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AGRADECIMIENTOS
A DIOS, que me ha dado la vida y me ha permitido conocer su creación. A mi alma mater, la UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO, ya que gracias a esta noble institución pude terminar una carrera. A todos los profesores de la Preparatoria Agrícola y principalmente a los del Departamento de ingeniería Agroindustrial, que generosamente han brindado su tiempo y esfuerzo para la educación en la Universidad Autónoma Chapingo. También porque les debo la formación y conocimientos que ahora tengo y que me servirán para toda la vida. Al M.C. Armando Santos Moreno, por su acertada dirección en esta Investigación y por todas sus aportaciones. Al Ing. José Alfredo Espejel Zaragoza, I.B.Q. Félix Esparza Torres, Dr. Arturo Hernández Montes y M.C. Abraham Villegas de Gante por la revisión y aceptación del presente trabajo de tesis. A Don salva, doña viky, Alvaro, Olivia, Alejandra, Diego, Blanca, Roberto, Salvador por dejarme ser parte de su familia y brindarme su apoyo. A José Luis por su apoyo, por su amor, compresión y paciencia. A Margarita García Velasco por el gran apoya brindado desde el inicio de nuestra carrera, por su amistad y por su apoyo incondicional. A mis amigos: Ana Laura, Sonia, Sayra, Lucía, Alonso (ponchin) y Brenda por su amistad y apoyo incondicional. A Mauricio por su apoyo incondicional en el laboratorio para el desarrollo de este proyecto. A todas esas personas que en algún momento fueron parte de mi vida durante mi estancia en Chapingo.

Gracias a todos

Abigail e Isabel por su incondicional amistad. por su amor. Lucía. su cariño. por compartir conmigo una feliz infancia y porque siempre estuvieron en el lugar preciso y el tiempo suficiente.e. por motivarme a seguir superándome en todo momento y darme la herencia más grande que pueda haber en este mundo “el estudio”. Elena. por sus consejos. A mis hermanos: Elisa. Macaria Tapia Ortega y Silvano Catalán Bonilla con el inmenso amor que les profeso y ser un constante ejemplo de amor.DEDICATORIA A mis PADRES. Alonso. A Ing. lucha . Sinceramente: Olivia . Elideth. José Luis Gallardo Salazar. los quiero mucho. Mireya. Brenda. por trasmitirme sus sabios consejos.d. confianza y cariño. Sonia. Silvia. por enseñarme a valorar la vida. Arturo. Luisa.p. Ana Laura. Ladislao y Aldo. Sayra. sin ustedes no hubiera podido. A mis abuelitos: Norberta Ortega y Salomón Tapia Guerrero (q. Yaretzi.). cariño y por darme una madre maravillosa. A mis mejores amigas (o): Margarita. nobleza y por apoyarme en los momentos que más necesite.

................ .............................................1.3........ 2................... 2.....2.............. Definición de Leche . 3 Leche pasteurizada........... .......................... 9 Fosfatasa ácida................. iii LISTA DE FIGURAS .............................................................................................CONTENIDO Pág... 2....................................... vi I........................................ 2........6.............. i .......................................3.......................................................................... 16 Calidad de la leche ............2.. 2............................... ............................................ i LISTA DE CUADROS ......................................................................................... 4 Yogur ..............................................3................. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................ 7 2..... 15 2................... Enzimas de la leche.3.........................................1................1.........................2......3............... 18 pág............................................................................. Prueba de la fosfatasa...................1...... 13 2.............. 1 II........................5..................2..... INTRODUCCIÓN ................................................ 2..................... 11 Importancia de las enzimas en la leche ...........................................................................4........................................ 2 2......................................... 2 Leche cruda .......2............................................................... 2................................3............................................................................... 2...................... 10 Fosfatasa alcalina..............1.............4. iv RESUMEN ............................ 16 Pasteurización de la leche ........................... 6 Queso .......................................................................7..... Productos lácteos............. .................................................................................................2.......................... 14 El paquete lacto-Zyma II .... v SUMARY .................1.....................................................2..................................................... 2............ 2....1.... CONTENIDO ................................................................................................................... 4 2...................................................... Espectrofotometría .......... 5 Crema ..................................................................................... ........... 2....................................................................................................

........................... 7.. III........................................... 61 4................................................................. LITERATURA CONSULTADA ....... ii ................Diagrama de proceso de la crema...... ............. Manual para la determinación de fosfatasa residual en leche y productos lácteos según la NOM-243-SSA1-2010...................................................................................... 24 Análisis para la sustitución de la solución (B......... Fosfatasa residual con el Método de Aschaffenburg y Mullen ...........Diagrama de proceso de pasteurización de la leche.....................................Q............................ 23 Lácteos utilizados .. 6....................................................……….... 6.............................. .... 62 5.......................................... 28 7....................... 28 método de la NOM-243-SSA1-2010 ................................................7.................................. 6.........................1..........Pág........................................... 23 Ubicación del trabajo ..................C...........................Diagrama de proceso del yogur.............................)............................................................................................................2..…………22 V....4................... 25 Interpretación de los resultados de los productos analizados con el ............ 23 VI...1.......................... 35 X.......... METODOLOGÍA ......................................................................... ...2...... 23 Materiales ................................................. Tipos de pasteurización ..............3...........3............................... 2.......60 3.............................................................................. .. JUSTIFICACION ..................................................... 24 Métodos aplicados ........... 32 Comprobar la utilización de los métodos ...... 34 IX.................................. ... 33 VIII...... 40 2........................................ IV................. 19 ANTECEDENTES ....... 6.....................1...........5...................................................................... 39 1............................... CONCLUSIONES ............................ 21 OBJEIVOS………………………………………………………………………................ 63 pág............ 7.... 6................................. 24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................. VII..................Diagrama de proceso del queso………………………………………….....…........................ ANEXOS..................................

................................ Concentración en de crema de la Unidad Tecnológica Lechera............. 31 Cuadro 14............... .................................LISTA DE CUADROS Pág.............................. ................................... 18 Cuadro 5.......... 29 Cuadro 10.... .............. 33 pág.............................................. Concentración en de leche ultrapasteurizada de la marca .................... 11 Cuadro 4................ Concentración en de yogur de la Unidad Tecnológica Lechera.............. 31 Cuadro 15........................ 28 Cuadro 8................ Tipos de crema y algunos parámetros............................ .......... Cuadro 1.................. . iii . 26 Cuadro 6... Límite máximo de fosfatasa residual............ Datos obtenidos de los tubos de la curva patrón............. Límite máximo según la NOM-243-SSA1-2010 e interpretación de resultados..................................... 27 Cuadro 7................................. ...................... Concentración de de leche cruda proveniente de la Unidad Tecnológica Lechera………......... ................. .......... ....... ................................... 28 Cuadro 9................... Concentración en de queso panela comercial............... Datos de la curva patrón del fenol y p-nitrofenol........... 32 Cuadro 16.......................... Resultados con diferentes concentraciones de fenol para elaboración de la curva patrón......... Características de la fosfatasa alcalina en le leche................................................ 30 Cuadro 12............................ Clasificación de los quesos............ .............................. ........ ......... 29 Cuadro 11................................Concentración en de leche pasteurizada proveniente de la Unidad Tecnológica Lechera. Concentración en de yogur de la marca comercial LALA.................... ............................. Resultados de obtenidos con los diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II............... 30 Cuadro 13............................... 6 Cuadro 2...... 8 Cuadro 3.....

. Concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II............ 27 Figura 4............. .................. 5 Figura 2............................. .................. Figura 1: productos derivados de la leche.......................... ...LISTA DE FIGURAS Pág.......................................... 26 Figura 3: Gráfica de curva patrón........... ........................ Curva patrón de p-nitrofenol................................ iv .................................................................... 32 pág.....

v . Universidad Autónoma Chapingo. pág. Armando Santos Moreno2 RESUMEN Tradicionalmente se han empleados pruebas colorimétricas cualitativas para determinar la pasteurización de la leche y sus derivados. Se realizó una investigación sobre dos métodos específicos de análisis que se realizan para verificar los procesamientos térmicos en las leches y en productos lácteos. Finalmente por medio de la distribución de t-student se determinó si los resultados de ambos métodos producían resultados similares. La prueba de la fosfatasa alcalina. En la actualidad se requiere de un método capaz de señalar de manera más exacta si la leche y/o sus derivados fueron sometidos a un proceso de pasteurización adecuado. con la finalidad de que puedan ser consideradas e implementadas por los pequeños productores lecheros. 1 2 Egresada del Departamento de Ingeniería Agroindustrial. Universidad Autónoma Chapingo. según la NOM243-SSA1-2010 y la segunda metodología corresponde al método Aschaffenburg y Mullen. El presente trabajo tuvo como propósito elaborar un manual para el análisis cuantitativo y cualitativo en la determinación de la fosfatasa residual en leche y en productos lácteos. leche y productos lácteos. es un método efectivo para verificar la pasteurización al término del proceso. PALABRAS CLAVES: fosfatasa alcalina. pasteurización.MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010. Olivia Catalan Tapia1. Profesor investigador del Departamento de Ingeniería Agroindustrial. La primera metodología está enfocada a la prueba de la fosfatasa.

Finally through the distrubution of t-student was determined if the results of both methods yielded similar. The phosphatase alkaline test is an effective method to verify pasteurization at the end of the process. An investigation was carried out on two specific methods of analysis to be performed to check the thermal processing on milk and dairy products.milk and dairy products. vi .MANUAL FOR THE DETERMINATION OF PHOSPHATASE ALKALINE IN MILK AND DAIRY PRODUCTS ACCORDING TO LA NOM-243-SSA1-2010 SUMARY Tests have traditionally been used to determine the qualitative colorimetric pasteurization of milk and derived. Actually a method is required to be able to point out in a more accurate if the milk and/or its derivatives were subjected to proper pasteurization process. pág. The purpose of this study was to develop a handbook for quantitative and qualitative analysis in the determination of residual phosphatase in milk and dairy products. KEYWORDS: Phosphatase alkaline. The first methodology is focused on the Phosphatase Test according to NOM-243-SSA1-2010 and the second methodology corresponds to the methods Aschaffenburg and Mullen. in order that they may be considered and implemented by small dairy producers. pasteurization.

pág. conservación. Ya que esta enzima se inactiva a temperatura de pasteurización. es sometida al procesamiento. Durante la fabricación de los productos lácteos. esta propiedad la convierte en el indicador de elección para comprobar que el tratamiento ha sido el adecuado. la leche cruda puede diferenciarse de la leche pasteurizada por determinación de la fosfatasa alcalina. ya que la deficiencia en la pasteurización puede generar graves consecuencias en la salud de los consumidores. Además de las determinaciones físicas. garantiza la salubridad y calidad del producto tanto de consumo nacional como de exportación. Sin embargo. en virtud de sus componentes. el interés por el monitoreo de la eficiencia de la pasteurización de la leche y sus derivados. transporte y distribución se apliquen procedimientos adecuados destinados a garantizar su calidad e inocuidad (Arroyo. El objeto de este proceso térmico es.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 I. en primer lugar. de acuerdo a la inactivación de determinadas enzimas que de forma natural se encuentran en la leche. La efectividad de los tratamientos térmicos a los que se somete la leche. En este caso nos referimos a la pasteurización. 1 . es necesario que durante su obtención. debería ser en el país de gran importancia. INTRODUCCIÓN La leche. destruir los microorganismos que puedan ser causantes de enfermedades para el consumidor y en segundo término. químicas y microbiológicas se deben realizar otras determinaciones para conocer la efectividad de los tratamientos térmicos de pasterización. debido también a esa característica es altamente susceptible a la contaminación y al deterioro por lo que. 1997). a efecto de que este producto reúna y conserve cualidades físicas. La leche una vez seleccionada bajo estrictos parámetros de calidad. constituye uno de los alimentos más completos desde el punto de vista nutritivo. Por eso. disminuir el número de aquellos agentes microbianos que puedan afectar la calidad de la leche y sus productos. químicas y microbiológicas suficientes para ser considerada segura para su consumo.

1993). 1997). pág. que pueda ser aplicado por medianos y pequeños productores. la cual debe ser sometida a tratamientos térmicos que garanticen la inocuidad del producto (SECOFI. II. Estructuras de reserva. Desarrolla la función de proteger a la leche del ataque de los seres vivos distintos a los críos de la especie. La leche está compuesto por un 87 a 88 % de agua. Estructuras funcionales.) (Santos y Villegas. Definición de Leche La leche. fosfolípidos. pasteurizada y ultrapasteurizada. en leche y productos lácteos (Leche cruda. vitaminas A.D. A la leche la componen tres grandes estructuras. es la secreción de las glándulas mamarias de las vacas sanas. REVISIÓN DE LITERATURA 2. carotenoides.5 % de grasa. 2 . etc. formando lo que se llama “micela”. un 3 a un 3. o sea que debe contener de un 13 a 12% de sólidos totales.E y K. excluida el calostro. 1.1. Estructuras de protección. La NOM-243-SSA1-2010 define como leche a la secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas sanas o de cualquier otra especie animal. 3.5 % de proteína y un 4 a un 6% de carbohidratos como la lactosa y minerales tan importantes como el calcio (Luquet. Están compuestas principalmente por lípidos o grasa butírica (acilgliceroles. proteína de la leche que se unen por medio de fosfatos de calcio y magnesio (en menor cantidad).ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La tesis “Elaboración de un manual para la determinación de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lácteos según NOM-243-SSA1-2010” tiene como objeto desarrollar una metodología entendible para el análisis de fosfatasa residual alcalina. 2005). Están compuestas por caseína. Estos sólidos totales están compuesto normalmente entre un 3 y 3. 2. crema y queso). se excluye el producto obtenido quince días antes del parto y cinco días después de éste o cuando tenga calostro. de tal manera. colesterol.

ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La importancia alimenticia de la leche y los productos lácteos radica en su composición fisicoquímica. pág. 2. actividad del agua. Manipularse (ordeño. su alta digestibilidad.g. etc. 1993). Para ello la leche debe: Provenir de animales exentos de brucelosis y tuberculosis (enfermedades transmisibles del animal al humano) dentro del cuadro de la profilaxis colectiva obligatoria. por lo tanto cuando los microorganismos patógenos y los adulterantes alteran o contaminan su composición fisicoquímica provocan una disminución de la calidad. la lactasa. Leche cruda La leche cruda es un producto que no ha sufrido ningún tratamiento de saneamiento que le permita asegurar una mejor conservación. envasado. En la leche. alto aporte nutritivo y energético. La apreciación. por ejemplo: la temperatura.1. la fuerza iónica. la evaluación de la calidad de la leche cruda es indispensable para fines concretos. estas son de origen microbiano. o propias del alimento (v.1. Los principales agentes causantes del deterioro de la leche son los microorganismos y las enzimas. A su vez la actividad microbiana y enzimática es afectada por diversas variables fisicoquímicas del alimento o de su entorno. las lipasas y proteasas). en la calidad de sus proteínas y carbohidratos. el pH. la humedad relativa ambiental. 3 . De explotaciones bien establecidas. almacenamiento) en condiciones higiénicas satisfactorias (Luquet. su contenido de calcio vitaminas. Su producción y su comercialización deben ser severamente controladas para evitar los riesgos que pudiesen ocasionar en la salud de los consumidores. por ejemplo:  La pertinencia de su empleo para elaborar productos seguros (inocuos) para el consumidor. o mejor.

2003). Otra categoría la forman los derivados de leche. constituyendo un peligro al consumidor. Los derivados lácteos son una gama de productos que se obtienen al someter a la leche a determinados procedimientos tecnológicos. leche deshidratada. ya que pág. 2. leche en polvo. a través de mezclas materiales contaminados. una leche UHT.2. equipos defectuosos. requesón. según su calidad: composicional. produciendo de esta manera una recontaminación. contacto con las manos o ropa de los operarios. etcétera (SECOFI. Todos tienen normas oficiales que les definan y especifican sus características y métodos de control. 2. por lo que es necesario practicar pruebas que nos permitan evaluar si hubo recontaminación y poder así evitar o reducir el riesgo al mínimo (OMS. o cajeta). crema. mantequilla. La NOM-155-SCFI-2012 define la leche pasteurizada como la que ha sido sometida al proceso de pasteurización. los microorganismos pueden llegar a ella directa o indirectamente. postres basados en leche. 1997). después de una pasteurización adecuada de la leche. Sin embargo. helados. entre ellos están la leche evaporada.1. sanitaria y tecnológica (Villegas y Santos. Los productos lácteos son los productos alimenticios elaborados total o parcialmente con leche. entre ellos los quesos. Productos lácteos. Leche pasteurizada. yogur.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010  La selección de la leche para elaborar productos lácteos concretos. deben de cumplir con características microbiológicas establecidas en las normas sanitarias.  El pago de la leche.2.g. Al igual que la leche. Un yogur. exposición a estornudos y tos o por caída de gotas de agua contaminada.1960). estandarizada o no. como materia prima. 4 . para cumplir con las especificaciones descritas en esta norma. según las exigencias del producto y el proceso (v.

y teniendo como resultado la reducción del pH. y que debe cumplir los requisitos Mexicana vigente (SECOFI. los tres principales derivados: queso. 2. Yogur Es un alimento que contiene fermentos vivos. pág. Badui 1990). 1999). obtenidos por la coagulación de la leche pasteurizada de vaca. yogur y crema se representan esquemáticamente en la figura 1 (Alais. Leche entera y descremada. estandarizada o no. 2001. pasteurizada. 1991). 5 de la Norma Oficial . por medio de la acción de microorganismos Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus. 2000). La lista de los productos lácteos y de los productos derivados de la leche aumenta cada día. debido a la fermentación ácida-láctica con Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus.1. La NOM-181-SCFI-2010 define yogur como el producto obtenido de la fermentación de leche.2. ultrapasteurizada (UHT) En polvo entera y descremada Condensada azucarada leche Yogur Kefir Yakult Otros: Helados Dulces Mantequilla Caseinatos Evaporada Figura 1: productos derivados de la leche (Fuente: Badui.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 estos productos derivados de la leche son consumidos por la sociedad y debemos de asegurar la salud del consumidor (Oria.

ya sea industrial o artesanal. Crema Se entiende por crema. 2. el proceso de obtención debe ser higiénico. además de someterse a la pasteurización antes de ser puesta en venta y conservarse a temperatura máxima de 6°C la crema se clasifica por el contenido de grasa como se presenta en el cuadro 1. Es en efecto.5% <10% <12% ÁCIDEZ EN ÁCIDO LÁCTICO < 1% 2-5% <1% <1% Fuente: Claveran. transformado incluso en un alimento peligroso para el consumo (Tamime y Robinson.5% <a 7. 1989.2. La incorporación de estos microorganismos garantiza la producción de características agradables y beneficiosas. entregan un producto sabroso y además contribuyen a la buena salud de las personas que lo consumen. Cuadro 1: Tipos de crema y algunos parámetros. ultrapasteurización. sometida al proceso de pasteurización. La crema es la parte de la leche en la que se ha reunido la mayor cantidad de grasa por medio de centrifugación y separación después del reposo. pág. En la elaboración del yogur. al alimento en el que se ha reunido la mayor parte de grasa de la leche. una leche enriquecida en grasa (SECOFI. TIPO Crema tradicional Crema ácida Media crema Crema ligera GRASA (MÍNIMO) 30% 30% 20% 14% VALORES SÓLIDOS NO GRASOS < a 7. se debe tener sumo cuidado con los procedimientos higiénicos de elaboración. 6 . ya que si no se respetan reglas básicas de higiene se puede alternar notablemente el producto final. 1991). sobre sus características organolépticas y lo más importante sobre la inocuidad del producto. ya que prolongan la vida útil de la leche. esterilización o cualquier otro tratamiento que asegure su calidad sanitaria. debe proceder de leches limpias.2. 2000). ya sea por reposo o por centrifugación.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 El yogur es el producto de la acción controlada de microorganismos. principalmente sobre el azúcar de la leche (lactosa) que es transformado a ácido (ácido láctico) y también sobre las proteínas que juegan un papel importante en el accionar de los microorganismos.

mantener esa temperatura durante un máximo de 5 minutos y después enfriar rápidamente a la temperatura de envasado (SECOFI. 1993). Al ser muy energética y una fuente de grasas principalmente saturadas. en presencia de ácido láctico producido por microorganismos agregados o propios de la leche.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La crema es un producto que se digiere y asimila más fácil que otras grasas animales y representa una fuente importante de vitamina A (10 veces más que la leche entera). calentamiento y/o prensado con subsecuente moldeado. es decir. La pasteurización de la crema consiste en elevar la temperatura hasta 85 a 90 °C. 1965. pág. Esas condiciones son: el contenido de humedad de la cuajada. citado por Villegas. 7 . (Davis. 2. La crema contiene por lo menos entre el 12 % y el 30 % de grasa.2%. la leche entera. prensado. La materia prima de elección para la elaborar crema es aquella que contenga mayor contenido de grasa. mientras que la leche contiene como promedio un 3. afinado y conservado en condiciones convenientes. 1991). La enorme variedad de condiciones a que puede someterse la cuajada obtenida de la leche hace posible producir un número casi infinito de quesos. debe ser consumida con moderación.3. el contenido relativo de proteínas y grasas. las combinaciones de temperatura a que puede someterse la cuajada al madurar y los microorganismos inoculados en ella (Luquet. del cual una parte de la humedad es eliminada por corte de la cuajada. Queso El queso es el producto resultante de la coagulación de la leche de ciertos mamíferos mediante la renina (presente en el cuajo) o enzimas similares. Como en el caso de la fabricación de yogur. los controles de recepción de la leche son la clave para la calidad del producto que se obtenga.2. 2002).

CLASIFICACIÓN QUESOS Frescos Frescales De pasta cocida. pág. Gouda. Fresco. y esto depende de varios factores: Temperatura. Blanco. Prensados. Acidificados Quesos de suero Panela. Manchego. Prensados de pasta dura. salado. Adobera. 8 . Camembert. Los quesos de larga maduración y prolongado almacenamiento permiten que con el transcurso del tiempo mueran las bacterias patógenas. Brick. Cuadro 2. Broccio. Nuefchatel. Durante este periodo de almacenamiento mueren algunas bacterias patógenas que pudieran estar presentes en la leche (Helen. Petit Suisse. y la subsiguiente liberación de agua en forma de suero. Geitmysost. Madurados. Edam. etc. Ricotta. Adobado. Enchilado. Clasificación de los quesos. Ranchero. si la leche usada para hacer queso contenía patógenos. El contenido de agua disminuye en un 87% durante el procesamiento de la leche cuando se transforma en queso lo que determina la dureza y las propiedades de conservación del queso. Crema. Asadero. Doble crema. Canasto. pero los quesos de vida breve y los quesos blandos pueden contener aún patógenos viables. Cotija. Recuit. Picotón. pH y la manera como se corta la cuajada. Chihuahua. Zinder. (Gary. Danablu. Sierra. Cheddar. Añejo. Limburgo. Gruyere. Requesón. Reggianito. Con mohos Procesados Fundidos Fundidos para untar Fuente: NOM-243-SSA1-2010. 2004). Los quesos hechos de leche no pasteurizada deben madurar por lo menos 60 días a una temperatura no menor de 35ºF = 2ºC. Mejetle. Mysost. Schottenezinger.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La fabricación del queso consiste en la coagulación de la leche y su conversión en una dispersión coloidal en un gel conocido como cuajada. Parmesano. Brie. La NOM-243-SSA1-2010 clasifica los quesos como se presenta en el cuadro 2. Del Morral. Cottage. Roquefort. Oaxaca. 1988). Cabrales. Chester. Gyetost. Azul. Broccotle. Mozzarela. Cerrase.

ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 2. lisozima y tal vez laribonucleasa.g. la catalasa. especialmente lipoproteína lipasa (rancidez hidrolítica). por ejemplo. con las cuales floculan generalmente. Fosfatasa alcalina) (Walstra et al. entre las enzimas que son nativas. calatasa. Detección de mastitis por medio de la catalasa) o indicadores de calidad (v. 2007). γ-glutamiltranspeptidasa. plamina (proteólisis .   Cambios deseables en productos lácteos. en la leche pueden encontrarse enzimas de origen microbiano.g. especialmente la mastitis (v. 9 especialmente la fosfatasa alcalina . ni porque se encuentran en grandes concentraciones. Índices de historia térmica de la leche. La leche contiene varias enzimas relacionadas con el grupo de las albúminas. se incluye también las que contienen los leucocitos. o que son liberadas al medio después de su lisis.3. Otras enzimas se utilizan con fines analíticos (v. ya sea benéfico o indeseable. plamina. Las enzimas nativas en la leche son de gran importancia. etc. Algunas enzimas presentan actividad antimicrobiana o ejercen otras funciones beneficiosas (v. sabores desagradables). Deterioro de la calidad del producto. 2003). 2001). que son secretarias por microorganismos (como las proteinasas y lipasas). fosfatasa ácida (modificación de la caseina). (Santos. lactoperoxidasa. Algunas de estas enzimas se encuentran en la membrana de los glóbulos de grasa. pág. ect. las fosfatasas. entre ellas están las reductasas aldehídicas. plasmina.g. Entre las más importantes características son:    Índices de salud del animal. . v. Otras floculan con las caseínas a pH 4. por ejemplo. Absorción de los componentes de la leche a nivel intestinal cuando termina la lactancia). por tanto son arrastradas por la crema. las proteasas.6. xantina oxidasa (rancidez oxidativa). Muchas de las enzimas de la leche no parecen tener alguna función biológica. La leche contiene muchas enzimas. catalasas. es decir producidas por la glándula mamaria. lipoproteína lipasa. Enzimas de la leche. Además.g. fosfatasa ácida y antina oxidasa en quesos madurados. lactoperoxidasa . Efectos de protección. NAcetil-β-D-Glucosaminidasa).g.g. v. (Fox.

se encuentra. o no (Santos.      pH óptimo: 4. Esta fosfatasa. su pH de actuación le permite intervenir en la evolución de las cuajadas ácidas de quesería (Veisseyre. pero su mayor estabilidad al calor. Sin embrago. La fosfatasa ácida tiene un interés tecnológico limitado. ya que no se desnaturaliza a 88°C.6-4. 1995). . Es muy termorresistente ya que soporta el calentamiento a 88°C durante 30 minutos. su inferior pH optimo y su capacidad de desfosforilar que la fosfatasa caseínas puede hacer más importante tecnológicamente (Fox. La fosfatasa ácida cuya concentración en la leche representa el 10% de la concentración de la fosfatasa alcalina.glicerofosfato se hidroliza lentamente. 2003). como la fosfatasa alcalina. está asociada a la membrana del glóbulo de grasa y es termorresistente.y .6-4. Aunque la actividad de la fosfatasa ácida es mucho menor que la fosfatasa alcalina. La enzima no es activada por Mg2+ (como la fosfatasa alcalina). 2. pág. cuyo pH óptimo es 4. La fosfatasa ácida tiene un máximo de actividad a un pH entre 4. Esta observación se confirmó por Mullen (1950).ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La leche contiene dos enzimas que hidrolizan a los ésteres fosfóricos.8. Fosfatasa ácida. El nivel de actividad de la fosfatasa ácida en la leche es sólo alcalina. 1998). aun durante 30 minutos. se activa ligeramente con el Mn2+ y es inhibida de manera muy eficaz por F-. Quien reporta muchas de estas características. asociada a la membrana del glóbulo graso. p-nitrofenilfosfato fue el mejor sustrato evaluado. La presencia de la fosfatasa ácida en la leche fue reportada por primera vez por Huggins y Talalay (1948). 10 .1.0 en fenilfosfato como sustrato.3. La fosfatasa alcalina es importante desde el punto de vista tecnológico de la leche porque revela si la leches ha pasteurizado. Temperatura óptima no se reporta pero aumenta linealmente su actividad entre 14 y 50 °C.8.

CARACTERÍSTICAS CONDICIONES pH óptimo Caseina 6. pH 9 Fuente: Fox. pH 9 63°C. 2003 27. EGTA. la inhiben (Santos. La fosfatasa alcalina es una glicoproteína presente en la leche.6 y es sensible al calor pues se inactiva a 62°C durante 15 minutos o a 72°C durante 15 a 20 segundos.69 mM en p-nitrofenilfosfato Ca2+. La fosfatasa alcalina es una glicoproteína que contiene ácido siálico. necesita la presencia de iones magnesio y zinc. 11 .Mg2+ Quelantes metálicos (EDTA. a 72 °C por 30 segundos y a 78°C por 20 segundos (Vignola. el yodo y la cisteína. su pH óptimo es de 9.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 2.2 min 8. 2002). a 70°C por 1 minuto. En el cuadro 3 se muestra más detallada las características de esta enzima. Los iones 2 2 2 2 y la activan y los iones .3 min 170 kDa 4 mol mol-1 pág.2.3. Fosfatasa alcalina.) Ortofosfatos Peso molecular Contenido de Zn Estabilidad térmica Valor D a 60 °C.Co2+.Mn2+.8 p-nitrofenilfosfato 9. Cuadro 3. ect. 2007). La desnaturalización de esta enzima puede ser por calentamiento a 60 °C por una hora.Zn2+. se activa a un pH alcalino entre 9-10. Características de la fosfatasa alcalina en le leche.65 p-nitrofenilfosfato 10 Temperatura optima KM Activadores Inhibidores 37 °C 0.

cataliza la hidrolisis de los monoesteres de fosfato. pág. 1988). aunque no todas. 1988).. es liberada de la membrana del glóbulo de graso y se dispersa en la fase acuosa. 2001). La inactivación de la enzima garantiza que todos los microorganismos patógenos (al menos los que pueden crecer en la leche) han sido destruidos durante el tratamiento térmico. por tanto. encontrándose modificada (Veisseyre. y de la lactoperoxidasa para los tratamientos más severos (Walstra et. se utiliza también como principal indicador de un eficiente tratamiento en la pasteurización de la leche. La determinación de la actividad enzimática mediante el “test de la fosfatasa alcalina” se utiliza habitualmente como el control de la pasteurización de la leche. el test de la fosfatasa es menos sensible cuando se realiza sobre leche descremada (Walstra et al. Esta fracción. La fosfatasa alcalina no es tan sólo de interés fisiológico en la secreción de la leche. 12 . también la mayoría. durante el calentamiento. La eficiencia de la pasteurización de los productos lácteos es comúnmente evaluada por la prueba de la fosfatasa alcalina (Mistry. El mecanismo de reactivación ha sido estudiado por numerosos autores. Solamente puede observarse la restauración de una fracción de la fosfatasa alcalina (isoenzima ).ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La fosfatasa alcalina. al. La pasteurización de la leche ha sido reconocida ya que es un proceso necesario en la obtención de productos lácteos libres de microorganismos patógenos desde hace más de 60 años y ha sido obligatoria para la protección de los consumidores.. La mayor parte de la enzima está en la membrana de los glóbulos grasos y. La norma NMX-F-368-1983 menciona que “La fosfatasa es una enzima normalmente presente en la leche cruda. 2001). Puede conocerse la intensidad de la pasteurización mediante la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina en el caso de la pasteurización baja (HTST). las bacterias láctica y las bacterias Gram-negativas se destruyen en la pasteurización.

2007). de la leche (Santos. puesto que se inactiva mediante el calentamiento suficiente para la destrucción de Mycobacterium tuberculosis. aunque limitadas. especialmente en la nata (debido a su elevado contenido de fosfatasa). Importancia de las enzimas en la leche La importancia tecnológica de la fosfatasa alcalina radica en su uso en el control de la pasteurización de leches y cremas. las proteasas provocan la hidrólisis de las caseínas. La importancia de las enzimas radica en cinco propiedades principales: 1. Hay muchas enzimas que no se reactivan y otras lo hacen muy lentamente. las lipasas son el factor de rancidez. 5. por ejemplo.. Algunas enzimas tienen actividad bactericida y por ello constituyen una protección. que se caracteriza por la reaparición de la actividad de la enzima (Santos.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La reactivación consiste en que la enzima que ha sido inactivada por el calor.3. 13 . etc. Su sensibilidad al calor permite controlar las temperaturas de pasteurización de la leche. 2007). La cantidad de algunas enzimas depende del número de leucocitos o bacterias que se encuentran en la leche. y también la lactoperoxidasa (Walstra et al. El contenido de enzimas no es el mismo para todas las leches. de esta manera. 3. vuelve a su forma activa después del enfriamiento. esta característica podría aprovecharse para distinguirlas pero en la actualidad no se utiliza. 2. 2001). Algunas son factores de degradación que tienen importancia tecnológica. pueden obtenerse datos acerca de la calidad higiénica de la misma. Como ejemplo de las enzimas que se reactivan puede mencionarse la fosfatasa alcalina.3. sin embargo. que experimenta una reactivación parcial a los pocos días del tratamiento térmico. pág. esta prueba no es muy exacta debido al fenómeno de reactivación. 4. 2.

Pero el más utilizado es el fenilfosfato disódico.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 2. también la mayoría. La presencia de esta enzima termosensible de la leche indica un proceso insuficiente de tratamiento térmico (v. los de leche cruda puede diferenciarse de los de leche pasteurizada por determinación de la fosfatasa alcalina. 1991). Esta técnica puede aplicarse a la mantequilla y a los quesos. por lo tanto. 1991). pasteurización) (Eck y Gillis. en cuya hidrólisis se libera fenol que es un compuesto muy fácil de medir (Oria. Durante la fabricación de productos lácteos. La prueba de la fosfatasa alcalina es de gran importancia para la salud pública como medio de vigilar la rigurosidad de la pasteurización o la adición de leche cruda en leche o productos lácteos pasteurizados. La inactivación de la enzima garantiza que todos los microorganismos patógenos (al menos los que puedan crecer en la leche) han sido destruidos durante el tratamiento térmico. La mayor parte de la enzima está en la membrana de los glóbulos grasos y. Mientras que la fosfatasa ácida se encuentra en el suero y es bastante termorresistente (Walstra et al. se utiliza habitualmente como control de la pasteurización de la leche. la prueba de la fosfatasa es menos sensible cuando se realiza sobre leche desnatada. La determinación de la actividad enzimática mediante la prueba de la fosfatasa alcalina.4. sobre todo en los quesos pequeños (Alais. Para le prueba de la fosfatasa alcalina se han propuesto diversos sustratos. 2000). aunque no todas. 14 . pero en este último caso es preciso tener el hecho de que ciertos microorganismos. Prueba de la fosfatasa. La prueba puede entonces ser negativa y volverse luego positiva. 2001)..g. secretan fosfatasas (especialmente las levaduras y mohos). normalmente presentes en el curso de la maduración. La prueba de la fosfatasa consiste en valorar colorimétricamente el fenol que se libera del fenilfosfato disódico. pág.

la cual al incubarse con un sustrato de fenil fosfato. c) Contaminación microbiana posterior a la pasteurización. se valora semi-cuantitativamente con el reactivo desarrollador de color Lacto-Zyma II. 2. sin pasteurizar. El paquete lacto-Zyma II El kit de Lacto-Zyma II. La cantidad de fenol libre producida. Al añadir estos dos reactivos a la muestra de leche dan una reacción de color la cual puede ser comparada con las simples inspección visual. pues. para ser activa. b) Contaminación con leche cruda.4. lo descompone. crema y mantequilla. lo cual es de gran valor en la supervisión ambulante de plantas pasteurizadas de leche (Medina. un resultado positivo puede deberse a varios factores: a) Una pasteurización inadecuada. Esta es la forma más estable del reactivo cualitativo para fosfatasa de scharer. liberando fenol.1. especialmente para la supervisión ambulante de plantas pasteurizadas de leche. 15 . d) Reactivación de la fosfatasa. la literatura menciona procedimientos fáciles para identificar el origen de la fosfatasa positiva. para esto se aprovecha el hecho de que la enzima. pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 La prueba de la fosfatasa debe. con producción de un color azul. se emplea en una prueba cualitativa para la detección de la fosfatasa en leche. El principio químico es: La leche no pasteurizada contiene la enzima fosfatasa. 2008). 1990). Sin embargo. interpretarse con mucha precaución. requiere de iones magnesio (Badui.

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2.5.

Espectrofotometría

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma (Kirk y Othmer, 1962). La espectrofotometría consiste en la medida de la absorción que experimentan las sustancias químicas, de una radiación electromagnética de longitudes de onda situadas en una banda definida y estrecha, en la región visible (380 nm - 780 nm). La cantidad absorbida por la solución de la muestra se relaciona con la concentración de sustancias que se desea analizar. Mientras más concentrada sea la solución de la sustancia analizada, mayor cantidad de luz es absorbida y se observa un color de tono más intenso, con esta finalidad se adiciona un reactivo a la muestra o a la sustancia puesta a prueba, para producir un color el cual al ser comparado con la preparación estándar que ha realizado simultáneamente y que contiene aproximadamente una cantidad igual del estándar de referencia (Fox, 1992). La medición de la luz en con la la región ayuda visible de un (colorimetría) colorímetro puede realizarse un

espectrofotométricamente

fotoeléctrico,

espectrofotómetro o con menor precisión por comparación visual con estándares de color.

2.6.

Calidad de la leche

Atendiendo a un enfoque productor/usuario, la calidad de la leche puede definirse como: la suma de las características que la definen (nutritivas, composicionales, microbiológicas, sensoriales, tecnológicas, etcétera) y que concurren a proporcionar una mayor o menor satisfacción al utilizarlo, ya sea éste consumidor intermedio (industrial) o final. El estado ha creado una serie de normas, leyes y reglamentos que ayuden a mejorar la calidad de la leche y sus productos (Villegas y Santos, 2003). pág. 16

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México cuenta con dos normas de calidad las NOMs (normas oficiales de calidad) y NMX (norma Mexicana) la primera es obligatoria y la segunda no, aunque esta última al igual que la primera está basada en las normas ISO 9000 y cuyo propósito es buscar la implementación de la calidad total en los bienes y servicios que se vayan a comercializar. La Norma Mexicana para la leche cruda establece los requisitos de calidad composicional y sanitaria que debe cumplir la leche en el lugar en donde se acuerde la transferencia al comprador o de la industria (Cano, 2006). Una de las principales preocupaciones que la Normatividad tiene es la salud pública; para contribuir a ello, la ley exige que la leche y los productos lácteos deben elaborarse con leche tratada térmicamente (Santos y Villegas, 2005). Considerando la NOM-243-SSA1-2010, la cual establece las especificaciones sanitarias y nutrimentales que debe cumplir la leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y los derivados lácteos. Dentro de las especificaciones físicas y químicas de esta norma se encuentra la prueba de la fosfatasa, que es utilizada para verificar la correcta pasteurización. Por lo que es necesario que esta sea de fácil entendimiento, para que pequeños productores puedan emplearla correctamente. Según la NOM-243-SSA1-2010 en la cuadro 4, muestra los límites máximos de fosfatasa residual en alimentos lácteos.

pág. 17

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Cuadro 4: Límite máximo de fosfatasa residual. PRODUCTO LÍMITE MÁXIMO DE FOSFATASA RESIDUAL (UF/G) Leche, fórmula láctea o producto lácteo 4

combinado pasteurizado Quesos frescos, madurados y procesados Quesos de suero Helados de crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados Mantequilla y crema pasteurizada Fuente: NOM-243-SSA1-2010. 4 12 4 4

2.7.

Pasteurización de la leche

La pasteurización puede definirse como “un proceso higienizante destinado a eliminar completamente la microflora patógena de la leche, disminuir considerablemente la microflora banal, y destruir una alto porcentaje de enzimas deterioradoras (v.g. lipasas). El proceso está basado en la destrucción de Mycobacterium tuberculosis, el cual es el patógeno más termorresistente que se halla en la leche.” (Santos y Villegas, 2005). El objetivo principal de la pasteurización de la leche es reducir los riesgos que supone para la salud del consumidor la eventual presencia de microorganismos patógenos en los productos crudos. En el tratamiento de pasteurización, es posible que no se eliminen todos los patógenos, pero se reducen a unos niveles que no suponen ningún riesgo para el consumidor (Early, 2000). La finalidad de la pasteurización de la leche, es destruir el bacilo de la tuberculosis, así como la Coxiella burnetti causante de la fiebre Q. este calentamiento también es suficiente para inactivar la fosfatasa alcalina (Badui, 1999).

pág. 18

Este es el fin primordial por el que se desarrolló la pasteurización. La pasteurización lenta LTLT (Low Temperature Long Time): Consiste en calentar la leche a temperaturas entre 62 y 64°C y mantenerla a esta temperatura durante 30 minutos. Los efectos más importantes de la pasteurización son: 1.7. Luego de estos 30 minutos. La destrucción de microorganismos patógenos perjudiciales para la salud del consumidor. con lo que se puede prolongar su periodo de consumo y utilización (vida de anaquel). 2. 1998). la leche es enfriada a temperaturas entre 4 y 10°C según la conveniencia.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Se han estudiado distintas combinaciones de temperatura y tiempo para pasteurizar pero finalmente se han reducido a dos: pasteurización lenta o discontinua y pasteurización rápida o continua (Nieto. 1990). 19 . por lo que hay que reemplazarlas por cepas microbianas seleccionadas que permitan obtener la calidad deseada del queso (Madrid. pág. Tipos de pasteurización 1. Por otro lado. La reducción del número total de bacterias presentes. 3. La inactivación de ciertas enzimas y bacterias perjudiciales en la elaboración de quesos. El uso de esta técnica es adecuada para procesar cantidades pequeñas de leche hasta aproximadamente 2000 litros diarios. de lo contrario no se aconseja.1. también hay que destacar la destrucción de bacterias y enzimas benéficas. 2.

alterando lo menos posible las estructuras de la leche (Santos y Villegas. por el cual se logra destruir todos los microorganismos que se encuentran normalmente. 1992). 2005).ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 2. pág. Posee un efecto germicida muy elevado gracias a la acción de la alta temperatura durante un tiempo de retención extremadamente breve. 3. este tratamiento consiste en aplicar a la leche una temperatura de 72–73°C en un tiempo de 15 a 20 segundos (Sánchez. ocasiona la destrucción o debilitamiento de las estructuras. 2005). Llamada también pasteurización continua o bien HTST (High Temperature short time). dificultándose la elaboración de quesos (Santos y Villegas. 20 . a casi toda la flora microbiana y la totalidad de la flora patógena. Es un tratamiento de esterilización comercial de la leche. Sin embargo este proceso de alta temperatura. designada también como ultra esterilización o procedimiento de temperatura ultra alta (UHT). Sin embargo. Ultra Pasteurización UHT (Ultra High Temperature): La ultra pasteurización. las modificaciones físico-químicas son equivalentes a la pasteurización rápida o alta (AOAC. se realiza en un intercambiador de calor de placas. 1984). provocando que el cuajo no actúe eficientemente. mediante el calor. Pasteurización rápida HTST (High Temperature Short Time): Este proceso tiene el propósito de eliminar.

ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 III. La ausencia de fosfatasa es un índice de que la leche ha sido pasteurizada. en una miniplanta procesadora de queso y obtuvo resultados positivos de la prueba de la fosfatasa en la leche cruda.6 Dibromoquinonacloroimida (BQC) en lugar del reactivo de Folin-Ciocalteu para cuantificar el fenol liberado. Scharer (1938) desarrolló un método para la detección de fosfatasa alcalina en leche. et al. pero la leche descremada cuando se calienta a 70 ° C durante 15 s muestra una reducción de 3 log y cuando se calienta un 65 ° C durante 70 s se reduce solo uno. (2000). mientras que su presencia denota calentamiento insuficiente o contaminación con leche cruda. ANTECEDENTES Numerosos trabajos se han orientado a la fosfatasa alcalina en la leche a continuación se menciona unos. Toda la leche cruda contiene fosfatasas que pueden hidrolizar los ésteres de fosfato por debajo de las condiciones alcalinas. 21 . Usó 2. Haab y Smith (1956) reporta variaciones en la actividad de la fosfatasa de la leche cruda y su posible importancia en las normas de pasteurización. Faría. El uso de p-nitrofenilfosfato como sustrato para estimar la actividad de la fosfatasa alcalina fue introducido por Aschaffenburg y Mullen (1949). la concentración inicial de la enzima puede producir variaciones correspondientes de la actividad de la fosfatasa residual presente después del tratamiento de pasteurización. en las leches pasteurizadas la prueba de la fosfatasa fue negativa. Teóricamente. mientras que. Bindith et al (1996) informó que la actividad de la fosfatasa alcalina no se ve afectada en la leche descremada a 55 °C por microfiltración. pero es destruida a la temperatura necesaria para una pasteurización eficiente. pág. estudió la eficiencia de la pasteurización de la leche de cabra. Kay y Graham (1935) desarrollaron otra prueba de fosfatasa. la cual está basada en el hecho de que la enzima natural fosfatasa está siempre presente en la leche cruda.

22 . Objetivos particulares  Analizar la metodología de la prueba de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lácteos según NOM-243-SSA1-2010. 64. Girrotti et al (1994) desarrolló un análisis quimioluminiscente altamente sensible y rápido para medir la actividad de la fosfatasa alcalina en la leche. al. IV. (1997) determinó la actividad de la fosfatasa alcalina fluorométricamente en la leche cruda o caliente (62. OBJETIVOS Objetivo general Elaborar un manual para la determinación de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lácteos según NOM-243-SSA1-2010. La actividad de la enzima en la leche disminuye progresivamente con el aumento de la intensidad del tratamiento térmico. en el queso Taleggio y Gorgonzola se elaboró con leche pasteurizada a 74°C por 20 s. pág.  Desarrollar la metodología según NOM-243-SSA1-2010 para la comprensión de su contenido.  Determinar la prueba cuantitativa de la fosfatasa residual en leche y en productos lácteos. Mencionó que la ausencia de la fosfatasa alcalina ha sido universalmente aceptada como la evidencia de una eficiente pasteurización de leche. y el queso Provolone se hizo con leche cruda. Reynold y Telford en 1966.66 o 68 ° C durante 20 s).ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Battistotti et.

VI. Sin embrago. En la NOM-243-SSA1-2010 se desarrolla una metodología para calcular los límites máximo expresados en UFenol/g. Ubicación del trabajo El presente estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de lácteos perteneciente al Departamento de Ingeniería Agroindustrial (DIA) de la Universidad Autónoma Chapingo. Por tal motivo surge la idea de elaborar un manual que sirva de guía a pequeños y medianos productores para verificar la adecuada pasteurización de la leche y productos lácteos de forma cualitativa y cuantitativa. La leche cruda. fue adquirido por el distribuidor de productos y equipos de laboratorio “QUÍMICA LAITZ”.5 de la carretera México-Texcoco. 23 .empleados para la desarrollo de la prueba de fosfatasa.2. el yogur y la crema que se utilizó se compraron en la Unidad Tecnológica Lechera y en la tienda Campestre de la Universidad Autónoma Chapingo. METODOLOGÍA 6. los términos técnicos utilizados en la norma hacen complicada su aplicación para personas que no están relacionadas con dichos términos. en el kilómetro 38.1. 6. JUSTIFICACION La fosfatasa alcalina es utilizada como indicador de una adecuada pasteurización. El material.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 V. Materiales Los materiales que se utilizaron se puntualizan en el manual. pág. los reactivos y el equipo de Baño de agua con control de temperatura a 3740°C.

) Debido a que no se pudo adquirir el reactivo 2. 1. al mismo tiempo fundamentar la sustitución.3. Medir con pipeta 1 mL de leche fluida y colocar dentro del tubo de ensayo. 6. Análisis para la sustitución de la solución (B. La cantidad de fosfatasa que hay en la leche o productos lácteos analizados se expresa en UFenol/g que es lo mismo que μgFenol/mL y μgP-nitrofenol/mL para el método de Aschaffenburg y Mullen. Los datos se obtuvieron al leer las muestras en un Spectronic Genesys 5 a 610 nm para la metodología de NOM-243-SSA1-2010 y 403 nm en el caso del método alterno. Lácteos utilizados Se pasteurizó la leche a 65°C durante 30 minutos (pasteurización lenta). por lo que fue necesario realizar los análisis para encontrar la concentración óptima a la que reaccione toda la fosfatasa alcalina presente en el producto y no se desperdicie reactivo. 6.Q.Q.6-dibromoquinonacloroimida (B.C. Para ello se utilizó el siguiente procedimiento. se optó por sustituirlo con el reactivo Lacto-Zyma II (desarrollador de color).4. fueron de la marca comercial LALA. Métodos aplicados Se realizó una investigación sobre los métodos para el análisis cuantitativo y cualitativo en la determinación de la fosfatasa alcalina residual en leche y en productos lácteos.5. Se revisó y analizó la NOM-243-SSA1-2010. Se aplicó la metodología de NOM-243-SSA1-2010 y el método conocido como Aschaffenburg y Mullen.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 6. queso y leche ultrapasteurizada.). Incubar en baño de agua a 37°-38°C por una hora. posteriormente tapar los tubos y mezclar. 2. 3. pág. Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo con fenil fosfato disódico. Ver el manual anexo. El yogur.C. 24 .

C. Pesar concentraciones exactas del reactivo desarrollador de color del kit de Lacto-Zyma II. VII. Filtrar empleando embudos de 5 cm de diámetro y papel filtro No. 8. Leer la intensidad del color azul midiendo en el espectrofotómetro la absorbancia de la muestra con referencia a la prueba en blanco a 610 nm. 5. 6. 25 .4.0.0. Agregar a cada tubo 5 mL de solución reguladora para desarrollo de color y del reactivo 0. mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 30 min para desarrollo de color.6.0. recoger 5 mL del filtrado en tubos graduado en 5 y 10 mL. 7. por lo que se tomó esta concentración para el desarrollo de la prueba ya que es donde la curva se vuelve asíntota lo cual implica que es la cantidad necesaria en donde reacciona toda la enzima y no se desperdicia el reactivo desarrollador de color de kit de Lacto-Zyma II. Añadir 1. 2 o su equivalente.5.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 4.3.0.8.0.05.2. 9. pág. con los resultados obtenidos de las diferentes concentraciones del desarrollador de LactoZyma II que se muestran en el cuadro 5 se elaboró una gráfica (ver figura 2) en que se puede observar que la concentración óptima es 0. 42 de 9 cm de diámetro o bien el No.0.5 g .0 mL de la solución precipitante para proteínas zinc-cobre.7.0.9 y 1 g de Lacto-Zyma II.). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la sustitución de la solución (B.0. Dejar enfriar los tubos a la temperatura ambiente por inmersión en un recipiente de agua fría.1.Q.0.

293 0 0. CONCENTRACIÓN DEL REACTIVO LACTO-ZYMA II A610 R1 A610 R2 A610 R3 0 0.6 0.29 0.9 1 concentración de Lacto-Zyma II (g) R1 R2 R3 Figura 2.304 0.05 0 0 0. 26 . pág.8 0.219 0.2 0.5 0.303 0. 0 0.278 0.285 0.220 0.128 0.4 0.262 0.292 0.239 0.293 0.246 0.184 0.305 0.176 0.3 0.25 Absorbancia 0.306 0.1 0.277 0.8 0.303 0.303 0.3 0.292 0.299 Diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II 0. Resultados de obtenidos con los diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II.15 0.2 0.35 0.243 0. Concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II.4 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Cuadro 5.301 0.6 0.291 0.3 0.304 0.281 0.302 0.122 0.7 0.5 0.1 0.301 0.1 0.9 1 Fuente: Elaboración propia.7 0.2 0. En la figura 3 presenta la gráfica de la curva patrón que se elaboró con los resultados obtenidos que se muestran en el cuadro 6.177 0.306 0 0.05 0.

017 0.081 0.009 1 0.061 0.523 0.014 0.346 0. Resultados con diferentes concentraciones de fenol para elaboración de la curva patrón.764 0.802 0.081 0. 27 .097 10 0.5 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Cuadro 6.359 0.357 30 0. Concentración de A610 A610 A610 fenol (UFenol/mL ó R1 R2 R3 µgFenol/mL) 0 0 0 0 0.077 5 0.085 0.023 0.017 3 0.827 Fuente: Elaboración propia.220 0.007 0. pág. Figura 3: Gráfica de curva patrón fenol.208 20 0.291 0.531 40 0.557 0.

Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴610 𝐴610 de leche cruda proveniente de la Unidad Con respecto a la curva patrón 9. la cual. 20. Concentración de Tecnológica Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴610 𝐴610 por lo tanto ambos productos se mantienen dentro de lo de leche pasteurizada proveniente de la Con respecto a la curva patrón 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 7.207 Fuente: Elaboración propia En la leche cruda se obtuvieron 21.71 2.71 0.1368 8.59 0.59 .21 0.167 0.53 25. Concentración en Unidad Tecnológica Lechera.021 0. Interpretación de los resultados de los productos analizados con el método de la NOM-243-SSA1-2010 Leche cruda Cuadro 7.178 0.375 0.53 y 25.09 1. 28 .8736 0.6631 Concentración de en el producto 21.346 0.017 Fuente: Elaboración propia pág.92 20.207 0.168 Final 0.92.335 0.018 0.206 0.5578 10.1. dado que solo hay límites para los productos pasteurizados. Los resultados de la leche pasteurizada y ultrapasteurizada (cuadro 8 y 9) si se puede comparar con la norma.189 Final 0. establece un límite máximo de fosfatasa residual de 4 UFenol/mL ó establecido Cuadro 8.7157 Concentración de en el producto 1. estos valores no se pueden comparar con los límites máximos que especifica la norma. pero es evidente la actividad de la fosfatasa residual.7157 0.

142 0. Concentración en Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴610 0.59 1. porque los resultados (cuadro 10 y 11) están dentro del límite máximo de fosfatasa residual de 4 UFenol/g ó Cuadro 10.5052 1.4526 1. Concentración en Lechera.014 0.11 0. Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴610 𝐴610 de yogur de la Unidad Tecnológica Con respecto a la curva patrón 0.131 Final 0.014 0.08 0. Con respecto a Concentración de 𝐴610 la curva patrón en el Final producto 0.4526 Concentración de en el producto 1.013 0.011 0.222 0.145 0.215 0.99 0.5052 0.017 0.144 0. Yogur El yogur comercial y el de la Unidad Tecnológica Lechera (UTL) se encuentran dentro de la norma.198 de leche ultrapasteurizada de la marca comercial LALA. 29 .21 Fuente: Elaboración propia.6631 0.212 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Cuadro 9.76 0.3473 0.013 Fuente: Elaboración propia pág.

Crema El contenido de fosfatasa residual alcalina en la crema de la UTL si cumplen con la norma ya que no rebasan el límite máximo de 4 que establece la norma. Concentración en Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴603 0.025 de crema de la Unidad Tecnológica Lechera.156 𝐴610 Final 0. Cuadro 12.0842 Concentración de en el producto 2.1894 0.013 0.3473 Concentración de en el producto 0.76 Fuente: Elaboración propia.181 0.231 0.85 2.41 0.011 de yogur de la marca comercial LALA. 30 .22 2.022 0.228 0. Concentración en Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴610 0.4526 0.220 𝐴610 Final 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Cuadro 11.233 0.178 0.60 Fuente: Elaboración propia.9263 1. Con respecto a la curva patrón 0.99 0.027 0.183 0.1894 0. Con respecto a la curva patrón 1.008 0. pág.

023 0.289 0. 31 .4526 4.012 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Queso A continuación se presenta los datos obtenidos de la muestra de queso.76 0. Productos Límite máximo UF/mL o según la NOM-243-SSA1-2010 4 4 4 4 4 4 4 12 Interpretación de resultados si ó no están dentro de la norma No Si Si Si Si Si Si Si leche cruda leche pasteurizada leche ultrapasteurizada yogur UTL yogur natural comercial crema UTL crema comercial Queso panela comercial Fuente: Elaboración propia. Cuadro 13. por lo que se puede notar los valores 1.99 están por bajo con respecto a 12 .3 0.277 Final 0.4 1. Cuadro 14.290 0.013 de queso panela comercial.30 y 1. pág. Límite máximo según la NOM-243-SSA1-2010 e interpretación de resultados. 4. Concentración en Tubos 1 2 3 Testigo 𝐴603 𝐴610 0. Con respecto a Concentración de la curva patrón en el producto 0.99 Fuente: Elaboración propia. que es el límite máximo que establece la norma para este producto. En el cuadro 14 se presenta la interpretación para cada uno de los productos analizados con respecto al límite máximo que establece la norma.30 1.76.9789 0.

919 1.123 Figura 4. Fosfatasa residual con el Método de Aschaffenburg y Mullen Con los resultados obtenidos que se muestran en el cuadro 15 se realizó una gráfica que se muestra en la figura 20.5 Fuente: Elaboración propia.356 0.544 0.596 0.13 0. 32 . Cuadro 15. 0. Curva patrón de p-nitrofenol.152 0. Datos obtenidos de los tubos de la curva patrón.978 1. Concentración de p-nitrofenol A403 A403 A403 (mgP-nitrofenol/mL) R1 R2 R3 0 0 0 0 0.5 1 2 3 4 4.022 1.147 0.283 0.298 0.173 0.007 1.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 7.2.981 1.221 0.601 0. pág.199 1.

981 1.5 1 2 3 4 4.356 Fuente: Elaboración propia.152 0. por lo que la regla de decisión es rechazar H o si to> 2.007 0.5 1 3 5 10 20 30 40 A610 0 0. la conclusión por lo que no se rechaza la H o con un α=0.2 0.596 0.9768. t0. Comprobar la utilización de los métodos Debido a que no fue posible conseguir el reactivo 2.014 0.9768 o to< -2. Con un nivel de significancia α=0.523 0. y se realizó una distribución t de student para comprobar que los resultados obtenidos de ambos métodos eran similares.359 0. Con 14 grados de libertad encontramos en la tabla de t-student. 33 . UFenol/mL 0 0. pág.764 Up-nitrofenol/mL 0 0.061 0.5 A403 0 0.3.6 Dibromoquinonacloroimida para desarrollar únicamente el método propuesto por la norma.298 0. Cuadro 16: Datos de la curva patrón del fenol y p-nitrofenol.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 7. Puesto que to= -2.01.199 1. lo cual indica que las medias de ambos métodos son iguales y por lo tanto se podrá utilizar cualquiera de los dos métodos investigados.1152.005(14)= 2.01.9768. fue necesario utilizar los datos de la curva patrón del método propuesto por la NOM-243-SSA1-2010 y el método de Aschaffenburg y Mullen (p-nitrofenol) (ver cuadro 16).081 0.

pág.005 con una se encontró que ambos métodos pueden ser utilizados obteniendo resultados similares.6 Dibromoquinonacloroimida por lo que fue necesario sustituirlo por el reactivo desarrollador de color del kit de LactoZyma II. es un método efectivo para verificar la pasteurización al término del proceso. 2.student la t0. 5. Sin embargo.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 VIII. 4. 34 . CONCLUSIONES Con base en los resultados obtenidos. 3. estas metodologías no son aplicables a leche en anaquel debido a que la fosfatasa alcalina tiende a reactivarse de acuerdo al tiempo y a la temperatura a la que se exponga. podemos concluir lo siguiente: 1. Por otra parte el método de Aschaffenburg y Mullen sólo puede ser utilizado para la determinación de fosfatasa residual en leche y no en productos lácteos como es el caso del método propuesto por la norma. El problema con el método propuesto por la NOM-243-SSA1-2010 es que no es posible conseguir en el mercado el reactivo 2. La prueba de la fosfatasa. El método de Aschaffenburg y Mullen en donde se utiliza p-nitrofenol es más rápido comparado con el método propuesto por la norma. El método utilizando p-nitrofenol es rápido y eficiente para la determinación de la pasteurización de la leche empleada en la elaboración de los productos derivados de ella y mediante la distribución de t.

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ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 pág. 39 .

6-dibromoquinonacloroimida (B.). pág. cuya intensidad se mide espectrofotométricamente a 610 nm. En el presente manual se encuentra la metodología de cada una de los métodos mencionados. se basa en la actividad de la fosfatasa alcalina presente en la leche cruda. 1. Este método. Por consiguiente si se descubre en una muestra de leche pasteurizada que la actividad de la fosfatasa alcalina está presente. La cantidad de fenol liberada a partir del sustrato es proporcional a la actividad de la enzima. en condiciones alcalinas liberando p-nitrofenol como producto.Q. Si la fosfatasa activa está presente. indicador de la correcta La prueba de la fosfatasa alcalina se aplica como un pasteurización en la leche. obteniéndose un color azul. esto comprueba que su procesamiento ha sido inadecuado o que la enzima ha sido reactivada. 1975).C. el fenilfosfato se hidroliza y se forma fenol. El Método de Aschaffenburg y Mullen. Esta prueba según la NOM-243-SSA1-2010. C6H5OPO3H2 + H2O Fosfatasa Alcalina C6H5OH + H3PO4 Por lo que si la leche utilizada en la elaboración del producto ha sido pasteurizada eficientemente. queso y otros productos lácteos. evidenciándose por su color amarillo. se fundamenta en la acción de la enzima fosfatasa alcalina sobre el sustrato fenilfosfato disódico en solución reguladora de hidróxido de bario-borato. 40 . sobre el sustrato p-nitrofenilfosfato disódico.MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010. también es muy utilizado para efectuar la prueba de la fosfatasa. la fosfatasa se inactiva y no hay hidrólisisEl fenol formado se determina colorimétricamente después de su reacción con 2. Cuya intensidad se mide espectrofotométricamente a 403 nm (Muñoz. INTRODUCCIÓN.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1.

Vasos de precipitación. 7 H2 O). pág. Celdas de cuarzo. Matraces volumétricos de diferentes capacidades. Perilla de succión. 42 o No. 1. Espectrofotómetro Balanza analítica.1. Reactivos Hidróxido de bario octahidratado (Ba (OH) 2 8 H2 O). Materiales Tubos de ensaye con tapas. 2. Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5 H2 O). 1. Fenilfosfato disódico (Cristales libres de fenol) (Na2 C6H5PO4) 2H2 O. Borato de sodio decahidratado (Na2 B4O7 10 H2 O). 1. Determinación de fosfatasa según la NOM-243-SSA1-2010. Tubos de ensaye con graduación de 0 a 10 mL. Pipetas graduadas. Sulfato de zinc heptahidratado (Zn SO4. Fenol (C6H6 O). Ácido bórico (H3 BO3).1.3.2. Equipo Parrilla de calentamiento. Alcohol butílico (C4 H10 O). 41 . Reactivo desarrollador de color del kit de Lacto-Zyma II.1. Cloruro de sodio (NaCl). de control termostático. Embudos de filtración.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1.1. Papel filtro Whatman No.1. Metaborato de sodio (NaBO2). Baño de agua con control de temperatura a 37-40°C. Agitadores de vidrio.

por agua debe entenderse agua destilada.15.6 ± 0. Conservar la solución en un recipiente bien cerrado.4. pág. Ajustar el pH a 10. Por ejemplo: diluir 500 mL de esta solución reguladora con 500 mL de agua. 1. Disolver 11 g de ácido bórico y diluir a 500 mL.15 a 25°C).5.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Todos los reactivos deben ser grado analítico y libre de fenol. Para leche y quesos: Antes de su uso.6 ± 0. 1. 42 . Metodología. Solución reguladora de hidróxido de bario-borato (pH 10. diluir la solución con la misma cantidad de agua. Para yogur: diluir esta solución reguladora con un cuarto de su volumen de agua (ejemplo 80 mL de este regulador con 20 mL de agua). con la solución de hidróxido de bario-borato y filtrar.1. Calentar cada una de las soluciones a 50°C y mezclar. a) Preparación de reactivos. Procedimiento. Agitar y enfriar aproximadamente a 25°C.1. De acuerdo a la NOM-243-SSA1-2010 la prueba de fosfatasa es una prueba cualitativa y cuantitativa y se expresa en unidades fenol o microgramos de fenol y existen límites máximos para leche y diferentes productos lácteos los cuales se presenta en la norma. 1. Disolver 25 g de hidróxido de bario octahidratado en agua caliente y diluir a 500 mL.

Dilución de la solución reguladora de hidróxido de bario-borato. Figura 2. 2. Soluciones reguladoras de trabajo con fenil fosfato disódico Para leche: Disolver 0. Preparación de la solución reguladora de hidróxido de bario-borato. pág. 43 .1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de la solución reguladora de hidróxido de bario-borato.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Figura 1.

borato y mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración. Mezclar y Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración.1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de hidróxido de bario.8 ± 0. repetir la extracción del color.(0. Reactivo precipitante para proteínas zinc-cobre. dejar en reposo 30 min. 4. 3.5 mL de alcohol butílico.5 mL de la solución reguladora de hidróxido de bario-borato y dos gotas de reactivo B. agregar 0. yogur y queso: Disolver 6 g de metaborato de sodio y 20 g de cloruro de sodio en agua y diluir a un litro.15 a 25°C).1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de solución de hidróxido de bario-borato.borato hasta aforar. Diluir 1 mL de esta solución en un matraz aforado de 100 mL y añadir el regulador de hidróxido de bario. Para yogur: Disolver 4. tapar inmediatamente y guardar en refrigeración.5 g de fenilfosfato disódico en 4. 44 .1 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y llevar un volumen de 100 mL. Esta solución madre debe mantenerse en el refrigerador durante algunos días. Extraer el color formado con 2. Para leche. Para quesos y crema: Disolver 0.5 g de Lacto-Zyma II).5 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0. desarrollar el color y eliminarlo por extracción como se ha indicado anteriormente.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 En caso de que el fenil fosfato disódico no esté libre de fenol debe ser purificado de la siguiente manera: Disolver 0. desarrollar el color y reextraer si es necesario. Para leche y crema: Disolver 3 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0. pág. Para yogur: Disolver 0.6 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y diluir a 100 mL. Calentar la solución a 85°C por 2 min.C. Luego de separar. La solución es estable por un año si se encuentra bien guardada y con mínima exposición al aire.Q. Conservar en refrigeración. Si fuese necesario. Al emplearse. Solución reguladora para desarrollo de color (pH 9. Antes de usar.5 mL de agua. descartar el alcohol butírico.

Disolver 0. pág. Solución precipitante para proteínas zinc-cobre.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Para quesos: Disolver 6 g de sulfato de zinc heptahidratado en agua y diluir a 100 mL. 45 . Figura 4.05%. Solución de sulfato de cobre para patrones al 0.05 g de sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua.05%. 5. Figura 3. Solución de sulfato de cobre para patrones al 0.

0 g de fenol.Q. Figura 5. Reactivo de fenol. Figura 6. Solución madre de fenol de 1 .) Agregar 0. Esta solución es estable durante varios meses mantenida en refrigeración. 46 . Pesar exactamente 1.C. transferir a un matraz volumétrico de un litro y llevar al volumen con agua. Reactivo desarrollador de color.6-dibromoquinonacloroimida (B. Mezclar perfectamente. 7. pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 6.5 g de Lacto-Zyma II. Solución de 2.

30 y 50 mL de la solución patrón de fenol de 10 μg/mL. 1. Preparación de Soluciones patrón para estándares: En cuatro matraces volumétrico de 100 mL añadir 5. El blanco se obtienen pipeteando 1 mL de agua destilada. 20. ( se recomienda preparar dos o más tubos de cada uno de las concentraciones de fenol para determinaciones por duplicado. 3. restar el valor que alcanza la lectura del testigo a la de cada una de las soluciones patrones de fenol.) 3. 30 y 40 μg o unidades de fenol por mL. pág. posteriormente adicionar agua destilada. Diluir 10 mL de la solución madre de fenol a un litro con agua y mezclar perfectamente.5 g de reactivo de LactoZyma II. 47 . 6. Agregar en cada tubo de ensayo 5 mL de la solución para el desarrollo de color. 5. 30 y 40 unidades por mL. 1.0 (blanco).05 %. Pipetear 1 mL de cada solución patrón en tubos de ensayo para obtener una serie de muestras conteniendo 0. 7. De manera semejante preparar las soluciones patrón que contengan 20. 10. Mezclar.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 b) Preparación de la curva patrón de comparación.5. agitar y aforar. 1. Pipetear sucesivamente en cada tubo de ensayo 1 mL de la solución de sulfato de cobre al 0. a temperatura ambiente para desarrollo de color.5. Estas soluciones contienen respectivamente 0. 3 mL de agua y 0. 0. con objeto de aumentar la intensidad del color azul y la estabilidad de los patrones 4.0. Realizar la lectura de la intensidad del color con un espectrofotómetro a 610 nanómetros. 10. Dejar en reposo 30 min.0 y 5. 5.0 μg o unida des de fenol por mL. 3. Guardar en refrigeración y permitir que esté a la temperatura ambiente en el momento de su uso. 2. Establecer una curva de calibración la cual debe ajustarse mediante el método de mínimos cuadrados (regresión lineal).

5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo. Para crema: pesar 1 g de crema de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2. 5 g de queso de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2. pág.5 X 2. yogur.5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo. Para leche: Medir con pipeta 1 mL de leche fluida y colocar dentro del tubo de ensayo.5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo. Figura 7. Nota: se necesita un tubo como testigo y se recomienda preparar dos o más tubos para determinaciones por duplicado. Para queso: Pesar 0. 48 .5 X 2.5 X 2. Tubos con muestras de crema. leche cruda y pasteurizada. Para yogur: Pesar 1 g de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 c) Preparación de la muestra.

pág. Baño de agua en donde se colocaron los tubos testigos. 2. Figura 9. Añadiendo los 10 mL de la solución de trabajo con fenil fosfato disódico.6. 49 . Calentar el tubo testigo en un baño de agua a ebullición cubierto durante 1 min (la temperatura interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Procedimiento 1.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1. Figura 8. Dejar enfriar a temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el agitador. posteriormente tapar los tubos y mezclar. Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo con fenil fosfato disódico.1.

Incubación de tubos a 38. Dejar enfriar los tubos a la temperatura ambiente por inmersión en un recipiente de agua fría. Agitando el contenido de vez en cuando. pág. Figura 11. 50 .ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 3. Colocar los demás tubos en baño de agua a 37°-38°C.0 °C. 4. Figura 10. Incubar ahí por una hora. Calentando los tubos durante un minuto. Trasladar los tubos a un recipiente con agua a ebullición durante 1 min.

Figura 12. Añadir 1 mL de la solución precipitante para proteínas zinc-cobre. pág. 7. Filtrar empleando embudos de 5 cm de diámetro y papel filtro No. El pH de la mezcla debe ser de 9 -9. Agregar a cada tubo 5 mL de solución reguladora para desarrollo de color y 0. mezclar. 2 o su equivalente. 42 de 9 cm de diámetro o bien el No. Añadiendo un mililitro de solución precipitante para proteína.1. 6. mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 30 min para desarrollo de color. recoger 5 mL del filtrado en tubos graduado en 5 y 10 mL.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 5. 51 . Descartar los primeros filtrados hasta obtener un líquido nítido.5 g del reactivo de Lacto-Zyma II.

ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Figura 13. pág. 52 . Figura 14. Leer la intensidad del color azul midiendo en el espectrofotómetro la absorbancia de la muestra por referencia a la prueba en blanco a 610 nm y a los estándares preparados. Color de los tubos después de 30 minutos. Lecturas de absorbancia con el espectrofotómetro. 8.

3.. 1.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1. de Fenol/mL = C X Factor de dilución.7. Para calcular la actividad de la fosfatasa expresada en microgramos de fenol por mL.Obtener los datos después de leer a 610 nm. empleando la formula siguiente: U. Cálculos.4 2. 2.Empleando la ecuación gráfica de la curva patrón se despeja x para obtener la concentración de la muestra con respecto a la curva patrón en unidades fenol/mL.1..4 Pasos para obtener el resultado de la actividad de la fosfatasa residual alcalina. 53 . Leche Yogur queso crema Factor de dilución. o .Restar a cada una de las lecturas de muestras la lectura del testigo. y = mx+b pág.2 4. Cuadro 1: Factor de dilución de algunos productos lácteos de acuerdo con la NOM-243-SSA1-2010 Producto lácteo. Donde: C = concentración de la muestra obtenida de la gráfica de la curva patrón en unidades fenol/mL.4 2. 2.. 1.

3. Enjuagar y hervir con agua o tratarlos por vapor todo el material de vidrio y tapones. 2.8. 1. El producto que resulta de esta operación se expresa en . Durante el desarrollo de la prueba de la fosfatasa residual se sugiere considerar siguientes recomendaciones. 54 . Limpiar perfectamente todo el material de vidrio y tapones. pág. Evitar el empleo de material plástico y tapones que pudieran contener fenol ó cualquier otro contaminante. las 1.1. 4.El resultado de la concentración se multiplica con el factor de dilución. Evitar cuidadosamente todo indicio de saliva. puesto que ésta contiene fosfatasa..ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 4. Recomendaciones para determinar fosfatasa en leche y en productos lácteos.

2. Bomba de vacio.75. Pipetas graduadas Embudos de filtración. Celdas de cuarzo.2. de control termostático.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1.2 M a pH 9. 2. 55 . pág. Papel filtro Whatman No. Materiales Tubos de ensaye con tapas. Solución de NaOH 0. Solución reguladora de glicina 0. Espectrofotómetro de UV-Visible.2. Reactivos Fosfatasa alcalina de leche cruda.02 M. Agitadores de vidrio. Determinación de fosfatasa con el Método de Aschaffenburg y Mullen.2.1. Vasos de precipitación. 1. 1.2. 42 o No. Balanza analítica. Perilla de succión. Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 1. Equipo Parrilla de calentamiento. Embudos de separación. Solución de p-nitrofenilfosfato.3.

convertirlos a concentración de producto (p-nitrofenol).5 0.02 M (mL) 0.5 0.0 2.5 Agua (mL) 4. pág.5 0.5 1.nitrofenol (5X10-5 m) 0.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1.4 Curva patrón.5 0. Esta curva se hace con el fin de que los datos obtenidos con las muestra de leche cruda.5 4. Para ello se prepara la siguiente serie de tubos como se indica en cuadro 2. 56 .0 0.0 4.2. N° de tubo 1 2 3 4 5 6 7 p.5 0.0 4.5 0. Cuadro 2.0 NaOH 0.5 1.0 3.5 0.5 0. Mezclar perfectamente y determinar su absorbancia a 403 nm utilizando el tubo uno como blanco.5 Figura 15.5 2.0 3. Preparación de tubos para la curva patrón.Tubos para la curva patrón.

5 X 10-3 M.75.5. Solución reguladora de glicina 0. Aforar con agua destilada a 200mL.02 M. Solución de NaOH 5 M. considerando un peso molecular de 264.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 1. Sución de p-nitrofenilfosfato disódico (sustrato) Preparar 100 m de solución al 2.2 M a pH 9. Preparación de reactivo. Disolver 0. 1. 4. 2. 3.08 g de NaOH en 100 mL de agua. Disolver 20 g de NaOH en 100 mL de agua. Figura 16. 57 . Frasco del reactivo p-nitrofenilfosfato disódico utilizado. pág. Solución de NaOH 0.75 Disolver 3 g de glicina en aproximadamente 150 mL de agua destilada y adicionar NaoH 5 M hasta que el pH sea de 9.2.

pág. 1. A un litro de leche sin pasteurizar agregar 500 mL de isobutanol. Solución de glicina. Solución de p-nitrofenol. Preparar una solución 5X 105 M a partir de una solución stock de concentración 0.2. Separar la capa superior de isobutanol y proceder conteniendo una capa de 0. sobre un papel whatman N° 2 en un embudo cónico el filtrado así obtenido será utilizado como extracto crudo de la enzima.5 mm de filtro agudo (celita).5 de ácido acético glacial y agitar hasta que dicha coagulación se lleve a cabo.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Figura 17.01 M (0. calentar a 38°C y agitar durante 5 minutos con el fin de lograr la coagulación de las caseínas. la solución diluida se deberá preparar al momento de usar. el stock se puede guardar bastante tiempo. 5.6.1391/100). Preparación de la muestra. si no ocurre esto agregar 4. 58 .

1. Preparar el tubo con la muestra cómo se nuestra en la cuadro y realizar la lectura en el fotoespectrometro a 403 nm. Bomba de succión y matraz para filtrar. 59 . Cuadro 3.2. Procedimiento. N° de tubo mL de p-nitrofenilfosfato 4 4 4 Leche (mL) 1 2 3 1 1 1 Fuente: Elaboración propia. pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 Figura 18.7. Preparación de tubos para la muestra testigo.

60 . Diagrama de proceso del queso Leche Acondicionamiento Estandarización Ajustes de acidez Pasteurización Ajuste de temperatura Adición de CaCl2 Cuajado Cortado Agitado Desuerado Moldeado Prensado Madurado Queso pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 2.

61 . Diagrama de proceso de la crema Leche Nata Estandarización Desacidificación Pasteurización Maduración Refrigeración Crema pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 3.

62 . Diagrama de proceso del yogur Leche Ajuste de sólidos Estandarización Ajuste de acidez Sobrepasteurización Enfriamiento Inoculación Incubación Enfriamiento Maduración Adición de fruta Envasado Conservación Yogur pág.ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 4.

ELABORACIÓN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIÓN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS SEGÚN LA NOM-243-SSA1-2010 5. 63 . Diagrama de proceso de pasteurización de la leche Recepción de la leche cruda Filtración Enfriamiento Estandarización Pasteurización Envasado Leche pasteurizada pág.