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GENETICA BACTERIANA INTRODUCCIN Las bacterias son microorganismos con una extraordinaria capacidad de adaptacin a diferentes condiciones ambientales.

Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer las bases de su gentica, es decir como esta organizada la informacin gentica, como realizan y regulan su expresin, que mecanismos de variacin gnica poseen. Entre otras, la capacidad infecciosa de las bacterias patgenas, radica en que poseen la informacin gnica necesaria para colonizar los tejidos de un husped, invadirlos y/o producir sustancias txicas que en definitiva causarn la enfermedad. Por otro lado, el conocimiento del modo de funcionamiento gentico de las bacterias, sumado al hecho de que estos microorganismos son de relativo fcil manejo en el laboratorio, que en general tienen un rpido crecimiento, ha llevado a que podamos utilizarlos para sintetizar productos tiles a la medicina, tanto para el diagnstico como para la prevencin y tratamiento de varias enfermedades. Estas posibilidades se han visto incrementadas a partir del desarrollo de la ingeniera gentica y la disponibilidad de tcnicas de biologa molecular. EL GENOMA BACTERIANO: SU ESTRUCTURA Toda la informacin gentica esencial para la vida de la clula bacteriana, est contenida en una nica molcula de ADN de doble cadena, circular y covalentemente cerrado, a la que podemos referirnos como cromosoma bacteriano. Muchas bacterias, poseen adems ADN extra cromosmico, tambin circular cerrado, denominado ADN plasmdico, por estar contenido en estructuras llamadas plsmidos, que portan informacin gnica para una variedad de funciones no esenciales para la clula en condiciones normales de crecimiento. En trminos bioqumicos, la composicin y estructura de los cidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier clula. Brevemente, conviene recordar que los cidos nucleicos son macromolculas compuestas de nucletidos unidos en forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3 y 5 de dos residuos de azcares adyacentes, que conforman un esqueleto de azcares y fosfatos que es constante a lo largo de toda la macromolcula. La variacin entre los distintos nucletidos que conforman la cadena de cido nucleico, esta dada por sus bases nitrogenadas, que en el caso del ADN son Adenina (A), Timina (T), Citocina (C) y Guanina (G), y en el caso del ARN en vez de T se encuentra Uracilo (U). A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan bases

pirimidnicas o pirimidinas. De esta manera, una cadena o hebra de cido nucleico, tendr una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El ADN como macromolcula, esta compuesto por 2 cadenas nucleotdicas o hebras antiparalelas, que se enlazan entre si conformando una doble hlice. Los enlaces entre las dos hebras de ADN estn dados por puentes de hidrgeno entre las purinas de una cadena con las pirimidinas de la otra. De esta forma, la A forma dos puentes de hidrgeno con la T, mientras que la C forma 3 puentes de hidrgeno con la G. A esto se le llama complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo es a la G.(Fig. 1) Estos enlaces permiten mantener estable la estructura de la doble hlice de ADN en la que pueden distinguirse pares de nucletidos o mejor dicho pares de bases (pb). Estos pb pueden utilizarse como unidad de tamao o longitud para las molculas de ADN, y de esa manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosmico de Escherichia coli tiene un tamao de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo 4.200 kilobases (Kb). Como sabemos, todas las clulas deben enfrentarse al problema de como lograr contener en su estructura molculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E. coli, los 4.200 Kb de su genoma, implican una longitud de 1,3 mm, es decir unas 1.000 veces la longitud de la clula. Las bacterias, no poseen histonas asociadas a su genoma y por tanto no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las clulas eucariotas. Por lo tanto, deben solucionar el dilema de como compactar su cromosoma de otra manera. Esto se logra, porque el ADN circular cerrado es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada de superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la doble hlice sobre si mismo. (Fig. 2) Este superenrollamiento se dice que tiene sentido negativo, porque es en el sentido contrario al del enrollamiento de una hebra de ADN sobre la otra, y supone para la bacteria una fuente de almacenamiento de energa para ser utilizada en una variedad de procesos fisiolgicos que la requieren, como por ejemplo la separacin de las 2 hebras de ADN necesaria para la replicacin y la transcripcin. El cromosoma bacteriano, es suficientemente largo como para formar varios lazos circulares, que como tales pueden a su vez superenrollarse, formando de esta manera una

serie de dominios topolgicos independientes. Esta organizacin en dominios, colabora al estado de compactacin general del genoma bacteriano, e impide que con la ruptura de una hebra en un punto cualquiera del cromosoma, se pierda el total del superenrollamiento, manteniendo de esta forma la energa almacenada. Las bacterias poseen enzimas capaces de alterar la estructura del ADN modificando su superenrrollamiento. Estas enzimas que se denominan genricamente "topoisomerasas", actan introduciendo o eliminando vueltas superhelicoidales, cumpliendo un importante rol en los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. Por otra parte, es interesante mencionar que algunas de estas topoisomerasas, como la ADN girasa, son blanco de accin para los antibiticos del grupo de las quinolonas, como el cido nalidxico. LOS PLASMIDOS SON ADN EXTRACROMOSOMICO Como ya dijimos, muchas bacterias poseen informacin gnica contenida en molculas de ADN distintas a las del cromosoma bacteriano, denominadas plsmidos. Los plsmidos, son molculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicacin independiente del cromosoma. Por esto pueden encontrarse ms de una copia del mismo plsmido dentro de la clula bacteriana. En general los plsmidos de mayor tamao, se encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los mas pequeos pueden estar en hasta 100 copias por clula (plsmidos multicopia). Si bien el ADN plasmdico no porta informacin gentica esencial para la vida de la bacteria, s portan genes que le confieren nuevas propiedades fenotpicas y que en algunos casos le son muy tiles para su adaptacin al crecimiento en ciertos ambientes. Muchas bacterias potencialmente patgenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales, cuando portan un plsmido en particular que contiene genes que le permiten expresar molculas de adhesin a los tejidos del husped o sintetizar sustancias txicas para ste. Como ejemplo, podemos mencionar el caso de la produccin de la toxina tetnica, por Clostridium tetani, agente causal del ttanos.

En muchos casos, los plsmidos contienen genes que codifican para enzimas capaces de degradar algunos antibiticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la accin de los mismos. Este es el caso de la produccin de beta lactamasas por cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus o Haemophylus influenzae, que poseen un plsmido que les confiere resistencia a ciertos antibiticos beta lactmicos como Penicilina y Ampicilina. Los plsmidos pueden clasificarse segn distintos criterios, por ejemplo por su tamao en pb, su nmero de copias en la bacteria o por el tipo de genes que porta (plsmidos de virulencia, plsmidos de resistencia a antibiticos, etc.) Tambin pueden clasificarse en grupos de incompatibilidad. Se dice que dos plsmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si son incapaces de coexistir en la misma clula bacteriana. Muchos plsmidos, en general los de mayor tamao (que pueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a otra mediante un proceso llamado conjugacin. Estos plsmidos de conjugacin codifican todos los factores necesarios para su transferencia. Algunos plsmidos mas pequeos, no conjugativos, pueden ser movilizados es decir que poseen la secuencia necesaria para permitir su transferencia, pero no codifican por ellos mismos las protenas necesarias para ser transferidos. Por ltimo, algunos plsmidos no se transfieren en absoluto. La adquisicin de ADN plasmdico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios distintos a la conjugacin, como transformacin, transduccin mediada por fagos o incorporacin en el cromosoma, segn veremos mas adelante. LAS BACTERIAS PUEDEN TENER GENES SALTARINES Los elementos transponibles, son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posicin a otra en el genoma, es decir transponerse o saltar desde un sitio determinado del genoma, escindindose del resto del ADN, hasta otro sitio distinto, integrndose. Pueden saltar del cromosoma a un plsmido y visceversa o a distintos sitios dentro de la misma molcula de ADN. Los elementos transponibles estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, clulas procariotas y eucariotas. Existen 2 variedades de elementos transponibles: 1) Las secuencias de insercin (elementos IS) 2) Los transposones (Tn) Los elementos IS, son segmentos de ADN relativamente pequeos, de aproximadamente 1 a 2 Kb que contiene la informacin gentica mnima, necesaria para la transposicin. Poseen secuencias especficas en ambos extremos del fragmento, que consisten en repeticiones invertidas una respecto a la otra. Estas secuencias, son reconocidas

especficamente por enzimas codificadas dentro del mismo elemento IS, denominadas transposasas responsables de la integracin del elemento en su sitio blanco del genoma. Los Tn son segmentos de ADN que adems de portar la informacin necesaria para la transposicin, contienen genes extra, que pueden codificar para muy distintas propiedades fenotpicas, encontrndose entre las mas importantes desde el punto de vista clnico, la resistencia a antimicrobianos como ser el caso de la resistencia de alto nivel a la gentamicina encontrada en algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plsmidos, poseen uno o mas Tn que portan determinantes de resistencia a antibiticos, y la capacidad de estos elementos para saltar de un plsmido a otro, proporciona a las bacterias una gran flexibilidad para desarrollar resistencia, debido a que estos plsmidos son en general conjugativos, por lo que pueden transferirse entre distintas bacterias. La insercin de un elemento transponible, puede producir una variedad de efectos sobre la expresin de la informacin gnica, como impedir la funcionalidad de un gen, o activar la expresin de otro. REPLICACION DEL ADN BACTERIANO El genoma completo de una clula, tanto sea procariota como eucariota, debe replicarse con exactitud una vez por cada divisin celular. Por tanto, la iniciacin de la replicacin compromete a la clula a una divisin posterior. Si se inicia la replicacin, la divisin consiguiente no debe ocurrir hasta que se haya completado la replicacin y de hecho, el final de la replicacin puede disparar la divisin celular.

Las bacterias, a diferencia de las clulas eucariotas, son capaces de replicar su ADN a lo largo de todo su ciclo celular.

Se denomina replicn a cada unidad de replicacin del ADN el cual contiene todos los elementos requeridos para regular este proceso. El cromosoma bacteriano, se replica a partir de un nico origen, que se mueve de forma lineal hasta completar la duplicacin total de la molcula, por lo que constituye un replicn. Esto facilita su regulacin, que est centrada en la etapa de iniciacin, una vez que la replicacin del cromosoma se inicia en el origen, todo el cromosoma ser duplicado. Los plsmidos, constituyen replicones independientes del cromosoma, dando lugar a una replicacin por ciclo celular coordinada con la replicacin genmica (plsmidos unicopia) o puede permitir varias replicaciones por ciclo (plsmidos multicopia). El punto en el que el ADN se est duplicando, se llama horquilla de replicacin. La replicacin puede ser unidireccional o bidireccional, segn se formen una o dos horquillas en el origen. Generalmente, los cromosomas bacterianos tienen replicacin bidireccional, mientras que algunos plsmidos pueden replicarse unidireccionalmente. En la replicacin unidireccional, una horquilla sale del origen y progresa a lo largo del ADN. En la bidireccional se forman dos horquillas que se alejan del origen en direcciones opuestas hasta que se encuentran completando la duplicacin. Esto permite a la bacteria duplicar su ADN mas rpidamente, que si el proceso fuera unidireccional, pudiendo replicar mas de 1000 pb por segundo. Es de destacar que a pesar de tal velocidad de replicacin, la fidelidad de la misma es muy grande, siendo la frecuencia de mutaciones espontneas del orden de 1 cada 107 a 1011 pb replicados.

La replicacin es semiconservativa porque cada molcula de ADN posee una cadena del ADN original y una "nueva" lo cual resalta la importancia de la complementariedad de bases en la estructura del ADN (Fig. 3). Las enzimas encargadas de catalizar el proceso de replicacin, se denominan ADN polimerasas. En E. coli se conocen 3 ADN polimerasas distintas. La responsable de la mayor parte de los procesos de replicacin es la llamada polimerasa III, mientras que las polimerasas I y II cumplen fundamentalmente roles en la reparacin de rupturas o de errores en las molculas de ADN. Tambin participan otras enzimas, como son las llamadas helicasas, responsables de desenrollar el ADN en el origen o cerca de l, paso que resulta indispensable para iniciar la replicacin. Esquemticamente, podemos decir que la replicacin consta de 3 fases: iniciacin, elongacin y terminacin. La iniciacin, se da a partir del origen del replicn donde se forma la o las horquillas de replicacin, por la accin de helicasas que desenrollan la estructura del ADN, formndose as una porcin monocatenaria que estar en condiciones de formar un complejo con ciertas protenas de unin al ADN encargadas de estabilizar la cadena sencilla, evitando la formacin de puentes de hidrgeno. Se sintetiza un corto oligonucletido de ARN con un grupo 3 oxidrilo libre, que actuar como cebador o primer, sobre el que la ADN polimerasa agrega los nucletidos. La elongacin, consiste en el avance de la horquilla de replicacin, conforme se van agregando nucletidos a la cadena neosintetizada, en un orden establecido por las reglas de complementariedad de bases (A con T y C con G) entre la cadena molde y la nueva cadena en sntesis. En esta etapa participa fundamentalmente la ADN polimerasa III. Todas las polimerasas conocidas, agregan nucletidos en direccin 5- 3 para el crecimiento de la cadena, y requieren de una cadena de ADN molde, un cebador y por supuesto los nucletidos. (Fig. 4) La terminacin se da luego de que ambas horquillas de replicacin han atravesado la mitad del cromosoma en direcciones opuestas, y se encuentran en la regin terminal del genoma. En esta regin hay secuencias de ADN que actan como bloqueadores para el avance del las horquillas, por lo que se asegura que toda replicacin termine en esa pequea porcin del genoma son a menudo polignicos, es decir que contienen informacin para mas de una protena. El etremo 5se traduce cuando todava se est transcribiendo el extremo 3. Los ARNm eucariotas son monogenicos y requieren de modificaciones postranscripcionales antes de atravezar la membrana nuclear y llegar al citoplasma donde es traducido.

Fig. 5. Comparacin entre la expresin de los genes eucariotas y procariotas. Los ARNm procariotas LA EXPRESIN DE LOS GENES PROCARIOTAS: TRANSCIPCION Y TRADUCCION. La expresin gentica de todas las clulas depende de los procesos secuenciales de la transcripcin y la traduccin que en conjunto, transfieren la informacin contenida en la secuencia de nucletidos de un gen a la secuencia de aminocidos de una protena. Esto implica que, a partir de la dotacin gnica portada por la clula, o genotipo, se expresarn un conjunto de caractersticas evidenciables que constituirn el fenotipo celular. Durante la transcripcin, las reglas del apareamiento de bases son usadas por la ARN polimerasa para sintetizar un producto complementario a una cadena del ADN usado como molde, que constituye el ARN. Una de las clases mas importantes de ARN es el llamado mensajero, que lleva la informacin para la sntesis de protenas. La ARN polimerasa bacteriana, es distinta de la de las clulas eucariotas, y de hecho, ciertos antibiticos que tienen como blanco la ARN polimerasa (como la rifampicina) son efectivos exclusivamente frente a clulas procariotas. La ARN polimerasa, reconoce un sitio especfico en el ADN, llamado promotor, al cual se une, iniciando el proceso transcripcional. Un mismo transcripto, ARNm, puede contener la informacin correspondiente a ms de un gen, por lo que se traducir luego en mas de un

polipptido. El conjunto de genes que son transcriptos en un nico ARNm, y que por tanto se expresan en conjunto, se denomina opern. Los genes procariotas, no poseen intrones como los eucariotas, es decir que una vez transcripto el ARNm, ste ser traducido directamente en una secuencia polipeptdica, sin necesidad de realizar un procesamiento post-transcipcional. Otra importante diferencia con la expresin de los genes eucariotas, es que por no poseer las bacterias un compartimento nuclear definido, los procesos de transcripcin y traduccin, se encuentran acoplados. Es decir que mientras se est sintetizando una molcula de ARNm, el ARN naciente puede tomar contacto con los ribosomas e iniciar la sntesis proteica. (Fig. 5) Esto implica una ventaja para la clula bacteriana, y constituye una importante causa de su gran capacidad de adaptacin a diferentes ambientes, ya que le permite responder rpidamente a los estmulos sintetizando los productos proteicos necesarios en el momento adecuado. La traduccin es un proceso por el cual el ARN ribosmico, el ARN de transferencia (ARNt) y numerosas protenas ribosomales y otras, participan en la "lectura" del cdigo gentico dado por los tripletes de nucletidos o codones portados por el ARNm, y en la "escritura" de la secuencia correspondiente de aminocidos en el producto polipeptdico. El ribosoma desempea un papel fundamental, reuniendo al ARNm y a los ARNt cargados de aminocidos. La estructura y composicin en ARN y protenas de los ribosomas procariotas, difiere en cierta medida de la de los ribosomas eucariotas. Tienen una menor masa y por tanto un coeficiente de sedimentacin menor (50 S la subunidad mayor y 30 S la menor, haciendo en conjunto 70 S) Estas diferencias entre los ribosomas procariotas y eucariotas, del mismo modo que otras diferencias en la expresin del material gentico (polimerasas, topoisomerasas, protenas y mecanismos regulatorios, factores de elongacin) tienen una serie de implicancias. Una de stas es la sensibilidad diferencial de procariotas y eucariotas a sustancias como toxinas y antibiticos. Por ejemplo macrlidos, aminoglucsidos, cloramfenicol y otros son antimicrobianos que actan sobre el ribosoma bacteriano o el proceso de sntesis proteica, mientras que ciertas toxinas bacterianas como la diftrica, actan selectivamente a nivel de la sntesis proteica eucariota. Existen 2 sitios en el ribosoma, el aceptor (sitioA) donde los ARNt cargados se asocian en primer lugar, y el sitio peptdico (sitio P), donde se sujeta la cadena polipeptdica en crecimiento.

Durante cada paso de adicin de aminocidos, el ARNm avanza 1 codn y el nuevo aminocido se traslada del sitio A al sitio P, incorporndose a la protena en formacin. Como el cdigo gentico es universal, el significado de los codones es muy similar al de los eucariotas, aunque cabe mencionar que se encuentran algunas diferencias en los codones que determinan la iniciacin y la terminacin de la traduccin, as como en la preferencia de uso de ciertos codones. Como en los procesos de replicacin y transcripcin, el paso inicial de la traduccin es un importante punto de regulacin. LA REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN BACTERIAS Las bacterias tienen una gran variedad de mecanismos para controlar la expresin de sus miles de genes, con cual logran que el producto de un gen determinado, solo se sintetice cuando es necesario y en lo posible, en la cantidad ptima. Esto les permite una sorprendente capacidad de adaptacin a cualquier cambio en la concentracin de nutrientes del medio en que habitan, activando solo cuando es necesario, determinadas vas metablicas. As, las bacterias evitan sintetizar enzimas cuando falta el sustrato correspondiente, pero siempre estn preparadas para fabricarlas cuando aparece el sustrato en el entorno. Un importante mecanismo regulatorio desarrollado por las bacterias se basa en la activacin o desactivacin de la transcripcin de un grupo de genes cuyos productos tienen funciones relacionadas, que se encuentran organizados en una regin del genoma de forma de regular su expresin en conjunto. Esta forma de organizacin gentica, se denomina opern y le permite a la clula administrar en forma ptima sus reservas energticas. Un opern consiste en: un promotor que es el blanco de la regulacin; genes adyacentes que codifican cada una de las enzimas de una va metablica y una secuencia de terminacin de la transcripcin. De esta manera, todos los genes constituyentes de un opern, son transcriptos de manera coordinada, como ARNm policistrnico, es decir, multignico, que es traducido secuencialmente en protenas por los ribosomas. La iniciacin de la transcripcin puede regularse de forma positiva o negativa. Los genes bajo control negativo se expresan constantemente a menos que sean "desconectados" por una protena represora que evitar la expresin del gen mediante su unin a una secuencia especfica del ADN denominada operador, impidiendo que la ARN polimerasa inicie la transcripcin en el promotor.

Aquellos genes cuya expresin se encuentra bajo control positivo, no sern transcriptos a menos que est presente una protena activadora la cual se une a una secuencia especfica del ADN y ayuda a la ARNpolimerasa en los pasos iniciales de la transcripcin. Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. Se considera que los operones son inducibles cuando la introduccin de un sustrato en el medio aumenta la expresin de las enzimas necesarias para su metabolismo. Esos operones inducibles slo funcionan en presencia de una pequea molcula llamada inductor. Por otro lado, un mecanismo regulatorio por represin, es el caso de algunas enzimas cuya sntesis disminuye cuando se encuentran cantidades suficientes de los productos terminales de la va metablica correspondiente. Esto se denomina "represin por producto final" y en este caso los metabolitos terminales son molculas conocidas como correpresores. Un ejemplo clsico es el del opern lactosa (lac), descrito en E. coli. (Fig. ) Este opern, contiene un conjunto de genes cuyos productos son las enzimas responsables de la degradacin del azcar lactosa. En ausencia de lactosa en el medio, el opern es reprimido por la unin de una protena represora a la secuencia del operador, lo que impide la funcin de la ARN polimerasa. La adicin de lactosa anula esta represin, ya que el propio azcar acta como inductor, unindose a la protena represora, impidiendo que sta contine asociada al operador. Este mecanismo de control negativo, asegura que el opern lac se transcriba solo cuando se encuentra lactosa en el medio. Por otra parte, existe un mecanismo para aumentar al mximo la expresin del opern lac, basada en un mecanismo de control positivo, mediado por protenas activadoras. En el caso de E. coli, una protena llamada protena activadora del gen por el catabolito (PAC), forma un complejo con AMPc y adquiere la capacidad de unirse a una secuencia especfica del ADN presente en el promotor. La unin del complejo PAC-AMPc al ADN, potencia la unin de la ARN polimerasa al promotor, permitiendo as un aumento en la frecuencia de iniciacin de la transcripcin. De esta manera, se regula no solo la sntesis sino tambin la cantidad que se sintetiza, segn los requerimientos, de las enzimas responsables de la degradacin de la lactosa. Este mismo tipo de mecanismos reguladores de la transcripcin, se encuentran en muchas bacterias para una gran variedad de vas metablicas. Por otra parte, tambin existen operones que son regulados a nivel de la terminacin de la transcripcin, por un mecanismo especial llamado atenuacin, que es caracterstico de las vas biosintticas de aminocidos y est basada en la caracterstica de acoplamiento entre transcripcin y traduccin. Este es el caso del opern triptofano, en el que el promotor codifica para un pequeo pptido que contiene 2 Trp en una posicin crtica. Cuando hay suficiente cantidad del aminocido en el medio, el pptido se sintetiza rpidamente a partir

del promotor que es transcripto y luego traducido. Esto conduce a un cambio conformacional en el ADN correspondiente al opern, que permite que se reconozca una seal de terminacin de la transcripcin, entre el promotor y los genes estructurales, en donde la ARN polimerasa se separa del ADN y termina la transcripcin. Por el contrario, cuando no se encuentra suficiente Trp, el pptido no podr sintetizarse y la ARN polimerasa continuar transcribiendo el conjunto de los genes del opern. De esta manera, la clula solo sintetizar el aminocido, cuando no haya suficiente cantidad en el medio como para utilizarlo para sus necesidades biosintticas No solo a nivel de la transcripcin existe regulacin, sino que tambin existen mecanismos reguladores que actan a nivel de la traduccin y an luego de la misma. La velocidad de la traduccin de las diferentes secuencias de ARN transcriptos, puede variar mas de 1000 veces, segn el sitio de unin del ribosoma con el mensajero. En general, el control de la traduccin, se basa en la obstruccin del sitio de unin del ribosoma, ya sea por la unin de una protena al ARN ribosmico en ese sitio, o por el apareamiento de bases del mismo con otro fragmento de ARN. Este es el mecanismo utilizado para la regulacin de la sntesis de las protenas ribosomales, cuyos genes tambin se encuentran organizados en operones. Por ltimo, existe tambin una regulacin postraduccional, que le es til a la clula bacteriana para inactivar enzimas innecesarias, ya que hay que considerar que si bien tienen mecanismos para dejar de producir enzimas cuando no las requieren, stas tienen una vida media relativamente larga, y en ciertas ocasiones le es ms redituable desde el punto de vista energtico inactivar las enzimas de una ruta biosinttica, que asumir el gasto de ATP correspondiente al funcionamiento de la ruta, cuando el producto se encuentra disponible en el medio. VARIACION GENOTIPICA: MUTACIONES Y TRANSFERENCIA DE GENES Como vimos, las bacterias tienen mecanismos que les permiten variar su expresin gnica favoreciendo la sntesis de los productos de ciertos genes y reprimiendo las de otros. Estos mecanismos pueden llamarse de variacin fenotpica, ya que implican una serie de cambios en el fenotipo celular o de la poblacin bacteriana. A su vez, tambin tienen mecanismos de variacin genotpica, que sern igualmente traducidos en cambios fenotpicos, pero que se basan en una modificacin de la informacin gentica contenida en la clula. Bsicamente, existen 2 formas de variacin genotpica en bacterias. Por un lado, el genoma est sujeto a sufrir cambios debidos a mutaciones y por otro lado, las clulas bacterianas pueden intercambiar material gentico y de esa forma sufrir recombinacin. Una mutacin es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos que constituyen el genoma de un organismo, que ocurren en condiciones naturales con una muy

baja frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicacin del ADN. Adems de las mutaciones espontneas, pueden ocurrir tambin mutaciones inducidas, provocadas por agentes mutagnicos que pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos los cuales proporcionan una herramienta para introducir cambios en el genoma bacteriano en el laboratorio. La mayora de estos errores o alteraciones introducidos en el genoma, son corregidos por los mecanismos de reparacin del ADN, pero algunos escapan a la correccin y pueden dar lugar a cambios heredables que proporcionan una diversidad gentica. Dada la baja frecuencia de mutaciones, solo los microorganismos, con su alta tasa de crecimiento, pueden alcanzar las cifras suficientemente altas como para que sean detectables.

Las mutaciones en bacterias, frecuentemente afectan propiedades fcilmente nutricionales, morfologa o resistencia a antibiticos. Algunas mutaciones, pueden conferir al mutante una ventaja frente a la cepa que le dio origen, bajo ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie de dicha clula mutante es capaz de superar el crecimiento de la cepa natural y sustituirla. Este es el caso de las mutaciones que confieren resistencia a los antibiticos, en las que el mutante resistente se seleccionar en un ambiente en el que las bacterias estn expuestas al antibitico en cuestin. Este tipo de mutaciones se denominan selectivas. En cambio, frente a una mutacin no selectiva la bacteria no adquiere beneficios en relacin a su progenitor,

como por ej. la prdida de pigmento de las colonias de Serratia marcescens que se observa al ser cultivadas en agar. Las mutaciones puntuales, son aquellas que implican un cambio en una nica base, y pueden provocar que se cambie un aminocido por otro en el producto proteico (mutacin por cambio de sentido). Otras veces no se traducen en ningn cambio (mutacin silenciosa), ya que como sabemos existe mas de un codn para cada aminocido. Tambin puede suceder que el codn se convierta en una seal de terminacin (mutacin sin sentido) y en ese caso se traducir una protena incompleta no funcional. Las deleciones y las inserciones dan lugar a cambios ms notorios en el ADN, provocando la prdida o la incorporacin de cualquier nmero de pares de bases, por lo que siempre que este no sea un mltiplo de 3 se producirn mutaciones por desplazamiento del marco de lectura que suelen provocar la prdida total del fenotipo. Muchas mutaciones que originan un producto proteico defectuoso, pueden ser suprimidas por un segundo evento de mutacin en otro sitio del genoma (mutaciones supresoras) restaurndose el fenotipo original. La recombinacin gentica es el proceso mediante el cual elementos genticos contenidos en genomas de diferentes individuos se combinan, lo que permite que el individuo lleve a cabo alguna nueva funcin y que puede dar como resultado una adaptacin a los cambios en el medio ambiente. Este es un evento evolutivo importante y las clulas tienen mecanismos especficos que aseguran que dicha recombinacin se efecte. A diferencia de los eucariotas donde la recombinacin gentica ocurre en asociacin a la reproduccin sexual, en los procariotas comprende una serie de mecanismos independientes del evento de reproduccin celular. Estos mecanismos son llamados transformacin, transduccin y conjugacin. La transformacin es el proceso por el cual ciertas bacterias llamadas competentes son capaces de incorporar ADN exgeno o extrao, proveniente de otras bacterias, que se encuentra libre en el medio. La virulencia del Streptococcus pneumoniae guarda relacin con la presencia de cpsula polisacardica a su alrededor. Las bacterias con cpsula tienen un aspecto liso (S) cuando se cultivan en placas de agar y son capaces de matar a los ratones que son inyectados experimentalmente con una suspensin bacteriana. Las colonias con bordes rugosos (R) de S. pneumoniae, carecen de cpsula y no son letales al infectar ratones. Frederick Griffith en 1928 observ por primera vez la transformacin cuando mezcl bacterias S muertas con bacterias R vivas y encontr que al inyectar la mezcla en ratones resultaba letal. De esto concluy que las R haban sido sustitudas o "transformadas" en bacterias S, ahora capaces de fabricar el polisacrido capsular virulento.

La capacidad de captar el ADN exgeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con l se denomina competencia. La competencia depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico asociado a membrana (Fig. 6). Ejemplos de bacterias con competencia natural son Haemphilus influenzae, Neisseria sp., Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Si bien la mayora de las bacterias no presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando por distintos medios distorsiones en la membrana celular, por ejemplo mediante pulsos elctricos (electroporacin) o mediante cambios osmticos y trmicos. Estos procedimientos son muy utilizados para introducir experimentalmente ADN extrao, por ejemplo un plsmido, en una bacteria y as transformarla para que adquiera un fenotipo de inters. Las bacterias tambin pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfeccin. La transduccin es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacterifago. Existen dos formas de transduccin la especializada y la generalizada. La primera ocurre cuando un fago temperado porta genes bacterianos adquiridos durante un ciclo infeccioso anterior, y al infectar una nueva bacteria e integrar su genoma al cromosoma bacteriano, incorporar a ste la informacin gentica correspondiente a la bacteria infectada previamente. La transduccin generalizada es llevada a cabo por partculas virales defectuosas, que se originan como cpsides vacas durante la replicacin viral y que luego incorporan ADN de una bacteria, as al infectar una nueva bacteria podr introducir en ella dicho material gentico. La conjugacin se basa en el intercambio unidireccional de informacin gentica desde una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real (Fig. 8). La conjugacin se produce en la mayora de las eucariotas, entre miembros de la misma especie, pero se ha demostrado tambin entre procariotas y clulas vegetales, animales y hongos. Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La capacidad de conjugacin depende de la presencia en la bacteria de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy conocido de plsmido conjugativo lo constituye el plsmido F de E. coli que codifica diversas protenas necesarias para la conjugacin, incluyendo el pili sexual. Esta es una estructura especializada esencial para el contacto entra la bacteria donadora y la receptora. En general, los plsmidos conjugadores solamente causan la transferencia de su propio material gentico pero en ocasiones el plsmido puede integrarse al cromosoma bacteriano y por tanto al momento de conjugar, se transferir no solo a s mismo sino tambin a los genes cromosmicos que se encuentran tras l. Tericamente todo el cromosoma podra ser transferido, lo que requerira ms de 2 hs, pero la unin entre las bacterias por medio del pili persiste menos tiempo. Las cepas bacterianas con el plsmido F tienen una gran capacidad de recombinacin por lo que se denominan cepas hfr (high

frecuency of recombination). Debemos recordar que este es un mecanismo muy efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibiticos. APORTES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Y LA GENETICA BACTERIANA A LA MEDICINA Una de las contribuciones mas grandes de la ingeniera gentica de bacterias, es su uso para el desarrollo de vectores o vehculos que permiten el clonado de cualquier secuencia de ADN. Los vectores mas ampliamente utilizados con este fin, son los plsmidos bacterianos. Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los vectores de clonacin, deben permitir la insercin de un fragmento de ADN extrao y ser capaces de replicarse normalmente dentro de la bacteria. Como vimos, los plsmidos tienen la capacidad de autoreplicarse y son elementos gnicos factibles de ser transferidos entre bacterias e introducidos en (como el pBR322 o el pUC) y tambin vectores virales (como el bacterifago lambda) o los mas modernos llamados csmidos que combinan algunas de las ventajas de los plmidos con las de los fagos.

Para clonar un gen cualquiera en un plsmido, es necesario en primer lugar cortar el ADN plasmdico y el ADN del cual procede el gen a clonar, para luego ligarlos de la manera deseada. Para esto, existen unas valiosas herramientas de la ingeniera gentica, que son las enzimas de restriccin. Muchas bacterias, sintetizan este tipo de enzimas, que son capaces de cortar hebras de ADN extraas a la propia bacteria, en secuencias nucleotdicas especficas. Por ejemplo, una cepa determinada de E. coli, produce una enzima denominada EcoRI. Que reconoce la secuencia GAATTC y la corta (Ver Fig.) As, luego que EcoRI ha cortado, quedarn bases sin aparear, que estarn disponibles para aparearse con otro

fragmento de ADN que posea las bases complementarias. Si cortamos 2 fragmentos de ADN con esta enzima, y mezclamos los productos de esa reaccin, se obtendr un producto recombinante, combinacin de los 2 ADN originales. Estas enzimas, que han sido hace tiempo purificadas y hoy se producen comercialmente, son utilizadas para clonar genes en por ejemplo un plsmido bacteriano. De esta manera, es posible por estos mtodos incorporar en un plsmido bacteriano un gen eucariota que codifique para una protena determinada que nos interese producir en grandes cantidades, siempre que se conozca su secuencia nucleotdica y se disponga de enzimas de restriccin que sean capaces de cortar especficamente el fragmento de ADN que contiene el gen. Una vez obtenido el fragmento de ADN de inters y cortado el plsmido a ser utilizado como vector con las mismas enzimas de restriccin, estaremos en condiciones de ligar ambos fragmentos de ADN, valindonos de las propiedades de complementariedad de bases del ADN, construyendo lo que se llama un plsmido recombinante. Este plsmido, podr ser introducido por transformacin en una cepa bacteriana apropiada y se podr producir la protena de inters en un cultivo bacteriano de E. coli, purificndola luego a partir del cultivo. Utilizando estos procedimientos de clonado y expresin de genes, actualmente se producen muchas protenas que son utilizadas para el tratamiento de diversas enfermedades humanas, como por ejemplo la diabetes, al producir la hormona humana insulina u otras como la hormona de crecimiento o el interfern, en bacterias recombinantes obteniendo cantidades suficientes como para su aislamiento y uso teraputico. Por otra parte, la disponibilidad de antibiticos naturales para el tratamiento de las infecciones bacterianas, no es infinita, por lo que otra importante rea de investigacin, se centra en la aplicacin de la ingeniera gentica a la creacin de nuevos frmacos antimicrobianos. Por manipulacin gentica, se intenta producir mutaciones especficas en los genes encargados de la codificacin de protenas con efecto antibitico o producir molculas de antibiticos hbridos, logrados por tcnicas de ADN recombinante.

Otra importante aplicacin de la biologa molecular a la medicina, es la produccin de vacunas recombinantes contra infecciones vricas o parasitarias, en bacterias. Este procedimiento, se basa en la expresin en bacterias de genes de patgenos que codifican por ejemplo antgenos de superficie del virus o del parsito contra el que se desea vacunar, que sean capaces de actuar como inmungenos adecuados en la vacunacin. As, clonando los genes apropiados en los microorganismos adecuados, podrn producirse grandes cantidades del antgeno puro. Este mtodo, proporciona la ventaja de que se evita trabajar con microorganismos patgenos. El desarrollo de la vacuna contra la hepatitis B representa el primer xito de las vacunas recombinantes. Esta vacuna, es producida en una levadura, que ha sido transformada previamente con un vector recombinante que contiene el gen del virus clonado, encargado de codificar para una protena de superficie inmunognica. Estos mtodos, pueden emplearse tambin para la produccin de vacunas vivas, es decir vacunas a ser administradas con virus o bacterias vivas, que han sido manipuladas genticamente para perder su virulencia pero que mantienen intactas sus propiedades inmunognicas. A su vez, estos microorganismos, denominados atenuados, pueden utilizarse como vectores de genes de otros grmenes patgenos, y lograr producir una vacuna que inmunice contra mas de una enfermedad infecciosa a la vez. Estos procedimientos, son motivo de investigacin en los laboratorios de desarrollo de vacunas en todo el mundo.

BIOTECNOLOGIA APLICADA AL DIAGNOSTICO CLINICO Otra utilidad de la produccin de antgenos a escala industrial en bacterias, es para la realizacin de pruebas diagnsticas que detecten anticuerpos especficos contra antgenos microbianos en el suero de pacientes. En estos casos, interesa clonar en una bacteria de rpido crecimiento como E. coli, el gen que codifica para un antgeno determinado del microorganismo contra el cual se desea detectar la respuesta inmune montada por el paciente. De esta manera se producir el antgeno proteico en cantidad suficiente, como para utilizarlo como "captura" de anticuerpos en la tcnica elegida para la prueba diagnstica, ya sea esta ELISA, Inmunofluorescencia, aglutinacin de partculas de ltex u otras. Un ejemplo de esto, es el reciente desarrollo de una tcnica de ELISA para la deteccin de anticuerpos dirigidos contra el antgeno del core del virus de hepatitis B, habindose este antgeno clonado y expresado en E. coli. Las bacterias patgenas, se comportan como tales porque poseen ciertos genes, portados tanto por su cromosoma como en plsmidos, que le confieren la capacidad de expresar determinadas caractersticas fenotpicas denominadas factores de virulencia o determinantes de patogenicidad. El estudio detallado de la gentica bacteriana, ha permitido identificar varios de estos genes y hoy da somos capaces no solo de identificar a una bacteria como patgena cuando la aislamos produciendo enfermedad, sino tambin, cuando encontramos en ella los genes responsables de la expresin de determinantes de patogenicidad. Esto es especialmente importante, en los casos en que no alcanza con identificar a nivel de especie una cepa bacteriana aislada de una muestra patolgica, para poder afirmar que esa bacteria es el agente causal del proceso infeccioso. Este es el caso de las enfermedades diarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli. Como sabemos, E. coli forma parte de la microflora normal del tracto intestinal del hombre, y por supuesto esas bacterias no actan como patgenos en el intestino. Sin embargo, algunas cepas especiales de la misma especie, cuando alcanzan a colonizar el tracto gastrointestinal, a travs de la ingesta de alimentos o agua contaminados, son capaces de multiplicarse a ese nivel y causar un proceso infeccioso que se manifiesta con un cuadro diarreico. Estas cepas productoras de diarrea, difieren en su carga gentica de las pertenecientes a la flora normal, en que poseen genes que codifican para factores de virulencia, por ejemplo pueden ser capaces de producir toxinas cuyo blanco de accin es el enterocito, o producir determinadas protenas de membrana externa, que la capacitan para adherirse a la mucosa intestinal. Entonces, a la hora de establecer un diagnstico clnico microbiolgico en un cuadro diarreico, por ejemplo en un lactante (rango etario donde E .coli es el primer agente causal de diarrea) no alcanzar con identificar fenotpicamente como E. coli una cepa aislada del coprocultivo, sino que habr que determinar que esta cepa posee los determinantes de patogenicidad adecuados. Una opcin para esto, es hoy identificar la presencia de los genes que codifican para estos determinantes.

Para esto, se han desarrollado tcnicas denominadas de hibridacin por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN. Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a una regin de un gen que nos interesa identificar, que ha sido marcada con algn indicador que pueda ser detectado luego de la hibridacin. El marcado puede realizarse incorporando nucletidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un cultivo bacteriano interesa saber si sta posee el gen X cuya secuencia conozco, podremos construir una sonda especfica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con nuestra sonda, en condiciones que permitan desnaturalizar la estructura de doble cadena del ADN para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria. De esta forma, podremos evidenciar si nuestro cultivo posee o no el gen buscado, ya que de estar presente, encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada en la estructura del ADN. Esta tcnica puede utilizarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clnica, por ejemplo una seccin tisular, y en ese caso se denomina hibridacin in situ. Hoy da se dispone de muchas sondas especficas de ADN empleadas para el diagnstico de muchas enfermedades bacterianas. La hibridacin por sondas, as como otros mtodos que comentaremos para detectar un gen en particular, es especialmente til para realizar el diagnstico etiolgico de infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por un crecimiento muy lento, como puede ser el caso de Micobacterium sp., o por tener requerimientos especiales para su cultivo y aislamiento, como en Chlamidia sp. Y Rickettsia sp. o en los virus. El mayor problema en el diagnstico utilizando hibridacin por sondas, ha sido la baja sensibilidad de la tcnica, ya que se requiere que en la muestra existan suficientes copias del gen buscado, como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada. En general, las tcnicas de hibridacin in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar solo mas de 200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la tcnica no es suficiente como para descartar como muestras negativas a aquellas con las que se obtienen resultados negativos. Uno de los mas interesantes avances en el rea de diagnstico clnico, ha sido el desarrollo de un mtodo que permite amplificar el nmero de copias de un determinado fragmento de ADN de inters. Esta tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la Polimerasa, mas conocida por su sigla en ingls PCR, permite la generacin de millones de copias exactas de un fragmento de ADN, a partir de tan solo 1 copia original en apenas 2 o 3 horas. La PCR se basa en las propiedades de la replicacin del ADN, que puede reproducirse in vitro si se coloca el ADN molde, en una mezcla de reaccin con una enzima ADN polimerasa, nucletidos y cebadores especficos para las regiones flanqueantes del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se coloca en condiciones de ph y osmticas tales que permitan el funcionamiento adecuado de la polimerasa, y en condiciones de temperatura distintas. Primero, a altas temperaturas (94 o 95 grados) para lograr que el ADN se desnaturalice, es decir que se separen ambas hebras; segundo, a temperaturas adecuadas

para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55 grados, segn los cebadores); y en tercer lugar, a la temperatura adecuada para que la polimerasa de ADN lleve a cabo el proceso de replicacin. Las polimerasas que se utilizan para esto, deben ser capaces de tolerar estas altas temperaturas de desnaturalizacin del ADN, por lo que la enzima utilizada, corresponde a una bacteria termfila, Thermus aquaticus, por lo cual se la llama Taq polimerasa, cuya temperatura ptima es de 72 grados. Hoy da se utiliza sta y tambin otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli . Estos cambios de temperatura, se realizan en un equipo conocido como termociclador, que es capaz de variar entre rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas, por ejemplo 94 por 1 minuto, 45 por 1,5 minutos y 72 por 1, 5minutos se repite unas 30 veces, con lo que se logra que en cada ciclo se duplique el nmero de copias de cada una de las hebras del ADN molde, con lo que se logra un crecimiento exponencial. Este procedimento, puede aplicarse directamente sobre una muestra clnica, buscando determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular, a travs de la deteccin de una secuencia especfica en su cido nucleico. Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de reaccin debe ser utilizada como muestra en una corrida electrofortica en gel de agarosa o de poliacril amida, en donde el ADN migra desde el polo negativo al positivo, en mayor o menor medida segn su peso molecular, es decir su tamao en pares de bases. El fragmento a amplificar, es por supuesto de un tamao conocido, por lo que podr determinarse la presencia del gen buscado en la muestra, porque habr amplificado en la reaccin y presentar una banda del tamao correspondiente en el gel.