 las muestras de la curva patrn si la segunda (la
primera despus del blanco) daba un valor de absorbancia de 1,3 o 1,4, aproximadamente. Pero nosotros al entender mal, diluimos
las muestras patrn, 1/10, al obtener en la tercera muestra 1,2. Despus de esta dilucin, las medidas resultaron totalmente
incoherentes. Por la falta de tiempo y por los nervios, no fuimos capaces de resolver este problema y decidimos tomar, como nuestra,
la recta patrn de la mesa 3D, y medir con su mismo aparato y con el mismo tubo.
3.2. Determinacin de la actividad catalasa.
Un mtodo rpido para la determinacin de la protena catalasa es la observacin de su actividad por la formacin de burbujas en una
solucin que contiene H2O2.
Procedimiento.
Preparar un tubo con 1 ml de una solucin constituida por 1 ml de PBS + 10% de H2O2.
Aadir 100l de las fracciones que, despus de la realizacin del mtodo de Bradford, sepamos que contienen un alto contenido en
protenas.
Aquellas fracciones que contengan catalasa producirn un burbujeo instantneo en la solucin.
Resultados de la prueba de la catalasa.
Tu)o Actividad (atalaa Tu)o Actividad catalaa
Muestra + + + + + + + + + + 10 -
3 + + + + + + + + 11 -
4 + + + + + + + + 12 -
5 + + + + 13 -
6 + + 14 -
7 +
-eg7n lo reultado o)tenido en la !rue)a tenemo =ue la catalaa e encuentra en la !rimera "raccione o)re todo en la # A en
la 2 =ue e corre!onde con el mililitro J A 1H: ;to no dice =ue la catalaa e una !rotena de gran !eo molecular al eluir !ronto en
la columna: (on la columna e!aramo la !rotena en "raccione eg7n u !eo A de!u> con e9!erimento como ete A como el
iguiente de la lio.ima< identi"icamo la !reencia de determinada !rotena en ea "raccione:
3.3. Determinacin de la presencia de lisozima.
Un mtodo rpido para la determinacin de la actividad lisozima es la medida de la disminucin de turbidez de una suspensin de
pared bacteriana al agregar dicha protena. Al incubar la suspensin con lisozima la pared celular se hidroliza originando fragmentos
pequeos, reducindose la dispersin de la luz lo que se manifiesta en una reduccin de la absorbancia a la longitud de onda de 450
nm. As, la actividad enzimtica ser, por lo tanto, proporcional a la disminucin en absorbancia.
En nuestro caso concreto se va a analizar la presencia de esta enzima en las mismas fracciones en las que realizamos el ensayo de
la catalasa.
Procedimiento.
Colocar 100l de la fraccin sobre un tubo que contenga 5 ml de suspensin de pared bacteriana, mezclar e incubar a temperatura
ambiente durante 15 min.
Como tubo "blanco tomamos uno solamente con la suspensin que nos dar el mximo de absorbancia. Para el ajuste a 0 del
densimetro o espectrofotmetro se utilizar el tubo en el que se colocaron 100l de la muestra inicial, que lgicamente tendr un
mximo de actividad lisozima (s es que esta protena existiera en la muestra).
Medir DO450.
La suspensin de pared bacteriana se prepara a partir de la pared del microorganismo Micrococcus lysodeikticus (preparado
comercial). 20 mg de este preparado se mezclan con 100 ml de tampn fosfato (100 mM; pH 6.2). (A nosotros se nos dio la
suspensin ya preparada).
Los resultados de este ensayo.
Tu)o A)or)ancia Actividad Tu)o A)or)ancia Actividad
Muestra 0,00 100% Blanco 0,38 0%
3 0,38 0% 10 0,285 25%
4 0,378 0,52% 11 0,28 26,3%
5 0,373 1,8% 12 0,242 36,3%
6 0,375 1,3% 13 0,28 26,3%
7 0,377 0,78% 14 0,307 19,21%
Para calcular la actividad de cada fraccin tenemos que utilizar una regla de tres inversa.
Se puede ver como en este caso la actividad lisozima se encuentra en las fracciones 10, 11, 12, 13, 14 que se corresponden con los
mililitros 16, 17, 18, 19, 20. Esta es, por tanto, una protena de menor tamao que la catalasa. El hecho de identificar en estos dos
grupos de fracciones dos protenas, mediante los ensayos de actividad, no quiere decir que no pueda haber ms protenas en esas
fracciones, pues al separar, durante la cromatografa, las protenas en funcin del peso molecular, puede haber en esas fracciones
otras protenas a parte de las ya mencionadas, con pesos parecidos. Los dos grupos de fracciones se corresponden, como ya vimos,
con dos picos en la grfica de D.O. frente a nmero de fraccin, que son las fracciones donde hay mayor concentracin de protenas y
con las que tenemos que trabajar para ver cuntas y cules son las protenas presentes en ellas.
Las grficas donde quedan reflejados los resultados de estos dos apartados se encuentran a continuacin, y las conclusiones sobre
ellas se pueden ver la parte final del cuaderno, seccin 7 de conclusiones.
2: ;lectro"orei en gele de PoliacrilamidaB-E-
El principio bsico de la electroforesis es el movimiento que experimenta una partcula cargada en un determinado medio cuando se
ve sometida a la accin de un campo elctrico. Dada una partcula de carga neta Q sometida a un campo elctrico de intensidad E, se
mover por accin de una fuerza igual a:
La tcnica se utiliza para separar protenas y cidos nucleicos, y uno de los medios soporte ms utilizados es el gel de poliaclilamida.
$ele de acrilamida
Permite gran cantidad de tratamiento
Permiten regular el tamaCo de !oro:
8uA eta)le:
Permite e!aracione m? r?!ida:
(ai no !reenta end%moi:
-on tran!arente< con lo =ue !ermiten 6acer etudio de denidometra:
Para reali.ar eto gele e !arte de cuatro com!onente l=uido@
- Acrilamida
CH2=CHCONH2
- Agente entrecruzante: bisacrilamida
CH2=CHCONH2CH2 CONH2CH=CH2
TEMED (Tetrametilen, etilen diamina)
(CH3)2CHNHCH(CH3)2
APS (Persulfato amnico)
S2O8(NH4)2
;lectro"orei en condicione denaturali.ante
0a electro"orei en condicione denaturali.ante< e )aa en aCadir com!ueto =ue alteren la condicione nativa de la
!rotena A =ue e agru!an en el llamado tam!%n de carga =ue e aCade ante de cargar la muetra en el gel A de!u> e incu)an
a uno 1HH 1( durante 2 minuto !ara =ue tenga u e"ecto: ;l tam!%n de carga conite en un agente reductor< 8e ( merca!to etanol)
=ue e encarga de eliminar lo !uente diul"uro: ;l -E- (dodecil ul"ato %dico) e el detergente derivado del ?cido de doce
car)ono< e une a la !rotena A la denaturali.a: ;a uni%n e contante< 1<2 gramo de -E- !or gramo de !rotena: Adem?< el
detergente et? cargado negativamente< A !or lo tanto e el =ue e ocu!a de dar carga a la !rotena: ;n el tam!%n tam)i>n e
incluAe el a.ul de )romo"enol< =ue e trata de un colorante con carga negativa (!or eo e utili.a) A con una movilidad electro"or>tica
=ue e=uivaldra a !e=ueCo !oli!>!tido: -u "unci%n e la de ir !or delante de la !rotena !ara ir marcando el "rente de
electro"orei A =ue !odamo viuali.ar como e va reali.ando la corrida (recordemo =ue tanto el gel como la !rotena on
tran!arente): ;l glicerol lo =ue 6ace e aumentar la denidad de la muetra< de modo =ue al ec6arla en el !ocillo no di"unda ni e
!ae a lo !ocillo de al lado: (on todo eto no encontramo con toda la !rotena cargada negativamente< con la relaci%n =/m
contante e conigue =ue la !rotena e e!aren !or u tamaCo< no !or u carga:
4.1. Determinacin del peso molecular de protenas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
Eeterminaci%n del !eo molecular mediante electro"orei con -E-
;te ti!o de electro"orei !ermite e!arar entonce la !rotena !or tamaCo< lo =ue im!lica =ue !odemo conocer la relaci%n
e9itente entre A el !eo molecular de la mol>cula< o lo =ue e lo mimo calcular el Pm de ditinta u)unidade de !rotena< Aa
=ue recordemo =ue en condicione denaturali.ante e eliminan lo conjunto de mon%mero: 0a relaci%n e conigue !oniendo en
el gel uno marcadore de Pm< A una ve. corrido el gel medimo (como ditancia al !ocillo) A re!reentamo la gr?"ica (log Pm / ):
Una ve. re!reentado lo marcadore< medimo de la ditinta )anda A la 6acemo corre!onder un valor del Pm a trav> del
antilogaritmo como e ve en la gr?"ica:
Preparacin del gel de poliacrilamida
Stock de acrilamida 30 % (29,2 g de acrilamida: 0,8 g de bisacrilamida.
Tris-HCl 1M. pH 6,8.
Tris-HCl 1M. pH 8,8.
SDS 10 %.
Persulfato amnico (APS) 10 %
TEMED
Tampn de electroforesis (Tris 0,025 M; glicina 0,192 M; SDS 0,1%; pH 8,3).
Tampn de carga 2x (Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8; SDS 4 %; glicerol 20 %; 2--mercaptoetanol 10 %; EDTA 15 nM; azul de bromofenol
0,008 %.
Limpiar los cristales con agua y etanol, colocar los separadores con algo de vaselina en la mitad que se orientar hacia fuera, montar
los cristales y sellarlos bien con vaselina. Antes de echar la acrilamida comprobar que el molde no tiene escapes vertiendo un poco de
agua. Haremos un gel discontinuo, con el gel separador y el de empaquetamiento.
;lectro"orei Eicontinua
Por eta caua e dieC% la electro"orei dicontinua< con el "in de minimi.ar la di"erencia de ditancia en la alida !ara =ue la
e!araci%n no !ermita o)tener la maAor reoluci%n:
;l nom)re le viene del !ro!io m>todo< =ue im!lica la !olimeri.aci%n de do gele con di"erente concentraci%n de acrilamida A ditinta
condicione de !H: ;l electrolito e com!one de una me.cla de TriBH(l A glicina< iendo el amino?cido la clave< Aa =ue a !H de I<I B
I<J e encuentra cargado al 13% en "orma de glAO< de modo =ue tranmite la corriente< al entrar en el gel concentrador< el !H vara a
K<I (en general do unidade de !H meno =ue el gel e!arador)< en ea condicione toda la glicina et? en "orma glAH< de modo
=ue un tranmite
la corriente< diminuAendo la intenidad de corriente (*)< algo =ue no e termodinamicamente !oi)le< Aa =ue de)e er contante< con
lo =ue e crea un gradiente de voltaje como e muetra en la "igura< el reultado e una diminuci%n de la velocidad de la !rotena
con"orme e alejan del !ocillo< de modo< =ue la !artcula e van reuniendo aAudada !or la )aja concentraci%n del gel: 0a
com!actaci%n< en una anc6ura de uno H<1 mm< e "acilitada !or la di"icultad =ue encuentran !ara entrar en el gel de e!araci%n< !ero
una ve. dentro la glicina e vuelve a cargar !or el nuevo cam)io de !H< A a !artir de a6 con todo !r?cticamente entrando a la ve. e
comien.a a e!arar con id>ntica condicione:
;n una electro"orei !odemo ailar un ti!o de !rotena< !ero veramo =ue la muA !e=ueCa e eca!aran A la grande ni
i=uiera legaran a entrar en el gel< !ue )ien< 6aA una "orma de electro"orei dicontinua =ue !ermite ailar tanto !rotena grande
como la !e=ueCa: 0a )ae e im!le< e trata de "ormar un gradiente de concentraci%n de acrilamida en el gel e!arador< con un
"ormador de gradiente< de modo =ue la !arte m? )aja del gel !reentara una concentraci%n alrededor del 2H% A de un G% en la
!arte de arri)a: (on eto la !rotena grande< entraran en el gel in muc6o !ro)lema A la !e=ueCa e veran retenida !or el
!e=ueCo tamaCo de !oro del "inal: 0o gele !ueden llegar a tener uno 2H cm de alto !or 1K B 1I de anc6o: 0a !rotena !e=ueCa
en lo gele normale i no eca!an< "orman )anda di"ua< !ero en la e!araci%n en gradiente corremo el !eligro de una gran
di"ui%n Aa =ue durante el gel< la concentraci%n de acrilamida tam!oco e muA grande< =ue "acilita la di"ui%n< lo =ue im!lica =ue 6aA
=ue llegar a un com!romio< como cai iem!re:
El APS y el TEMED sern los ltimos componentes que aadiremos a la poliacrilamida, para que no nos polimerice en el matraz.
Primero se prepara la solucin del gel separador, se vierte cuidadosamente en el molde hasta que el frente llegue como un centmetro
por debajo de lo que ocupar el peine. Entonces se vierte con una pipeta Pasteur un poco de agua(d) de modo que el frente quede
cubierto. Esto se hace porque el O2 inhibe la polimerizacin de al poliacrilamida.
Cuando el gel de separacin halla polimerizado eliminamos el frente de agua, secandolo bien con papel de filtro y aadimos la
solucin del gel concentrador, hasta el lmite del cristal ms bajo, entonces colocamos el peine. Es conveniente que esto se haga
introduciendo una de las puntas e ir descendiendo poco a poco para evitar que se formen burbujas en el fondo de los pocillos, que
hara desvirtuar la posterior electroforesis.
Una vez polimerizado totalmente el gel, se retira el peine con cuidado de no romper el gel concertador, ya que es muy frgil. El molde
se coloca en el aparato de electroforesis, tal y como se muestra en la figura. Una vez fijo, se aade el tampn de electroforesis en las
cubetas, teniendo en cuenta que en la de arriba debe entrar en contacto con el gel.
Preparacin de las muestras
Como ya hemos dicho, las muestras deben incubarse con el tampn de carga para desnaturalizarse, para ello seguimos esta lista:
Muestra: 60 l + 30 l de tampn de carga.
Fracciones: 60 l + 30l de tampn de carga.
Patrn: 25 l + 30 l de tampn de carga.
Todo ello en eppendorf, a calentar 5 minutos a 100 C para desnaturalizar las protenas y luego en hielo para mantenerlas
desnaturalizadas. Para que los eppendorf no se abran violentamente durante la incubacin se les hace un orificio en la tapa y se
cubre todo con parafilm, material elstico, con lo que dar de si y se hinchar, pero no estallar.
Cargado de las muestras en el gel
Una vez preparadas las muestras, las cargamos en el gel con este orden:
F3 PATRN F4 MUESTRA F5 F6 F10 F11 F12 F13 F14 F7
Una vez cargadas las muestras en el gel se desarrolla la electroforesis a una intensidad constante de 15 mA durante toda la noche.
Parar la electroforesis al da siguiente, cuando el azul de bromofenol est a 1cm del final del gel. Desmontarlo y ponerlo a teir.
Tincin del gel de protenas
Material
Solucin fijadora: etanol + actico + agua (en proporcin 5/1/5).
Solucin teidora: 0,1 5 de azul de Coomassie; 40 % de etanol, y 10 % de cido actico.
Solucin desteidora 7 % de cido actico.
Colocamos el gel de protenas, con cuidado de no romperlo, en un bandeja donde se aadir la solucin fijadora. ncubamos 30
minutos a 20 C con agitacin leve. Tras retirar el fijador, aadimos al solucin de tincin e incubamos durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Finalmente, retirar el teidor y pasar a desteir. Para acelerar el proceso de destincin aadimos unas bolitas
de papel de filtro, que absorber el azul de Coomassie. Esto se mantendr as hasta que las bandas de protenas sean claramente
visibles, en este punto, el gel est listo para ser secado sobre el papel W 3MM. Para ello se utilizar un secador de geles.
Resultados
Una vez teido el gel tena un aspecto similar al de la figura:
F3 PATRN F4 MUESTRA F5 F6 F10 F11 F12 F13 F14 F7
Determinacin de los pesos moleculares
4anda 1
(cm)
4anda 2
(cm)
4anda #
(cm)
4anda 2
(cm)
4anda 3
(cm)
4anda K
(cm)
Patrn 0,7 1,3 1,8 2,4 2,7 3,2
F3 0,7 1
F6 0,8 1
CENCAS BOLGCAS Y DE LA SALUD
BOQUMCA
LABORATORO
PRACTCA 1
H*ER+0*-*- ;,P*8AT*(A E; U, P&0*-A(AR*E& V;$;TA0 (A08*E&,)
PROF. VERONCA SOUZA ARROYO
ALUMNO:
ESPNOSA NERA ROBERTO
GRUPO
BC05
18 - JUN - 2002
NTRODUCCN
Almidn.
Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5), inodoro e inspido, en forma de grano o polvo. El almidn es el principal carbohidrato
de reserva en la mayora de las plantas. En las hojas el almidn se acumula en los cloroplastos, donde es un producto directo de la
fotosntesis. En los rganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos, en los cuales se forma despus de la translocacin
de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas.
En los vegetales, el almidn se encuentra en uno o ms granos amilceos en un plastidio. La cantidad de almidn en diversos tejidos
depende de muchos factores genticos y ambientales. El almidn se acumula a la luz del da cuando la fotosntesis excede las tasas
combinadas de respiracin y translocacin, despus parte de l desaparece por la noche.
Se presentan dos tipos de almidn en la mayora de los granos amilceos: amiloa y amilo!ectina, ambos compuestos por unidades
de d-glucosa unidas por enlaces -1, 4. Las uniones -1, 4 hacen que las cadenas de almidn se enrollen en forma de hlices. La
amilopectina consta de molculas muy ramificadas, cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el
C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces -1, 6). Las amilosas son ms pequeas y contienen de cientos a
miles de unidades de glucosa, numero que depende de la especie y las condiciones ambientales.
La formacin de almidn ocurre sobre todo por un proceso que implica la donacin repetida de unidades de glucosa provenientes de
un azcar nucleotidico similar al UDPG y que se denomina di"o"oglucoa de adenoina, ADPG.
Hidrlisis del almidn.
La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de
la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a monosacridos.
La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras
ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimas son una QBamilaa< QBamilaa A almid%n "o"orilaa: Al
parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y la almidn
fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria
enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando
productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un
disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los
puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan de9trina ramificadas con
cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un
elemento esencial.
La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia
con rapidez, por mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi
completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificacin. La
actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas
hidrolasas. Las reacciones hidrolticas no son reversibles, de modo que no se pueden detectar sntesis de almidn por amilasas. Las
amilasas estn diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que estn germinando, ricas en almidn. Es
probable que la -amilasa tenga ms importancia que la -amilasa para la hidrlisis de almidn. Gran parte de la -amilasa se localiza
dentro de los cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidn que atacara. Acta tanto en el da como por la noche aunque,
por supuesto, durante la luz de da hay produccin neta de almidn por la fotosntesis.
La amilopectina solo es degradada parcialmente por la accin del almidn fosforilasa. La reaccin procede de manera consecutiva a
partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones -1,6 de
las ramificaciones, por lo que de nuevo que dan dextrinas. La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo,
por eliminacin repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La almidn fosforilasa esta
ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difcil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidn en las clulas
de inters.
OBJETVO
Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maz hidrolizan al almidn, dando como producto final unidades de maltosa
siendo este uno de los mecanismos que la semilla utiliza para obtener energa necesaria para germinar.
El alumno estudiara las diferencias en la actividad amiloltica, dependiendo de los estados de germinacin en las semillas y de sus
requerimientos energticos.
Se aplicara el mtodo de Nelson-Simogy para la determinacin de reductores totales.
Determinaremos la actividad enzimtica de las semillas de maz, dependiendo de su tiempo de germinacin.
MATERAL
1 mortero
1 bistur
1 bao de agua hirviendo
6 tubos de centrifuga
5 pipetas graduadas de 10 ml
1 embudo de filtracin de 5 cm de dimetro
1 caja de Petri de 9 cm
1 tripi con tela de asbesto
1 mechero
25 tubos de ensayo de 15X150
1 centrifuga
1 espectrofotmetro
1 gasa
30 semillas de maz
METODOLOGA
La preparacin de las semillas de maz, se llevara a cabo cinco das anteriores a la prctica. Se desinfectaran 10 semillas de maz en
cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida; posteriormente las semillas las
pondremos a germinar en un frasco limpio, en el frasco se pondr una capa de algodn, las semillas, y se humedecer el algodn.
Despus el mismo procedimiento de germinacin se aplicara a otras cuantas semillas limpias pero tres das antes de la prctica.
Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maz de ningn da de germinacin; despus se seleccionaron un
par de semillas de 5, de 3 y 0 das de germinacin, entonces se les quita el embrin y el escueto, para que solo nos quede el
endospermo almidonoso. Una vez limpios los maces prepararemos un extracto enzimtico de los respectivos das de germinacin; lo
anterior se har macerando el endospermo de 2 semillas de 5 das de germinacin, en un mortero de con 5 ml de succinato con pH 5.
Se hizo el mismo procedimiento con las semillas de 3 y 0 das de germinacin, los productos obtenidos de los macerados se
colocaran en tubos de centrfuga, lavando el mortero con el amortiguador en cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm
durante 20 minutos. Despus de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo; para ser colocadas en los tubos numerados
del 7 al 12, segn la relacin del formato siguiente.
El ultimo paso de la practica ser la determinacin de los reductores totales, que se llevara a cabo con las diluciones de los extractos
enzimticos de la semilla de diferentes tiempos de germinacin; aqu se realizan las reacciones con los diferentes reactivos ( y ) y la
determinacin de azucares reductores totales que obtuvimos con la hidrlisis enzimtica del almidn; tambin realizaremos la curva
patrn. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla.
RESULTADOS
Anotaremos las lecturas espectrofotomtricas de cada tubo en la tabla siguiente.
TUBO
DENSDAD OPTCA (nm)
1 H H: H
2 H:HIK H:HJH H:HII
3 H:#GG H:212 H:2J23
4 H:2JG H:2J2 H:2J23
5 H:##J H:23J H:2JJ
6 H:2K2 H:3H3 H:2I23
Determinaremos la concentracin de maltosa en los tubos 1 al 6 correspondientes a la curva patrn, de acuerdo con la ecuacin:
(Volumen inicial)((oncentraci%n inicial) R (Volumen "inal)((oncentraci%n "inal)
(Tu)o 9)(3HH Qg/ml) R (Patr%n maltoa S Agua)( F )
Se anota la concentracin en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan las lecturas espectrofotomtricas
obtenidas en los tubos 1 a 6.
Tabla 1. VALORES PARA CURVA PATRON
TUBO
#
X Y
[Maltosa g/mL]
Densidad
ptica
(520 nm)
1 H H
2 123 H:HII
3 ###:## H:2J23
4 G3H H:2J23
5 2HHH H:2JJ
6 H H:2I23
Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y. Debido a que los datos se presentan como una recta, se ajustan de ser
necesario.
En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de densidad ptica de los tubos problema (7-12).
DAS
TUBOS
PROBLEMA
DENSDAD OPTCA
(nm)
MUESTRA DUPLCADO MEDA
0 7 1:22J H:I## 1:H#1
0 8 H:JJH 1:21I 1:1H2
3 9 1:232 H:JIJ 1:12H
3 10 H:I22 1:1HK H:JG3
5 11 1:HG1 1:2HH 1:1#33
5 12 1:112 1:1K2 1:1#J
Tomando en consideracin los datos de la curva patrn donde Y ha sido corregida Y y recordando nuevamente que ARH:HIG#9B
H:HK21; se calcula la concentracin de maltosa de los diferentes das de germinacin.
Los datos se registran en la siguiente tabla.
TUBO # DAS [MALTOSA Qg]
7 0 H:H2GJ
8 0 H:H#22
9 3 H:H#3K
10 3 H:H2#H
11 5 H:H#GH
12 5 H:H#G#
En la siguiente grafica se encuentra la concentracin de maltosa por los das de germinacin de las semillas.
DSCUSN
En esta prctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados. Creemos que nuestros resultados hubieran estado
ms precisos si la extraccin del almidn no hubiera presentado algunas dificultades para obtener el endospermo. Esto lo pensamos
ya que en las semillas de 0 y 3 das el endospermo presentaba partes ms duras, que hacan ms difcil la extraccin total.
Otra cuestin a destacar, es la parte en que hacemos la segunda incubacin (reactivo 1), pues por un descuido el agua hirvi y se
derramo un poco, provocando que a algn tubo le entrase agua y alterara una absorbancia; esto se nota pues el mismo nmero de
tubo pero del duplicado da una lectura ms coherente.
Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad enzimtica en la semilla es mayor si el tiempo
de germinacin es mayor.
CONCLUSN
En esta prctica se esperaba y se observo la actividad enzimtica de la amilasa sobre el almidn. Observamos que al tener ms
tiempo de germinacin una semilla, mayor es la actividad enzimtica de la amilasa. En los granos de cero das se manifest una
actividad de la enzima muy baja, despus existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres das y por supuesto que la
mayor actividad se registro en las semillas de 5 das. Todas estas reacciones nos dejan una produccin de maltosa, por accin de la
hidrlisis enzimtica de la amilasa sobre el almidn; esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho, sera porque haba mucho
almidn para hidrolizar y poder producir maltosa.
En resumen y conclusin, la actividad enzimtica es directamente proporcional a la produccin de maltosa, todo esto con respecto a
los das de germinacin que tengan las semillas (entre mas das de germinacin tenga las semillas, mas almidn habr, entonces, la
actividad enzimtica ser mucho mayor.)
CUESTONARO
1.- CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMDON?
3
2.- QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR?
Cuando en una determinacin cuantitativa de los monosacridos se realiza frecuentemente, basndose en su observacin en
disoluciones alcalinas mediante Cu2+, Ag+ o ferricianuros, se origina una mezcla de azucares -cidos. Los azucares son capaces de
reducir, a tales oxidantes se les denomina azucares reductores.
Se puede definir tambin a un azcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un grupo carbonio y es susceptible de
participar en otra oxidacin.
3.- QUE TPO DE ENLACES HDROLZAN LAS AMLASAS?
-Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa
-Amilasa, (14) glucan maltodeshidrogenasa
4.- QUE AMLASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANSMOS ANMALES?
-D-glucopiranosa
-Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa
BBLOGRAFA
-A0*-4URT< 4: 5RA,U
Fisiologa Vegetal, Ed. beroamericana, 1994.
MATHEWS, C. K. Y VAN HOLDE, K. E.
Bioqumica, McGraw Hill nteramericana, 2. Ed., Espaa, 1998.
BRTNNCA CD 2000 DELUXE
Encyclopdia Britannica, nc.
WHTE, A., HANDLER, P., SMTH, E., HLL, R., LEHMAN, R.
Principios de Bioqumica, McGraw Hill, 1989.
MCROSOFT EXCEL 2002 (10.2614.2625)