Informe de actividades prcticas

Introduccin La inmunidad es el conjunto de fenmenos mediante los cuales el organismo, utilizando su sistema inmunolgico, reconoce elementos que son propios, tolerndolos, y reacciona frente a los elementos extraos, rechazndolos, la biologa moderna en este sentido ha introducido a lo largo de su historia un gran nmero de procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas. Durante muchos aos los procedimientos inmunolgicos se han ido perfeccionando de manera importante, dando as otra herramienta para el anlisis de sustancias de inters que no se podan llevar acabo con los mtodos habituales. La base de las reacciones inmunolgicas es la reaccin antgeno-anticuerpo, la principal funcin biolgica de los anticuerpos es reconocer y unirse a sustancias extraas denominadas antgenos, para facilitar su eliminacin del organismo, esta reaccin se hace visible con diversas tcnicas de laboratorio como fenmenos de precipitacin, aglutinacin, mecanismos de marcaje como la inmunofluorescencia o ensayos inmunoenzimaticos. Dentro de los procedimientos prcticos se recurri a la utilizacin de animales para su inmunizacin, la inmunizacin es un proceso en el cual un individuo genera una respuesta inmune frente a un agente extrao, la respuesta depende de caractersticas que presente este antgeno como su complejidad, conformacin, va de administracin, entre otras. En las actividades practicas que se trataran a continuacin de llevaron acabo tcnicas de reconocimiento de la reaccin antgeno-anticuerpo que nos permitieron visualizar esta reaccin luego de obtener muestras de grupos de animales previamente inmunizados. Descripcin de actividades practicas Inmunizacin de animales La inmunizacin de animales se llev acabo en ratones Rockefeller de entre 2 y 3 meses de edad, para esto asistimos al bioterio, donde se llev acabo una familiarizacin con los animales y luego fueron inmunizados por va intraperitoneal con 3 preparaciones distintas, grupo 1 fue inmunizado con Albmina humana /Coadyuvante incompleto de Freund, grupo 2 con Albmina/Buffer Fosfato Salino y grupo 3 con Buffer Fosfato Salino/Coadyuvante incompleto de Freund, estas muestras fueron previamente preparadas en el laboratorio.

Posteriormente la obtencin del suero luego del tratamiento se llev acabo por sangramiento (no realizado dentro de la actividad). Aglutinacin y precipitacin Para la tcnica de aglutinacin y precipitacin, se realizaron dos tcnicas, la inmunodifusion doble para precipitacin y la aglutinacin en ltex de protena c reactiva. En la inmunodifusion doble se prepar un gel de agarosa al 1%, luego se tom un volumen de 2mL aproximadamente y se deposit sobre un portaobjeto hasta su solidificacin, una vez solido con un sacabocado se perforo el gel de acuerdo al esquema mostrado en la Figura 1, las perforaciones se llenaron con el antisuero Antialbumina humana y antisuero humano, y diferentes antgenos Albumina humana, albumina no humana, y suero humano, finalmente se incubo para luego observar la reaccin antgeno anticuerpo. Para la tcnica de precipitacin de utilizo la prueba HUMATEX CRP, esta prueba se basa en la reaccin inmunolgica de la protena C reactiva de la muestra y el correspondiente anticuerpo anti-PCR humano que recubre las partculas de latex.
Figura 1. Esquema de perforacin portaobjetos con agar para precipitacin (inmunodifusion doble).

Inmunofluorescencia

En la tcnica de inmunofluorescencia los anticuerpos utilizados se unen a un fluorforo que permite detectar si interaccin con el antgeno, durante la actividad prctica se evalu la presencia de dos protenas, p120 y -catenina en clulas endoteliales y clulas de cncer de mama. El anticuerpo para p-120 fue de origen murino, en el caso de -catenina se utiliz un anticuerpo de conejo. Luego de que las clulas se encontraran fijadas se procedi a realizar el protocolo de bloqueo y lavado, seguido de la incubacin en cmara hmeda con los correspondientes anticuerpos primarios y secundarios, finalmente los covers fueron puestos en un portaobjeto con solucin de montaje y guardados a 4C en oscuridad. Ensayo ELISA El ensayo ELISA realizado en la actividad prctica fue un ensayo indirecto (Figura 2), la

Figura 2. Esquema de ELISA indirecto, un antgeno se une a una placa ELISA y luego se incuba con un primer anticuerpo, este reconoce al antgeno y luego se agrega un anticuerpo secundario conjugado a una enzima, este reconoce al primer anticuerpo, luego se agrega un sustrato para la enzima conjugada que dar una reaccin, permitiendo ver un producto coloreado proporcional a la cantidad de antgeno presente en la muestra.

deteccin se realiz en placas de poliestireno de 96 pocillos donde previamente se fijaron los antgenos de inters, para luego agregar las muestras diluidas de los sueros de ratones inmunizados durante la primera actividad prctica, el procedimiento incluyo el bloqueo de la placa con leche descremada 5% en PBS pH7.0, esto se incubo a 37C por una hora, luego se incubo la placa con las distintas diluciones de suero (1:100, 1:500, 1:1000), se colocaron 100uL por pocillo. Posteriormente se lav la placa y se incubo con un anticuerpo secundario, se agregaron 100uL por pocillo de anti-IgG de ratn conjugada con Peroxidasa. Finalmente el revelado se realiz usando una solucin de sustrato Ortofenilendiamina 1mg/mL en buffer Fosfato-Citrato, se incubo por 10 minutos y luego se detuvo la reaccin con cido Sulfrico 2.5M. La lectura de placas se llev acabo a una longitud de onda de 490nm. Resultados En el primer trabajo prctico se inmunizaron ratones Rockefeller de entre 2 y 3 meses con 3 soluciones distintas, grupo 1 fue inmunizado con Albmina humana/Coadyuvante incompleto de Freund, grupo 2 con Albmina/Buffer Fosfato Salino y grupo 3 con Buffer Fosfato Salino/Coadyuvante incompleto de Freund. El coadyuvante incompleto de freund consiste en una solucin acuosa de antgeno, junto con aceite mineral y un agente dispersante, esto permite liberar lentamente el antgeno para lograr un estmulo persistente, en esta actividad no se observaron resultados como tal pero si se espera que el grupo 1 el cual fue inmunizado con Albmina humana/Coadyuvante incompleto de Freund presente ms anticuerpos que los otros dos grupos, ya que permite que la reaccin sea ms mantenida en el tiempo no como en el caso del grupo 2 donde el buffer no tiene efecto sobre la reaccin de defensa del ratn, el grupo 3 no debera mostrar anticuerpos ya que el buffer no reacciona al igual que el coadyuvante incompleto de Freund. En el caso de la inmunodifusion doble se esperaba ver reaccin entre suero antialbumina humana y antialbumina humana en los pocillos 1 y 2 respectivamente, esto fue concordante con el resultado observado en la Figura 3 donde se observo reaccin entre el antisuero de albumina humana y la antialbumina humana, no asi con albumina no humana, para el caso del pocillo 4 donde se agrego antisuero humano se esperaba ver reaccin en ambos pocillos inferiores ya que la albumina es una protena que se encuentra en el suero humano, por lo tanto vemos que hay una pequea reaccin entre los pocillos 4 y 5 donde se encontraba la albumina, en el caso del pocillo 6 habia una muestra de suero humano por lo que la reaccin se ve mucho mas aumentada.

Figura 3. Reaccion de Inmunodifusion doble. Pocillo 1, suero antialbumina humana, pocillo 2, antialbumina humana, pocillo 3, albumina no humana, pocillo 4, antisuero humano, pocillo 5 albumina humana y pocillo 6 suero humano.

En la precipitacin por ltex se observ precipitacin en las muestras que dieron positivo para protena C reactiva de acuerdo a lo indicado por el kit. En el ensayo de inmunofluorescencia que quiso determinar la presencia de dos protenas p120 y -catenina en clulas endoteliales y de cncer de mama, ambas funcionan como parte de las uniones adherentes en las clulas mencionadas, luego de llevado a cabo el protocolo de inmunofluorescencia se obtuvo el resultado que se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Inmunofluorescencia de clulas endoteliales y de cncer de mama, se detect la presencia de protenas de uniones adherentes p120 y -catenina.

Se ve en la imagen de clulas endoteliales la presencia de p120 en las uniones de cada clula, estas adems se encuentran formando una monocapa de clulas, la IF permite ver la forma de la clula de acuerdo al contorno que fue marcado con el anticuerpo para esta protena. Las clulas tumorales al centro presentan una prdida de adherencia celular, por ende no se observa tincin especifica de p-120, en la tercera imagen se ve la inmunofluorenscencia obtenida para clulas tumorales tratadas con LDBK, un agonista de receptores B1, estos receptores se encuentran acoplados a protenas G y su principal ligando es la Bradicinina, pptido que es sintetizado en inflamacin, trauma, alergias, entre otros. El ensayo ELISA indirecto realizado en la ltima sesin se realiz con los sueros obtenidos de los ratones inmunizados en la primera actividad prctica, posteriormente se midi la

Figura 5. Determinacin de Absorbancia en placa de ELISA. Se muestra una mayor absorbancia en las muestras de Albumina humana/ Coadyuvante incompleto de Freund, intermedia en las muestras de Albumina/ Buffer Fosfato Salino y una absorbancia mas baja en las muestras

absorbancia de la placa a 492 obtenindose los resultados mostrados en la Figura 5. Vemos que la absorbancia corresponde con las muestras aplicadas en cada pocillo y lo que se esperaba obtener en relacin a la inmunogenicidad provocada en el animal, tambin hay una disminucin en cada dilucin realizada, en este caso es importante tener en cuenta el factor de dilucin que permitir conocer la concentracin real de esas muestras, los pocillos que presentan una absorbancia mayor corresponden a los sueros de los ratones Albmina humana/Coadyuvante incompleto de Freund luego los ratones del grupo dos Albmina/Buffer Fosfato Salino y finalmente la solucin menos inmunogenica fue la solucin de Buffer Fosfato Salino/ Coadyuvante incompleto de Freund.